Вирус лихорадки Западного Нила IgG (Аnti

West Nile virus (IgG), EUROIMMUN AG
1
_____________________________________________________________________________________________________
Вирус лихорадки Западного Нила IgG (Аnti- West Nile virus ELISA (IgG))
Иммуноферментный набор для определения антител класса IgG к вирусу лихорадки Западного Нила в
сыворотке или плазме крови человека.
Номер по каталогу: ЕI 2662-9601 G
Набор рассчитан на 96 определений
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор Anti- West Nile virus ELISA (IgG) предназначен для полуколичественного или количественного
определения in vitro антител человека классa IgG к антигенам вируса лихорадки Западного Нила в
сыворотке или плазме крови.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Тест Anti- West Nile virus ELISA (IgG) основан на методе твердофазного иммуноферментного анализа
(ИФА). Набор содержит 12 8-луночных стрипов, разделяемых на отдельные лунки, покрытых антигенами
вируса лихорадки Западного Нила. На первой стадии реакции разведенные образцы пациентов инкубируют
в лунках. Если образцы положительные, специфические IgG-антитела (а также IgA- и IgM-антитела) будут
связываться с антигенами на твердой фазе. Для определения связанных антител проводится вторая
инкубация с использованием меченных ферментом антител к IgG человека (ферментный конъюгат),
которые обеспечивают взаимодействие субстрата и хромогена с появлением окраски.
МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ
Состав набора
Компонент
Цвет
Лунки микропланшета
покрытые антигенами: 12 стрипов 8-луночных
--(разделяемых на отдельные лунки), в рамкедержателе, готовы к использованию
темноКалибратор
красный
(IgG, человеческий), готов к использованию
Положительный контроль
синий
(IgG, человеческий), готов к использованию
Отрицательный контроль
зеленый
(IgG, человеческий), готов к использованию
Ферментный конъюгат
зеленый
Кроличьи антитела к IgG человека, конъюгированные с
пероксидазой хрена; готов к использованию
Буфер для образцов
голубой
Готов к использованию
Промывочный буфер
бесцветный
10×концентрат
Раствор хромогена/субстрата
бесцветный
ТМБ/Н2О2, готов к использованию
Стоп-реагент
бесцветный
0,5 М серная кислота, готов к использованию
--Инструкция по применению
--Протокол с заданными величинами
--Защитная пленка
Серия
Для in vitro диагностики
Количество
Обозначение
12 x 8
.STRIPS.
1 x 2.0 ml
.CAL
1 x 2.0 ml
.POS CONTROL.
1 x 2.0 ml
.NEG CONTROL.
1 x 12 ml
.CONJUGATE.
1 x 100 ml
.SAMPLEBUFFER.
1 x 100 ml
.WASHBUFFER 10x.
1 x 12 ml
.SUBSTRATE.
1 x 12 ml
.STOP SOLUTION.
1 буклет
1 протокол
3 части
Температура хранения
Невскрытый
использовать до
набор
Хранение и стабильность набора
Набор следует хранить при температуре от +2 °С до +8 °С. Не замораживать. Невскрытые компоненты
набора сохраняют стабильность в течение всего указанного срока годности набора.
Удаление отходов
Образцы пациентов, калибраторы, контроли и стрипы после инкубации следует рассматривать, как
инфицированные отходы, и обращаться с ними соответствующим образом. Все реагенты следует удалять в
соответствии с действующими официальными инструкциями.
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2006
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
West Nile virus (IgG), EUROIMMUN AG
2
_____________________________________________________________________________________________________
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ
Примечание: Температуру всех реагентов необходимо довести до комнатной (от +18 °С до +25 °С) в
течение 30 минут перед использованием. После первого использования реагенты сохраняют стабильность в
течение указанного срока годности, если они хранятся при температуре от +2 °С до +8 °С и защищены от
микробной контаминации. Прочие сведения о стабильности отдельных реагентов указаны ниже.
Лунки, покрытые антигенами: Готовы к использованию. Вскройте защитную упаковку планшета,
расстегнув имеющуюся на пакете самоуплотняющуюся застежку. Во избежание конденсации влаги внутри
лунок, не вскрывайте пакет до тех пор, пока он не нагреется до комнатной температуры. Отломив
необходимое количество лунок, остальные неиспользованные лунки немедленно вложите вновь в ту же
защитную упаковку и плотно закройте ее на застежку (не вынимайте из упаковки пакетик с
влагопоглотителем).
После первого вскрытия упаковки плотно упакованные вновь лунки с антигенами можно хранить минимум 4
месяца в сухом месте при температуре от +2 °С до +8 °С.
Калибраторы и контроли: Готовы к использованию. Тщательно перемешать перед использованием.
Ферментный конъюгат: Готов к использованию. Тщательно перемешать перед использованием.
Буфер для образцов: Готов к использованию.
Промывочный буфер: Поставляется в виде 10-кратного концентрата. Если образовались кристаллы, их
можно растворить перед разведением буфера, нагревая концентрат до 37°С и интенсивно взбалтывая.
Необходимое количество концентрата следует отобрать из бутыли чистой пипеткой и растворить
деионизированной или дистиллированной водой (1 часть концентрированного реагента плюс 9 частей
воды).
Например, для проведения анализа на 1 стрипе: к 5 мл концентрата следует добавить 45 мл воды.
о
Готовый разведенный промывочный буфер стабилен до 1 месяца, если его хранят при температуре от +2 С
о
до +8 С и правильно используют.
Раствор хромогена/субстрата: Готов к использованию. После отбора необходимого количества реагента
из флакона немедленно вновь закройте его, так как раствор чувствителен к свету. Во время использования
раствор хромогена/субстрата должен быть бесцветным. Не используйте раствор, если он приобрел голубую
окраску.
Стоп-реагент: Готов к использованию.
Предостережение
Использованные контрольные сыворотки и калибраторы были проверены на антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и
вирусу гепатита С, а также на наличие HBsAg, методами иммуноферментного анализа и непрямой
иммунофлуоресценции и при этом показали отрицательные результаты. Тем не менее, все используемые
материалы следует считать потенциально опасными и обращаться с ними, соблюдая необходимые меры
предосторожности. Некоторые реагенты содержат токсичный азид натрия. Избегайте его попадания на кожу.
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ОБРАЗЦОВ ПАЦИЕНТОВ
Материал образцов
Сыворотка или плазма (ЭДТА, гепарин или цитрат) крови человека.
Стабильность
Образцы пациентов, предназначенные для исследования этим методом, можно хранить до 14 дней при
о
о
температуре от +2 С до +8 С. Разведенные образцы необходимо использовать в течение одного рабочего
дня.
Разведение образцов: Образцы пациентов разводят 1:101 буфером для образцов. Например: разведите
10 мкл сыворотки в 1,0 мл буфера для образцов и тщательно перемешайте на вортексе (пипетки для этого
не подходят).
Примечание: Калибраторы и контроли предварительно разведены и готовы к использованию, их разводить
не надо.
ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ
Инкубация с образцом (1 стадия)
Внесите по 100 мкл калибратора, положительного контроля, отрицательного контроля или разведенных
образцов пациентов в отдельные лунки микропланшета в соответствии со схемой размещения. Закройте
планшет защитной пленкой и инкубируйте при температуре 37°С в течение 60 минут.
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2006
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
West Nile virus (IgG), EUROIMMUN AG
3
_____________________________________________________________________________________________________
Промывка
Ручная: Удалите жидкость из лунок и затем промойте 3 раза, используя каждый раз по 300 мкл рабочего
промывочного буфера на лунку.
Автоматическая: проводите в режиме с переполнением (установите в программе для соответствующего
автоматического вошера параметр “Overflow”, с 3-мя циклами промывки и внесением в лунки по 400 мкл
рабочего промывочного буфера.
При каждом цикле промывки после заполнения лунок буфером оставляйте планшет на 30-60 секунд и затем
опорожняйте. По окончании промывки (ручной или автоматической) тщательно удалите остатки жидкости из
лунок, энергично постукивая перевернутым планшетом по впитывающей бумаге.
Примечание: Остаточная жидкость (больше 10 мкл), обычно остающаяся в лунках после промывки, может
помешать действию субстрата и снизить оптическую плотность (ОП) раствора в лунках. Недостаточно
полная промывка (например, менее 3 раз, или при маленьком объеме добавляемого промывочного буфера,
или при коротком времени выдерживания буфера в лунках) может в результате привести к завышенным
величинам ОП в лунках.
Инкубация с конъюгатом (2 стадия)
Внесите в каждую лунку по 100 мкл ферментного конъюгата (меченные пероксидазой антитела к IgG
человека). Закройте планшет защитной пленкой и инкубируйте при температуре 37°С в течение 60 минут.
Промывка
Удалите жидкость из лунок. Промойте, как описано ранее.
Инкубация с субстратом (3 стадия)
Внесите в каждую лунку по 100 мкл раствора хромогена/субстрата. Закройте планшет защитной пленкой и
инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре (от +18 °С до +25 °С) в защищенном от прямого
солнечного света месте.
Остановка реакции
Снимите защитную пленку и добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента (в той же
последовательности и с такой же скоростью, как вносился раствор хромогена/субстрата).
Измерение
Фотометрическое измерение интенсивности окрашивания раствора в лунках проводят при основной длине
волны 450 нм и при референтной длине волны между 620 нм и 650 нм в течение 30 минут после
добавления стоп-реагента. Перед измерением слегка покачайте планшет, чтобы добиться гомогенного
распределения раствора.
СХЕМА РАЗМЕЩЕНИЯ НА ПЛАНШЕТЕ ОБРАЗЦОВ И КОНТРОЛЕЙ
A
B
C
D
E
F
G
H
1
C
pos
neg
P1
P2
P3
P4
P5
2
P6
P7
P8
P9
P 10
P 11
P 12
P 13
3
P 14
P 15
P 16
P 17
P 18
P 19
P 20
P 21
4
P 22
P 23
P 24
5
6
7
8
9
10
11
12
Представленная выше схема представляет собой пример размещения на планшете проб для определения
IgG-антител в 24 образцах пациентов (от Р 1 до Р 24).
В соответствующие лунки вносят и инкубируют калибратор (С), положительный контроль (pos.),
отрицательный контроль (neg.), а также образцы пациентов (Р 1 – Р 24). Достоверность ИФА анализа можно
увеличить, размещая и измеряя каждую анализируемую пробу в двух параллельных лунках (дубликатах).
Лунки можно отламывать от стрипов по одной. Это позволяет привести в соответствие используемое
количество лунок и количество исследуемых образцов и, таким образом, минимизировать расход реагентов.
Положительный и отрицательный контроли выполняют роли внутренних контролей для проверки
правильности процедуры тестирования. Их следует использовать при каждой постановке анализа.
РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Полуколичественный анализ
Результаты можно оценить полуколичественно, рассчитывая отношение ОП в лунке с контрольным
образцом или в лунке с образцом пациента относительно ОП в лунке с калибратором. Для расчета этого
отношения используйте следующую формулу:
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2006
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
West Nile virus (IgG), EUROIMMUN AG
4
_____________________________________________________________________________________________________
Отношение (RATIO) =
ОП контрольного образца или образца пациента
ОП калибратора
Фирма EUROIMMUN рекомендует следующую интерпретацию результатов:
Отношение (RATIO) < 1,0:
Отрицательный результат
Отношение (RATIO) от ≥ 1,0 до < 1,5
Пограничный результат
Отношение (RATIO) ≥ 1,5:
Положительный результат
Для определений, проводящихся в дубликатах, следует использовать в расчетах среднее значение двух
величин. Если эти две величины существенно расходятся между собой, анализ образца следует повторить.
Для установления диагноза всегда, кроме результатов серологических исследований, необходимо
учитывать клинические симптомы пациента.
ХАРАКТЕРИСТИКИ ТЕСТА
Калибровка
Так как в настоящее время не существует Международного стандарта (референтной сыворотки с
антителами к вирусам лихорадки Западного Нила), калибровка представлена в виде соотношения (RATIO).
Для каждой группы тестов, выполненных на наборах определенной серии, величины ОП калибраторов и
отношения (RATIO), определенные для положительного и отрицательного контролей, должны лежать в
границах, установленных для наборов этой серии. Протокол с установленными значениями включается в
поставку набора. Обнаружение отклонения контрольных значений от указанных в спецификации будет
свидетельствовать о неправильной постановке анализа; в этом случае тест следует повторить.
Активность фермента, используемого в составе набора, зависит от температуры, поэтому величины ОП
могут варьироваться, если не используется термостат. Чем выше температура воздуха в помещении во
время инкубации с субстратом, тем выше величины ОП. Сходные изменения происходят и с временем
инкубации. Однако, таким же воздействиям подвергается и сыворотка калибратора, поэтому при расчете
результатов возможные колебания в основном компенсируются.
Антиген
Источником антигена являются инактивированные лизаты вируса лихорадки Западного Нила (штамм New
York).
Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования
сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см.
внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо
руководствуйтесь оригиналом инструкции.
Anti-West Nile_IgG_ELISA_EI_2662-9601G_rus.doc
10.07.2006 14:00
Оригинал EI_2662G_A_UK_B01.doc
Version: 17.08.04 14:14
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2006
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru