ÕÀÐÀÊÒÅÐÈÑÒÈÊÀ ÓÃËÅÂÎÄ-ÐÀÑÏÎÇÍÀÞÙÈÕ ÖÅÍÒÐΠÀÍÃÈÎÒÅÍÇÈÍ-ÏÐÅÂÐÀÙÀÞÙÈÕ ÔÅÐÌÅÍÒΠÁÛÊÀ È ×ÅËÎÂÅÊÀ ÓÄÊ 577.175.8

380
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 2. ÕÈÌÈß. 2000. Ò. 41. ¹ 6
ÓÄÊ 577.175.8
ÕÀÐÀÊÒÅÐÈÑÒÈÊÀ ÓÃËÅÂÎÄ-ÐÀÑÏÎÇÍÀÞÙÈÕ ÖÅÍÒÐÎÂ
ÀÍÃÈÎÒÅÍÇÈÍ-ÏÐÅÂÐÀÙÀÞÙÈÕ ÔÅÐÌÅÍÒÎÂ ÁÛÊÀ È
×ÅËÎÂÅÊÀ
1
1
2
2
1
×åìîäàíîâà Å.Å. , Îðò Ò.À , Íàñîíîâ Â.Â. , Áîâèí Í.Â. , Êîñò Î.À. *.
1
( Õèìè÷åñêèé ôàêóëüòåò, Ìîñêîâñêèé Ãîñóäàðñòâåííûé Óíèâåðñèòåò èì. Ì. Â.
Ëîìîíîñîâà, Ìîñêâà 119899, Ðîññèÿ; 2Èíñòèòóò Áèîîðãàíè÷åñêîé õèìèè èì. Ì. Ì.
Øåìÿêèíà è Þ. À. Îâ÷èííèêîâà, ÐÀÍ, óë. Ìèêëóõî-Ìàêëàÿ, 16/10, Ìîñêâà 117871, Ðîññèÿ,
Fax: (7 ) (095) 9395417. Phone: (7) (095) 9393417. E-mail: kost@enzyme.chem.msu.ru)
Ïîêàçàíî, ÷òî àíãèîòåíçèí-ïðåâðàùàþùèå ôåðìåíòû (ÀÏÔ) áûêà è ÷åëîâåêà ìîãóò ñóùåñòâîâàòü â ñèñòåìå îáðàùåííûõ ìèöåëë, ìîäåëèðóþùèõ ìåìáðàííîå îêðóæåíèå ôåðìåíòà, êàê â
ìîíîìåðíîé, òàê è äèìåðíîé ôîðìàõ ñ ñîõðàíåíèåì êàòàëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè. Äèìåðèçàöèÿ
ÿâëÿåòñÿ îáðàòèìûì ïðîöåññîì è ñïåöèôè÷íî êîíòðîëèðóåòñÿ óãëåâîäàìè. Èçó÷åíî âëèÿíèå
óãëåâîäîâ ðàçëè÷íîé ñòðóêòóðû íà îáðàçîâàíèå äèìåðîâ ÀÏÔ. Ñïåöèôèêà äåéñòâèÿ óãëåâîäîâ
íà äèìåðèçàöèþ ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà ïðàêòè÷åñêè îäèíàêîâà. Ðàçëè÷èÿ íàáëþäàþòñÿ ëèøü
âî âëèÿíèè íåêîòîðûõ îëèãîñàõàðèäîâ, òàêèõ êàê 3′′SiaLac, 6′′SiaLac, Lac-ol. Ïîêàçàíî, ÷òî
àñèàëî- è àãàëàêòî-ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà ñïîñîáíû ê ôîðìèðîâàíèþ äèìåðîâ â ñèñòåìå îáðàùåííûõ ìèöåëë, â òî âðåìÿ êàê àñèàëî-àãàëàêòî-ÀÏÔ íå îáðàçóåò äèìåðà.
Ñîìàòè÷åñêèé àíãèîòåíçèí-ïðåâðàùàþùèé ôåðìåíò
(ÀÏÔ, ïåïòèäèë-äèïåïòèäãèäðîëàçà, ÊÔ 3.4.15.1) ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé îäèí èç ôèçèîëîãè÷åñêè âàæíûõ ãëèêîïðîòåèíîâ â îðãàíèçìå ÷åëîâåêà è æèâîòíûõ. Îäíîé èç íàèáîëåå èçó÷åííûõ ôèçèîëîãè÷åñêèõ ôóíêöèé ÀÏÔ ÿâëÿåòñÿ
ó÷àñòèå â ðåãóëÿöèè êðîâÿíîãî äàâëåíèÿ è âîäíî-ñîëåâîãî îáìåíà [1]. Ñîìàòè÷åñêèé ÀÏÔ N-ãëèêîçèëèðîâàí; ñîäåðæàíèå óãëåâîäîâ (7–33%), êîëè÷åñòâî ñàéòîâ ãëèêîçèëèðîâàíèÿ, à òàêæå ñòðóêòóðà îëèãîñàõàðèäíûõ öåïåé
ñèëüíî çàâèñÿò îò èñòî÷íèêà âûäåëåíèÿ ôåðìåíòà [2, 3].
ÀÏÔ ÷åëîâåêà è áûêà èìåþò 17 è 16 ïîòåíöèàëüíûõ ñàéòîâ äëÿ N-ãëèêîçèëèðîâàíèÿ, ñîîòâåòñòâåííî [4, 5], íî êîëè÷åñòâî ðåàëüíî ãëèêîçèëèðîâàííûõ ñàéòîâ äëÿ ÀÏÔ ÷åëîâåêà, êðûñû, êðîëèêà è ìîðñêîé ñâèíêè áûëî îöåíåíî
ðàâíûì 7–8 [3]. Ñâîè îñíîâíûå ôèçèîëîãè÷åñêèå ôóíêöèè ÀÏÔ âûïîëíÿåò â ñîñòàâå áèîëîãè÷åñêèõ ìåìáðàí.
 ýòèõ óñëîâèÿõ ñâîéñòâà ôåðìåíòà ìîãóò ñóùåñòâåííî
îòëè÷àòüñÿ îò åãî ñâîéñòâ â âîäíîé ãîìîãåííîé ñðåäå.
Äëÿ âûÿâëåíèÿ âîçìîæíîãî âëèÿíèÿ ìåìáðàííîãî ìèêðîîêðóæåíèÿ íà õàðàêòåðèñòèêè ôåðìåíòà èñïîëüçóþò ìîäåëüíûå ñèñòåìû, òàêèå êàê ñèñòåìà îáðàùåííûõ ìèöåëë
ÀÎҖâîäà–îêòàí [6]. Êàòàëèòè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü ôåðìåíòîâ â ýòîé ñèñòåìå çàâèñèò îò ñòåïåíè ãèäðàòàöèè W0 –
ïàðàìåòðà, îïðåäåëÿþùåãî ðàçìåðû âíóòðåííåé ïîëîñòè
ìèöåëë. Ïîäîáíûå çàâèñèìîñòè îáû÷íî èìåþò êîëîêîëîîáðàçíûé âèä, ãäå îïòèìóì àêòèâíîñòè ïðèõîäèòñÿ íà ñòåïåíü ãèäðàòàöèè, êîòîðàÿ îòâå÷àåò ðàäèóñó âíóòðåííåé
ïîëîñòè ìèöåëëû, ñîâïàäàþùåìó ñ ðàäèóñîì ãëîáóëû
ôåðìåíòà [6].
Èñïîëüçîâàíèå ýòîé ñèñòåìû ïîçâîëèëî ïîêàçàòü, ÷òî
ÀÏÔ èç ëåãêèõ áûêà ìîæåò ôóíêöèîíèðîâàòü â ìîíîìåð-
*Àäðåñàò äëÿ ïåðåïèñêè.
íîé è äèìåðíîé ôîðìàõ, ïðè÷åì îáðàçîâàíèå äèìåðà
ñïåöèôè÷íî êîíòðîëèðóåòñÿ óãëåâîäàìè [7]. Ýòè äàííûå
ïîçâîëèëè ïðåäïîëîæèòü ñóùåñòâîâàíèå íà ìîëåêóëå
ôåðìåíòà óãëåâîä-ðàñïîçíàþùåãî öåíòðà.
 íàñòîÿùåé ðàáîòå îöåíåíû ñòðóêòóðíûå òðåáîâàíèÿ
óãëåâîä-ðàñïîçíàþùèõ öåíòðîâ ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà.
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû
Íåéðàìèíèäàçà (Å.Ñ. 3.2.1.18) èç Vibrio cholerae è β-ãàëàêòîçèäàçà èç Aspergillus oryzae («Serva», Ãåðìàíèÿ).
Ôóðèëàêðèëîèë-L-ôåíèëàëàíèë-ãëèöèë-ãëèöèí (FA-Phe-GlyGly) («Sigma», ÑØÀ). Íàòðèåâàÿ ñîëü äè-(2-ýòèë)ãåêñèëîâîãî ýôèðà ñóëüôîÿíòàðíîé êèñëîòû (àýðîçîëü ÎÒ, ÀÎÒ)
(«Fluka», Àâñòðèÿ). Ìîíîñàõàðèäû, ìåòèëãëèêîçèäû, ëàêòîçà, ñèàëèëëàêòîçû, ñèàëèëëàêòîçàìèí («Sigma», ÑØÀ).
Îëèãîñàõàðèäíûå öåïè ÀÏÔ áûêà, α1-êèñëîãî ãëèêîïðîòåèíà ÷åëîâåêà, îâàëüáóìèíà, ôåòóèíà, èììóíîãëîáóëèíà
G è α-ôèáðèíîãåíà ïîëó÷åíû ãèäðàçèíîëèçîì.
Ïîëó÷åíèå ÀÏÔ. ÀÏÔ âûäåëÿëè èç ëåãêèõ áûêà èëè
ìåìáðàííîé ôðàêöèè ïî÷åê ÷åëîâåêà ýêñòðàêöèåé â
50 ìM ôîñôàòíîì áóôåðå (ðÍ 7,5), ñîäåðæàùåì 150 ìM
NaCl, 1 ìêM ZnCl2, 0,1% Òðèòîí X-100. Çàòåì ôåðìåíòû
î÷èùàëè äî ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîé ãîìîãåííîñòè ïîñðåäñòâîì àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè íà ëèçèíîïðèë-àãàðîçå
[8]. Ïðè âûäåëåíèè ÀÏÔ ÷åëîâåêà áîðàòíûé áóôåð ñîäåðæàë 0,1% Tðèòîíà Õ-100.
Ïîëó÷åíèå àñèàëî-ÀÏÔ. Äåñèàëèðîâàíèå ÀÏÔ áûêà è
÷åëîâåêà ïðîâîäèëè ñ ïîìîùüþ íåéðàìèíèäàçû (0,3 åä.
íà 0,05 ìã ÀÏÔ) ïî [8].
Ïîëó÷åíèå àãàëàêòî-ÀÏÔ. Äåãàëàêòîçèëèðîâàíèå íàòèâíîãî ÀÏÔ èëè àñèàëî-ÀÏÔ îñóùåñòâëÿëè β-ãàëàêòîçè-
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 2. ÕÈÌÈß. 2000. Ò. 41. ¹ 6
äàçîé (0,1 åä. íà 0,05 ìã ÀÏÔ) â 0,5 ìë 0,05 Ì öèòðàòíîôîñôàòíîãî áóôåðà ïðè ðÍ 6,0. Ðåàêöèþ ïðîâîäèëè â òå÷åíèå 24 ÷ ïðè 37°.
Êèíåòè÷åñêèå ýêñïåðèìåíòû â îáðàùåííûõ ìèöåëëàõ
òðîéíîé ñèñòåìû ÀÎҖâîäà–îêòàí ïðîâîäèëè êàê îïèñàíî â [7].
Ðåçóëüòàòû è èõ îáñóæäåíèå
381
A0, %
%
100
80
 ðàáîòå ìû èññëåäîâàëè ÀÏÔ, âûäåëåííûé èç ëåãêèõ
áûêà, è ÀÏÔ, âûäåëåííûé èç êîðû ïî÷åê ÷åëîâåêà. Ïîëó÷åííûå ïðåïàðàòû ôåðìåíòîâ áûëè ýëåêòðîôîðåòè÷åñêè
ãîìîãåííûìè. Cîäåðæàíèå àêòèâíûõ ìîëåêóë äëÿ îáîèõ
ôåðìåíòîâ ñîñòàâëÿëî 95–97%.
 âîäíûõ ðàñòâîðàõ ôåðìåíò îáû÷íî ôóíêöèîíèðóåò
â âèäå ìîíîìåðà [9], íî åñòü äàííûå î òîì, ÷òî â ýêñòðàêòàõ è êîíöåíòðèðîâàííûõ ðàñòâîðàõ [10] ÀÏÔ ìîæåò
àãðåãèðîâàòü. Áîëåå òîãî, ïðîâåäåíèå ýëåêòðîôîðåçà â
íåäåíàòóðèðóþùèõ óñëîâèÿõ ïîêàçàëî [3],÷òî ÀÏÔ èç íåñêîëüêèõ èñòî÷íèêîâ ñïîñîáíû äèìåðèçîâàòüñÿ. Ðàíåå ìû
ïðîäåìîíñòðèðîâàëè ñïîñîáíîñòü ÀÏÔ áûêà ôîðìèðîâàòü äèìåð â îáðàùåííûõ ìèöåëëàõ òðîéíîé ñèñòåìû
ÀÎҖâîäà–îêòàí [7].  äàííîé ðàáîòå ìû ïðèìåíèëè
ýòîò ïîäõîä äëÿ ôåðìåíòà ÷åëîâåêà. Äëÿ îáîèõ ôåðìåíòîâ íà çàâèñèìîñòè êàòàëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè îò ñòåïåíè ãèäðàòàöèè íàáëþäàëîñü äâà îïòèìóìà ïðè W0 = 27
è 31 (ðèñ. 1, êðèâàÿ 1), óêàçûâàþùèå íà ñóùåñòâîâàíèå
1
60
2
3
40
20
25
30
35
W0, [H2O]/[AOT]
Ðèñ. 2. Âëèÿíèå íà îáðàçîâàíèå äèìåðà ÀÏÔ ÷åëîâåêà â
ñèñòåìå îáðàùåííûõ ìèöåëë N-àöåòèëíåéðàìèíîâîé êèñëîòû (Neu5Ac), ìM: 1 – 1; 2 – 6 ; 3 – 10 (0,3 Ì ÀÎÒ â îêòàíå,
50 ìÌ Hepes-áóôåð c pH 7,5, ñîäåðæàùèé 150 ìÌ NaCl, 10
ìêÌ ZnCl2, êîíöåíòðàöèÿ ÀÏÔ 10–8 Ì, êîíöåíòðàöèÿ
ñóáñòðàòà 7,5⋅10 –5 Ì)
Òàáëèöà 1
Âëèÿíèå óãëåâîäîâ íà îáðàçîâàíèå äèìåðà ÀÏÔ áûêà è
÷åëîâåêà
A0, %
Óãëåâîäû
100
Êîíöåíòðàöèÿ óãëåâîäà, ïðè êîòîðîé
íå íàáëþäàåòñÿ îáðàçîâàíèå äèìåðà
ôåðìåíòà, Ì
ÀÏÔ áûêà
ÀÏÔ ÷åëîâåêà
Ìîíîñàõàðèäû
80
1
60
Glc, GalNAc
GlcNAc
Man, Neu5Acβ–OMe
Fuc
Galβ–OÌe
Gal
Galβ–OÌe
Neu5Ac
Neu5Acα–OÌe
10–1
10–2
10–3
10–4
10–4
10–5
10–5
10–5
10–5
10–1
10–2
10–3
10–4
10–4
10–5
10–5
10–5
10–5
10–3
10–5
10–5
10–6
10–6
10–6
10–3
10–4
10–6
10–5
10–6
10–6
10–7
10–7
10–7
10–6
10–3
10–7
10–7
10–7
10–5
10–3
Îëèãîñàõàðèäû
40
2
20
25
30
35
W0, [H2O]/[AOT]
Ðèñ. 1. Çàâèñèìîñòü êàòàëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ÀÏÔ îò
ñòåïåíè ãèäðàòàöèè â îáðàùåííûõ ìèöåëëàõ òðîéíîé ñèñòåìû ÀÎҖâîäà–îêòàí (àêòèâíîñòü ÀÏÔ ïðè ñòåïåíè
ãèäðàòàöèè W î = 27 ïðèíÿòà çà 100%): 1 – íàòèâíûé,
àñèàëî- èëè àãàëàêòî-ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà; 2 – ïîñëåäîâàòåëüíî àñèàëèðîâàííûé, àãàëàêòîçèëèðîâàííûé ÀÏÔ
áûêà è ÷åëîâåêà (0,3 Ì ÀÎÒ â îêòàíå, 50 ìÌ Hepesáóôåð c pH 7,5, ñîäåðæàùèé 150 ìÌ NaCl, 1 ìêÌ ZnCl2,
êîíöåíòðàöèÿ ÀÏÔ 10 –8 Ì, êîíöåíòðàöèÿ
ñóáñòðàòà 7,5⋅10 –5 Ì)
Lac
Lac-ol
6'SiaLac
3'SiaLac
3'SiaLac-ol
3'SiaLacNAc
Ïóë îëèãîñàõàðèäîâ*
OSagp
Osfg
OSIgG
OSf
Osov
* Ïóë N-öåïåé α 1-êèñëîãî ãëèêîïðîòåèíà (OSagp ); àñèàëî-áèàíòåííûå
öåïè α-ôèáðèíîãåíà (OSfg) èëè èììóíîãëîáóëèíà G (OSIgG);
òðèàíòåííûå öåïè ôåòóèíà (OSf); âûñîêîìàííîçíûå öåïè
îâàëüáóìèíà (OSov).
382
äâóõ ôîðì ôåðìåíòà. Ðåçóëüòàòû ñåäèìåíòàöèîííîãî àíàëèçà, ïðîâåäåííûå äëÿ ÀÏÔ áûêà [7] ïîêàçàëè, ÷òî ïðè
ñòåïåíÿõ ãèäðàòàöèè íèæå W0 << 30 â ñèñòåìå íàõîäèòñÿ
ìîíîìåðíàÿ ôîðìà ÀÏÔ, à ïðè W 0 >> 30 – òîëüêî åãî
äèìåðíàÿ ôîðìà. Òàêèì îáðàçîì, ïåðâûé ìàêñèìóì àêòèâíîñòè ïðè W0 = 27 ñîîòâåòñòâóåò ôóíêöèîíèðîâàíèþ â
ñèñòåìå ìîíîìåðà, à âòîðîé ìàêñèìóì ïðè W0 =31 –
ôóíêöèîíèðîâàíèþ äèìåðà ôåðìåíòà. Òàêèì îáðàçîì,
ñïîñîáíîñòü ê îáðàçîâàíèþ êàòàëèòè÷åñêè àêòèâíîé äèìåðíîé ôîðìû ÿâëÿåòñÿ îáùèì ñâîéñòâîì ñîìàòè÷åñêèõ
äâóäîìåííûõ àíãèîòåíçèí-ïðåâðàùàþùèõ ôåðìåíòîâ èç
ðàçëè÷íûõ èñòî÷íèêîâ.
Äèìåðèçàöèþ íàòèâíîãî ñîìàòè÷åñêîãî ÀÏÔ ìîæíî
íàðóøèòü äîáàâëåíèåì ñâîáîäíûõ óãëåâîäîâ â ðåàêöèîííóþ ñðåäó. Äëÿ ÀÏÔ ÷åëîâåêà áûëè ïîëó÷åíû äàííûå,
äåìîíñòðèðóþùèå âëèÿíèå óãëåâîäîâ íà ôîðìèðîâàíèå
âòîðîãî îïòèìóìà ïðè W0 = 31, ñîîòâåòñòâóþùåãî ôóíêöèîíèðîâàíèþ äèìåðà. Òàê, íàïðèìåð, óâåëè÷åíèå ñîäåðæàíèÿ N-àöåòèëíåéðàìèíîâîé êèñëîòû â ñèñòåìå ïðèâîäèëî ê ïîñòåïåííîìó óìåíüøåíèþ è, íàêîíåö, èñ÷åçíîâåíèþ âòîðîãî ïèêà àêòèâíîñòè ÀÏÔ (ðèñ. 2), àíàëîãè÷íî
íàáëþäàåìûì ðàíåå ðåçóëüòàòàì [7] äëÿ ÀÏÔ áûêà. Ïîëó÷åííûå äàííûå ïîçâîëÿþò çàêëþ÷èòü, ÷òî îáðàçîâàíèå
äèìåðîâ îáîèõ ôåðìåíòîâ îñóùåñòâëÿåòñÿ çà ñ÷åò îäèíàêîâûõ âçàèìîäåéñòâèé ñ ó÷àñòèåì ñîáñòâåííûõ îëèãîñàõàðèäíûõ öåïåé ÀÏÔ, ò.å. âçàèìîäåéñòâèå ÀÏԖÀÏÔ ïðîèñõîäèò çà ñ÷åò îáðàçîâàíèÿ óãëåâîä-áåëêîâûõ êîíòàêòîâ ñ
ó÷àñòèåì óãëåâîä-ðàñïîçíàþùèõ öåíòðîâ ýòèõ ôåðìåíòîâ.
Ñâîáîäíûå óãëåâîäû, äîáàâëåííûå â ðåàêöèîííóþ ñðåäó, êîíêóðèðóþò ñ îëèãîñàõàðèäíûìè öåïÿìè îäíîé ìîëåêóëû ÀÏÔ çà öåíòð ñâÿçûâàíèÿ íà äðóãîé. Òàêèì îáðàçîì, ñâîáîäíûå óãëåâîäû ìîãóò áûòü ðàññìîòðåíû êàê
èíãèáèòîðû äèìåðèçàöèè ÀÏÔ, à ïîäàâëåíèå äèìåðèçàöèè ÀÏÔ óãëåâîäàìè ðàçíîãî ñòðîåíèÿ, â ñâîþ î÷åðåäü,
ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíî êàê ïîäõîä äëÿ èçó÷åíèÿ ñïåöèôè÷íîñòè è ñòðóêòóðû óãëåâîä-ðàñïîçíàþùåãî öåíòðà íà
ìîëåêóëå ôåðìåíòà.
Äàííûå ïî ñïåöèôèêå âëèÿíèÿ óãëåâîäîâ íà îáðàçîâàíèå äèìåðîâ ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà ïðèâåäåíû â òàáë. 1.
Çà ýôôåêòèâíîñòü èíãèáèðóþùåé ñïîñîáíîñòè óãëåâîäîâ
áûëà âçÿòà êîíöåíòðàöèÿ óãëåâîäà, íåîáõîäèìàÿ äëÿ ïîëíîãî ïîäàâëåíèÿ äèìåðèçàöèè. Îêàçàëîñü, ÷òî ñòåïåíü
âëèÿíèÿ óãëåâîäîâ ñèëüíî çàâèñèò îò èõ ñòðóêòóðû. Èç
ìîíîñàõàðèäîâ íàèáîëüøåé èíãèáèòîðíîé ñïîñîáíîñòüþ
îáëàäàþò ãàëàêòîçà è N-àöåòèëíåéðàìèíîâàÿ êèñëîòà, ÿâëÿþùèåñÿ êîíöåâûìè â îëèãîñàõàðèäíûõ öåïÿõ êîìïëåêñíîãî òèïà N-ãëèêîïðîòåèíîâ. Ëàêòîçà îáëàäàåò äîâîëüíî
ñëàáîé èíãèáèðóþùåé ñïîñîáíîñòüþ ïî îòíîøåíèþ ê
äèìåðèçàöèè ÀÏÔ, íî ëàêòèòîë èíãèáèðóåò äèìåðèçàöèþ
ôåðìåíòà ãîðàçäî áîëåå ýôôåêòèâíî (îñîáåííî ïî îòíîøåíèþ ê ôåðìåíòó áûêà). Òàêèì îáðàçîì, î÷åâèäíî, îñòàòîê ãëþêîçû â ýòîì äèñàõàðèäå íàðóøàåò ñâÿçûâàíèå ñ
óãëåâîä-ðàñïîçíàþùèì öåíòðîì ôåðìåíòà. Åùå áîëåå ýôôåêòèâíûìè îêàçàëèñü ñèàëèëëàêòîçû, ïðè÷åì 3′-ñèàëèë-
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 2. ÕÈÌÈß. 2000. Ò. 41. ¹ 6
Òàáëèöà 2
Âëèÿíèå óãëåâîäîâ íà îáðàçîâàíèå äèìåðà íàòèâíîãî,
àãàëàêòî- è àñèàëî-ÀÏÔ áûêà
Óãëåâîäû
Neu5Ac
Gal
Lac
3'SiaLac
Êîíöåíòðàöèÿ óãëåâîäà, ïðè êîòîðîé íå íàáëþäàåòñÿ
îáðàçîâàíèå äèìåðà ôåðìåíòà, Ì
Íàòèâíûé
ÀÏÔ
10−5
10−5
10−3
8⋅10−7
àãàëàêòî-ÀÏÔ
6⋅10−6
4⋅10−5
2⋅10−3
4⋅10−7
àñèàëî-ÀÏÔ
5⋅10−5
5⋅10−6
5⋅10−4
2⋅10−6
Òàáëèöà 3
Âëèÿíèå óãëåâîäîâ íà îáðàçîâàíèå äèìåðà íàòèâíîãî,
àãàëàêòî- è àñèàëî- ÀÏÔ ÷åëîâåêà
Óãëåâîäû
Neu5Ac
Gal
Lac
3′SiaLac
Êîíöåíòðàöèÿ óãëåâîäà, ïðè êîòîðîé íå íàáëþäàåòñÿ
îáðàçîâàíèå äèìåðà ôåðìåíòà, Ì
Íàòèâíûé
ÀÏÔ, Ì
àãàëàêòî-ÀÏÔ,
Ì
àñèàëî-ÀÏÔ, Ì
9⋅10−6
8⋅10−6
10−3
9⋅10−6
5⋅10−6
10−4
10−2
5⋅10−6
6⋅10−5
2⋅10−6
2⋅10−4
4⋅10−5
ëàêòîçà áîëåå ýôôåêòèâíî èíãèáèðîâàëà äèìåðèçàöèþ
ÀÏÔ áûêà, à 6′-ñèàëàëëàêòîçà – äèìåðèçàöèþ ÀÏÔ ÷åëîâåêà. Áîëåå ýôôåêòèâíîå äåéñòâèå îëèãîñàõàðèäîâ ïî
ñðàâíåíèþ ñ ìîíîñàõàðèäàìè ñâèäåòåëüñòâóåò î íàëè÷èè
ïðîòÿæåííûõ êîíòàêòîâ ïðè âçàèìîäåéñòâèè ÀÏÔ ñ óãëåâîäîì. Ïðè ýòîì ïåðâûé è âòîðîé óãëåâîäíûå îñòàòêè â
îëèãîñàõàðèäíîé öåïè îêàçûâàþòñÿ íàèáîëåå âàæíûìè
äëÿ âçàèìîäåéñòâèÿ ñ óãëåâîä-ðàñïîçíàþùèì öåíòðîì
ÀÏÔ. Ñòðóêòóðíûå âàðèàöèè â ãëþêîçíîì îñòàòêå òðèñàõàðèäà 3′SiaLac (3′SiaLac, 3′SiaLac-ol, 3′SiaLacNAc) íå âëèÿëè íà èíãèáèðîâàíèå äèìåðèçàöèè ÀÏÔ áûêà, îäíàêî
âëèÿëè íà èíãèáèðîâàíèå ÀÏÔ ÷åëîâåêà, ÷òî ìîæåò óêàçûâàòü íà ñâÿçûâàíèå òðåòüåãî îñòàòêà â îëèãîñàõàðèäíîé öåïè óãëåâîä-ðàñïîçíàþùèì öåíòðîì ÀÏÔ ÷åëîâåêà, íî íå áûêà. Ñ äðóãîé ñòîðîíû, äàííûå ïî âëèÿíèþ
Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc, Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAc,
Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc ïîêàçûâàþò íåçíà÷èòåëüíîå
âëèÿíèå òðåòüåãî ìîíîñàõàðèäà íà äèìåðèçàöèþ ÀÏÔ ÷å–6
–6
–6
ëîâåêà (8⋅10 M, 9⋅10 M è 5⋅10 M ñîîòâåòñòâåííî).
Íàèáîëåå ñèëüíûìè èíãèáèòîðàìè äèìåðèçàöèè ÀÏÔ êàê
áûêà, òàê è ÷åëîâåêà îêàçàëèñü îëèãîñàõàðèäíûå áèàíòåííûå öåïè êîìïëåêñíîãî òèïà, âûäåëåííûå èç äðóãèõ ãëèêîïðîòåèíîâ (òàáë. 1).
Òîò ôàêò, ÷òî óãëåâîä-ðàñïîçíàþùèé öåíòð ýôôåêòèâíî ñâÿçûâàåò òåðìèíàëüíûå îñòàòêè Gal è Neu5Ac N-öåïåé êîìïëåêñíîãî òèïà è ñàìè êîìïëåêñíûå öåïè, ïîçâîëÿåò ïðåäïîëîæèòü, ÷òî êðèòè÷åñêóþ ðîëü â àññîöèàöèè
ìîíîìåðîâ ôåðìåíòîâ èãðàþò óãëåâîäíûå öåïè ÀÏÔ
ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 2. ÕÈÌÈß. 2000. Ò. 41. ¹ 6
êîìïëåêñíîãî òèïà, à èìåííî âõîäÿùèé â íèõ òåðìèíàëüíûé äèñàõàðèä Neu5Acα2-3Galβ.
Íåçíà÷èòåëüíûå îòëè÷èÿ â ñïåöèôè÷íîñòè óãëåâîä-ðàñïîçíàþùèõ öåíòðîâ ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà óêàçûâàþò íà
òî, ÷òî ýòîò öåíòð ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé êîíñåðâàòèâíûé
ó÷àñòîê íà áåëêîâîé ãëîáóëå.
Êàê óæå áûëî îòìå÷åíî, ðàçíûå ïî ñòðóêòóðå ìîíîñàõàðèäû – Gal è Neu5Ac – ïðîÿâëÿþò îäèíàêîâîå ñðîäñòâî ê ìîëåêóëå ÀÏÔ. Îäíèì èç îáúÿñíåíèé ýòîìó ôàêòó
ìîãëî áûòü ñóùåñòâîâàíèå íà áåëêå äâóõ ðàçíûõ óãëåâîäðàñïîçíàþùèõ öåíòðîâ ñ ðàçíûìè ñòðóêòóðíûìè òðåáîâàíèÿìè, èç êîòîðûõ ïåðâûé ñïåöèôè÷åí ê Gal, à âòîðîé
– ê Neu5Ac. Îäíàêî, åñëè áû ÀÏÔ èìåë äâà öåíòðà, òî
äèìåð àñèàëî-ÀÏÔ ôîðìèðîâàëñÿ áû çà ñ÷åò âçàèìîäåéñòâèÿ êîíöåâûõ ãàëàêòîçèëüíûõ îñòàòêîâ îäíîé ìîëåêóëû
ôåðìåíòà è Gal-ñâÿçûâàþùåãî öåíòðà äðóãîé. Ýòîò äèìåð
íå áûë áû ÷óâñòâèòåëåí ê ïðèñóòñòâèþ â ñðåäå Neu5Ac.
Äèìåð æå àãàëàêòî-ÀÏÔ ôîðìèðîâàëñÿ áû â ýòîì ñëó÷àå
çà ñ÷åò êîíöåâûõ îñòàòêîâ N-àöåòèëíåéðàìèíîâîé êèñëîòû îäíîé ìîëåêóëû ôåðìåíòà è Neu5Ac-ñâÿçûâàþùåãî
öåíòðà äðóãîé ìîëåêóëû. Äèìåð ýòîãî ôåðìåíòà íå áûë
áû ÷óâñòâèòåëåí ê ïðèñóòñòâèþ â ñðåäå Gal.
Íàìè áûëè ïîëó÷åíû êàê äåñèàëèðîâàííûé, òàê è äåãàëàêòîçèëèðîâàííûé ÀÏÔ áûêà è ÷åëîâåêà. Îêàçàëîñü,
383
÷òî ýòè ôåðìåíòû, êàê è èõ íàòèâíûå ïðåäøåñòâåííèêè,
ôóíêöèîíèðóþò â ñèñòåìå îáðàùåííûõ ìèöåëë êàê â
âèäå ìîíîìåðà, òàê è â âèäå äèìåðà (ðèñ. 1, êðèâàÿ 1),
ò.å. îòùåïëåíèå êîíöåâûõ îñòàòêîâ ñèàëîâûõ êèñëîò èëè
ãàëàêòîçû îò îëèãîñàõàðèäíûõ öåïåé ÀÏÔ íå íàðóøàëî
ñïîñîáíîñòè ôåðìåíòà ê îáðàçîâàíèþ äèìåðà (òàáë. 2).
Îêàçàëîñü, ÷òî, äåéñòâèòåëüíî, äëÿ äåñèàëèðîâàííîãî
ÀÏÔ áîëåå ýôôåêòèâíû óãëåâîäû, ñîäåðæàùèå ãàëàêòîçó,
è ìåíåå ýôôåêòèâíû óãëåâîäû, ñîäåðæàùèå Neu5Ac, ïî
ñðàâíåíèþ ñ íàòèâíûì ÀÏÔ (òàáë. 2).  ñëó÷àå äåãàëàêòîçèëèðîâàííîãî ÀÏÔ áîëåå ýôôåêòèâíû ñèàëèðîâàííûå
óãëåâîäû, à óãëåâîäû, ñîäåðæàùèå Gal, ìåíåå ýôôåêòèâíû.  òî æå âðåìÿ ïîëó÷åííûå äàííûå íå ñîãëàñóþòñÿ ñ
ãèïîòåçîé î ñóùåñòâîâàíèè äâóõ ïðîñòðàíñòâåííî ðàçäåëåííûõ óãëåâîä-ðàñïîçíàþùèõ öåíòðîâ ñ ðàçíûìè òðåáîâàíèÿìè ê ñòðóêòóðå óãëåâîäà, íî ñîãëàñóþòñÿ ñ âåðîÿòíûì íàõîæäåíèåì â ñîñòàâå áåëêîâîé ãëîáóëû ÀÏÔ îäíîãî öåíòðà, óçíàþùåãî ìîòèâ Neu5Aca2-3Galb. Íà ýòó
âîçìîæíîñòü ïðÿìî óêàçûâàþò ïîëó÷åííûå íàìè äàííûå
ñ ïîñëåäîâàòåëüíî äåñèàëèðîâàííûì, äåãàëàêòîçèëèðîâàííûì ÀÏÔ. Ýòîò ôåðìåíò ôóíêöèîíèðóåò â ñèñòåìå îáðàùåííûõ ìèöåëë òîëüêî â âèäå ìîíîìåðà (ðèñ. 1, êðèâàÿ
2), ò.å. ïîñëåäîâàòåëüíîñòü Neu5Aca2-3Gal êðèòè÷íà äëÿ
ôåðìåíò-ôåðìåíòíîãî âçàèìîäåéñòâèÿ.
ÑÏÈÑÎÊ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ
1. Corvol P., Williams T.A., Soubrier F. // Methods Enzymol. 1995.
248. Ð. 283.
2. Ehlers M.R.W., Chen Y.P., Riordan J.F. // Biochem. Biophys. Res.
Commun. 1992. 183. Ð. 199.
3. Ripka J.E., Ryan J.W., Valido F.A., Chung A.Y.K., Peterson C.M.,
Urry R.L. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. 196.
Ð. 503.
4. Soubrier F., Alhenc-Gelas F., Hubert C., Allegrini J., John H.,
Tregear G., Corvol P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. 85.
Ð. 9386.
5. Shai Sh.-Y., Fishel R.S., Martin B.M., Berk B.C., Bernstein K.E.
// Circ. Res. 1991. 70. Ð. 1274.
6. Klyachko N.L., Levashov A.V., Kabanov A.V., Khmelnisky Yu.L.,
Martinek K. / Surfactant science series: Kinetics and catalysis in
microheterogeneous systems. Eds. M. Gratzel and K.
Kalyanasundaram, N. Y., 1991. 38. Ð. 135.
7. Kost O.A., Orth T.A., Nikolskaya I.I., Nametkin S.N.,
Levashov A.V. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1998. 44. Ð. 535.
8. Orth T., Voronov S., Binevski P., Saenger W., Kost O. // FEBS
Lett. 1998. 431. Ð. 255.
9. Meng Q. Ch., King S.J., Chen Y.-F., Delucas L.J., Oparil S. // J.
Chromatogr. 1989. 461. Ð. 271.
10. Lanzillo J.J., Stevens J., Dasarathy Y., Yotsumoto H., Fanburg
B.L. // J. Biol. Chem. 1985. 260. Ð. 14938.
Ïîñòóïèëà â ðåäàêöèþ 20.06.00