Введение в биотехнологию Семченко П. А. 5 курс 5 группа Биотехнология ■ ■ Биотехнология - это наука, которая на основе применения знаний в области микробиологии, биохимии, генетики, генной инженерии, иммунологии, химической технологии, приборо- и машиностроения использует биологические объекты (микроорганизмы, клетки тканей животных и растений и др.) или молекулы (нуклеиновые кислоты, белки, ферменты, углеводы и др.) для целей промышленного производства полезных для человека и животных веществ и продуктов. Биотехнология создает возможность получения из сравнительно дешевых, доступных и возобновляемых материалов тех веществ и соединений, которые необходимы для жизни человека и животных. РЫНОК БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ Пищевая промышленность 10% Оборудование 2% Фармацевтика 58% Сельское хозяйство 30% Элементы биотехнологии широко используются при производстве продуктов питания и биологически активных веществ, в интересах экологии при очистке сточных вод и грунтов, переработке производственных и хозяйственных отходов, изготовлении компостов. ПОЛОЖЕНИЕ БИОТЕХНОЛОГИИ В СИСТЕМЕ НАУК Фундаментом современной биотехнологии являются микробиология, генетика, биохимия, биофизика, технология, приборостроение. Сочетанное использование основных элементов указанных дисциплин позволяет создавать производственные системы для выпуска биологических препаратов, предназначенных для индикации возбудителей, диагностики, профилактики инфекционных болезней и лечения животных. Производственные предприятия биотехнологии К числу производственных предприятий относятся биофабрики, биозаводы, биокомбинаты ветеринарного, медицинского и фармацевтического профиля, осуществляющие изготовление профилактичес-ких, лечебных, диагностических препаратов, интерферонов, дрожжей, кормовых биодобавок и др. Для получения биопрепаратов в больших объемах, культивирование микроорганизмов и клеточных культур проводится с использованием крупномасштабного оборудования. История возникновения и развития биотехнологии ■ 1 этап - зарождение биотехнологии с древних времен до конца XVIII в. Археологические раскопки показывают, что ряд биотехнологических процессов зародились в древности. На территории древнейших очагов в Месопотамии, Египте сохранились остатки пекарен, пивоваренных заводов, сооруженных 4-6 тысячелетий назад. В 3 тысячелетии до н. э. шумеры изготовляли до двух десятков сортов пива. ■ В Древней Греции и Риме широкое распространение получили виноделие и изготовление сыра. В основе пивоварения и виноделия лежит деятельность дрожжевых грибков, сыроделия молочнокислых бактерий, сычужного фермента Получение льняного волокна происходит с разрушением пектиновых веществ микроскопическими грибами и бактериями. Иными словами, зарождение биотехнологии тесно связано с сельским хозяйством, переработкой растениеводческой и животноводческой продукции. В Древней Греции и Риме широкое распространение получили виноделие и изготовление сыра. В основе пивоварения и виноделия лежит деятельность дрожжевых грибков, сыроделия - молочнокислых бактерий, сычужного фермента Получение льняного волокна происходит с разрушением пектиновых веществ микроскопическими грибами и бактериями. Иными словами, зарождение биотехнологии тесно связано с сельским хозяйством, переработкой растениеводческой и животноводческой продукции. ■ 2 этап (XIX - первая половина XX в.) - становление биотехнологии как науки. Этот этап связан с началом бурного развития биологических наук: генетики, микробиологии, вирусологии, цитологии, физиологии, эмбриологии. На рубеже XIX и XX вв. в ряде стран создаются первые биогазовые установки, в которых отходы животноводства и растениеводства под действием микроорганизмов превращались в биогаз (метан) и удобрение. В конце 40-х годов XX, века, с организацией крупномасштабного производства антибиотиков стала развиваться микробиологическая промышленность. 2 этап (XIX первая половина XX в.) - становление биотехнологии как науки. Этот этап связан с началом бурного развития биологических наук: генетики, микробиологии, вирусологии, цитологии, физиологии, эмбриологии. На рубеже XIX и XX вв. в ряде стран создаются первые биогазовые установки, в которых отходы животноводства и растениеводства под действием микроорганизмов превращались в биогаз (метан) и удобрение. В конце 40-х годов XX, века, с организацией крупномасштабного производства антибиотиков стала развиваться микробиологическая промышленность. ■ ■ Антибиотики нашли широкое применение не только в медицине, но и в сельском хозяйстве для лечения животных и растений, в качестве биодобавок в корма. Были созданы высокоэффективные формы с помощью мутаций. Возникли предприятия, на которых с помощью микроорганизмов производились аминокислоты, витамины, органические кислоты, ферменты. В конце 60-х годов получила развитие технология иммобилизованных ферментов. Антибиотики нашли широкое применение не только в медицине, но и в сельском хозяйстве для лечения животных и растений, в качестве биодобавок в корма. Были созданы высокоэффективные формы с помощью мутаций. Возникли предприятия, на которых с помощью микроорганизмов производились аминокислоты, витамины, органические кислоты, ферменты. В конце 60-х годов получила развитие технология иммобилизованных ферментов. ■ 3 этап (с середины 70-х годов XX века) - ознаменовался развитием биотехнологии в различных направлениях с помощью методов генной и клеточной инженерии. Формальной датой рождения современной биотехнологии считается 1972г., когда была создана первая рекомбинативная (гибридная) ДНК, путем встраивания в нее чужеродных генов. До этого момента использовались, главным образом, физические и химические мутагены с целью создания форм микроорганизмов, синтезирующих ценные для человека вещества в 5 - 10 раз интенсивнее, по сравнению с исходными штаммами. ■ • Основные события 2-го и 3-го этапов: • 1970 г. – В. Арбер, Х. Смит, Д. Натан выделили первую рестрицирующую эндонуклеазу (НП) • 1972 г. – Хар Гобинд Корана с соавторами синтезировали полноразмерный ген тРНК • 1973 г. – Герберт Бойер, Стэнли Коэн, начало технологии рекомбинантных ДНК (НП) • 1975 г.- Георг Кëлер, Сезар Мильштейн, получение моноклональных антител • 1976 г. – Волтер Гилберт и Алан Максам, Фредерик Сенгер разработали методы определения нуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот (НП) • 1978 г. - первый выпуск человеческого инсулина, полученного с помощью E. coli • 1988 г. - создан метод ПЦР, Кэри Мюллис (НП) • 1990 г. - официально начат проект "Геном человека" • 1994-95 гг. - опубликованы подробные генетические и физические карты хромосом человека • 1996 г. - определена нуклеотидная последовательность всех хромосом эукариотического микроорганизма Saccharomyces cerevisiae • 1997 г. - клонировано млекопитающее из дифференцированной соматической клетки Основные направления ветеринарной биотехнологии Повышение эффективности и ускорение селекционного процесса Повышение коэффициента размножаемости самок ■ Сохранение ценных мутантных генов малых популяций генофонда исчезающих животных ■ Получение потомков от бесплодных, но генетически ценных по генотипу животных ■ Выявление вредных рецессивных ■ Выявление вредных рецессивных мутаций генов и хромосомных аномалий ■ Повышение устойчивости к заболеваемости ■ Борьба с болезнями путём замены экспорта и импорта замороженных и законсервированных эмбрионов ■ Акклиматизация пород иностранного происхождения ■ Получение монозигот близнецов ■ Повышение плодовитости коров, путём пересадки половин эмброионов в оба рога матки ■ Объекты и методы биотехнологии ■ Основными объектами биотехнологии являются: вирусы, бактерии, грибы, протозойные организмы, клетки (ткани) растений, животных и человека, некоторые вещества биологического происхождения (например, ферменты, простагландины, витамины, нуклеиновые кислоты и др.), молекулы. ■ В этой связи можно сказать, что объекты биотехнологии относятся либо к микроорганизмам, либо к растительным и животным клеткам. В свою очередь микроорганизм можно охарактеризовать как систему экономного, сложнейшего, компактного, целенаправленного синтеза, устойчиво и активно протекающего при оптимальном поддержании всех необходимых параметров. ■ ■ ■ ■ ■ Микробиологические процессы имеют ряд особенностей: - процесс микробного синтеза, как правило, является частью многостадийного производства, причем часто продукт биосинтеза не является товарным и подлежит дальнейшей переработке; - при культивировании микроорганизмов обычно необходимо поддерживать асептические условия, что требует стерилизации оборудования, коммуникаций, сырья и др.; - культивирование микроорганизмов осуществляют в гетерогенных многообразных системах, физико-химические свойства которых в ходе процесса могут существенно изменяться; - технологический процесс характеризуется высокой вариабельностью из-за наличия в системе живого биологического объекта, т.е. популяции микроорганизмов; - сложность биохимических механизмов регуляции роста микроорганизмов и биосинтеза продуктов метаболизма, ферментативный характер регуляции; ■ - сложность и, в большинстве случаев, неопределенность химического состава производственных питательных сред; ■ - автокаталитический характер процесса, то есть влияние образующихся продуктов (в том числе биомассы) на скорость протекания процесса; ■ - относительно низкие концентрации субстратов, продуктов и скорости реакций; ■ - способность процесса к саморегулированию; ■ - условия, оптимальные для роста микроорганизмов и для биосинтеза целевых продуктов, не всегда совпадают. ■ Методы биотехнологии ■ Основными методами биотехнологии являются такие как крупномасштабное, глубинное культивирование биообъектов в периодическом, полунепрерывном или непрерывном режиме; культивирование биообъектов в специальных аппаратах, например, биореакторах (ферментерах) различной конструкции и емкости, с применением стерильного оборудования; выращивание клеток растительных и животных тканей в особых условиях (глубинное культивирование суспензионные культур клеток в специальных аппаратах-культиваторах, культивирование культур клеток в стеклянных роллерах и др). Применение методов биотехнологии определяется двумя уровнями: клеточным и молекулярным, в зависимости от используемого биобъекта. ■ В первом случае дело имеют: ■ с бактериальными клетками (при получении вакцин, сывороток, антигенов, аллергенов и др.); ■ актиномицетами (при получении антибиотиков); ■ микромицетами (при получении органических кислот); ■ животными клетками (при изготовлении противовирусных вакцин); ■ клетками человека (при изготовлении интерферона и др). ■ ■ Во втором случае дело имеют с молекулами, например, с нуклеиновыми кислотами в так называемой «рекомбинантной ДНК - биотехнологии», которая базируется на методологии генной инженерии; некоторыми ферментами (ферментными системами), например, протеазами, применяемыми в моющих средствах, или линеазами - для модификации вкуса молочных продуктов и т.д. Однако необходимо помнить, что в начальной или конечной стадии биотехнологического процесса молекулярный уровень трансформируется в клеточный. Так, ферменты продуцируются клетками и при генноинженерных разработках носителем новой генетической информации становится также клетка. ■ Существуют закономерности роста и размножения клеток. Накопление биомассы - это начальная стадия биотехнологических процессов. ■ Важное значение имеет метаболизм прокариотов и эукариотов. Экзо- и эндометаболиты как целевые продукты биотехнологии. Переработка биомассы как способ получения клеточных компонентов и ■ эндометаболитов. Современные способы комплексной переработки клеточной биомассы. ■ Получение экзометаболитов – основа производства биологически активных веществ. Значение методов биосинтеза и биотрансформации. Закономерности выделения метаболитов клетками разных видов. ■ Необходимо иметь представление о научных и практических основах регулирования процессов биосинтеза и трансформации. Взаимосвязь биологических, химических и физико-химических методов в биотехнологических процессах и использование их в безотходных технологиях. ■ Выделение ферментов – основа высокоэффективных процессов технической биохимии и органического синтеза. Перспективы применения ферментов в ветеринарии и медицине для диагностических целей, в пищевой и комбикормовой промышленности - для получения высококачественных продуктов питания и сбалансированных кормов. ■ Особое внимание необходимо уделять требованиям к чистоте, потребительским свойствам БАВ и контролю процесса их производства. ■ Необходимо запомнить, что клеточная и генная инженерия являются основой прогресса в биотехнологии. Отметьте основные достижения и перспективы ее развития. ■ Важную роль играют способы получения клеточных культур растений, животных, генетически модифицированных микроорганизмов с заданными свойствами для целей биосинтеза особо дефицитных и ценных метаболитов. ■ Гибридомная технология получения биологически активных веществ. Необходимо отработать практические навыки получения гибридом и моноклональных антител, иметь представление о ■ специфике генно-инженерных и гибридомных работ. Инженерно-техническое обеспечение биотехнологических процессов ■ Оборудование, используемое для производства и контроля качества ветеринарных препаратов, должно конструироваться и размещаться так, чтобы максимально облегчить его подготовку к работе, эксплуатацию и обслуживание. Вид, размер и характеристики биотехнологического оборудования и контрольно-измерительных приборов должны соответствовать проводимым технологическим процессам. Система стерилизации Генетический материал Биомасса микроорганизма Среда с продуктом Среда Вода Энергия Отходы производства На переработку ПРИНЦИПИАЛЬНАЯ СХЕМА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА БИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКТОРЫ Ферментеры для прерывистого культивирования Ферментер непрерывного культивирования БИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКТОРЫ Помещения для получения продукции от животных Помещения для получения продукции из растений Dactylopius coccus - кармин БИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКТОРЫ Загружаемые компоненты Генетический материал Контроль параметров культивирования Комбикорм Вода Воздух (О2) Энергия Выходные компоненты Яйцо куриное Помет Отработанны й воздух (СО2) ■ ■ ■ ■ ■ ■ К конструкции оборудования биопредприятий предъявляются следующие требования: - поверхности оборудования, соприкасающиеся с исходным сырьем, полупродуктами или с готовым продуктом, должны быть гладкими и изготовленными из нетоксичного, стойкого к коррозии материала, который не реагирует с используемым сырьем или материалами и выдерживает обработку дезинфицирующими средствами; - все детали оборудования, контактирующие с продуктами производства, должны быть съемными для облегчения их мойки, обработки дезинфицирующими средствами или стерилизации; - оборудование не должно загрязняться материалами, используемыми для его эксплуатации (например, смазочными веществами) во избежание ухудшения качества и загрязнения целевых продуктов; - все передающие устройства (транспортеры, цепные передачи, приводы трансмиссии) должны быть закрыты или огорожены; - бункеры, емкости и аналогичное оборудование должны быть закрыты. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ОРГАНИЗМОВ Рост организмов в среде и лимиты культивирования Динамика роста популяции организмов Рост организма Выделение метаболита I – лаг-фаза; II – фаза ускорения роста; III – фаза экспоненциального роста; IV – фаза замедления роста; V – фаза стационарная; VI – фаза отмирания культуры КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ОРГАНИЗМОВ Рост организмов в среде и лимиты культивирования Лимиты роста вирусов: Достигнут лимит • по площади монослоя (культыры клеток) или по массе эмбриона; Лимиты роста культуры бактерий: • по углероду (С); • по азоту (N); • по энергии (Е); Лимиты роста животных: • по белку; • по энергии; • по объему кислорода; • и др. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ОРГАНИЗМОВ Рост организмов в среде и лимиты культивирования Масса исходных веществ равна массе продуктов реакции. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ОРГАНИЗМОВ Рост организмов в среде и лимиты культивирования Уравнение (модель) Моно S - концентрация субстрата x - концентрация клеток в культиваторе S0 -концентрация субстрата, поступившего в культиватор D - скорость протока (разбавления) культуры 1/a - «экономический коэффициент», показывающий, какая часть поглощенного субстрата идет на приращение биомассы. Поясним смысл членов, входящих в правые части уравнений μ(S)x - прирост биомассы за счет поглощения субстрата, --Dx - отток биомассы из культиватора. -aμ(S)x - количество субстрата, поглощенного клетками культуры, DS0 - приток субстрата в культиватор, -DS - отток неиспользованного субстрата из культиватора. Скорость роста биомассы предполагается зависящей только от концентрации субстрата в соответствии с формулой Моно СОЗДАНИЕ И ПРОИЗВОДСТВО БИОПРЕПАРАТА Общая схема создания и производства биопрепарата 1. Выделение и клонирование штаммов микроорганизмов, сортов растений, пород и кроссов животных (продуцентов), отвечающих требованиям продуктивности и конверсии субстратов. 2. Экспериментальное определение констант роста, конверсии субстратов и биосинтеза целевых продуктов. Подбор оптимальных параметров культивирования продуцента. 3. Создание или подбор технологического оборудования, отвечающего требованиям культивирования продуцента. 4. Культивирование продуцента и получение целевого продукта. 5. Сертификация продукта. Подготовка к его реализации. 6. Сертификация продуцента. Организация патентной защиты сделанных изобретений и полезных моделей. 7. Публикация результатов работы и реклама технологии производства и целевого продукта. СОЗДАНИЕ И ПРОИЗВОДСТВО БИОПРЕПАРАТА 1. Выделение и клонирование штаммов микроорганизмов, сортов растений, пород и кроссов животных (продуцентов), отвечающих требованиям продуктивности и конверсии субстратов. ВИРУСЫ ПРОКАРИОТЫ ГРИБЫ КЛЕТКИ РАСТЕНИЙ И ЖИВОТНЫХ ВЫСШИЕ РАСТЕНИЯ НИЗШИЕ И ВЫСШИЕ ЖИВОТНЫЕ ВОДОРОСЛИ ПРОСТЕЙШИЕ МИКРОКОСМЫ, МЕЗОКОСМЫ, МАКРОКОСМЫ СОЗДАНИЕ И ПРОИЗВОДСТВО БИОПРЕПАРАТА 1. Выделение и клонирование штаммов микроорганизмов, сортов растений, пород и кроссов животных (продуцентов), отвечающих требованиям продуктивности и конверсии субстратов. Поиск новых объектов в природе Отбор и селекция Получение мутантов Создание трансгенных организмов Создание межвидовых гибридов Создание искусственных видов Изоляция ферментных систем Создание белков с заданными свойствами СОЗДАНИЕ И ПРОИЗВОДСТВО БИОПРЕПАРАТА 1. Выделение и клонирование штаммов микроорганизмов, сортов растений, пород и кроссов животных (продуцентов), отвечающих требованиям продуктивности и конверсии субстратов. Корниш Белый Плимутрок Родители Бройлеры (финальный гибрид) СОЗДАНИЕ И ПРОИЗВОДСТВО БИОПРЕПАРАТА 2. Экспериментальное определение констант роста, конверсии субстратов и биосинтеза целевых продуктов. Подбор оптимальных параметров культивирования продуцента. Бройлеры (финальный гибрид) Бройлеры (финальный гибрид) СОЗДАНИЕ И ПРОИЗВОДСТВО БИОПРЕПАРАТА 3. Создание или подбор технологического оборудования, отвечающего требованиям культивирования продуцента. 4. Культивирование продуцента и получение целевого продукта. Бройлерная птицефабрика СОЗДАНИЕ И ПРОИЗВОДСТВО БИОПРЕПАРАТА 5. Сертификация продукта. Подготовка к его реализации. 6. Сертификация продуцента. Организация патентной защиты сделанных изобретений и полезных моделей. 7. Публикация результатов работы и реклама технологии производства и целевого продукта. Продуцент Продукция СЫРЬЕ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИИ Любые источники углерода, азота, серы, фосфора и др. РАСТИТЕЛЬНОЕ СЫРЬЕ УГЛЕВОДОРОДНОЕ СЫРЬЕ ОТХОДЫ ОРГАНИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПРОДУКТЫ БИОТЕХНОЛОГИИ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ (антибиотики, ферменты, вакцины, гормоны) НУТРИЕНТЫ (белки, витамины) ТОПЛИВО (этанол, метан, водород) ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ (хлеб, спиртные напитки, кисломолочные продукты) ОЧИСТКА ВОД, РЕКУЛЬТИВАЦИЯ ПОЧВ КОМПЛЕКСНЫЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОИЗВОДСТВА Концепция БиоПерерабатывающего Завода (БПЗ) ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУКТОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ■ Выделение и консервация эндометаболитов Деструкция Клеток продуцента Отжим Осаждение хим. методами Сепарирование Концентрирование 0,02μ Высушивание Фильтрация Замораживание ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУКТОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ■ Выделение и консервация экзометаболитов Поточные системы биосинтеза Осаждение хим. методами Сепарирование Концентрирование Высушивание Фильтрация Замораживание 0,02μ 0,22μ Курс биотехнологии. Занятие 1 47 ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУКТОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ■ Регулирование биосинтеза и трансформации Пульт управления • Термостатирование • Контроль давления • Контроль рН • Контроль О2 • Контроль уровня среды • и др. Программа биосинтеза • Вкл./откл. нагрев • Вкл./откл. охлаждение • Вкл./откл. клапан давления • Вкл./откл. насос с содой • Вкл./откл. воздух • Вкл./откл. насос со средой ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЕ ПРОДУКТОВ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ■ Трансформация отходов жизнедеятельности ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУКТОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА Твёрдофазный биосинтез (1977- 1979 гг.) ■ Blakeslea trispora KP 74+ и КР 86■ β-каротин
