Антиген Scl-70 (IgG) (Anti-Scl

Anti-Scl-70 ELISA (IgG), EUROIMMUN AG
1
_____________________________________________________________________________________________________
Регистрационное удостоверение ФС №2005/1125 от 18.08.2005 г.
Антиген Scl-70 (IgG) (Anti-Scl-70 ELISA (IgG))
Иммуноферментный тест для определения IgG-антител к антигену Scl-70 в сыворотке и плазме крови
человека
Номер по каталогу: ЕА 1599-9601 G
Набор рассчитан на 96 определений
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор Anti-Scl-70 ELISA (IgG) предназначен для полуколичественного или количественного определения in
vitro человеческих аутоантител класса IgG к антигену Scl-70 в сыворотке и плазме крови.
ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ
Прогрессирующий системный склероз.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Тест Anti-Scl-70 ELISA (IgG) основан на методе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Набор
содержит двенадцать 8-луночных стрипов, разделяемых на отдельные лунки, каждая из которых покрыта
очищенным антигеном Scl-70. На первой стадии реакции разведенные образцы пациентов инкубируют в
лунках. Если образцы положительные, специфические IgG-антитела (а также IgA- и IgM-антитела) будут
связываться с антигенами на твердой фазе. Для определения связанных антител проводится вторая
инкубация с использованием меченных ферментом антител к IgG человека (ферментный конъюгат),
которые обеспечивают взаимодействие субстрата и хромогена с появлением окраски.
МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Компонент
Лунки микропланшета
покрытые антигеном: 12 стрипов 8-луночных
(разделяемых на отдельные лунки),
в рамке-держателе; готовы к использованию
Калибратор 1
200 ОЕд/мл (IgG, человеческий), готов к использованию
Калибратор 2
20 ОЕд/мл (IgG, человеческий), готов к использованию
Калибратор 3
2 ОЕд/мл (IgG, человеческий), готов к использованию
Положительный контроль
(IgG человеческий), готов к использованию
Отрицательный контроль
(IgG человеческий), готов к использованию
Ферментный конъюгат
Кроличьи антитела к IgG человека, конъюгированные с
пероксидазой хрена; готов к использованию
Буфер для образцов
готов к использованию
Промывочный буфер
10×концентрат
Раствор хромогена/субстрата
ТМБ/Н2О2, готов к использованию
Стоп-реагент
0,5 М серная кислота, готов к использованию
Инструкция по применению
Протокол с заданными величинами
Серия
Цвет
Количество
–
12 × 8
темнокрасный
красный
1 × 2,0 мл
светлокрасный
синий
1 × 2,0 мл
1 × 2,0 мл
зеленый
1 × 2,0 мл
зеленый
1 × 12 мл
голубой
1 × 100 мл
бесцветный
1 × 100 мл
бесцветный
1 × 12 мл
бесцветный
1 × 12 мл
–
–
1 буклет
1 протокол
Обозначение
Температура хранения
Для in vitro диагностики
Невскрытый набор использовать до
STRIPS
CAL 1
1 × 2,0 мл
CAL 2
CAL 3
POS CONTROL
NEG CONTROL
CONJUGATE
SAMPLEBUFFER
WASHBUFFER 10×
SUBSTRATE
STOP SOLUTION
Хранение и стабильность набора
Набор следует хранить при температуре от +2 °С до +8 °С. Не замораживать. Невскрытые компоненты
набора сохраняют стабильность в течение всего указанного срока годности набора.
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Scl-70 ELISA (IgG), EUROIMMUN AG
2
_____________________________________________________________________________________________________
Утилизация отходов
Образцы пациентов, калибраторы, контроли и стрипы после инкубации следует рассматривать, как
инфицированные отходы, и обращаться с ними соответствующим образом. Все реагенты следует
утилизировать в соответствии с действующими официальными инструкциями.
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ
Примечание: Перед использованием все реагенты необходимо прогреть до комнатной температуры (от +18
°С до +25 °С) в течение 30 минут. После первого использования реагенты сохраняют стабильность в
течение указанного срока годности, если они хранятся при температуре от +2 °С до +8 °С и защищены от
микробной контаминации. Прочие сведения о стабильности отдельных реагентов указаны ниже.
Лунки, покрытые антигенами: Готовы к использованию. Вскройте защитную упаковку планшета,
расстегнув имеющуюся на пакете самоуплотняющуюся застежку. Во избежание конденсации влаги внутри
лунок, не вскрывайте пакет до тех пор, пока он не прогреется до комнатной температуры. Отломив
необходимое количество лунок, остальные неиспользованные лунки немедленно вложите вновь в ту же
защитную упаковку и плотно закройте ее на застежку (не вынимайте из упаковки пакетик с
влагопоглотителем).
После первого вскрытия упаковки плотно упакованные вновь лунки с антигенами можно хранить минимум 4
месяца в сухом месте при температуре от +2 °С до +8 °С.
Калибратор и контроли: Готовы к использованию. Необходимо тщательно перемешать перед
использованием.
Ферментный конъюгат: Готов к использованию. Необходимо тщательно перемешать перед
использованием.
Буфер для образцов: Готов к использованию.
Промывочный буфер: Поставляется в виде 10-кратного концентрата. Если образовались кристаллы, их
можно растворить перед разведением буфера, нагревая концентрат до 37°С и интенсивно взбалтывая.
Необходимое количество концентрата следует отобрать из бутыли чистой пипеткой и разбавить
деионизированной или дистиллированной водой (1 часть концентрированного реагента плюс 9 частей
воды).
Например, для проведения анализа на 1 стрипе: к 5 мл концентрата следует добавить 45 мл воды.
Готовый разведенный промывочный буфер стабилен до 4 недель при хранении +2 оС - +8 оС и правильном
использовании.
Раствор хромогена/субстрата: Готов к использованию. После отбора необходимого количества реагента
из флакона немедленно вновь закройте его, так как раствор чувствителен к свету. Во время использования
раствор хромогена/субстрата должен быть бесцветным. Не используйте раствор, если он приобрел
голубую окраску.
Стоп-реагент: Готов к использованию.
Предостережение
Использованные калибраторы и контроли были проверены на антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и вирусу гепатита
С, а также на наличие HBsAg, методами иммуноферментного анализа и непрямой иммунофлуоресценции и
при этом показали отрицательные результаты. Тем не менее, все используемые материалы следует
считать потенциально опасными и обращаться с ними, соблюдая необходимые меры предосторожности.
Некоторые реагенты содержат токсический агент азид натрия. Избегайте его попадания на кожу.
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ОБРАЗЦОВ ПАЦИЕНТОВ
Материал образцов
Сыворотка или плазма (ЭДТА, гепарин или цитрат) крови человека.
Стабильность
Образцы пациентов, предназначенные для исследования этим методом, можно хранить до 14 дней при
температуре от +2 оС до +8 оС. Разведенные образцы необходимо использовать в течение одного рабочего
дня.
Разведение образцов: Образцы пациентов разводят 1:201 буфером для образцов. Например: разведите 5
мкл сыворотки в 1,0 мл буфера для образцов и тщательно перемешайте на вортексе (пипетки для этого не
подходят).
Примечание: Калибраторы и контроли готовы к использованию, их разводить не надо.
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Scl-70 ELISA (IgG), EUROIMMUN AG
3
_____________________________________________________________________________________________________
ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ
Для полуколичественного анализа одновременно с инкубацией положительного и отрицательного
контролей и образцов пациентов проводите инкубацию калибратора 2. Для количественного анализа
одновременно с инкубацией положительного и отрицательного контролей и образцов пациентов проводите
инкубацию калибраторов 1, 2 и 3.
Инкубация с образцом (1 стадия)
Внесите по 100 мкл калибраторов, положительного и отрицательного контролей или разведенных образцов
пациентов в отдельные лунки микропланшета в соответствии со схемой внесения. Инкубируйте планшет
при комнатной температуре (от +18 °С до + 25 °С) в течение 30 минут.
Промывка
Ручная: Удалите жидкость из лунок и затем промойте 3 раза, используя каждый раз по 300 мкл рабочего
промывочного буфера на лунку.
Автоматическая: проводите в режиме с переполнением (установите в программе для соответствующего
автоматического вошера параметр “Overflow”, с 3-мя циклами промывки и внесением в лунки по 400 мкл
рабочего промывочного буфера.
При каждом цикле промывки после заполнения лунок буфером оставляйте планшет на 30-60 секунд и
затем удаляйте промывочный буфер. По окончании промывки (ручной или автоматической) тщательно
удалите остатки жидкости из лунок, энергично постукивая перевернутым планшетом по впитывающей
бумаге.
Примечание: Остаточная жидкость (больше 10 мкл), остающаяся в лунках после промывки, может
помешать действию субстрата и снизить оптическую плотность (ОП) раствора в лунках. Недостаточно
полная промывка (например, менее 3 раз, или при маленьком объеме вносимого промывочного буфера,
или при коротком времени выдерживания буфера в лунках) может в результате привести к ложно
завышенным величинам ОП в лунках.
Инкубация с конъюгатом (2 стадия)
Внесите в каждую лунку по 100 мкл ферментного конъюгата (меченные пероксидазой антитела к IgG
человека). Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (от +18 °С до + 25 °С).
Промывка
Удалите жидкость из лунок. Промойте, как описано выше.
Инкубация с субстратом (3 стадия)
Внесите в каждую лунку по 100 мкл раствора хромогена/субстрата. Инкубируйте планшет в течение 15
минут при комнатной температуре (от +18 °С до +25 °С) в защищенном от прямого солнечного света месте.
Остановка реакции
Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента (в той же последовательности и с такой же скоростью,
как вносился раствор хромогена/субстрата).
Измерение
Фотометрическое измерение интенсивности окрашивания раствора в лунках проводят при основной
длине волны 450 нм и при референтной длине волны между 620 нм и 650 нм в течение 30 минут после
добавления стоп-реагента. Перед измерением слегка покачайте планшет, чтобы добиться гомогенного
распределения раствора.
СХЕМА ВНЕСЕНИЯ ОБРАЗЦОВ И КОНТРОЛЕЙ
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
C2
P6
P 14 P 22
C1
P4
P 12 P 20
B
pos
P7
P 15 P 23
C2
P5
P 13 P 21
C
neg
P8
P 16 P 24
C3
P6
P 14 P 22
D
P1
P9
P 17
pos P 7
P 15 P 23
E
P2
P 10 P 18
neg P 8
P 16 P 24
F
P3
P 11 P 19
P1 P9
P 17
G
P4
P 12 P 20
P 2 P 10 P 18
H
P5
P 13 P 21
P 3 P 11 P 19
Представленная выше схема - пример внесения проб:
- на стрипах 1-4 - для полуколичественного определения IgG-антител в 24 образцах пациентов (от Р 1 до
Р 24);
- на стрипах 7-10 - для количественного определения IgG-антител в 24 образцах пациентов (от Р 1 до Р
24).
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Scl-70 ELISA (IgG), EUROIMMUN AG
4
_____________________________________________________________________________________________________
В соответствующие лунки вносят и инкубируют калибраторы (от С1 до С3), положительный контроль (pos.),
отрицательный контроль (neg.), а также образцы пациентов (Р 1 – Р 24). Достоверность анализа можно
увеличить путем измерения оптической плотности анализируемых проб, вносимых в дубликатах.
Лунки можно отламывать от стрипов по одной. Это позволяет привести в соответствие используемое
количество лунок и количество исследуемых образцов и, таким образом, минимизировать расход
реагентов.
Положительный и отрицательный контроли играют роль внутреннего контроля для проверки правильности
процедуры тестирования. Их следует использовать при каждой постановке анализа.
РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Полуколичественный анализ
Результаты можно оценить полуколичественно, рассчитав отношение оптической плотности (ОП) в лунке с
контрольным образцом или с образцом пациента к ОП в лунке с калибратором 2. Для расчета этого
отношения используйте следующую формулу:
ОП контроля или образца пациента
= Отношение (RATIO)
ОП калибратора 2
Фирма EUROIMMUN рекомендует следующую интерпретацию результатов:
Отношение (RATIO) < 1,0:
Отрицательный результат
Отношение (RATIO) ≥ 1,0:
Положительный результат
Поглощение
Количественный анализ
На графике линейной зависимости откладывают величины ОП, измеренные для 3 калибровочных
сывороток (ось Y) против концентрации антител в этих сыворотках, выраженных в относительных единицах,
ОЕд/мл (ось X). По полученным точкам строят калибровочную кривую для определения концентрации
антител в образцах пациентов. Для построения кривой с помощью компьютера используйте способ
построения по точкам (“point-to-point”). Ниже приведен пример типичной калибровочной кривой. Не
используйте ее, пожалуйста, для определения концентрации антител в образцах пациентов.
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
20
40
60
80 100 120 140 160 180 200
ОЕд/мл
Если ОП образца пациента лежит выше величины ОП для калибратора 1 (с концентрацией 200 ОЕд/мл),
результат следует выражать как “>200 ОЕд/мл”. Такой образец рекомендуется развести 1:800 и
протестировать повторно, а полученный результат (в ОЕд/мл) умножить на фактор 4.
Верхняя граница интервала нормальных значений (уровень отсечения, cut-off), рекомендованная фирмой
EUROIMMUN, составляет 20 относительных единиц (ОЕд)/мл. EUROIMMUN рекомендует следующую
интерпретацию результатов:
< 20 ОЕд/мл:
Отрицательный результат
≥ 20 ОЕд/мл:
Положительный результат
Для определений, проводящихся в дубликатах, следует использовать в расчетах среднее значение двух
величин. Если эти две величины существенно расходятся между собой, анализ образца следует повторить.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Калибровка
Так как в настоящее время не существует Международного стандарта (референтной сыворотки для
количественного определения антител к Scl-70), калибровка выполняется в относительных единицах
(ОЕд/мл). Калибраторы теста Anti-Scl-70 ELISA (IgG) стандартизованы по референтной человеческой
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Scl-70 ELISA (IgG), EUROIMMUN AG
5
_____________________________________________________________________________________________________
сыворотке CDC-ANA #9, предоставленной контрольным Центром “Centers for Disease Control” (Атланта,
США).
Для каждой группы тестов, выполненных на наборах определенного лота, величины ОП калибраторов и
относительные единицы и/или отношения (RATIO), определенные для положительного и отрицательного
контролей, должны лежать в границах, установленных для наборов этого лота. Протокол с установленными
значениями включается в поставку набора. Если обнаружены отклонения контрольных значений от
значений, указанных в спецификации, результаты теста могут быть ошибочными и тест следует повторить.
Активность фермента, используемого в составе набора, зависит от температуры, поэтому, если не
используется термостат, величины ОП могут различаться. Чем выше температура воздуха в помещении (от
+18оС до +25оС) во время инкубации с субстратом, тем выше величины ОП. Сходные изменения
происходят и при варьировании времени инкубации. Однако таким же воздействиям подвергаются и
калибровочные сыворотки, поэтому при расчете результатов возможные колебания в целом
компенсируются.
Антиген
Лунки планшета покрыты нативным антигеном Scl-70 из тимуса быка и кролика, очищенным аффинной
хроматографией.
Антиген Scl-70, как было установлено, является ферментом ДНК-топоизомеразой-I. Молекулярная масса
нативного антигена составляет 100 кДа. Вначале методом Вестерн-блота был обнаружен только продукт
метаболизма этого антигена с молекулярной массой 70 кДа. ДНК-топоизомераза-I находится в
нуклеоплазме и, в особенно высокой концентрации, в ядрышке. Фермент участвует в репликации и
транскрипции двуспиральной ДНК: сначала он разрывает одну из двух цепей ДНК, а затем ковалентно
присоединяется к разорванному концу. Таким образом, решается “проблема закручивания” ДНК – теперь во
время репликации вся спираль может не вращаться, так как участки ДНК в районе разрыва, находящиеся
непосредственно перед репликационной вилкой, получают возможность свободно вращаться относительно
друг друга и, таким образом, напряжение в спирали ДНК ослабляется. Реакция, приводящая к разрыву
цепи, обратима, поэтому, как только репликация или транскрипция участка ДНК произошла, цепь вновь
соединяется и топоизомераза I высвобождается.
Линейность
Линейность теста исследовали, используя серию разведений сыворотки пациента с высокой концентрацией
антител. Тест Anti-Scl-70 ELISA (IgG) линеен в пределах интервала измерения 2 – 200 ОЕд/мл.
Аналитическая чувствительность
Аналитическая чувствительность – это величина, равная 3SD образца, не содержащего аналита, и
представляет собой наименьший определяемый титр антител. Аналитическая чувствительность теста AntiScl-70 ELISA (IgG) составляет приблизительно 1 ОЕд/мл.
Перекрестная реактивность
Перекрестная реактивность данного набора не выявлена.
Вещества, мешающие определению
Проведению анализа не мешали образцы с признаками гемолиза, липемические и иктеричные образцы с
концентрациями гемоглобина до 10 мг/мл, триглицеридов – до 20 мг/мл и билирубина – до 0,4 мг/мл.
Воспроизводимость
Воспроизводимость теста исследовали, определяя коэффициент вариации (CV) результатов анализа трех
сывороток с концентрациями антител, попадающими на разные участки калибровочной кривой. Величины
CV внутри одного опыта определяли из 20 параллельных измерений каждой сыворотки. Величины CV в
разных опытах получали, проводя по 4 параллельных измерения каждой сыворотки в течение 6 различных
дней.
Вариабельность внутри одного опыта, n = 20
Сыворотка
Среднее
CV
(ОЕд/мл)
(%)
1
76
4,4
2
84
3,0
3
96
4,9
Вариабельность в разных опытах, n = 4 × 6
Сыворотка
Среднее
CV
(ОЕд/мл)
(%)
1
78
7,3
2
90
3,7
3
91
2,7
Специфичность
Представляемый метод ИФА специфически определяет антитела класса IgG к Scl-70. Перекрестных
реакций с другими аутоантителами не обнаружено.
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Scl-70 ELISA (IgG), EUROIMMUN AG
6
_____________________________________________________________________________________________________
Ожидаемые значения
Уровни IgG Anti-Scl-70 анализировали с помощью Anti-Scl-70 ELISA (IgG), EUROIMMUN AG на панели
сывороток крови 206 здоровых доноров. При уровне отсечения (значение cut-off) 20 ОЕд/мл был получен
только один положительный результат (специфичность 99,5 %).
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
В зависимости от использованных методов проверки и степени активности заболевания, антитела к Scl-70
находят в 25% - 70% случаях у пациентов с прогрессирующим системным склерозом (диффузная форма).
Эти аутоантитела не встречаются при очаговой склеродермии.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке.
Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования
сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см.
внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо
руководствуйтесь оригиналом инструкции.
Anti-Scl-70_IgG_ELISA_EA_1599-9601_G_rus.doc
27.08.2007 8:58
Оригинал EA_1599G_A_UK_C01.doc
Version: 12.12.03 14:54
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru