Антитела (IgG) к цитомегаловирусу (ИФА) Anti

Anti-CMV ELISA (IgG), “EUROIMMUN”
1
_____________________________________________________________________________________________________
Антитела (IgG) к цитомегаловирусу (ИФА)
Anti-CMV ELISA (IgG)
Иммуноферментный тест для определения антител класса IgG к CMV в сыворотке или плазме крови
Номер по каталогу:
ЕI 2570-9601 G (набор на 96 определений)
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор Anti-CMV ELISA (IgG) предназначен для полуколичественного или количественного определения in
vitro IgG-антител человека к цитомегаловирусу в сыворотке и плазме крови.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Anti-CMV ELISA (IgG) основан на методе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Данный набор
содержит стрипы, каждый из которых состоит из восьми отламываемых лунок, покрытых антигенами
цитомегаловируса (CMV). На первой стадии реакции разведенные образцы пациентов инкубируют в лунках.
Если образцы положительные, специфические IgG-антитела (а также IgA- и IgM-антитела) будут
связываться с антигенами на твердой фазе. Для определения связанных антител проводится вторая
инкубация с использованием меченных ферментом антител к IgG человека (ферментный конъюгат),
которые затем обеспечивают развитие цветной реакции.
МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ
Компонент
1.
Лунки микропланшета
покрытые антигенами: 12 стрипов 8луночных (разделяемых на отдельные
лунки), в рамке-держателе, готовы к
использованию
2.
Калибратор 1
200 ОЕд/мл (IgG человека), готов к
использованию
3.
Калибратор 2
20 ОЕд/мл (IgG человека), готов к
использованию
4.
Калибратор 3
2 ОЕд/мл (IgG человека), готов к
использованию
5.
Положительный контроль
(IgG, человека), готов к использованию
6.
Отрицательный контроль
(IgG, человека), готов к использованию
7.
Ферментный конъюгат
Антитела кролика к IgG человека,
конъюгированные с пероксидазой хрена;
готов к использованию
8.
Буфер для образцов
готов к использованию
9.
Промывочный буфер
10×концентрат
10.
Раствор хромогена/субстрата
ТМБ/Н2О2, готов к использованию
11.
Стоп-реагент
0,5 М серная кислота, готов к
использованию
12.
Инструкция по применению
13.
Протокол с заданными величинами
Серия
Цвет
–
Количество
12 × 8
темнокрасный
1 × 2,0 мл
CAL 1
красный
1 × 2,0 мл
CAL 2
светлокрасный
1 × 2,0 мл
CAL 3
синий
1 × 2,0 мл
POS CONTROL
зеленый
1 × 2,0 мл
NEG CONTROL
зеленый
1 × 12 мл
CONJUGATE
голубой
1 × 100 мл
бесцветный
1 × 100 мл
бесцветный
1 × 12 мл
SUBSTRATE
бесцветный
1 × 12 мл
STOP SOLUTION
–
–
1 буклет
1 протокол
Для in vitro диагностики
Обозначение
STRIPS
SAMPLEBUFFER
WASHBUFFER 10×
Температура хранения
Невскрытый набор
использовать до
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2006
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-CMV ELISA (IgG), “EUROIMMUN”
2
_____________________________________________________________________________________________________
Хранение и стабильность набора: Набор следует хранить при температуре от +2 °С до +8 °С. Не
замораживать. Невскрытые компоненты набора сохраняют стабильность в течение всего указанного срока
годности набора.
Удаление отходов: Образцы пациентов, калибраторы, контроли и стрипы после инкубации следует
рассматривать как инфицированные отходы и обращаться с ними соответствующим образом. Все реагенты
следует удалять в соответствии с действующими официальными инструкциями.
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ
Примечание: Температуру всех реагентов необходимо довести до комнатной (от +18 °С до +25 °С) в
течение 30 минут перед использованием. После первого использования реагенты сохраняют стабильность в
течение указанного срока годности, если они хранятся при температуре от +2 °С до +8 °С и защищены от
микробной контаминации. Прочие сведения о стабильности отдельных реагентов указаны ниже.
Лунки, покрытые антигенами: Готовы к использованию. Вскройте защитную упаковку планшета,
расстегнув имеющуюся на пакете самоуплотняющуюся застежку. Во избежание конденсации влаги внутри
лунок, не вскрывайте пакет до тех пор, пока он не нагреется до комнатной температуры. Отломив
необходимое количество лунок, остальные неиспользованные лунки немедленно вложите вновь в ту же
защитную упаковку и плотно закройте ее на застежку (не вынимайте из упаковки пакетик с
влагопоглотителем).
После первого вскрытия упаковки плотно упакованные вновь лунки с антигенами можно хранить минимум 4
месяца в сухом месте при температуре от +2 °С до +8 °С.
Калибраторы и контроли: Готовы к использованию. Тщательно перемешать перед использованием.
Ферментный конъюгат: Готов к использованию. Тщательно перемешать перед использованием.
Буфер для образцов: Готов к использованию.
Промывочный буфер: Поставляется в виде 10-кратного концентрата. Если образовались кристаллы, их
можно растворить перед разведением буфера, нагревая концентрат до 37°С и интенсивно взбалтывая.
Необходимое количество концентрата следует отобрать из бутыли чистой пипеткой и растворить
деионизированной или дистиллированной водой (1 часть концентрированного реагента плюс 9 частей
воды).
Например, для проведения анализа на 1 стрипе: к 5 мл концентрата следует добавить 45 мл воды.
о
Готовый разведенный промывочный буфер стабилен до 1 месяца, если его хранят при температуре от +2 С
о
до +8 С и правильно используют.
Раствор хромогена/субстрата: Готов к использованию. После отбора необходимого количества реагента
из флакона немедленно вновь закройте его, так как раствор чувствителен к свету. Во время использования
раствор хромогена/субстрата должен быть бесцветным. Не используйте раствор, если он приобрел голубую
окраску.
Стоп-реагент: Готов к использованию.
Предостережение: Используемые калибраторы и контроли были проверены на антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и
вирусу гепатита С, а также на наличие HBsAg, методами иммуноферментного анализа и непрямой
иммунофлуоресценции и показали отрицательные результаты. Тем не менее, все используемые материалы
следует считать потенциально опасными и обращаться с ними, соблюдая необходимые меры
предосторожности. Некоторые реагенты содержат токсичный азид натрия. Избегайте его попадания на кожу.
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ОБРАЗЦОВ ПАЦИЕНТОВ
Материал образцов: Сыворотка или плазма (ЭДТА, гепарин или цитрат) крови человека.
Стабильность: Образцы пациентов, предназначенные для исследования этим методом, можно хранить до
о
о
14 дней при температуре от +2 С до +8 С. Разведенные образцы необходимо использовать в течение
одного рабочего дня.
Разведение образцов: Образцы пациентов разводят 1:101 буфером для образцов. Например: разведите
10 мкл сыворотки в 1,0 мл буфера для образца и тщательно перемешайте на вортексе (пипетки для этого не
подходят).
ПРИМЕЧАНИЕ: Калибраторы и контроли готовы к использованию, их разводить не надо.
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2006
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-CMV ELISA (IgG), “EUROIMMUN”
3
_____________________________________________________________________________________________________
ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ
Для полуколичественного анализа проводите одновременно с инкубацией положительного и
отрицательного контролей и образцов пациентов инкубацию калибратора 2. Для количественного
анализа проводите одновременно с инкубацией положительного и отрицательного контролей и образцов
пациентов инкубацию калибраторов 1, 2 и 3.
Инкубация с образцом (1 стадия)
Внесите по 100 мкл калибратора, положительного контроля, отрицательного контроля или разведенных
образцов пациентов в отдельные лунки планшета в соответствии с протоколом. Инкубируйте планшет при
комнатной температуре (от +18 °С до + 25 °С) в течение 30 минут.
Промывка
Ручная: Удалите жидкость из лунок и затем промойте 3 раза, используя каждый раз по 300 мкл рабочего
промывочного буфера на лунку.
Автоматическая: проводите в режиме с переполнением (установите в программе для соответствующего
автоматического вошера параметр “Overflow”, с 3-мя циклами промывки и внесением в лунки по 400 мкл
рабочего промывочного буфера.
При каждом цикле промывки после заполнения лунок буфером оставляйте планшет на 30-60 секунд и затем
опорожняйте. По окончании промывки (ручной или автоматической) тщательно удалите остатки жидкости из
лунок, энергично постукивая перевернутым планшетом по впитывающей бумаге.
Примечание: Остаточная жидкость (больше 10 мкл), обычно остающаяся в лунках после промывки, может
помешать действию субстрата и снизить оптическую плотность (ОП) раствора в лунках. Недостаточно
полное промывание (например, менее 3 раз, или при маленьком объеме добавляемого промывочного
буфера, или при коротком времени выдерживания буфера в лунках) может в результате привести к
завышенным величинам ОП в лунках.
Инкубация с конъюгатом (2 стадия)
Внесите в каждую лунку по 100 мкл ферментного конъюгата (меченные пероксидазой антитела к IgG
человека). Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (от +18 °С до + 25 °С).
Промывка
Удалите жидкость из лунок. Промойте, как описано ранее.
Инкубация с субстратом (3 стадия)
Внесите в каждую лунку по 100 мкл раствора хромогена/субстрата. Инкубируйте планшет в течение 15
минут при комнатной температуре (от +18 °С до +25 °С) в защищенном от прямого солнечного света месте.
Остановка реакции
Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента (в той же последовательности и с такой же скоростью,
как вносился раствор хромогена/субстрата).
Измерение
Фотометрическое измерение интенсивности окрашивания раствора в лунках проводят при основной длине
волны 450 нм и при референтной длине волны между 620 нм и 650 нм в течение 30 минут после
добавления стоп-реагента. Перед измерением слегка покачайте планшет, чтобы добиться гомогенного
распределения раствора.
ПРОТОКОЛ РАЗМЕЩЕНИЯ НА ПЛАНШЕТЕ ОБРАЗЦОВ И КОНТРОЛЕЙ
1
2
3
4
5
6
7
8
9
A
C2
P6
P 14
P 22
C1
P4
P 12
B
Рos
P7
P 15
P 23
C2
P5
P 13
C
Neg
P8
P 16
P 24
C3
P6
P 14
D
P1
P9
P 17
pos P 7
P 15
E
P2
P 10
P 18
neg P 8
P 16
F
P3
P 11
P 19
P1 P9
P 17
G
P4
P 12
P 20
P 2 P 10
P 18
H
P5
P 13
P 21
P 3 P 11
P 19
10
P 20
P 21
P 22
P 23
P 24
11
12
Представленный выше протокол представляет собой пример размещения на планшете проб:
- на стрипах 1-4 - для полуколичественного определения IgG-антител в 24 образцах пациентов (от Р 1 до Р
24);
- на стрипах 7-10 - для количественного определения IgG-антител в 24 образцах пациентов (от Р 1 до Р 24).
В соответствующие лунки вносят и инкубируют калибраторы (от С1 до С3), положительный контроль (pos.),
отрицательный контроль (neg.), а также образцы пациентов (Р 1 – Р 24). Достоверность анализа можно
увеличить, размещая и измеряя каждую анализируемую пробу в двух параллельных лунках (дубликатах).
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2006
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-CMV ELISA (IgG), “EUROIMMUN”
4
_____________________________________________________________________________________________________
Лунки можно отламывать от стрипов по одной. Это позволяет привести в соответствие используемое
количество лунок и количество исследуемых образцов и, таким образом, минимизировать расход реагентов.
Положительный и отрицательный контроли выполняют роли внутренних контролей для проверки
правильности процедуры тестирования. Их следует использовать при каждой постановке анализа.
РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Полуколичественный анализ:
Результаты можно оценить полуколичественно, рассчитывая отношение ОП в лунке с контрольным
образцом или в лунке с образцом пациента относительно ОП в лунке с калибратором 2. Для расчета этого
отношения используйте следующую формулу:
Отношение (RATIO) =
ОП контрольного образца или образца пациента
ОП калибратора 2
Фирма EUROIMMUN рекомендует следующую интерпретацию результатов:
Отношение (RATIO) < 0,8:
Отношение (RATIO) в интервале от ≥ 0,8 до < 1,1:
Отношение (RATIO) ≥ 1,1:
Отрицательный результат
Пограничный результат
Положительный результат
В случае пограничного результата необходимо взять у пациента дополнительный образец крови через 7
дней и повторить тест в параллели с первым образцом. По результатам теста обоих образцов можно делать
заключение об изменениях концентрации антител.
Количественный анализ:
На графике линейной зависимости откладывают величины ОП, измеренные для 3 калибровочных сывороток
(ось Y) против концентрации антител в этих сыворотках, выраженной в относительных единицах ОЕд/мл
(ось X). По полученным точкам проводят стандартную кривую для определения концентрации антител в
образцах пациентов. Для расчета кривой с помощью компьютера используйте способ построения по точкам
(“point-to-point”). Ниже приведен пример типичной калибровочной кривой. Не используйте ее, пожалуйста,
для определения концентрации антител в образцах пациентов.
ОП450
2,0 –
1,8 –
1,6 –
1,4 –
1,2 –
1,0 –
0,8 –
0,6 –
0,4 –
0,2 –
0,0 –
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
ОЕд/мл
Если ОП образца пациента лежит выше величины ОП для калибратора 1 (с концентрацией 200 ОЕд/мл),
результат следует выражать как “>200 ОЕд/мл”. Такой образец рекомендуется развести 1:400 и
протестировать повторно, а результат, полученный по калибровочной кривой (в ОЕд/мл), умножить на
коэффициент разведения 4.
Верхняя граница интервала нормальных значений неинфицированных людей (уровень отсечения, cut-off),
рекомендованная фирмой EUROIMMUN, составляет 20 относительных единиц (ОЕд/мл). EUROIMMUN
рекомендует следующую интерпретацию результатов:
< 16 ОЕд/мл:
от ≥ 16 до < 22 ОЕд/мл:
≥ 22 ОЕд/мл:
Отрицательный результат
Пограничный результат
Положительный результат
Для определений, проводящихся в дубликатах, следует использовать в расчетах среднее значение двух
величин. Если эти две величины существенно расходятся между собой, анализ образца следует повторить.
Для установления диагноза всегда, кроме результатов серологических исследований, необходимо
учитывать клинические симптомы пациента.
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2006
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-CMV ELISA (IgG), “EUROIMMUN”
5
_____________________________________________________________________________________________________
ХАРАКТЕРИСТИКИ ТЕСТА
Калибровка: Так как в настоящее время не существует Международной референтной сыворотки с
антителами к CMV, калибровка выполняется в относительных единицах (ОЕд), которые позволяют измерить
относительную концентрацию антител в сыворотке или плазме. Для калибровки применяется внутренняя
референтная сыворотка, используемая для оценки тест-системы.
Для каждой группы тестов, выполненных на наборах определенной серии, величины ОП калибраторов и
относительные единицы и/или отношения (RATIO), определенные для положительного и отрицательного
контролей, должны лежать в границах, установленных для наборов этой серии. Протокол с установленными
значениями включается в поставку набора. Обнаружение отклонения контрольных значений от указанных в
спецификации будет свидетельствовать о неправильной постановке анализа; в этом случае тест следует
повторить.
Активность фермента, используемого в составе набора, зависит от температуры, поэтому величины ОП
могут варьировать, если не используется термостат. Чем выше температура воздуха в помещении во время
инкубации с субстратом, тем выше величины ОП. Сходные изменения происходят и со временем инкубации.
Однако таким же воздействиям подвергается и сыворотка калибратора, поэтому при расчете результатов
возможные колебания в основном компенсируются.
Антиген: Источником антигенов являются инактивированные лизаты клеток MRC-5, инфицированных
штаммом CMV “AD169”.
Линейность: Линейность теста исследовали, используя серию разведений сыворотки пациента с высокой
концентрацией антител. Тест Anti-CMV ELISA (IgG) линеен в пределах интервала измерения 2 – 200
ОЕд/мл.
Аналитическая чувствительность: Аналитическая чувствительность – это величина, равная 3SD образца,
не содержащего аналита, и представляет собой наименьший определяемый титр антител. Аналитическая
чувствительность теста Anti- CMV ELISA (IgG) составляет приблизительно 1 ОЕд/мл.
Перекрестная реактивность: Качество используемого антигена обеспечивает высокую специфичность
ИФА. Данный иммуноферментный тест не показал наличия перекрестной реактивности.
Вещества, мешающие определению: Проведению анализа не мешали образцы с признаками гемолиза,
липемические и иктерические образцы с концентрациями гемоглобина вплоть до 10 мг/мл, триглицеридов –
до 20 мг/мл и билирубина – до 0,4 мг/мл.
Воспроизводимость: Воспроизводимость теста исследовали, определяя коэффициент вариации (CV)
результатов анализа трех сывороток с концентрациями антител, попадающими на разные участки
калибровочной кривой. Величины CV внутри одного опыта определяли из 20 параллельных измерений
каждой сыворотки. Величины CV в разных опытах получали, проводя по 4 параллельных измерения каждой
сыворотки в течение 6 различных дней.
Вариабельность внутри одного опыта, n = 20
Сыворотка
Среднее
CV
(ОЕд/мл)
(%)
1
19
4,2
2
57
5,4
3
165
4,5
Вариабельность в разных опытах, n = 4 × 6
Сыворотка
Среднее
CV
(ОЕд/мл)
(%)
1
25
11,2
2
66
8,5
3
183
5,7
Специфичность и чувствительность: Образцы от 92 пациентов (европейского происхождения)
исследовали, используя данный набор EUROIMMUN Anti-CMV ELISA (IgG) и другой ИФА-набор в качестве
референтного метода. Специфичность составила 100%, а чувствительность – 98,4%. Значения трех
образцов попадали в интервал пограничных значений и не были включены в расчеты.
Референтный интервал: Уровни антител (IgG) к CMV анализировали, используя ИФА-набор фирмы
EUROIMMUN на панели 300 здоровых доноров крови. При уровне отсечения (cut-off), равном 20 ОЕд/мл,
39,7% доноров крови оказались положительными по IgG-антителам к CMV, что отражает известный процент
инфицированности взрослого населения.
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2006
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-CMV ELISA (IgG), “EUROIMMUN”
6
_____________________________________________________________________________________________________
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Обычно у взрослых людей CMV-инфекция протекает без типичных симптомов. Тем не менее, она
затрагивает почти все органы, и может сопровождаться длительной лихорадкой на фоне гепатита и
пневмонии. Особое значение имеет перинатальная цитомегаловирусная инфекция, которая в частности
является причиной поражений в печени, селезенке и центральной нервной системе. Наиболее частой
формой заболевания является инфекционный мононуклеоз. Около 1% смертных случаев при
цитомегаловирусной инфекции связано с инфицированием в утробе и характеризуется наличием
специфических антител класса IgM.
По ходу заболевания в сыворотке почти всех пациентов обнаруживаются антитела к цитомегаловирусу. В
результате развивается нормальный пожизненный иммунитет. В популяции распространенность инфекции
на 80% затрагивает взрослых людей. Однако инфекция может реактивироваться в раннем возрасте, в
случае ослабления механизмов иммунной защиты организма. Серонегативным пациентам с напряженным
состоянием иммунной системы (раковые больные, трансплантационные пациенты) часто бывает показана
пассивная иммунизация концентратами специфических иммуноглобулинов. Однако, такие пациенты и
младенцы на искусственном вскармливании (особенно новорожденные) ни в коем случае не должны
получать препараты крови от доноров крови, инфицированных CMV (серопозитивных по антителам к CMV).
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке.
Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования
сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см.
внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо
руководствуйтесь оригиналом инструкции.
Anti-CMV_ ELISA_EI_2570-9601 G - rus.doc
04.04.2006 18:03 Оригинал EI_2570G_A_UK_C02.doc – Version: 26.10.2005
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2006
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru