ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ ÓÄÊ 577.27 ÑÏÅÖÈÔÈ×ÍÛÅ È ÍÅÑÏÅÖÈÔÈ×ÍÛÅ ÂÇÀÈÌÎÄÅÉÑÒÂÈß ÀÍÒÈÒÅË È ÈÌÌÓÍÎÃËÎÁÓËÈÍÎÂ Ñ ÀÍÒÈÃÅÍÀÌÈ È ÑÏÎÑÎÁÛ ÀÍÀËÈÇÀ ÝÒÈÕ ÂÇÀÈÌÎÄÅÉÑÒÂÈÉ Ñ. À. ÁÎÁÐÎÂÍÈÊ Èíñòèòóò áèîõèìèè èì. À. Â. Ïàëëàäèíà ÍÀÍ Óêðàèíû, Êèåâ; e-mail: sab@biochem.kiev.ua Ðîçãëÿíóòî ïðîáëåìó ñïåöèô³÷íî¿ òà íåñïåöèô³÷íî¿ âçàºìî䳿 ñèðîâàòêîâèõ ³ìóíîãëîáóë³í³â òà àíòèò³ë ç àíòèãåíàìè. Ïîêàçàíî, ùî âèñîêà ÷óòëèâ³ñòü ìåòîä³â, ùî âèêîðèñòîâóþòüñÿ äëÿ âèâ÷åííÿ âçàºìî䳿 àíòèãåí–àíòèò³ëî, äîçâîëÿº ñïîñòåð³ãàòè íèçüêîàô³ííó íåñïåöèô³÷íó âçàºìîä³þ ³ìóíîãëîáóë³í³â ç àíòèãåíàìè.  òîìó âèïàäêó, ÿêùî êîíöåíòðàö³ÿ ñïåöèô³÷íèõ àíòèò³ë ó äîñë³äæóâàíèõ çðàçêàõ º íåçíà÷íîþ, íåñïåöèô³÷íà âçàºìîä³ÿ ³ìóíîãëîáóë³í³â ç àíòèãåíàìè ìîæå çíà÷íî ïåðåâèùóâàòè ñïåöèô³÷íó ðåàêö³þ çà ³íòåíñèâí³ñòþ ³, ÿê íàñë³äîê, îäåðæàí³ ðåçóëüòàòè ìîæóòü áóòè íåâ³ðíî ³íòåðïðåòîâàí³. Ó çâ’ÿçêó ç öèì ðîáèòüñÿ âèñíîâîê ïðî íåîáõ³äí³ñòü áðàòè äî óâàãè ìîæëèâ³ñòü íåñïåöèô³÷íî¿ âçàºìî䳿 ³ìóíîãëîáóë³í³â ç àíòèãåíàìè òà íåîáõ³äí³ñòü ðîçðîáêè ìåòîä³â, ùî äîçâîëÿþòü â³äð³çíÿòè ñïåöèô³÷íó òà íåñïåöèô³÷íó âçàºìîä³þ. Ê ë þ ÷ î â ³ ñ ë î â à: âçàºìîä³ÿ àíòèãåí–àíòèò³ëî, ïîë³ðåàêòèâí³ñòü, ñïåöèô³÷í³ñòü, àô³íí³ñòü, ELISA. Í åîáõîäèìîñòü âûÿâëåíèÿ íåçíà÷èòåëüíûõ êîëè÷åñòâ àíòèòåë â ñûâîðîòêå èëè äðóãèõ áèîëîãè÷åñêèõ æèäêîñòÿõ ñòèìóëèðóåò ïðèìåíåíèå äëÿ ýòèõ öåëåé ìåòîäîâ, îáëàäàþùèõ âûñîêîé ÷óâñòâèòåëüíîñòüþ, òàêèõ êàê ðàäèîèììóíîàíàëèç èëè èììóíîôåðìåíòíûå ìåòîäû, â ÷àñòíîñòè ELISA. Èñïîëüçîâàíèå ïîäîáíûõ ìåòîäîâ ïîçâîëÿåò îáíàðóæèòü íå òîëüêî ìèêðîêîëè÷åñòâà àíòèòåë, íî è âûÿâèòü íèçêîàôôèííûå íåñïåöèôè÷íûå âçàèìîäåéñòâèÿ èììóíîãëîáóëèíîâ ñ ðàçíîîáðàçíûìè àíòèãåíàìè, êîòîðûå íåâîçìîæíî áûëî îáíàðóæèòü ïðè ïîìîùè òàêèõ íèçêî÷óâñòâèòåëüíûõ ìåòîäîâ, êàê àããëþòèíàöèÿ, ïðåöèïèòàöèÿ è äð. Âûñîêî÷óâñòâèòåëüíûå ìåòîäû, íåñîìíåííî, ïîçâîëÿþò çíà÷èòåëüíî ðàñøèðèòü äèàïàçîí èññëåäîâàíèé èììóíîõèìè÷åñêèõ ðåàêöèé. Âìåñòå ñ òåì, âûÿâëÿåìûå ïðè ïîìîùè ïîäîáíûõ ìåòîäîâ îòíîñèòåëüíî “ñëàáûå” âçàèìîäåéñòâèÿ èììóíîãëîáóëèíîâ ñ àíòèãåíàìè ñòàâÿò âîïðîñ î âçàèìîñâÿçè ýòèõ ñëàáûõ âçàèìîäåéñòâèé ñ êëàññè÷åñêèìè, âûñîêîñïåöèôè÷íûìè ðåàêöèÿìè àíòèãåí–àíòèòåëî. Îñîáåííî âàæíî óìåòü ðàçëè÷àòü âûñîêîàôôèííîå ñïåöèôè÷íîå âçàèìîäåéñòâèå àíòèòåë è íèçêîàôôèííîå íåñïåöèôè÷íîå âçàèìîäåéñòâèå èììóíîãëîáóëèíîâ ñ àíòèãåíàìè â ñëó÷àå ðàáîòû ñ ñûâîðîòêàìè æèâîòíûõ èëè ÷åëîâåêà. Äåëî â òîì, ÷òî ñûâîðîòêè ñîäåðæàò îãðîìíîå êîëè÷åñòâî ðàçíîîáðàçíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ, â òîì ÷èñëå è òåõ, êîòîðûå ñïîñîáíû ñâÿçûâàòüñÿ íåñïåöèôè÷íî ñ ðàçíûìè àíòèãåíàìè. Ïîñêîëüêó êîëè÷åñòâî ïîäîáíûõ, òàê íàçûâàåìûõ ïîëèðåàê- òèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ [1–4] â èññëåäóåìîì îáðàçöå ñûâîðîòêè ìîæåò çíà÷èòåëüíî ïðåâûøàòü êîíöåíòðàöèþ ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë, òî ïîëó÷àåìûé ñóììàðíûé ðåçóëüòàò ñïåöèôè÷íîãî è íåñïåöèôè÷íîãî âçàèìîäåéñòâèÿ èììóíîãëîáóëèíîâ ñ àíòèãåíàìè èíîãäà äîâîëüíî ñëîæíî èíòåðïðåòèðîâàòü.  ñâÿçè ñ ýòèì âîçíèêàåò ïðîáëåìà îòûñêàíèÿ ñïîñîáîâ ðàçëè÷èÿ ìåæäó âûñîêîñïåöèôè÷íûì è íèçêîñïåöèôè÷íûì âçàèìîäåéñòâèåì èììóíîãëîáóëèíîâ ñ àíòèãåíàìè.  íàñòîÿùåé ñòàòüå ìû ðàññìàòðèâàåì èìåþùèåñÿ âîçìîæíîñòè, ïîçâîëÿþùèå äèôôåðåíöèðîâàòü ñïåöèôè÷íîå âçàèìîäåéñòâèå êëàññè÷åñêèõ àíòèòåë ñ àíòèãåíîì, è íåñïåöèôè÷íîå, òàê íàçûâàåìîå ïîëèðåàêòèâíîå âçàèìîäåéñòâèå ñ àíòèãåíîì ñûâîðîòî÷íûõ èììóíîãëîáóëèíîâ. Ðàññìàòðèâàþòñÿ òàêæå âîçìîæíîñòè áëîêèðîâàíèÿ ïîëèðåàêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ, ÷òî ïîçâîëÿåò àíàëèçèðîâàòü ðåàêòèâíîñòü ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë, íàõîäÿùèõñÿ â èññëåäóåìîé ñûâîðîòêå. 132 ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5 Ìàòåðèàëû è ìåòîäû  ðàáîòå èñïîëüçîâàëè â êà÷åñòâå àíòèãåíîâ àëüáóìèí êóðèíûõ ÿèö (îâàëüáóìèí), áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí (ÁÑÀ) èëè ìèîãëîáèí ñåðäöà ëîøàäè («Sigma», ÑØA). Àíòèãåíû èììîáèëèçîâàëè íà 96-ëóíî÷íûõ ïëîñêîäîííûõ ïëàòàõ äëÿ èììóíîôåðìåíòíîãî àíàëèçà äâóìÿ ñïîñîáàìè.  ïåðâîì ñëó÷àå èñïîëüçîâàëè îáùåïðèíÿòûé ìåòîä èíêóáàöèè ðàñòâîðà àíòèãåíà (20– 30 ìêã/ìë) â ôîñôàòíîì áóôåðå (ðÍ 8,5–9,0) â Ñ. À. ÁÎÁÐÎÂÍÈÊ òå÷åíèå 2 ÷àñ ïðè 37 °Ñ èëè 18–20 ÷àñ ïðè 4 °Ñ. Âî âòîðîì ñëó÷àå àíòèãåíû èììîáèëèçîâàëè íà ïëàòàõ ñ ïîìîùüþ ðàçðàáîòàííîãî íàìè ðàíåå ìåòîäà âûñóøèâàíèÿ ðàñòâîðà àíòèãåíà (1–2 ìêã/ìë) â 1,5%-ì ðàñòâîðå NH4HCO3 ïðè 37 °Ñ [5]. Íåïîñðåäñòâåííî ïåðåä èñïîëüçîâàíèåì ïëàòû ñ èììîáèëèçîâàííûìè àíòèãåíàìè òùàòåëüíî ïðîìûâàëè âíà÷àëå ïðîòî÷íîé, à çàòåì äèñòèëëèðîâàííîé âîäîé. Ìûøåé ëèíèè ÑÂÀ ïåðâîíà÷àëüíî èììóíèçèðîâàëè âíóòðèâåííî 0,1 ìë ðàñòâîðà îâàëüáóìèíà (10 ìã/ìë â ôèçèîëîãè÷åñêîì ðàñòâîðå NaCl), çàòåì, ñïóñòÿ òðè è øåñòü íåäåëü, ïîâòîðíî èììóíèçèðîâàëè ïîëîâèííîé äîçîé óêàçàííîãî àíòèãåíà. ×åðåç 10 ñóòîê ïîñëå òðåòüåé èììóíèçàöèè ìûøåé çàáèâàëè äèñëîêàöèåé øåéíûõ ïîçâîíêîâ, ñûâîðîòêó ñîáèðàëè è õðàíèëè çàìîðîæåííîé ïðè –20 °Ñ âïëîòü äî èñïîëüçîâàíèÿ. Êðîâü ëþäåé ïîëó÷àëè èç ëîêòåâîé âåíû ó äîáðîâîëüöåâ, íå èìåþùèõ âèäèìûõ çàáîëåâàíèé, çàòåì äåôèáðèëëèðîâàëè è ïîëó÷åííûå ñûâîðîòêè õðàíèëè çàìîðîæåííûìè. ×òîáû îïðåäåëèòü ðåàêòèâíîñòü ïîëèðåàêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ â èññëåäóåìûõ îáðàçöàõ ñûâîðîòîê, èñïîëüçîâàëè ñòàíäàðòíûé èììóíîôåðìåíòíûé ìåòîä ELISA. Èññëåäóåìûå îáðàçöû èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè 37 °Ñ â ëóíêàõ ïëàò ñ ñîðáèðîâàííûì îïðåäåëåííûì àíòèãåíîì. Àíòèòåëà èëè ïîëèðåàêòèâíûå èììóíîãëîáóëèíû, ñâÿçàííûå ñ èììîáèëèçîâàííûìè íà ïëàøêå àíòèãåíàìè, âûÿâëÿëè ñ ïîìîùüþ êîçüèõ àíòèòåë ê IgG ìûøè, ìå÷åííûõ ïåðîêñèäàçîé õðåíà («Sigma», ÑØÀ).  êà÷åñòâå ñóáñòðàòà ïåðîêñèäàçû èñïîëüçîâàëè ñìåñü îðòîôåíèëåíäèàìèíà ñ 0,03% Í2Î2. Ðàçâèòèå öâåòíîé ðåàêöèè îñòàíàâëèâàëè äîáàâëåíèåì 8,0 Ì Í2SO4, ïîñëå ÷åãî èíòåíñèâíîñòü îêðàñêè ëóíîê ïëàò èçìåðÿëè íà ìèêðîôîòîêîëîðèìåòðå ïðè äëèíå âîëíû 490 íì. BrCN-àêòèâèðîâàííóþ ñåôàðîçó 4 («Sigma», ÑØÀ) êîâàëåíòíî ñâÿçûâàëè ñ ìèîãëîáèíîì ñåðäöà ëîøàäè, êàê îïèñàíî â ðóêîâîäñòâå ïî èñïîëüçîâàíèþ ñåôàðîçû, è äàííûé ñîðáåíò, ïîìåùåííûé â ïëàñòèêîâóþ êîëîíêó (äèàìåòð 1 ñì, âûñîòà 1 ñì), èñïîëüçîâàëè äëÿ èñòîùåíèÿ ïîëèðåàêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ ñûâîðîòêè ìûøåé, ïðåäâàðèòåëüíî ðàçâåäåííîé â ôîñôàòíîì áóôåðå (ðÍ 7,2) ñ äîáàâëåíèåì 0,01% òâèíà 20. Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå Íà ðèñ. 1 ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû îïðåäåëåíèÿ ïðè ïîìîùè ELISA ñïîñîáíîñòè èììóíîãëîáóëèíîâ èíòàêòíîé ñûâîðîòêè ìûøè è ÷åëîâåêà ñâÿçûâàòüñÿ ñ îâàëüáóìèíîì, èììîáèëèçîâàííûì íà ïëàòàõ äëÿ èììóíîôåðìåíòíîãî àíàëèçà. ×àñòü ýòîé ðåàêòèâíîñòè èììóíîãëîáóëèíîâ ñâÿçàíà ñ íàëè÷èåì â ñûâîðîòêå òàê íàçûâàåìûõ íîðìàëüíûõ àíòèòåë, ñïåöèôè÷íûõ ê äàííîìó àíòèãåíó. Èíàÿ ÷àñòü ðåàêòèâíîñòè ÿâëÿåòñÿ íåñïåöèôè÷íîé è îáóñëîâëåíà ñïîñîáíîñòüþ èììóíîãëîáóëèíîâ ñâÿçûâàòüñÿ ñ ðàçëè÷íûìè àíòèãåíàìè, â òîì ÷èñëå è ñ àóòîàíòèãåíàìè. Ñõîäíûå ðåçóëüòàòû ïîëó÷àþòñÿ è â òîì ñëó÷àå, åñëè âìåñòî îâàëüáóìèíà èñïîëüçóþòñÿ èíûå àíòèãåíû. Ðàíåå íàìè áûëî ïîêàçàíî [6, 7], ÷òî íåñïåöèôè÷åñêóþ ðåàêòèâíîñòü ñûâîðîòîê â îòíîøåíèè ðàçíîîáðàçíûõ àíòèãåíîâ ìîæíî ïîâûñèòü, åñëè ýêñïåðèìåíòàëüíûì æèâîòíûì ââåñòè âíóòðèâåííî ñìåñü FeSO4-ÝÄÒÀ (êîíöåíòðàöèÿ 60 ìÌ è 30 ìÌ ñîîòâåòñòâåííî). Îäíàêî íåñïå- Á A490 A490 À Ðèñ. 1. Ðåàêòèâíîñòü ñûâîðîòî÷íûõ èììóíîãëîáóëèíîâ êëàññà G ÷åëîâåêà (À) è ìûøè (Á) äî è ïîñëå èíêóáàöèè ñûâîðîòîê ïðè ðÍ 3,0 â òå÷åíèå 5 ìèí ïðè 25 °Ñ: – ðÍ 3,0; – êîíòðîëü. ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5 133 ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ öèôè÷åñêóþ ðåàêòèâíîñòü ñûâîðîòî÷íûõ èììóíîãëîáóëèíîâ â îòíîøåíèè ðàçíîîáðàçíûõ àíòèãåíîâ ìîæíî ïîâûñèòü íàìíîãî áîëüøå, åñëè âîçäåéñòâèå íà èììóíîãëîáóëèíû ðàçëè÷íûìè ðåàãåíòàìè, â òîì ÷èñëå è ñìåñüþ FeSO4-ÝÄÒÀ, ïðîâåñòè íå in vivo, à in vitro. Òàêîå æå ïîâûøåíèå íåñïåöèôè÷åñêîé ðåàêòèâíîñòè èììóíîãëîáóëèíîâ ìîæíî èíäóöèðîâàòü ñ ïîìîùüþ îáðàáîòêè èììóíîãëîáóëèíîâ âûñîêîé êîíöåíòðàöèåé õàîòðîïíûõ èîíîâ, èíêóáàöèåé èììóíîãëîáóëèíîâ ïðè íèçêèõ èëè âûñîêèõ çíà÷åíèÿõ ðÍ è íåêîòîðûìè äðóãèìè ñïîñîáàìè. Íà ðèñ. 1 ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû òèòðîâàíèÿ ñûâîðîòîê äî è ïîñëå èíêóáàöèè èõ ïðè ðÍ 3,0 â òå÷åíèå 5 ìèí ïðè 25 °Ñ. Ïîêàçàíî, ÷òî èíêóáàöèÿ ñûâîðîòêè ïðè ðÍ 3,0 ïðèâîäèò ê ñóùåñòâåííîìó óâåëè÷åíèþ íåñïåöèôè÷åñêîé ðåàêòèâíîñòè ñûâîðîòî÷íûõ èììóíîãëîáóëèíîâ. Åùå áóëüøåå óñèëåíèå íåñïåöèôè÷åñêîé ðåàêòèâíîñòè ñûâîðîòî÷íûõ èììóíîãëîáóëèíîâ âûçûâàåò èíêóáàöèÿ ñûâîðîòêè ñ KSCN (ïðè êîíöåíòðàöèÿõ ñîëè 3,0–4,0 Ì). Êàê èçâåñòíî, äëÿ àôôèííîé î÷èñòêè àíòèòåë, ñâÿçàâøèõñÿ ñ èììîáèëèçîâàííûì íà êîëîíêå àíòèãåíîì, ÷àùå âñåãî èñïîëüçóþò îáðàáîòêó êîëîíîê áóôåðàìè ñ íèçêèì ðÍ èëè ñîëÿìè, îáðàçóþùèìè õàîòðîïíûå èîíû SCN—. Ñëåäîâàòåëüíî, ñòàíîâèòñÿ î÷åâèäíûì, ÷òî èçâåñòíûå ìåòîäû àôôèííîé î÷èñòêè àíòèòåë, ïðåäïîëàãàþùèå ïðèìåíåíèå ýêñòðåìàëüíûõ çíà÷åíèé ðÍ èëè õàîòðîïíûõ èîíîâ, íåèçáåæíî ïðèâîäÿò ê óñèëåíèþ ïîëèðåàêòèâíîñòè èììóíîãëîáóëèíîâ. Ïðèìåðîì òàêîãî óñèëåíèÿ àêòèâíîñòè ìî- 2,02 À æåò áûòü àôôèííîå âûäåëåíèå èììóíîãëîáóëèíîâ íà êîëîíêå ñ èììîáèëèçîâàííûì íà ñåôàðîçå ïðîòåèíîì À èëè G. Íà ðèñ. 2 ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû îïðåäåëåíèÿ ñïîñîáíîñòè èììóíîãëîáóëèíîâ ñûâîðîòêè èíòàêòíûõ ìûøåé âçàèìîäåéñòâîâàòü ñ èììîáèëèçîâàííûì îâàëüáóìèíîì äî è ïîñëå î÷èñòêè íà ïðîòåèí-À-êîëîíêå. Âûÿâëåíî, ÷òî èììóíîãëîáóëèíû ñûâîðîòêè ìûøåé, ýëþèðîâàííûå ñ êîëîíêè áóôåðîì ïðè ðÍ 2,95, îáëàäàþò çíà÷èòåëüíî áîëüøåé ñïîñîáíîñòüþ ñâÿçûâàòüñÿ ñ èììîáèëèçîâàííûìè àíòèãåíàìè, ÷åì èììóíîãëîáóëèíû èñõîäíîé ñûâîðîòêè. Ïðè ýòîì ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî êîíöåíòðàöèÿ èììóíîãëîáóëèíîâ â îáðàçöå, ýëþèðîâàííîì ñ êîëîíêè, áûëà ïðèìåðíî â òðè ðàçà íèæå, ÷åì â èñõîäíîé ñûâîðîòêå. Òàêèì îáðàçîì, óäåëüíàÿ ðåàêòèâíîñòü î÷èùåííûõ íà ïðîòåèí-À-êîëîíêå èììóíîãëîáóëèíîâ áîëåå ÷åì â äåñÿòü ðàç ïðåâûøàåò ïîëèðåàêòèâíûå ñâîéñòâà èììóíîãëîáóëèíîâ èíòàêòíîé ñûâîðîòêè. Àíàëîãè÷íûå ðåçóëüòàòû áûëè ïîëó÷åíû è ïðè èñïîëüçîâàíèè ïðîòåèí-G-êîëîíêè. Î÷åâèäíî, ÷òî ïîñêîëüêó äëÿ àôôèííîé î÷èñòêè àíòèòåë èñïîëüçóþò îáû÷íî áîëåå æåñòêóþ îáðàáîòêó ñâÿçàâøèõñÿ ñ êîëîíêîé àíòèòåë, ÷åì âîçäåéñòâèå áóôåðà ñ ðÍ 2,95 (íàïðèìåð àíòèòåëà ñ êîëîíîê ÷àñòî ýëþèðóþò ïðè ðÍ 2,20– 2,80), òî ÷àñòü ïîëèðåàêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ â ïðåïàðàòàõ î÷èùåííûõ àíòèòåë ìîæåò áûòü âåñüìà ñóùåñòâåííîé.  òîì ñëó÷àå, êîãäà ñïåöèôè÷íîñòü ïîëó÷åííîãî ïðåïàðàòà àíòèòåë ÿâëÿåòñÿ âàæíîé äëÿ èõ ïðèìåíåíèÿ â äàëüíåéøåé ðàáîòå èëè íóæíî õàðàêòåðèçîâàòü ïóë ïîëó÷åííûõ ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë, íåîáõîäèìî íàéòè êàê Á 2,5 Сыворот ка Сыворот ка Очищенные Igs Очищенные Igs 2,0 A 490 A 490 1,5 1,0 1,5 1,0 0,5 0 0,0 0,0 0,5 0,0 0,25 0,5 Ðàçâåäåíèå (×100) 0,75 1,0 0,0 0,25 0,5 0,75 1,0 Ðàçâåäåíèå (×100) Ðèñ. 2. Ðåçóëüòàòû òèòðîâàíèÿ ìåòîäîì ELISA èììóíîãëîáóëèíîâ êëàññà G ñûâîðîòêè ÷åëîâåêà (À) è ñûâîðîòêè èíòàêòíûõ ìûøåé (Á) äî è ïîñëå èõ î÷èñòêè íà ïðîòåèí-À-êîëîíêå.  êà÷åñòâå àíòèãåíà èñïîëüçîâàëè îâàëüáóìèí, èììîáèëèçîâàííûé íà ïëàòàõ ìåòîäîì âûñóøèâàíèÿ: – ñûâîðîòêà, – î÷èùåííûå IgG. 134 ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5 Ñ. À. ÁÎÁÐÎÂÍÈÊ Àêòèâíîñòü ñâÿçûâàíèÿ, % 120 100 80 Иммунноглобулины 60 Антитела 40 20 0 0,0 0,0004 0,002 0,01 0,05 0,25 Êîíöåíòðàöèÿ òâèí 20, % Ðèñ. 3. Âëèÿíèå êîíöåíòðàöèè òâèí 20 â ôîñôàòíîì áóôåðå, ðÍ 7,2, íà ñâÿçûâàíèå ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë èëè íåñïåöèôè÷íûõ èììóíîãëîáóëèíîâ ñ èììîáèëèçîâàííûì íà ïëàòàõ îâàëüáóìèíîì: – èììóíîãëîáóëèíû, – àíòèòåëà. ñïîñîá îöåíêè ðåàêòèâíîñòè ïðèìåñè ïîëèðåàêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ, òàê è ñïîñîáû èõ óäàëåíèÿ èëè áëîêèðîâàíèÿ. Ðàíåå íàìè áûëî ïîêàçàíî [8, 9], ÷òî ïîëèðåàêòèâíûå èììóíîãëîáóëèíû íåñïåöèôè÷åñêè ñâÿçûâàþòñÿ ñ àíòèãåíàìè âî ìíîãîì áëàãîäàðÿ îáîþäíîìó ãèäðîôîáíîìó âçàèìîäåéñòâèþ. Ïîýòîìó ìîæíî îæèäàòü, ÷òî ðàçëè÷íûå äåéñòâèÿ, íàïðàâëåííûå íà îñëàáëåíèå èëè áëîêèðîâàíèå ãèäðîôîáíîãî âçàèìîäåéñòâèÿ ìàêðîìîëåêóë ïðèâåäóò, ñëåäîâàòåëüíî, è ê îñëàáëåíèþ âçàèìîäåéñòâèÿ ïîëèðåàêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ ñ àíòèãåíàìè. Îäíèì èç ýôôåêòèâíûõ ñïîñîáîâ ïîäàâëåíèÿ ãèäðîôîáíîãî âçàèìîäåéñòâèÿ ÿâëÿåòñÿ ïðîâåäåíèå ðåàêöèè â ïðèñóòñòâèè ïîâåðõ- íîñòíî àêòèâíûõ âåùåñòâ, íàïðèìåð òâèíà 20.  ñâÿçè ñ ýòèì ìû èññëåäîâàëè âëèÿíèå ðàçëè÷íûõ êîíöåíòðàöèé òâèíà 20 íà íåñïåöèôè÷íîå ñâÿçûâàíèå èììóíîãëîáóëèíîâ ñ àíòèãåíàìè, èììîáèëèçîâàííûìè íà ïëàòàõ ìåòîäîì âûñóøèâàíèÿ. Íà ðèñ. 3 ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû èññëåäîâàíèÿ çàâèñèìîñòè âçàèìîäåéñòâèÿ ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë èëè ïîëèðåàêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ ñ îâàëüáóìèíîì, âûñóøåííûì íà ïëàòàõ, îò êîíöåíòðàöèè òâèíà 20 â èññëåäóåìîì ðàñòâîðå àíòèòåë èëè èììóíîãëîáóëèíîâ. Ïîêàçàíî, ÷òî òâèí 20 äåéñòâèòåëüíî ýôôåêòèâíî ïîäàâëÿåò íåñïåöèôè÷íîå âçàèìîäåéñòâèå èììóíîãëîáóëèíîâ è èììîáèëèçîâàííîãî àíòèãåíà, òîãäà êàê ïðàêòè÷åñêè íå âëèÿåò íà âçàèìîäåéñòâèå ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë ñ àíòèãåíîì. Òàêèì îáðàçîì, òâèí 20 ÿâëÿåòñÿ ðåàãåíòîì, êîòîðûé ìîæåò ñïîñîáñòâîâàòü ïîäàâëåíèþ íåñïåöèôè÷íîãî ñâÿçûâàíèÿ èììóíîãëîáóëèíîâ ñ àíòèãåíàìè è, ñëåäîâàòåëüíî, âûÿâëåíèþ ðàçëè÷èé ìåæäó ñïåöèôè÷íûì è íåñïåöèôè÷íûì âçàèìîäåéñòâèåì àíòèòåë è èììóíîãëîáóëèíîâ ñ àíòèãåíàìè. Ïîñêîëüêó ñòåïåíü ãèäðîôîáíîñòè èììîáèëèçîâàííîãî íà ïëàòàõ àíòèãåíà çàâèñèò îò ìåòîäà èììîáèëèçàöèè, òî ïðåäñòàâëÿëîñü öåëåñîîáðàçíûì èññëåäîâàòü âîïðîñ î òîì, êàê ñïîñîá èììîáèëèçàöèè àíòèãåíà âëèÿåò íà íåñïåöèôè÷íîå ñâÿçûâàíèå èììóíîãëîáóëèíîâ. Íàìè áûëî óñòàíîâëåíî, ÷òî ìåòîä âûñóøèâàíèÿ àíòèãåíà íà ïëàòàõ ïðèâîäèò ê çíà÷èòåëüíî áîëåå ñèëüíîìó íåñïåöèôè÷íîìó ñâÿçûâàíèþ èììóíîãëîáóëèíîâ, ÷åì ïðè ñîðáöèè àíòèãåíà èç ðàñòâîðà (ðèñ. 4). Îñîáåííî ñèëüíî ñ âûñóøåííûì íà ïëàòàõ àíòèãåíîì ñâÿçûâàëèñü èììóíîãëîáóëèíû ñûâîðîòêè ìûøè, àôôèííî î÷èùåííûå íà ïðîòåèí-À-êîëîíêå. 2,5 À 0,5 Á À 490 Сыворотка 2,0 0,3 1,5 À 490 0,4 Иммуноглобулины 1,0 0,2 Сыворотка 0,5 Иммуноглобулины 0,1 0,0 0,0 0,0 0,25 0,5 0,75 1,0 Ðàçâåäåíèå (×50) 0,0 0,25 0,5 0,75 1,0 Ðàçâåäåíèå (×50) Ðèñ. 4. Çàâèñèìîñòü íåñïåöèôè÷åñêîãî ñâÿçûâàíèÿ èììóíîãëîáóëèíîâ êëàññà G ñûâîðîòêè ìûøè ñ îâàëüáóìèíîì, èììîáèëèçîâàííûì íà ïëàòàõ è ïðè ïîìîùè ñîðáöèè èç ðàñòâîðà (À), è ìåòîäîì âûñóøèâàíèÿ (Á): – ñûâîðîòêà, – èììóíîãëîáóëèíû. ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5 135 ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ À 0,6 0,8 Конт роль 0,5 0,7 Желат ин Á 0,9 0,4 À 490 À 490 0,6 0,5 0,3 0,4 0,2 0,3 0,2 0,1 Конт роль 0,1 Ж елат ин 0,0 0,0 0,25 0,5 0,75 0,0 0,0 1,0 0,25 0,5 2,0  0,8 Конт роль 0,7 Желат ин à 1,5 0,6 0,5 À 490 À 490 1,0 Ðàçâåäåíèå (×400) Ðàçâåäåíèå (×50) 0,9 0,75 0,4 1,0 0,3 Контроль 0,5 0,2 Желат ин 0,1 0,0 0,0 0,0 0,25 0,5 0,75 1,0 Ðàçâåäåíèå (×50) 0,0 0,25 0,5 0,75 1,0 Ðàçâåäåíèå (×400) Ðèñ. 5. Âëèÿíèå îáðàáîòêè 1%-ì ðàñòâîðîì æåëàòèíû ïëàò ñ ñîðáèðîâàííûì èç ðàñòâîðà îâàëüáóìèíîì (À) è (Á) èëè îâàëüáóìèíîì, èììîáèëèçîâàííûì ìåòîäîì âûñóøèâàíèÿ (Â) è (Ã), íà ñïîñîáíîñòü äàííîãî àíòèãåíà íåñïåöèôè÷åñêè ñâÿçûâàòü èììóíîãëîáóëèíû èíòàêòíîé ñûâîðîòêè ìûøè (À) è (Â) èëè òå æå èììóíîãëîáëèíû, ïðåäâàðèòåëüíî î÷èùåííûå íà ïðîòåèí-À-êîëîíêå (Á) è (Ã): – êîíòðîëü, – æåëàòèí. Ñëåäîâàòåëüíî, â òîì ñëó÷àå, åñëè íåîáõîäèìî îïðåäåëÿòü àêòèâíîñòü ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë â èññëåäóåìîì îáðàçöå, èììîáèëèçàöèþ àíòèãåíà ñëåäóåò ïðîâîäèòü ïðè ïîìîùè ñîðáöèè èç ðàñòâîðà, à ñàìó ðåàêöèþ âçàèìîäåéñòâèÿ àíòèòåë ñ àíòèãåíîì – â ïðèñóòñòâèè âûñîêèõ êîíöåíòðàöèé òâèíà 20. È, íàîáîðîò, åñëè íåîáõîäèìî ñäåëàòü âûâîä î íàëè÷èè ïîëèðåàêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ â èññëåäóåìîì îáðàçöå, àíòèãåí ñëåäóåò èììîáèëèçîâàòü ïðè ïîìîùè âûñóøèâàíèÿ, à ðåàêöèþ ïðîâîäèòü ïðè íèçêèõ êîíöåíòðàöèÿõ òâèíà 20. Èçâåñòíî, ÷òî ãèäðîôîáíûå ó÷àñòêè íà èììóíîëîãè÷åñêèõ ïëàòàõ, à, âîçìîæíî, è íà èì- ìîáèëèçîâàííûõ ìàêðîìîëåêóëàõ ìîæíî äî íåêîòîðîé ñòåïåíè áëîêèðîâàòü ïðè ïîìîùè ðàñòâîðà æåëàòèíû.  ñâÿçè ñ ýòèì ìû èññëåäîâàëè âëèÿíèå îáðàáîòêè ïëàò ñ èììîáèëèçîâàííûì àíòèãåíîì ðàñòâîðîì æåëàòèíû íà èõ ñïîñîáíîñòü ñâÿçûâàòü ïîëèðåàêòèâíûå èììóíîãëîáóëèíû. Áûëî óñòàíîâëåíî (ðèñ. 5), ÷òî îáðàáîòêà ïëàò ñ èììîáèëèçîâàííûì àíòèãåíîì 1%-ì ðàñòâîðîì æåëàòèíû (1 ÷ ïðè 25 °Ñ) íåïîñðåäñòâåííî ïåðåä èñïîëüçîâàíèåì ïëàò, ïðèâîäèò ê ñíèæåíèþ íåñïåöèôè÷íîãî ñâÿçûâàíèÿ èììóíîãëîáóëèíîâ íåçàâèñèìî îò ñïîñîáà èììîáèëèçàöèè àíòèãåíà. È, íàêîíåö, êàê áûëî ïîêàçàíî ðàíåå [4, 10], 136 ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5 Ñ. À. ÁÎÁÐÎÂÍÈÊ íåñïåöèôè÷íîå âçàèìîäåéñòâèå èììóíîãëîáóëèíîâ ñ èììîáèëèçîâàííûì àíòèãåíîì ìîæåò áûòü â çíà÷èòåëüíîé ñòåïåíè ñíèæåíî, åñëè â ðàñòâîð èññëåäóåìûõ èììóíîãëîáóëèíîâ äîáàâèòü âûñîêóþ êîíöåíòðàöèþ ñåðîëîãè÷åñêè íåðîäñòâåííîãî àíòèãåíà, à òàêæå ïðîâîäèòü ðåàêöèþ ïðè íèçêèõ çíà÷åíèÿõ òåìïåðàòóðû (0–4 °Ñ). Íåðîäñòâåííûé àíòèãåí äëÿ áëîêèðîâàíèÿ ïîëèðåàêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ ìîæíî èñïîëüçîâàòü ïî òîé ïðè÷èíå, ÷òî îí íå ñïîñîáåí çàáëîêèðîâàòü ñïåöèôè÷íûå àíòèòåëà, íî â çíà÷èòåëüíîé ñòåïåíè ñíèçèò íåñïåöèôè÷åñêóþ ðåàêòèâíîñòü èììóíîãëîáóëèíîâ. Âàæíûì ìîìåíòîì âñåõ îïèñàííûõ âûøå äåéñòâèé, íàïðàâëåííûõ íà ïîäàâëåíèå íåñïåöèôè÷íîãî ñâÿçûâàíèÿ èììóíîãëîáóëèíîâ àíòèãåíàìè, ÿâëÿåòñÿ íåîáõîäèìîñòü òîãî, ÷òîáû ýòè äåéñòâèÿ íå ïðèâåëè ê ñóùåñòâåííîìó ñíèæåíèþ ðåàêòèâíîñòè ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë. Òàêèì òðåáîâàíèÿì îòâå÷àþò îïèñàííûå âûøå ïîäõîäû, íàïðàâëåííûå íà áëîêèðîâàíèå íåñïåöèôè÷åñêîé ðåàêòèâíîñòè èììóíîãëîáóëèíîâ, ïîñêîëüêó îíè ìàëî âëèÿþò íà ñïåöèôè÷íîå âçàèìîäåéñòâèå àíòèòåë è àíòèãåíà (ðèñ. 6, À è Á).  òî æå âðåìÿ îæèäàåìûé íàìè ýôôåêò áëîêèðîâàíèÿ ïîëèðåàêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ ñ ïîìîùüþ 1%-ãî ðàñòâîðà æåëàòèíû, íàõîäÿùåéñÿ â èñïûòóåìîì îáðàçöå àíòèòåë, îêàçûâàåò ñóùåñòâåííîå ïîäàâëåíèå ðåàêòèâíîñòè íå òîëüêî ïîëèðåàêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ, íî è ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë (ðèñ. 6, Â). Åñëè ê 1%-ìó ðàñòâîðó æåëàòèíû äîáàâèòü ðàñòâîð ïîðîøêà îáåçæèðåííîãî ìîëîêà (êîíå÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ 5%), òî ñóïðåññèÿ ñâÿçûâàíèÿ ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë óâåëè÷èâàåòñÿ åùå áîëüøå. Ñëåäîâàòåëüíî, 1%-é ðàñòâîð æåëàòèíû ìîæíî èñïîëüçîâàòü äëÿ ïðåäâàðèòåëüíîé îáðàáîòêè ïëàò ñ èììîáèëèçîâàííûì àíòèãåíîì, íî íåæåëàòåëüíî èñïîëüçîâàòü äëÿ ïîäàâëåíèÿ ïîëèðåàêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ íåïîñðåäñòâåííî â èõ ñìåñè ñî ñïåöèôè÷íûìè àíòèòåëàìè. Óñòðàíèòü çíà÷èòåëüíóþ ÷àñòü ïðèìåñè ïîëèðåàêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ èç îáðàçöà ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë ìîæíî, î÷åâèäíî, ïðè ïîìîùè ñîðáöèè íà êîëîíêå ñ èììîáèëèçîâàííûì àíòèãåíîì, ñ êîòîðûì äàííûå àíòèòåëà ñïåöèôè÷íî íå âçàèìîäåéñòâóþò. Òàê, íåñïåöèôè÷åñêàÿ ðåàêòèâíîñòü èììóíîãëîáóëèíîâ â àíòèñûâîðîòêå ìûøåé ê îâàëüáóìèíó çíà÷èòåëüíî ñíèæàëàñü ïîñëå ñîðáöèè äàííîé ñûâîðîòêè íà êîëîíêå ñ èììîáèëèçîâàííûì ìèîãëîáèíîì (ðèñ. 7) èëè ÁÑÀ (äàííûå íå ïîêàçàíû). Ê ñîæàëåíèþ, êàê âèäíî èç ðèñ. 7, ïðè ýòîì ïðîèñõîäèò òàêæå ïîòåðÿ ÷àñòè ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë ê îâàëüáóìèíó èç-çà òîãî, ÷òî îíè, ïî-âèäèìîìó, ìîãóò íåñïåöèôè÷íî ñîðáèðîâàòüñÿ íà êîëîíêå. Òàêèì îáðàçîì, ïðåäñòàâëåííûå â íàñòîÿùåé ðàáîòå äàííûå ïîêàçûâàþò, ÷òî íå òîëüêî ñûâîðîòêè, íî è àôôèííî î÷èùåííûå àíòèòåëà ìîãóò ñîäåðæàòü ïðèìåñü òàê íàçûâàåìûõ ïîëè- ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5 137 2,0 À Êîíòðîëü Ко нтроль 0,1%Т2 Ò20 0,1% 0 1,5 À 490 5% П ÏÌ 5% М 1,0 0,5 0,0 0,0 0,25 0,5 0,75 1,0 À 490 Ðàçâåäåíèå (×50) 2,0 Контроль Êîíòðîëü 0,1%Т20 Ò20 0,1% 1,5 5% 5%ПМ ÏÌ Á 1,0 0,5 0,0 0,0 0,25 0,5 0,75 1,0 Ðàçâåäåíèå (×250000)  1,4 Êîíòðîëü Ко нтроль 1,2 1%ЖеÆåëàòèí 1% ла тин 1,0 1%Æ 1% Ж +5 5% %ПÏÌ М À 490 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,0 0,25 0,5 0,75 1,0 Ðàçâåäåíèå (×250000) Ðèñ. 6. Âëèÿíèå 0,1%-ãî òâèíà 20 èëè 5%-ãî ïîðîøêà ìîëîêà (ÏÌ) íà ñâÿçûâàíèå ïîëèðåàêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ (À) è ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë ñûâîðîòêè ìûøè (Á) ñ ñîðáèðîâàííûì íà ïëàòàõ îâàëüáóìèíîì, à òàêæå âëèÿíèå 1%-ãî ðàñòâîðà æåëàòèíû (Æ) èëè 1%-íîãî ðàñòâîðà æåëàòèíû + 5%-ãî ïîðîøêà ìîëîêà íà ñâÿçûâàíèå ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë ñ îâàëüáóìèíîì (Â). ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ 2,0 Контроль Истощенная 1,5 Контроль Á Истощенная 1,5 1,0 A 490 A 490 2,0 À 0,5 1,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,25 0,5 0,75 1,0 Ðàçâåäåíèå (×500) 0,0 0,25 0,5 0,75 1,0 Ðàçâåäåíèå (×30000) Ðèñ. 7. Ýôôåêò èñòîùåíèÿ àíòèñûâîðîòêè ìûøè ê îâàëüáóìèíó íà êîëîíêå ñ èììîáèëèçîâàííûì ìèîãëîáèíîì íà íåñïåöèôè÷åñêóþ ðåàêòèâíîñòü ñûâîðîòî÷íûõ èììóíîãëîáóëèíîâ (À) è ðåàêòèâíîñòü ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë (Á) ñ èììîáèëèçîâàííûì îâàëüáóìèíîì: – êîíòðîëü, – èñòîùåíèå. ðåàêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ, ñïîñîáíûõ íåñïåöèôè÷íî ñâÿçûâàòüñÿ ñ ðàçíîîáðàçíûìè àíòèãåíàìè. Î÷åâèäíî, ÷òî äëÿ òîãî, ÷òîáû àíàëèçèðîâàòü àôôèííîñòü ïîäîáíûõ îáðàçöîâ àíòèòåë èëè èçìåðÿòü êîíöåíòðàöèþ àíòèòåë â îáðàçöå è ïð., íåîáõîäèìî ó÷èòûâàòü, ÷òî ïðèìåñü ïîëèðåàêòèâíûõ èììóíîãëîáóëèíîâ ìîæåò ñóùåñòâåííûì îáðàçîì âëèÿòü íà ïîëó÷àåìûå ýêñïåðèìåíòàòîðîì îöåíêè.  òîì ñëó÷àå, åñëè åñòü íåîáõîäèìîñòü àíàëèçèðîâàòü ïîëèðåàêòèâíûå èììóíîãëîáóëèíû ñ ïîìîùüþ ELISA, òî, ñîãëàñíî ïðèâåäåííûì âûøå äàííûì, èììîáèëèçàöèþ àíòèãåíà íà èììóíîëîãè÷åñêèõ ïëàòàõ æåëàòåëüíî âûïîëíÿòü ïðè ïîìîùè ìåòîäà âûñóøèâàíèÿ [5]. Èììóíîôåðìåíòíûé àíàëèç ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë, íàõîäÿùèõñÿ â ñìåñè ñ ïîëèðåàêòèâíûìè èììóíîãëîáóëèíàìè, æåëàòåëüíî îñóùåñòâëÿòü ïðè ïîíèæåííûõ òåìïåðàòóðàõ â ïðèñóòñòâèè âûñîêèõ êîíöåíòðàöèé êàê òâèíà 20, òàê è ñåðîëîãè÷åñêè íåðîäñòâåííûõ àíòèãåíîâ, êîòîðûå ìàëî âëèÿþò íà âçàèìîäåéñòâèå ñïåöèôè÷íûõ àíòèòåë ñ àíòèãåíîì, íî â çíà÷èòåëüíîé ñòåïåíè ïîäàâëÿþò íåñïåöèôè÷åñêóþ ðåàêòèâíîñòü èììóíîãëîáóëèíîâ.  çàêëþ÷åíèå ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî èñïîëüçîâàíèå ïðåäëîæåííûõ â äàííîé ñòàòüå ïîäõîäîâ ïîçâîëÿåò äèôôåðåíöèðîâàííî îöåíèòü êàê ñïåöèôè÷åñêóþ àêòèâíîñòü àíòèòåë, òàê è íåñïåöèôè÷åñêóþ ðåàêòèâíîñòü èììóíîãëîáóëèíîâ ê ðàçíîîáðàçíûì àíòèãåíàì. 138 SPECIFIC AND NONSPECIFIC INTERACTIONS OF ANTIBODIES AND IMMUNOGLOBULINES WITH ANTIGENS AND THE METHODS OF ANALYSIS OF THESE INTERACTIONS S. A. Bobrovnik Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv; e-mail: sab@biochem.kiev.ua Summary The problem of specific and nonspecific interaction of serum immunoglobulins and antigens was considered. It was shown that high-sensitive methods allow to reveal low-affinity non-specific interaction of immunoglobulins and antigens. If the concentration of the specific antibodies in a studied sample of serum is low, the non-specific interaction of serum immunoglobulins may exceed substantially the effect of specific reaction. In this case the obtained results could be misinterpreted. In this connection the conclusion has been done that in such a case it is necessary to take into account the capability of serum immunoglobulins to interact non-specifically with antigens and to discriminate between specific and non-specific interaction. The methods of the diminishing the non-specific interaction are suggested. K e y w o r d s: antigen–antibody interaction, polyreactivity, specificity, affinity, ELISA. ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5 Ñ. À. ÁÎÁÐÎÂÍÈÊ 1. Avrameas S. // Immunol. Today. 1991. 12. Ð. 154–159. 2. Bouvet J. P., Stahl D., Rose S. et al. // J. Autoimmun. 2001. 16. P. 163–172. 3. Áîáðîâíèê Ñ. À., Ìàðèíåö À. Â. // Óêð. áèîõèì. æóðí. 1993. 65, ¹ 5. C. 21–26. 4. Bobrovnik S. A. // Comments Molec. & Cellular Biophys. 1999. 9. P. 323–356. 5. Áîáðîâíèê Ñ. À., Ñòàðîäóá Í. Ô. // Èììóíîëîãèÿ. 1988. ¹ 5. C. 83–85. 6. Áîáðîâíèê Ñ. À. // Óêð. á³îõ³ì. æóðí. 1999. 71, ¹ 3. C. 129–135. 7. Áîáðîâíèê Ñ. À. // Òàì ñàìî. 2002. 74, ¹ 3. C. 133–141. 8. Áîáðîâíèê Ñ. À. // Òàì ñàìî. 2001. 73, ¹ 2. C. 116–122. 9. Áîáðîâíèê Ñ. À. // Òàì ñàìî. 2002. 74, ¹ 2. Ñ. 26–33. 10. Áîáðîâíèê Ñ. À. // Òàì ñàìî. 1990. 62, ¹ 5. Ñ. 86–89. Ïîëó÷åíî 25.06.2004 ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 5 139