Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии
реклама
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи ПРИЛИПОВ АЛЕКСЕЙ ГЕННАДЬЕВИЧ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ВИРУСА ЗАПАДНОГО НИЛА 03.01.03 – молекулярная биология 03.02.02 – вирусология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2015 1 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ а.о. – аминокислотных остатков а.к. – аминокислота БОЕ – бляшкообразующие единицы ВЗН – вирус Западного Нила ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИФН – интерферон кДНК – комплементарная ДНК ЛД – летальная доза ЛЗН – лихорадка Западного Нила н. п. – нуклеотидных пар НТР – нетранслируемый регион ОТ – обратная транскрипция ОГС – обратная генетическая система ОРС – открытая рамка считывания ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота ЦНС – центральная нервная система ЭПР – эндоплазматический ретикулум 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................6 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………..………....22 1.1. Экология, эпидемиология и географическое распространение вируса Западного Нила …………………………………………………………....…….22 1.1.1. Экология вируса Западного Нила…………...…………..………...22 1.1.2. Эпидемиология вируса Западного Нила………………....……….22 1.1.3. Географическое распространение вируса Западного Нила…...…28 1.2. Филогенетический анализ вируса Западного Нила, его происхождение и эволюция…………................................................................................................30 1.2.1. Происхождение и эволюция вируса Западного Нила……………30 1.2.2. Молекулярная эволюция ВЗН………………………..……………34 1.2.3. Генотипы вируса Западного Нила…………………………….......43 1.3. Генетическая организация и репликативный цикл флавивирусов…….44 1.3.1. Общее строение вирусного генома……...………………….......…44 1.3.2. Трансляция вирусного генома……………………………....…….47 1.3.3. Процессинг и биологические функции неструктурных белков…48 1.3.4. Репликация вирусного генома…………………….…………..…..50 1.3.5. Образование зрелых структурных белков и сборка вириона……52 1.4. Генетические факторы патогенности ВЗН…………………………..….53 1.5. Разработка вакцин к вирусу Западного Нила…………...…………...….58 1.5.1. Требования к вакцине против вируса ЗН…………..…………......59 1.5.2. Ветеринарные вакцины против вируса Западного Нила………...61 1.5.3. Вакцины против вируса Западного Нила для человека……….…62 1.5.4. Вакцины, проходящие клинические испытания………………....62 1.5.5. Вакцины, на стадии доклинической разработки………………....64 1.5.5.1. Субъединичные вакцины………………………….…..……64 1.5.5.2. ДНК-вакцины…………………….…………..…………..….66 3 1.5.5.3. Нерепликативные вакцины одного цикла………………….67 1.5.5.4. Инактивированные вирусные вакцины…………………....67 1.5.5.5. Рекомбинантные вакцины на основе вирусных векторов...69 1.5.5.6. Химерные вакцины………………………………………….69 1.5.5.7. Живые аттеньюированные вакцины, полученные из инфекционных клонов…………………………………………………………...70 1.5.5.8. Кандидаты в вакцины против ВЗН на базе рекомбинантной вакцины против кори………………………………………………………….....72 1.5.5.9. Вакцина MVSchw-sEwnv…………………..………….…….73 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ……………………………..…………75 2.1. Места сбора и объем полевого материала……………...…………..…..75 2.2. Методы сбора, транспортировки, хранения и подготовки полевых материалов…………………………..………...…………………………………79 2.3. Вирусологическое обследование………………………...…………...….79 2.4. Штаммы, олигонуклеотиды и нуклеотидные последовательности ВЗН, использованные в работе………………………………………………..……....80 2.5. Компьютерный анализ последовательностей ДНК……..…………...…87 2.6. Выделение РНК……..………………………………………..……….…..87 2.7. Реакция обратной транскрипции…………………….…………….…….88 2.8. Проведение полимеразной цепной реакции……………………...…......88 2.9. Клонирование кДНК-фрагментов генома……………………...…...…...89 2.10. Приготовление компетентных клеток…………………………………...89 2.11. Трансформация плазмидной ДНК…………………………………….…89 2.12. Электрофорез ДНК в агарозном геле………………………………….…90 2.13. Выделение фрагментов ДНК из агарозы…………………………...…....90 2.14. Секвенирование ДНК…….……………………………………......……..91 4 2.15. Сайт-направленный мутагенез ДНК……………..………………….......91 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ……………………………..……………….…..…....93 3.1. Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН, изолированных до 2001 г……………………………………….…………93 3.1.1. Стратегия подбора первой пары праймеров для проведения ПЦР…………………………………….…………………………………….…..94 3.1.2. Определение и анализ первичной структуры части генома штаммов ВЗН от 5’-конца до праймера 3594Runi……………………..…..….97 3.1.3. Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН генотипа 1…………………………………………………………………........101 3.1.4. Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН генотипов 2,4 и 5……………….……………………………………………….106 3.1.5. Определение и анализ 5’-концевых последовательностей геномов штаммов ВЗН…………………………………………………………..….……106 3.2. Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН, изолированных после 2001 г…………………………………..………………107 3.3. ОТ-ПЦР тест система для обнаружения РНК вируса ЗН…………...…108 3.3.1. Создание ОТ-ПЦР тест системы для обнаружения РНК вируса ЗН в клинических образцах и пробах полевого материала……………………....108 3.3.2. Разработка параметров проведения ПЦР для первого и второго раундов амплификации……………….…………………………………….…113 3.3.3. Определение чувствительности ОТ-ПЦР тест системы………..117 3.3.4. Проверка работы ОТ-ПЦР тест-системы на различных генотипах вируса ЗН………………………………...……………………………………..121 3.4. Исследование полевого материала……………………………...……...122 3.4.1. Исследование комаров и клещей Астраханской области на наличие вируса ЗН при помощи ОТ-ПЦР системы……………………...…...122 3.4.2. Анализ зараженности видового состава комаров…………..…...124 3.4.3. Анализ положительных проб для определения генотипа вируса при помощи определения частичной нуклеотидной последовательности….128 5 3.4.4. Статистическая обработка результатов…………….…………...129 3.5. Клонирование кДНК-копии генома вируса Западного Нила…………131 3.5.1. Получение плазмид, несущих кДНК-фрагменты вирусной РНК…………………………………………………………………….………..131 3.5.2. Транскрипция РНК in vitro…………………………………….....132 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ………………………..…….....134 4.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей штаммов ВЗН………….…………………………………………………………………..134 4.1.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей штаммов ВЗН первого генотипа……..………………………………………..134 4.1.2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей штаммов ВЗН первого генотипа, выделенных после 1999 г…………….......139 4.1.3. Анализ штамма 322 2-го генотипа………………………………143 4.1.4. Анализ штамма Ksnd190 4-го генотипа…………………………148 4.1.5. Анализ штамма Ig2266 5-го генотипа……………………………150 4.2. Анализ генетических детерминант патогенности ВЗН…………….….152 4.3. ОТ-ПЦР тест-система для обнаружения РНК ВЗН……………………155 4.4. Исследование комаров и клещей Астраханской области на наличие ВЗН при помощи ОТ-ПЦР системы …………………………………………..…....156 4.5. Клонирование кДНК-копии генома вируса Западного Нила…………157 4.6. Значимость полученных данных о нуклеотидных последовательностях ВЗН, заложенных в базу данных ………………………………..………...…..158 ВЫВОДЫ...........................................................................................................161 БЛАГОДАРНОСТИ.........................................................................................163 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ………………………..……..164 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Род Flavivirus семейства Flaviviridae состоит более, чем из 70 вирусов, большинство из передающимися которых путем является биологической арбовирусами, трансмиссии т.е. вирусами, восприимчивым позвоночным кровососущими членистоногими переносчиками [9, 11, 17, 27]. Флавивирусы способны инфицировать широкий круг организмов, включающий в себя млекопитающих, насекомых, птиц и рептилий. Многие из них могут вызывать тяжелые заболевания человека - желтую лихорадку, лихорадку Денге, клещевой энцефалит, японский энцефалит и др. Прототипным вирусом семейства считается вирус жёлтой лихорадки, который и дал название семейству и роду флавивирусов. Термин “flavi” происходит от латинского слова “flavus” – жёлтый и связан с жёлтым цветом кожи у больных жёлтой лихорадкой [9, 11]. В большинстве случаев передача инфекции осуществляется через укус переносчика – комара или клеща, что позволяет разделить флавивирусные инфекции на переносимые клещами и комарами, а также заболевания, для которых переносчик не установлен. Наиболее значимые для человека флавивирусные инфекции связаны с вирусами Денге, желтой лихорадки, японского энцефалита, клещевого энцефалита и Западного Нила. Ежегодно Всемирная Организация Здравоохранения регистрирует более 50 миллионов случаев заболевания лихорадкой Денге, около 200 000 случаев заболевания желтой лихорадкой и около 50 000 случаев заболевания японским энцефалитом. Смертность от заболеваний, вызванных этими наиболее патогенными представителями семейства флавивирусов, варьирует в пределах 5%-30% [11]. Дополнительным фактором значимости проблем, связанных с флавивирусными инфекциями, становится существенное расширение их ареала. Здесь ярким примером может служить вирус японского энцефалита, 7 который во второй половине XX века широко распространился в Азии, Океании, а в конце 1990-х достиг австралийского континента. Другой хорошо известный пример связан с проникновением в 1999 году и последующим стремительным распространением вируса Западного Нила на американском континенте. Возможность переноса флавивирусов перелетными птицами, их способность реплицироваться в новых видах млекопитающих, быстрая адаптация к природным условиям обеспечивает формирование новых природных очагов флавивирусных инфекционных заболеваний, в которые вовлекается и проживающее на этой территории население. Отсутствие на сегодняшний день вирусоспецифических препаратов, эффективных методов лечения, а нередко и профилактики заболеваний, вызванных флавивирусными инфекциями, объясняет научный интерес и органов практического здравоохранения к данной проблеме. Для России наиболее актуальными являются вирус клещевого энцефалита (несмотря на существование разных вариантов вакцины) и вирус Западного Нила. В нашей стране наиболее активные очаги лихорадки Западного Нила расположены в Астраханской области, на территории дельты Волги. Здесь, в дельте Волги, в силу географических и экологических особенностей сформированы чрезвычайно благоприятные условия для поддержания активной циркуляции ВЗН, и, почти ежегодно фиксируется спорадическая заболеваемость ЛЗН, иногда эпидемические вспышки [1, 10, 13, 15, 29]. Вирус Западного Нила (ВЗН) принадлежит к серокомплексу Японского энцефалита, рода Flavivirus, семейства Flaviviridae. Семейство объединяет содержащие РНК положительной полярности, покрытые липидной оболочкой сферические вирусы, диаметром около 45 нм. Впервые ВЗН был выделен в 1937 г. в провинции Западный Нил в Уганде от женщины, больной лихорадкой. Поскольку заболевание характеризовалось общелихорадочными симптомами, оно получило название лихорадки Западного Нила. ВЗН явился причиной многих эпидемий [322]. 8 ВЗН является широкораспространенным флавивирусом [14, 146]. Его ареал охватывает практически весь африканский континент, Юго-Западную и Южную Азию, Южную и некоторые центральные части Европы [11, 146]. Начиная с 1999 г. ВЗН выявляется также на территории Североамериканского континента [180]. Для Австралийского континента топотипным является вирус Кунджин, который изначально рассматривался как самостоятельный вирус. Однако, современные данные генетических исследований позволяют рассматривать штаммы вируса Кунджин как, характерные для Австралии изоляты ВЗН, отнесенные к I-ой филогенетической группе [137, 295, 296]. Спорадическая заболеваемость и эпидемические вспышки регулярно происходят на африканском континенте. В восточных странах наиболее часто вспышки регистрируются в Израиле, Индии, Пакистане, а в европейских странах во Франции и Румынии. В последние время самые активные очаги вируса ЗН отмечаются в США, где с 1999 г. каждый год регистрируется значительное число случаев лихорадки Западного Нила (ЛЗН). В Африке вирус ЛЗН неоднократно выделяли в различных частях континента, от различных позвоночных хозяев и переносчиков [76]. В южной Африке наиболее крупная эпидемия ЛЗН, по-видимому, была в 1974 г. в провинциях Северный Капе и Кароо [215]. Как показали серологические исследования, до 18 000 человек были инфицированы ВЗН, однако случаи поражений ЦНС здесь регистрировались крайне редко. Исследования населения районов северной Африки показали, что антитела против ВЗН обнаруживались у до 44 % детей и 72 % взрослого населения дельты Нила. Исследование лошадей, проведенное здесь в 1959 г., показало, что из них около 54 % имеют антитела к ВЗН. В 1969 г. в Египте антитела против ВЗН были выявлены в среднем у 50 % населения, причем в северных частях страны этот показатель достигал 73,9 % [99]. В Алжире, в 1994 г. зафиксировано около 50 случаев заболеваний ЛЗН, из которых 20 были представлены энцефалитами и 8 завершились фатально. В Тунисе в 1997 г. с менингитом или менингоэнцефалитом было госпитализировано 173 пациента, из которых 9 8 умерли. Диагноз ЛЗН был подтвержден серологически в 86 % случаев. Кроме того, из тканей умерших было выделено несколько штаммов ВЗН [321]. Добавим, что антитела к вирусу ЗН выявлялись с различной частотой у населения Сенегала, Кении, Марокко, Демократической республики Конго. В этих странах в разные годы также фиксировались случаи заболеваний ЛЗН, иногда переходящие в крупные эпидемические вспышки. На территории этих стран вирус ЗН выделяли от людей, комаров и некоторых позвоночных [235]. В Европе антитела к вирусу ЛЗН были впервые обнаружены в Албании в 1958 г., а первая изоляция вируса была произведена от комаров во Франции в 1964 г. [140]. Тогда же было показано существование стойких природных очагов ЛЗН в дельте Волги в России [3, 4, 5, 26, 27, 28]. Случаи заболевания людей и животных регистрировались начиная с 1960 гг. на юге Франции, в Испании, России, Румынии, Украине, Белоруссии [4-7]. Серологические исследования показали, что в 1975 – 1983 гг. антитела против вируса ЗН встречались у от 3 % до 4,9 % населения южных районов Франции На севере Испании этот показатель составил 9,8 % [129]. В южных районах Португалии антитела к ВЗН обнаружены у 15 % населения [121]. Обширная эпидемическая вспышка ЛЗН возникла в июле-октябре 1996 г. в Юго – Восточной Румынии в Южном течении Дуная. Заболеваемость достигала 12,4 на 100 тыс. и охватила 7 районов, включая Бухарест. С явлениями поражения ЦНС госпитализировано 835 больных. Лабораторно подтверждено 393 случая. Умерли 17 больных (4,3%), причем тяжесть течения и летальность возрастали с возрастом, что типично для ЛЗН. Число больных с симптомами лихорадки было по крайней мере в 10 раз, а число инфицированных в 100-300 раз больше [146, 322]. Чрезвычайный интерес вызывает распространение вируса ЗН по территории Северной Америки. До 1999 г., когда эпидемическая вспышка менингоэнцефалита, опосредованного ВЗН, возникла на северо-востоке США, вирус ЗН на территории Нового Света не выделялся. Вспышка произошла в июле-сентябре 1999 г. с пиком во второй половине августа. В 10 общей сложности было выявлено 59 случаев менингоэнцефалита, из которых 7 с летальным исходом (12,5%) [69, 180]. Однако пост-эпидемические и серологические исследования выявили до 110 бессимптомных, и до 30 случаев лихорадочной формы ЛЗН на каждый случай менингоэнцефалита. По данным CDC (Center for Disease Control and Prevention, USA) в 2000 г. зарегистрировано только 18 менингоэнцефалитных случаев ЛЗН. Хотя, эпицентром заболеваемости людей в 1999-2000 гг. были окрестности НьюЙорка, ВЗН был выделен или детектирован в птицах, лошадях и/или комарах в 1999 г. в 4 штатах, а в 2000 г. уже в 12. В 2001 г. случаи Западно-Нильского менингоэнцефалита регистрировались уже в 38 районах в 10 штатах [68, 102, 103, 113, 114]. Общее число таких случаев составило 66, из них 9 фатальных. При этом циркуляция вируса (в птицах, комарах и животных) регистрировалась уже в 27 штатах. Особые значения заболеваемости в Америке были достигнуты в 2002 и 2003 гг. По данным CDC число только клинически заболевших ЛЗН составило в 2001 г. 3389 человек в 37 штатах, из которых 2354 (69%) с менингоэнцефалитом, 704 (21%) с лихорадочными проявлениями и 331 (10 %) с неспецифичными проявлениями. Вирусная активность регистрировалась уже в 44 штатах. Учитывая, что на один клинически выраженный случай ЛЗН может приходиться до 100-150 случаев бессимптомных, можно предположить, что число инфицированных достигало 300-400 тысяч. В 2003 г. всего было зарегистрировано более 9000 случаев ЛЗН, причем случаи с поражениями ЦНС составили около 30% [227, 256, 309]. Таким образом, за несколько лет ВЗН распространился практически по всей территории США вплоть до Западного побережья. Кроме того, ВЗН был детектирован в юго-центральных областях Канады и в Мексике [116, 256]. Открытым остается вопрос о заносе вируса на Американский континент. Считают, что занос мог быть произведен двумя путями – или со случайным (на кораблях или самолетах) завозом зараженной популяции комаров [11], или с завозом инфицированных птиц. Причем завоз сельскохозяйственных птиц, так и экзотических. [77, 180]. мог быть как 11 Вирус Западного Нила в России На территории бывшего СССР ареал ВЗН охватывает Молдавию, Украину, Белоруссию, юг европейской части России (степи и лиственные леса), в Западной Сибири – Алтайский край (степи и лесостепь). Кроме того, циркуляция вируса зафиксирована в Армении, Азербайджане, Грузии, Казахстане, Таджикистане, Киргизии, Узбекистане и Туркмении [11]. Заболеваемость ЛЗН за последние 20 лет регистрировалась в Казахстане и Среднеазиатских республиках, на Украине, в Азербайджане. Особенно велик риск заражения в пустынных частях Поволжского района, особенно вдоль долин крупных рек. Наличие стойких природных очагов ВЗН показано в дельте Волги [5]. Здесь почти ежегодно регистрируются спорадические случаи заболевания. Небольшая вспышка ЛЗН была отмечена в 1963 г. в Астраханской области [3, 26]. В этом же регионе, в Волгоградской, Астраханской областях и Краснодарском крае в июле-сентябре 1999 г. зарегистрирована крупная вспышка ЛЗН. В общей сложности было зафиксировано не менее 600 случаев заболеваний [12, 13]. В Волгоградской области в 1999 г. было выявлено 380 лабораторно подтвержденных случаев ЛЗН. При этом, у 72,4 % пациентов диагностирован серозный менингит, у 67,4 % менингоэнцефалит и у 12,6 % острое лихорадочное заболевание без поражения ЦНС. В Астраханской области в 1999 г. всего было зарегистрировано 95 случаев ЛЗН [13]. В последующие годы заболеваемость регистрировалась в меньшем масштабе: в 2000 г. – 24 случая, в 2001 г. – 49, в 2002 г. – 34 [10]. При исследованиях распространения ВЗН на территории ВолгоАхтубинской поймы, проведенных в 2000-2004 гг. в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН были обнаружены представители трех генотипов вируса : 1, 2 и 4. Субгенотип 1а генотипа 1 встречался в 96% случаев, а на генотипы 2 и 4 приходилось примерно по 2 %. 12 Филогенетические взаимоотношения изолятов ВЗН. Первоначальные исследования, в которых использовались различные серологические методики, позволили выделить несколько обособленных групп вируса. На основании этих исследований штаммы ВЗН были разделены в две большие серогруппы: африканскую (топотипный штамм Eg101, выделенный в Египте) и индийскую (топотипный штамм Ig2266 из ЮгоВосточной Индии). К африканской серогруппе относятся штаммы, выделенные в Северной, Восточой и Центральной Африке, Средней Азии, все штаммы выделенные в Европе. К этой же серогруппе относятся почти все изоляты из Южной Африки и с острова Мадагаскар. К индийской серогруппе относят штаммы изолированные в различных частях Индии, часть изолятов из Южной Африки и с острова Мадагаскар [11]. Секвенирование и анализ последовательностей генома различных изолятов позволили получить значительно более полную картину межштаммовых филогенетических отношений. Следует заметить, что ко времени начала эпидемии ЛЗН в США (1999 г.) в международной базе данных имелась всего одна полная нуклеотидная последовательность генома ВЗН: последовательность вируса генотипа II. Кроме того, была доступна полная нуклеотидная последовательность генома вируса Кунджин, который к тому времени считался самостоятельным вирусом, хотя и родственным ВЗН. Эта ситуация привела к значительным трудностям при первичном определении принадлежности вируса, вызвавшего эпидемическую вспышку 1999 г. в США. Фактически, только последовательность штамма, изолированного в НьюЙорке в 1999 г., явилась первой полной последовательностью генома для генотипа 1, который является наиболее распространенным и ответственен за наибольшее количество эпидемических вспышек. Одной из первых и основополагающих стала работа F. Berthet с соавт. [53]. Сравнительное исследование было построено на анализе нуклеотидной последовательности части гена оболочечного белка Е (участок, кодирующий приблизительно от 150-ой по 250-ую а.к. от N-конца белка). Данный регион 13 характеризуется высокой вариабельностью, что связано с формированием ряда антигенных детерминант. Кроме того, в этой области находится единственный для данного белка потенциальный сайт гликозилирования, который у некоторых штаммов может быть изменен или делетирован. В результате, изоляты (в работе использовался 21 штамм) были разделены в две группы, с дивергенцией между группами до 29%. Гомология между штаммами внутри групп составляла минимум 87% для I группы и 80,5% для II-ой. Подобная классификация на основе сравнения небольшой части гена Е оказалась весьма удачной, и, как показали дальнейшие исследования, соответствует наиболее достоверному сравнительному анализу полноразмерных последовательностей генома. В тоже время, в описываемой работе не использовалась частичная нуклеотидная последовательность индийского изолята Ig2266, доступная для анализа к этому времени. В последующих работах число штаммов ВЗН, используемых для анализа, значительно возросло и подобное разделение на две группы стало общепринятым. Важную роль сыграли работы J.Scherret [295, 296], в которых данные о филогенетических взаимоотношениях штаммов ВЗН были в значительной мере обобщены и структурированы. Помимо прочего, в этих работах было показано, что вирус Кунджин является австралийским субтипом ВЗН. К группе I относят штаммы, выделенные в США, Европе, Среднем Востоке, Центральной, Северной и Западной Африке. Отметим, что к этой группе отнесены штаммы, вызвавшие все крупные эпидемии последних лет в Израиле, Румынии, России и США. К этой же группе относят австралийские изоляты Кунджин и изоляты из Индии. Группа II включает в себя вирусы из Центральной, Восточной и Западной Африки и с острова Мадагаскар [53, 76, 180, 295]. Отнесение индийских изолятов к первой группе, а затем попытка вынести их в субгенотип 1с явились артефактом анализа по небольшому участку последовательности, так как при дальнейших исследованиях и 14 сравнении была доказана принадлежность их к самостоятельному генотипу ВЗН. В 2002 г. была опубликована работа по анализу последовательности штамма Krsn190, выделенного в 1988 г. на территории Краснодарской области. Его не удалось классифицировать ни в одну группу, т.к. степень его дивергенции по нуклеотидной последовательности открытой рамки считывания составляет приблизительно 30% от штаммов I-ой, II-ой и индийской групп. Подобная проблема возникла и в работе J.Scherret [296]. Для двух штаммов из Сенегала и Индонезии вопрос о групповой принадлежности решить не удалось. В 1997 г. на территории Моравии был выделен штамм ВЗН, сильно филогенетически удаленный от всех генотипов, известных к тому времени. Авторы Bakonyi с соавт. предложили после проведенного к 2005 г. анализа, вынести штамм Rabensburg (97-103) в отдельный генотип ВЗН [40]. В итоге, к 2007 г. сложилось разделение ВЗН на 5 основных генотипов (lineage): генотип 1 – самый широко распространенный, ответственный за наибольшее количество эпидемических вспышек, подразделяемый на два субгенотипа (clade) (1а и 1 b - ранее австралийский вирус Кунджин); генотип 2 - менее распространенный вариант, но доказано ответственный за некоторое количество эпидемических вспышек; генотипы 3 и 4 (Rabensburg (97-103) и Krsn190 соответственно), представленные фактически каждый одним известным топотипным штаммом и генотип 5, влючающий изоляты ВЗН из Индии. Филогенетическое древо (из работы Bondre и др. [60]) представлено на рис.1. Не исключено, что в будущем число филогенетических групп вируса ЗН, по мере новых исследований будет расширено. 15 Рис. 1. Филогенетическая дендрограмма построена на основе нуклеотидной последовательности длиной 921 нуклеотидов из области C–prM–E ВЗН. Вирус японского энцефалита (JEV) взят в качестве аутгруппы. Древо построено программой Mega с помощью алгоритма ближайшего соседа 16 Территориальное распространение генотипов ВЗН. Самым широко распространенным генотипом вируса следует считать генотип 1. Субгенотип 1а встречается в Европе, Африке, на Американском континенте распространен только данный вариант, кроме того, его второй субгенотип 1b (ранее вирус Кунджин) распространен в Австралии. Этот генотип ответственен за подавляющее большинство эпидемических вспышек, кроме того, для него собрана наибольшая база нуклеотидных последовательностей и, именно на генотипе I проведена основная масса работ по определению маркеров патогенности ВЗН. При исследованиях распространения ВЗН на территории ВолгоАхтубинской поймы, проведенной в 2000-2004 гг. в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН были обнаружены представители трех генотипов вируса: 1а, 2 и 4. Причем субгенотип 1а встречался в 96% случаев, а на генотипы 2 и 4 приходилось примерно по 2 %. Генотип 2 встречается в основном в Африке и Европе. Достоверно известно о его способности вызывать заболевания у людей. Достаточно вспомнить, что самый первый, описанный ВЗН выделенный в 1937 г. в провинции Западный Нил в Уганде от женщины, больной лихорадкой, принадлежал к генотипу 2. Недавняя вспышка 2007 г. в Волгоградской области, где удалось определить полную нуклеотидную последовательность генома ВЗН из мозга умершего так же подтверждает опасность для человека второго генотипа вируса. Генотипы 3 и 4 обнаружены в очень небольшом количестве, фактически имеются только два топотипных штамма, по одному на генотип (Rabensburg (97-103) и Krsn190, соответственно), оба выделены от клещей. Достоверных данных о заболеваниях ЛЗН, вызванных этими генотипами нет. Однако, не следует забывать, что в Астраханской области, по данным Института вирусологии им. Д.И. Ивановского, генотип 4встречается с такой же частотой, что и генотип 2. 17 Генотип 5 является вариантом вируса, распространенным в Индии, возможно, еще в некоторых территориально близких регионах, и ситуация с ним подобна с ситуацией с вирусом Кунджин для Австралии. Группирование изолятов ВЗН на основе сравнения их нуклеотидных последовательностей совпадает с их географическим происхождением. Это весьма актуально, т.к. основным хозяином ВЗН являются птицы, которые во время своих сезонных миграций могут переносить новые, возможно, более патогенные штаммы на значительные расстояния. Кроме того, считается, что изоляты различных групп вируса обладают различной патологической способностью. Так, случаи энцефалитов и менингоэнцефалитов фиксируются в основном при вспышках, вызванных штаммами первой группы. Все крупные эпидемии ЛЗН последних лет (в России, США, Румынии, Израиле) также были вызваны представителями первой группы. Установить связь патогенности с определенными участками генома вируса достаточно сложно, хотя в ряде работ выявлены определенные участки генома, замены в которых приводят, например, к изменениям нейроинвазивной способности вируса в модельной системе [82]. Особую значимость вирус Западного Нила приобрел после ряда крупных эпидемических вспышек, произошедших в конце 1990-х годов в различных частях света и характеризующихся необычно частыми, для данной инфекции, случаями поражения ЦНС и высокой смертностью. В 1994 году произошла вспышка в Алжире, в ходе которой было зарегистрировано около 50 случаев заболевания с 8 летальными исходами. Последующая вспышка ЛЗН была зарегистрирована в Румынии в 1996 году, где также наблюдался необычно высокий (~9%) уровень смертности. В 1997 году на гусиных фермах в Израиле случилась крупная эпизоотия ЛЗН с острыми неврологическими проявлениями. Среди людей эпидемия случилась в 2000 году, хотя еще в 1999 году было отмечено два смертельных случая заболевания ЛЗН. В общей сложности в 2000 году в Израиле было зарегистрировано 417 подтвержденных случаев заболевания ЛЗН, причем в половине случаев с поражениями ЦНС. 18 Уровень смертности при этом составлял, по разным данным, от 8 до 14 %. В 1999 году почти одновременно эпидемические вспышки ЛЗН произошли на юге России и в Нью-Йорке, США, при сходном (~ 10%) уровне летальности. Вопрос, чем обусловлено серьезное изменение характера патогенности эпидемических вспышек, вызванных в последнее время вируса Западного Нила, остается открытым. Сравнительный и эволюционный анализ первичной структуры геномов различных изолятов ВЗН, поиск и изучение генетических детерминант вируса, отвечающих за его патогенные свойства, являются в настоящее время предметом интенсивных исследований. Настоящая работа была выполнена в рамках комплексного изучения биологии и структуры генома вируса Западного Нила, циркулирующего на территории юга Русской равнины, которое проводится в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского с 1999 года. В рамках этого исследования были выполнены работы по генетической характеристике российских штаммов ВЗН, вызвавших эпидемии 1999-2000 гг., созданию новых чувствительных тест-систем для детекции возбудителя, а также работы по мониторингу циркуляции вируса, включающему в себя наблюдения за вирусной активностью во всех звеньях экологической цепи. Цель исследования Характеристика, изучение генетических свойств и анализ детерминант патогенности штаммов ВЗН, циркулирующих на эндемичной территории юга России, а также исторических штаммов, находящихся в Государственной коллекции института вирусологии им. Д.И.Ивановского. Задачи исследования 1. Установить первичную структуру геномов 9 исторических штаммов вируса Западного Нила из Государственной коллекции вирусов института вирусологии им. Д.И.Ивановского. 19 2. Установить первичную структуру геномов 22 штаммов вируса Западного Нила, изолированных в 1999-2005 гг. на территории Астраханской и Волгоградской областей. 3. Определить принадлежность исследуемых штаммов ВЗН к известным генотипам этого вируса, а в случае выявления вирусов, не принадлежащих к уже известным генотипам, охарактеризовать новые генотипы и предложить среди исследованных штаммов топотипные варианты ВЗН. 4. Разработать оптимальную схему для определения полной первичной структуры генома для вирусов ВЗН субгенотипа 1а. 5. Создать тест-систему на основе ОТ-ПЦР, позволяющую проводить идентификацию РНК ВЗН в пробах членистоногих переносчиков. 6. Охарактеризовать генетические свойства вирусной популяции, циркулировавшей на территории Астраханской области в 2001-2005 гг. 7. Разработать экспериментальную систему для изучения биологических свойств ВЗН методом обратной генетики на основе низкопатогенного штамма. Основные положения, выносимые на защиту 1. Установлена полная нуклеотидная последовательность геномов 31 штамма ВЗН. Для 28 штаммов ВЗН показана принадлежность к субгенотипу 1a и для одного штамма к генотипу 2. 2. На основании сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей геномов штамм вируса Krnd88-190 предложено отнести к новому генотипу 4. 3. На основании сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей геномов штамм вируса Ig2266 предложено отнести к новому генотипу 5. 4. Проведена молекулярно-генетическая характеристика данных штаммов, включающая в себя анализ их нуклеотидных и аминокислотных 20 последовательностей, а также поиск известных функциональных детерминант вируса, отвечающих за его патогенные свойства. 5. Создана ОТ-ПЦР тест система для определения РНК ВЗН, данная система показала высокую специфичность и чувствительность при работе с пробами пулов комаров и клещей. 6. Создана экспериментальная система для транскрипции вирусной РНК in vitro на основе бактериальной высококопийной плазмиды, несущей полноразмерную кДНК копию вирусного генома. Научная новизна и практическая ценность работы В данной работе впервые была определена полная нуклеотидная последовательность генома для 31 штамма ВЗН, в том числе для 24 штаммов, изолированных в России. Это составляет до настоящего времени 45% данных для Евразии и более 82% данных для России. Впервые, на основании полной последовательности генома вируса была показана принадлежность индийского штамма Ig2266 к новому генотипу 5, что в дальнейшем было подтверждено работами исследователей из Индии. Впервые, была показана принадлежность и штамма Krnd88-190 к новому генотипу 4, не известному до настоящей работы, что также было подтверждено позднее работами других исследователей. Впервые была получена молекулярно-генетическая характеристика данных штаммов, включающая в себя анализ их нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, а также поиск известных функциональных детерминант вируса, отвечающих за его патогенные свойства. В данной работе были предложены оптимизированные стратегии работы для получения полных последовательностей генома для ВЗН субгенотипа 1а, проведен анализ использования большого количества олигонуклеотидных праймеров с точки зрения их эффективности для проведения ПЦР и секвенирования. 21 Разработана система ОТ-ПЦР для детекции РНК ВЗН в пробах полевого материала и продемонстрирована её эффективность и специфичность при работе с пулами комаров и клещей. Проанализирован генотипический состав ВЗН из членистоногих переносчиков в Астраханской области в 2001-2005 гг. Проанализирован процентный состав зараженности для различных видов комаров в Астраханской области в 2001-2005 гг. Разработанная тест – система защищена патентом РФ №2199589 от 27.02.2003 г. Клонирована кДНК копия полного генома вируса Западного Нила, относящегося к IV генотипу на основе низкопатогенного штамма LEIVKrnd88-190. Создана экспериментальная система для получения вирусной РНК in vitro. 22 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Экология, эпидемиология и географическое распространение вируса Западного Нила 1.1.1. Экология вируса Западного Нила Вирус Западного Нила (ВЗН) является этиологическим агентом лихорадки Западного Нила (ЛЗН). Инфицирование человека ВЗН может иметь различные проявления – от бессимптомной инфекции или легкой лихорадки до развития тяжелых форм энцефалитов и менингоэнцефалитов с летальностью до 12-14%. Заражение происходит, как правило, посредством укусов комаров различных видов, хотя описаны случаи заражения при переливании крови, кормлении грудью, трансплантации органов и т.д. ВЗН способен размножаться в организме млекопитающих, птиц, земноводных и членистоногих. У животных инфекция протекает, как правило, инаппаратно. Исключение составляют лошади, у которых ЛЗН имеет клиническое течение в виде энцефаломиелита и других неврологических проявлений, а также птицы, являющиеся главным природным резервуаром вируса. Рис.2. Трансмиссивный цикл вируса Западного Нила. Основной природный цикл вируса ЗН происходит между птицами и комарами, преимущественно рода Culex (рис.2). Вирус Западного Нила был многократно, в различных частях ареала, изолирован от птиц, принадлежащих 23 к различным семействам и отрядам [1]. Главным фактором, определяющим основное значение птиц в циркуляции ВЗН, является их способность развивать высокие, достаточные для заражения комаров, титры виремии в крови. Экспериментальное заражение птиц различных отрядов и семейств позволило выделить среди них виды, особенно восприимчивые к ВЗН, демонстрирующих высокие и продолжительные показатели виремии [23, 25]. Так, например, в исследовании, проведенном в 2003 году [171], было показано, что очень высокие (до 12 log10 БОЕ/мл) титры виремии развиваются у семейства врановых (Corvidae). Немного меньшие (до 8 log10 БОЕ/мл) титры виремии были отмечены у представителей семейств чайковые (Laridae) и ржанковые (Charaiidae). Еще меньшие, но, однако, достаточные для заражения комаров титры виремии, развивались у птиц семейства голубиные (Columbidae), совиные (Strigidae), дятловые (Picidae). На основании этих данных были выделены пять наиболее важных для циркуляции ВЗН на территории США видов птиц. К ним были отнесены голубая сойка (Cyanocitta cristata), гракл (Quiscalus quiscula), чечивица (Carpodacus mexicanus), американская ворона (Corvus branchyrhynchos) и домашний воробей (Passer domesticus) [171]. Среди американских ворон Corvus brachyrhynchos, в отличие от европейского подвида C.corone, наблюдается массовая гибель уже в период развития эпизоотии, предшествующей началу эпидемического периода. Высокая восприимчивость к вирусу Западного Нила, широкая распространенность почти на всей территории страны, а также массовость в населенных пунктах придают этому виду птиц большое эпидемиологическое значение как резервуара в урбанистической циркуляции ВЗН в США. Массовая гибель ворон положена в основу систему раннего оповещения в США о предстоящем обострении эпидемической ситуации. В 2004 году в работе Brault с соавторами показали существенное - до 5 log10 БОЕ/мл различие между штаммом NY99, циркулировавшим в начале 2000-х в США, и генетически близкими штаммами ВЗН из Австралии и Африки (KUN и KEN-3829) в уровне виремии и смертности (в 8 раз) при экспериментальном 24 заражении Corvus branchyrhynchos. Дальнейшие исследования американских авторов [67] позволили идентифицировать генетические характеристики штамма NY99, отвечающие, по крайней мере, частично за его повышенные вирулентные свойства in vivo. В общей сложности, в США ВЗН был обнаружен, по крайней мере, в 138 видах умерших птиц. В Европе, в отличие от США, смертность среди птиц, вызванная ВЗН, является редким явлением. Массовая гибель ворон, однако, наблюдалась и во время вспышки ЛЗН в г. Волгограде в 1999 г. Важно отметить, что птицы играют не только роль резервуара ВЗН в природных очагах, но и способны переносить его на огромные расстояния во время сезонных миграций. Причем в процессе миграций происходят тесные контакты между их различными популяциями и видами, а, следовательно, и обмен адаптированными к ним возбудителями во время промежуточных остановок и в местах зимовок. Млекопитающие, за редким исключением, не играют существенной роли в поддержании циркуляции ВЗН, поскольку титры развивающейся у них виремии недостаточны для заражения следующего пула комаров. Об этом свидетельствуют и экспериментальные данные по их заражению. Это относится и к диким, и к домашним животным. Среди домашних животных, исключая птиц, только у лошадей возникает выраженная клиническая картина в форме лихорадки с явлениями менингоэнцефалита и частым (до 30% и более) смертельным исходом. Определенное значение в экологии вируса могут играть земноводные. В частности, озерные лягушки Rana ridibunda могут сохранять вирус, и их донорская возможность для комаров рода Culex Pipiens подтверждена рядом исследователей. Главную роль переносчиков ВЗН играют комары и, возможно, аргасовые и иксодовые клещи. Основное эпидемиологическое значение имеют комары, по крайней мере, 43 видов из 11 родов, преимущественно рода Culex. Естественно, что в различных экосистемах то или иное значение в эпизоотологии и эпидемиологии имеют разные виды комаров. В США вирус выделен от многих видов комаров родов Culex, Coquillettidia, Culiseta, Aedes 25 [33, 51, 141]. Одни виды рода Culex (C.pipiens, C.restuans) являются абсолютными кровососами птиц, обеспечивая циркуляцию вируса в природных и антропогенных биоценозах, другие (C.salinarius) пьют кровь и у птиц, и у млекопитающих (в том числе и у человека), являясь, поэтому эпидемиологически значимыми переносчиками [227]. Во время эпидемической вспышки в 1996 г. в Румынии основное эпидемиологическое значение в антропогенных биоценозах имели комары Culex pipiens. В Эфиопской зоогеографической области (Египет, ЮАР, Израиль) основную роль играют C.univittatus, что показано в полевых наблюдениях и при экспериментальном изучении. Несколько меньшее значение в этом регионе имеют C. pipiens и C.neavei. Во Франции выявлена важная роль C.modestus в качестве переносчика. В Израиле экспериментально установлена эффективная передача вируса комарами C.pipiens molestus. Этот вид, наряду с высокой агрессивностью по отношению к человеку, обладает также выраженной орнитофильностью и может иметь серьезное эпидемическое значение в городах, где он способен размножаться в подвалах домов. В Индии и Пакистане основными переносчиками являются комары комплексов С. vishnui, C. quinquefasciatus, C. fatigans.. Комары рода Culex перезимовывают в стадии имаго. ВЗН был выделен в США в зимнее время от напитавшихся осенью кровью самок. Это один из возможных, наряду с сохранением вируса в клещах, механизмов сохранения вируса в зимнее время и создания устойчивых природных и антропогенных очагов инфекции. В России в очагах ЛЗН в Северо-Западном Прикаспии, территория которого включает в себя Астраханскую область и юг Волгоградской, включая Волгоград, число видов комаров - потенциальных переносчиков ВЗН - достигает 15-ти, из них вирус ЗН обнаружен в 6 видах [15, 24]. Наиболее важное эпизоотическое значение имеют комары вида Cl. modestus, они же могут играть важную роль в эпидемических процессах, особенно в открытых урбанизированных биотопах. Комары Cl. pippiens являются основными переносчиками вируса в популяциях птиц и между популяциями птиц и 26 млекопитащих. Определенное эпизоологическое значение могут иметь также комары Coq.richiardii и An. messeae, особенно в годы их высокой численности [15, 24]. ВЗН неоднократно выделяли от иксодовых и, особенно часто, аргасовых клещей. Их роль в сохранении вируса в межэпидемический период доказана многократно в полевых и экспериментальных исследованиях. Вирус был выделен в Египте от клещей Argas hermanii, собранных зимой. Показано возникновение стойких очагов на юге СССР за счет адаптации вируса к клещам Ornithodoros coniseps, обитающих в гнездовьях чаек и крачек в бассейне Каспийского моря [17]. 1.1.2. Эпидемиология Лихорадки Западного Нила. Лихорадка Западного Нила является спорадическим, природноочаговым заболеванием. Возникновению эпидемической ситуации часто предшествует эпизоотия среди домашних или синантропных животных, которая, в свою очередь, развивается после эпизоотии среди диких животных. Заболевания среди диких животных, как правило, остаются незамеченными. Впервые ВЗН был изолирован в 1937 году в провинции Западный Нил в Уганде от больного с легкой лихорадкой. В течение многих лет после описания ВЗН спорадическая заболеваемость и некрупные вспышки ЛЗН отмечались в Африке, на Ближнем Востоке и Азии. Первые значительные вспышки ЛЗН были зарегистрированы в 1950-1954 годах и в 1957 году в Израиле, а также в 1974 году в ЮАР, когда заболело около 3000 человек. Летальных исходов во время этих вспышек зарегистрировано не было. Случаи менингоэнцефалита, вызванные ВЗН, впервые наблюдались в 1957 году во время вспышки в Израиле (среди пожилых пациентов), а позднее в Индии (среди детей) со смертельными исходами. Начиная с 1990-х г.г. характер патогенности эпидемических вспышек ЛЗН резко изменился в неблагоприятную сторону. В 1994 году произошла вспышка в Алжире, в ходе которой было зарегистрировано около 50 случаев 27 заболевания с 8 летальными исходами. Последующая вспышка ЛЗН была зарегистрирована в Румынии в 1996 году, где также наблюдался необычно высокий для ЛЗН (около 9%) уровень смертности. В 1997 году на гусиных фермах в Израиле случилась крупная эпизоотия ЛЗН с острыми неврологическими проявлениями. Эпизоотия сопровождалась высокой смертностью птиц и повторилась в 1998 году. Там же в этот период отмечались и многочисленные случаи энцефаломиелита, вызванного ВЗН, среди лошадей. Среди людей эпидемия случилась в 2000 году, хотя еще в 1999 году было отмечено два смертельных случая заболевания ЛЗН. В общей сложности в 2000 году в Израиле было зарегистрировано 417 подтвержденных случаев заболевания ЛЗН, причем в половине случаев с поражениями ЦНС (энцефалит). Уровень смертности при этом составлял, по разным данным, от 8 до 14 %. В 1999 году почти одновременно вспышки ЛЗН произошли на юге России и в Нью-Йорке, США, при сходном уровне летальности. Здесь следует особо отметить, что до 1999 года американский континент был свободен от вируса. Однако уже через год возник очаг во Флориде, а к 2003-2004 году практически вся территория США, Южной Канады и Латинской Америки стала эндемичной с высоким для данной инфекции уровнем заболеваемости и смертности. По данным Center for Disease Control and Prevention (www.cdc.gov) за 1999-2008 гг. в США переболело около 29 тыс. человек, из которых 1124 умерло. Максимум заболеваемости был отмечен в 2003 году – в США 9862 подтвержденных случая, из них 24 - с летальным исходом, в Канаде -1335 случаев, из них 10 летальных [32]. В 2006 году ВЗН был обнаружен на территории Аргентины. В России спорадическая заболеваемость ЛЗН фиксировалась еще с середины 60-х годов прошлого столетия. В 1991-1996 гг., когда заболеваемость носила спорадический характер, в Астраханской области было зарегистрировано 10 случаев заболевания ЛЗН. В 1999 году было выявлено около 600 подтвержденных случаев, причем помимо Астраханской области, впервые больные были зарегистрированы также в Волгоградской области и в 28 Краснодарском крае. Позднее, заболеваемость ЛЗН фиксировалась и в 20012002 гг., но в меньшем масштабе [10]. Новая ограниченная вспышка ЛЗН была отмечена в Астраханской области и в 2005 году (около 70 случаев заболевания). 1.1.3. Географическое распространение вируса Западного Нила. До 1999 года ареал ВЗН был ограничен восточным полушарием. Однако сейчас его ареал занимает огромные территории в пределах экваториального, тропического и умеренного (южная часть) климатических поясов в Африке, Европе, Америке, Азии, Океании и Австралии. На рис. 3 показаны ареалы вирусов антигенного комплекса японского энцефалита. Из него, в частности, видно, что ВЗН является в настоящее время одним из самых широко распространенных вирусов рода Flavivirus. Кроме того, несмотря на близкие антигенные свойства, ареалы вирусов серокомплекса японского энцефалита перекрываются. Так, вирус Западного Нила в Индии сосуществует с вирусом японского энцефалита, в Австралии с вирусом энцефалита долины Мюррей, а в Северной Америке – с вирусом энцефалита Сент-Луис. Рис.3. Географическое распространение вирусов энцефалита Сент-Луис (SLEV), Западного Нила (WNV), Японского энцефалита (JEV) и энцефалита долины Мюррей (MVEV). 29 На территории стран бывшего СССР ареал ВЗН охватывает Молдавию, Украину, Белоруссию, юг европейской части России (степи и лиственные леса), в Западной Сибири – Алтайский край (степи и лесостепь). Кроме того, циркуляция вируса зафиксирована в Армении, Азербайджане, Грузии, Казахстане, Таджикистане, Киргизии, Узбекистане и Туркменистане [2, 6, 7, 8, 20, 21]. Заболеваемость ЛЗН за последние 20 лет регистрировалась в Казахстане и Среднеазиатских республиках, на Украине, в Азербайджане. Очень велик риск заражения в пустынных частях Поволжского района, особенно вдоль долин крупных рек. Наиболее активные природные очаги ВЗН находятся в дельте Волги, вдоль ее низовий до впадения в Каспий. Вопрос о механизмах изменения ареала вирусов остается одним из чрезвычайно сложных вопросов эпидемиологии из-за влияния множества причин самого различного происхождения – как природных, так и связанных с деятельностью человека. Так, например, вопрос, каким именно образом вирус Западного Нила проник на американский континент, остается открытым. Однако современная возможность быстрого получения и анализа генетической информации, наряду с развитием методов молекулярной эпидемиологии, позволяет надежно установить эпидемиологическую связь и эволюционные отношения между разными штаммами вируса. Так, анализ первичной структуры штаммов ВЗН, выделенных на территории Израиля в 1997 – 2001 гг., выявил их очень высокую идентичность штаммам, изолированным в 1999 г. в Северной Америке, в связи с чем Ближний Восток рассматривают как наиболее вероятный источник интродуцированного в США вируса [42, 56, 180]. 30 1.2. Филогенетический анализ вируса Западного Нила, его происхождение и эволюция 1.2.1. Происхождение и эволюция вируса Западного Нила Род Flavivirus насчитывает в настоящее время 15 антигенных комплексов. Большинство вирусов, вызывающих энцефалиты, относятся либо к антигенному комплексу японского энцефалита, либо к антигенному комплексу клещевого энцефалита. Вирус Западного Нила относится к антигенному комплексу японского энцефалита, куда помимо ВЗН входят еще 15 вирусов. Часть флавивирусов передается комарами, некоторые клещами, а ряд вирусов, включая ВЗН, обладает способностью к трансмиссивной передаче и комарами, и клещами. Результаты филогенетических исследований и эволюционного анализа свидетельствуют о том, что вирусы, переносимые клещами, вирусы, переносимые комарами и большинство вирусов без переносчика или переносчик для которых не установлен, относятся к трем различным эволюционным линиям, которые образовались на ранних стадиях эволюции представителей рода Flavivirus. [175, 209, 363]. Предполагается, что все три линии произошли от общего вируса-предшественника, циркулирующего в Африке около 10 000 лет назад, причем первой (приблизительно 3000 лет назад) произошла дивергенция вирусов без переносчика, затем вирусов, переносимых клещами и, в последнюю очередь, произошла дивергенция вирусов, переносимых комарами. Было также показано, что скорость эволюции арбовирусов ниже, чем у вирусов без переносчика. Кроме того, отношение числа несинонимических замен в геноме к синонимическим у вирусов, циркуляция которых связана с членистоногими и позвоночными, выше. Это означает, что на арбовирусы оказывается более выраженное селективное воздействие. С помощью эволюционного анализа протяженных участков геномов флавивирусов было установлено, что скорость эволюции вирусов, 31 переносимых комарами, выше скорости эволюции вирусов, переносимых клещами почти в два раза. При этом “комариные” и ”клещевые” вирусы существенно различаются топологией филогенетического дерева. Вирусы, переносимые клещами, имеют асимметричное филогенетическое дерево, для которого характерны постоянные появляющиеся в процессе эволюции ответвления, причем количество дочерних ветвей значительно больше, чем можно было бы ожидать на основе расчета математического ожидания. Филогенетическое дерево вирусов, переносимых комарами, имеет более сбалансированную топологию с меньшим количеством дочерних ветвей, причем большая часть из них возникла в последнее время (около 200 лет назад). Отношение количества несинонимических замен к количеству синонимических у “клещевых” вирусов выше, чем у “комариных”, при этом у “клещевых” вирусов чаще встречаются аминокислотные замены на биохимически близкие. Это указывает на то, что флавивирусы, переносимые клещами, испытывают большее селективное воздействие по сравнению с вирусами, переносимыми комарами. Таким образом, случайное появление жизнеспособных вариантов в популяции у “клещевых” вирусов является менее вероятным событием, чем у “комариных”. Важнейшим фактором эволюции вирусов, независимо от их характеристик, является хозяин. Смена основного хозяина часто приводит к появлению новых эпидемически важных вариантов вируса, вирулентных для нового хозяина. Для успешной циркуляции в природе арбовирусы должны эффективно репродуцироваться в таких отдаленных хозяевах, как позвоночные-прокормители и членистоногие-переносчики. Сопоставление филогенетических данных с данными экологических исследований позволило установить, что главным фактором эволюции флавивирусов на уровне вида является переносчик [125, 175, 209]. Из рис.4 хорошо видно деление членов всего рода Flavivirus на три основных кластера, связанных с типом переносчика. В свою очередь, кластер, объединяющий все флавивирусы, переносимые комарами, подразделяется на два субкластера, связанные либо с 32 комарами рода Culex (среди них вирусы ЯЭ, энцефалита Сент-Луис и Западного Нила), либо с комарами рода Aedes (среди них, например, вирусы желтой лихорадки и вирус Денге), причем субкластер “Сulex” сформировался уже после отделения “комариных” вирусов от “клещевых” и вирусов без переносчика. Доминирующая роль комаров рода Aedes и Culex в циркуляции флавивирусов объясняется их широким распространением, а также большим видовым разнообразием. Род Aedes насчитывает 975 различных видов, а Culex – 769, что в сумме превышает численность всех видов комаров, относящихся к остальным родам (1522). Из сопоставления филогенетических и экологических данных, представленных на рис.3, для вирусов, переносимых комарами, можно также заметить связь между переносчиком вируса и характером вызываемых им заболеваний. Так, большинство вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки, переносятся комарами рода Aedes, а вирусы, способные вызывать энцефалиты – комарами рода Culex. 33 Рис.4. Филогенетическое дерево представителей рода Flavivirus, совмещенное с экологическими данными. Иллюстрация из работы Gaunt M.W. et al., 2001. 34 1.2.2. Молекулярная эволюция ВЗН. ВЗН относится к группе комариных флавивирусов, переносчиком (вектором) для которых являются комары. Происхождение и эволюция комариных флавивирусов тесно связано с комарами родов Aedes и Culex [125, 175]. Имеющиеся данные филогенетического анализа указывают на то, что предшественники многих современных комариных флавивирусов могли возникнуть на Африканском континенте. Африканское происхождение вируса желтой лихорадки в странах Центральной и Южной Америки достаточно хорошо документировано, и есть все основания полагать, что занос вируса желтой лихорадки на Американский континент произошел около 300-400 лет назад во времена торговли рабами [75]. Хорошо известны примеры распространения комариных флавивирусов в течение последних десятилетий по обширным территориям Старого и Нового Света - это вирусы денге, Усуту, Кьясанурской лесной болезни и многие другие флавивирусы [60, 220, 224, 338]. Особое место в скорости распространения по новым территориям занимает ВЗН. Проникнув в 1999 году на территорию атлантического побережья Северной Америки ВЗН в течение всего нескольких лет распространился по территории как Северной, так и Южной Америки [132]. Аналогичная вспышка в Астрахани и Волгограде в 1999 году привела к распространению генотипа 1 вируса Западного Нила по Евразии вплоть до тихоокеанского побережья [234]. В последние годы регистрируется дальнейшее распространение ВЗН по территории России, вплоть до границы начала лесотундры. Причем вторая волна распространения ВЗН по РФ связана уже и с генотипом 2 этого вируса. По всей вероятности, вариабельность генома флавивирусов обеспечивает достаточно быструю молекулярную эволюцию флавивирусов и их адаптацию к новым природно-географическим условиям. Способность флавивирусов реплицироваться в различных видах комаров (клещей), птиц и млекопитающих определяет их успешное внедрение в различные типы природных очагов и быстроту распространения в новых природных ландшафтах. 35 В работе 2013 г. [22] авторами была проведена оценка скорости эволюции вируса Западного Нила. Для анализа было использовано 68 нуклеотидных последовательностей белка Е ВЗН. Скорость накопления нуклеотидных замен составила 2,5х10-4 замен на сайт в год. Филогенетический анализ и оценка времени эволюции ВЗН с применением методологии молекулярных часов показала, что на территории европейской части России циркулируют 1, 2 и 4 генотипы ВЗН с расчетным временем дивергенции от общего предшественника около 2360, 2800 и 5950 лет, соответственно. Соотношение частот несинонимичных замен (dN) к синонимичным (dS) может колебаться в пределах 0,022 – 0,275 для отдельных штаммов ВЗН, сгруппированных по географическому и/или филогенетическому признакам. Наиболее высокие значения соотношения dN/dS были обнаружены для современных изолятов ВЗН в России и Северной Америке, которые интродуцировались в новые природные биоценозы этих регионов в течение последних 14 лет. Оценка dN/dS для вида ВЗН показывает, что показатели внутривидовой изменчивости dN/dS могут быть использованы для оценки наличия ускоренной эволюции новых вариантов ВЗН. Все это подтверждает гипотезу о сложившихся благоприятных условиях для широкого распространения и быстрой эволюции различных генотипов ВЗН, возникших от 2 до 6 тысяч лет назад, в современных природно-климатических условиях. Вирусные штаммы, относящиеся к генотипу I ВЗН широко распространены в различных Африки, Европы и Азии [213]. Генотип I ВЗН (Нр-94) был впервые обнаружен на территории Российской Федерации в 1963 году. Несколько позднее, в период с 1967-1970 гг, было изолировано три генетически очень близких штамма (LEIV-72Az, LEIV-1640Az, LEIV-1628Az) на территории СССР (республика Азербайджан). Современный генотип 1а ВЗН, связанный с крупными вспышками заболевания человека лихорадкой Западного Нила в Волгограде и Астрахане, был обнаружен в России 1999 году. В этом же году этот геновариант ВЗН был обнаружен на Американском континенте, где вызвал вспышку заболеваний человека в Нью-Йорке. На 36 рисунке представлено филогенетическое дерево, построенное на основе 68 нуклеотидных последовательностей (рис. 5), кодирующих поверхностный белок E штаммов ВЗН, выделенных в разное время на различных территориях. В качестве внешней группы для укоренения филогенетического дерева использовали гомологичный участок последовательности гена E ВКЭ штамма Glubinnoe/2004. По результатам расчетов, скорость накопления замен в гене E ВЗН составила в среднем 2,5х10-4 замен на сайт в год. Согласно последним опубликованным работам, посвященным филогении ВЗН, данный вид разделяют на 5 основных генотипов [60]. Вирус Кунджин входит в первый генотип, но образует в нем отдельный подкластер (1b) [30]. Российские штаммы ВЗН имеют различное происхождение, несмотря на то, что большинство из них выделены на юге России. Так, к первому генотипу относятся штаммы Hp-94, Ast99-901 (Астрахань), VLG-4, LEIV-Vlg99-27889 и LEIV-Vlg00-276249 (Волгоград). Штамм, выделенный в Астрахани в 1999 году, кластеризуется с циркулирующими в США штаммами, однако генетически более близок к входящим в этот же кластер штаммами, выделенными в Тунисе и Венгрии. Возраст ближайшего общего предка российского штамма Ast99-901 и родственных ему нероссийских изолятов (узел Д) составляет 158 лет. Три волгоградских штамма VLG-4, LEIV-Vlg9927889 и LEIV-Vlg00-276249 имеют общее происхождение с румынским штаммом RO97-50 (узел Ж), который в свою очередь происходит от одного предка (узел Е) со штаммом KN3827, выделенным в Кении. В рассматриваемый подкластер входят как европейские и российские штаммы, так и штаммы, выделенные на африканском континенте (Египет, Марокко, Кения), причем географическая близость не коррелирует с генетической, и весь подкластер имеет современное происхождение. Общий предок данного подкластера существовал порядка 86 (71-107) лет назад. Возможно, в течение недавнего времени между этими территориями происходил множественный обмен штаммами ВЗН, что может быть связано с миграциями птиц. 37 Штамм Eg101, выделенный в Египте в 1951 г. – самый старый из вошедших в исследование штаммов ВЗН относится к генотипу 1 и дивергировал от общего с остальными штаммами предка (узел Г) около 304 года назад. Вместе с ним кластеризуются штаммы HP-94, LEIV-72Az, LEIV1640Az, LEIV-1628Az изолированные из птиц и клещей на территории СССР в районе Каспийского моря и индийский штамм 68856 (1968г). Вирус Кунджин, выделенный в Австралии в 1960, году также относится к генотипу 1, но образует в нем отдельный кластер (1b). Вирус Кунджин и штаммы генотипа 1а разделились около 938 лет назад (узел В). Штаммы ВЗН, выделенные в Индии, образуют отдельный генотип, филогенетически наиболее близкий к генотипу 1 и обозначенный как генотип 5 [60]. Недавно, было опубликовано несколько новых геномных последовательностей штаммов, изолированных в Индии в период с 1955 года по 2011 год (рис.5). Эти штаммы формируют компактную филогенетическую группу, что свидетельствует об их циркуляции на территории Индии в течение достаточно длительного времени. Некоторые авторы считают, что эта группа штаммов ВЗН может быть отнесена к генотипу I и общий предок этого генотипа циркулировал на Восточном побережье Африки [213]. Согласно расчетам на основе последовательности гена белка Е, генотипы 1 и 5 разделились около 2360 лет назад, что подтверждает правомочность выделения генотипа 5 в отдельную филогенетическую группу ВЗН. Генотип 2 достаточно древний. Возраст общего предка всех представителей данного генотипа составляет примерно 1339 лет. Генотип 2 объединяет африканские штаммы, выделенные в различное время (с 1958 по 2004 гг.), а также включает целый ряд современных вариантов ВЗН, выделенных в Волгограде последовательности в российского 2007 штамма г. Анализ VLG/07 полноразмерной показывает, что Волгоградские изоляты достаточно давно отделились от африканских штаммов. Предок данного штамма, вероятно, был занесен на территорию России из Африки через территорию Израиля, так как эти варианты 38 кластеризуются со штаммом Sarafend (AY688948.1), выделенным ориентировочно в середине прошлого века. Генотип 3 представлен единственным Европейским штаммом Rabensburg и имеет общего предка с генотипом 2 (возраст общего предка составляет около 2815 лет). Предок, от которого произошли все четыре описанных генотипа ВЗН (узел Б), существовал около 3568 лет назад. Генотип 4 ВЗН возник около 5945 лет назад (узел А). Данный генотип интересен в первую очередь тем, что все известные на сегодняшний день его представители были выделены на территории России и северо-западного Кавказа с 1998 по 2006 годы. Кроме того, данный генотип генетически наиболее удален от первых четырех генотипов ВЗН и, вероятно, эндемичен на территории России порядка 132 лет (узел И). Таким образом, на территории России выявляются штаммы ВЗН, принадлежащие к трем генотипам: 1, 2 и 4. Основным вектором для ВЗН являются комары различных видов, которые инфицируют птиц. Кочевой образ жизни птиц обеспечивает быстроту распространения вируса по территории различных географических районов, и объясняет практически повсеместное распространение ВЗН по территории пяти континентов. В последние 14 лет особенно быстро распространялся современный генотип 1а ВЗН, который за этот период широко распространился по территории Европы, Америки, Азии и Африки. С ним связаны многочисленные случаи заболевания человека и, по всей вероятности, ВЗН интродуцировался в природные ландшафты в различных природных и климатических условиях [132, 172]. Современные исследования достаточно точно описывают климатические изменения на нашей планете на протяжении последних нескольких тысяч лет [164, 187, 208]. Окончание последнего ледникового периода датируется около 10 тысяч лет тому назад. Фактически эта дата и является ключевой для освоения флавивирусами новых территорий на севере Евразии и Америки после таяния ледников. Также описаны дальнейшие периоды сильных похолоданий с последующими периодами потеплений, 39 которые также могли существенно изменить географию распространения комаров и клещей. Это могло существенно влиять на эволюцию флавивирусов на северных территориях Евразии и Америки. Наиболее близкие существенные похолодания датируются около 2200-1900, 1550-1150, 830-655 и 400-200 лет назад. В эти периоды средняя температура ледников Гренландии могла изменяться на 2-3 градуса. Последний период похолодания в многочисленных письменных свидетельствах даже получил название малого ледникового периода [208]. Рассчитанные времена дивергенции основных генотипов ВЗН существенно отличаются от таковых для двух исследованных клещевых флавивирусов. Это не позволяет связать эволюцию ВЗН с периодами резких климатических изменений, что, по всей вероятности, более характерно для клещевых флавивирусов. Узел дивергенции генотипов 1 и 5 ВЗН может быть связан с периодом выраженных климатических изменений, который имел место около 2200-2400 лет назад (окончание «Римского потепления»). Репликация ВЗН в комарах существенно зависит от температуры [273]. Так при температуре 14,3⁰С уже фактически прекращается активная репликация ВЗН в современных комарах рода Culex. Это обстоятельство предопределяет ареал формирования природных очагов ВЗН в более теплых регионах по сравнению с клещевыми флавивирусами, переносчики которых становятся активными ранней весной при средней температуре около 0 ⁰С [264]. Также интересно отметить, что различные генотипы ВЗН, разделившиеся довольно давно, циркулируют в одном географическом регионе. Так, на территории Волгоградской области обнаруживаются генотипы 1, 2 и 4 ВЗН. Это говорит о том, что занос ВЗН на территорию Европы осуществлялся, как минимум, несколько раз в различные исторические периоды. Буквально несколько лет назад аналогичный пример заноса и распространения в Европе описан для вируса Усуту, который является близкородственным ВЗН комариным флавивирусом [74]. Ранее он обнаруживался на юге Африки, а в 2001 году впервые был найден и на 40 территории Европы - в Австрии во время вспышки заболевания у птиц. В настоящее время он обнаруживается во многих странах южной Европы, и моделирование климатических изменений показывает, что этот вирус может стать эндемичным для Европы в самом ближайшем будущем. Тест селекции (соотношение dN/dS), примененный к гену Е ВЗН, показал, что на территории Африки ВЗН подвергается стабилизирующему отбору. Эти данные подтверждают гипотезу африканского происхождения ВЗН. Влияние движущего отбора показано для российских штаммов ВЗН, что указывает на наиболее активную эволюцию ВЗН на данной территории. Это, по всей видимости, связано с недавним происхождением данных штаммов от их европейских и африканских предков. Также влияние движущего отбора показано для изолятов ВЗН, выделенных на территории Америки, на которой данный вирус также стал эндемичным относительно недавно. Таким образом, оценка скорости эволюции ВЗН, активно циркулирующего на территории России, показала, что скорость накопления нуклеотидных замен в нуклеотидной последовательности гена Е составляет приблизительно 2,5 х 10-4 замен на сайт в год. Оценка, проведенная для целого генома ВЗН, показала, что для различных штаммов скорость накопления мутаций может колебаться в пределах 6,35 x 10-3 до 4,27 x 10-5 [213]. Расчеты, проведенные ранее для клещевых флавивирусов, дали значение равное 1,4х10 4 для гена белка Е ВКЭ и 5,4х10-5 для гена NS5 вируса Повассан. Оценка времени дивергенции по гену белка Е от общих предшественников для 1, 2 и 4 генотипов ВЗН, циркулирующих на территории европейской части России, показала, что расчетное время дивергенции составляет 2360, 2800 и 5950 лет, соответственно. Расчет времени дивергенции основных геновариантов ВЗН по полноразмерному геному ВЗН и с использованием иного методического подхода уменьшил время дивергенции основных генотипов ВЗН [213]. Это демонстрирует, что использование полного вирусного генома, разных методов расчета времени дивергенции могут вносить существенные различия в результаты подобных расчетов. 41 Изменение времени дивергенции также может быть связано с использованием в расчетах нуклеотидных последовательностей с некоторыми характерными особенностями. Например, вариабельность нетраслируемых областей вирусного генома, возможные шифтовые (рекомбинационные) изменения генома, особенности проведения составления расчетов, секвенирование увеличение протяженных последовательностей с низким выборки доли последовательностей технических фрагментов уровнем генома, ошибок для при использование достоверности вследствие применения некоторых новых методов секвенирования может существенно исказить результаты. Эти предположения косвенно подтверждаются высоким уровнем замен нуклеотидов в геномах некоторых вариантов ВЗН. Он достигает значений 6,35 x 10-3, что сравнимо или даже превосходит уровень изменчивости характерной для вируса иммунодефицита человека. также было описано, что последовательности некоторых Ранее штаммов флавивирусов не укладываются в гипотезу последовательной эволюции и не могут быть использованы для расчетов времени дивергенции основных генотипов. 42 Рис.5 Филогенетическое дерево штаммов ВЗН, построенное на основе фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей белок E. Жирным шрифтом выделены последовательности российских изолятов ВЗН. В рамках указано усредненное время дивергенции основных геногрупп ВЗН, в скобках приведены временные интервалы с вероятностью 0,95. Треугольником черного цвета, обозначенного «Штаммы ВЗН, СССР, 1963 – 1970 гг.; Индия, 1968; Африка, 1951», представлены последовательностями: JX041630; JX041633; JX041628; JX041629; EU249803; AF260968. Треугольником черного цвета, обозначенного «Штаммы ВЗН, Индия, 1955 – 2011гг.», представлены последовательностями: JX041632; GQ851605; GQ851604; KC601756; DQ256376. 43 1.2.3. Генотипы вируса Западного Нила До недавнего времени все известные штаммы ВЗН, включая индийские, подразделялись на два генотипа, а австралийский генотип вируса Кунджин и вовсе считался отдельной нозологической единицей. Однако по мере накопления данных о первичной структуре геномов различных изолятов ВЗН, эта филогенетическая картина подверглась существенному пересмотру. Вопервых, вирус Кунджина был признан 1b-субтипом вируса Западного Нила. Во-вторых, были открыты изоляты ВЗН, образующих, по крайней мере, еще два отдельных самостоятельных генотипа – Рабенсбург 97-103 из Центральной Европы и LEIV-Krnd88-190 из России [19, 40]. И, наконец, индийские штаммы - новые и уже известные - были отнесены к отдельному, пятому генотипу ВЗН [60]. Таким образом, к настоящему моменту известно, по меньшей мере, пять различных генотипов вируса. Количественные оценки дивергенции между ними приведены в таблице 1. Нуклеотидная дивергенция между различными генотипами вируса ЗН варьирует в пределах 20-25% , а внутри отдельных генотипов - 5-15%. Таблица 1. Нуклеотидное сходство между различными генетическими линиями вируса Западного Нила. Данные взяты из работы V.P.Bondre и соавторов, 2007 В целом, принадлежность к той или иной генетической линии коррелирует с географическим распространением вируса. Так, субкластер 1b первой группы содержит только изоляты из Австралии (Кунджин), штаммы из Южной Африки и Мадагаскара относятся ко второй группе, а все изоляты из Индии объединяются в пятом генотипе. Два изолята, LEIV-Krnd190 44 (российский изолят из Краснодарского края) и Rabensburg 97-103 (из Центральной Европы), образуют отдельные генетические линии вируса. Однако полной корреляции между генотипами и их географическим распространением все же не наблюдается. По-видимому, это связано с тем, что важную роль в циркуляции ВЗН играют птицы, способные к передаче вируса на длительные расстояния, иногда на другие континенты. Так, субкластер 1а первой группы содержит изоляты самого различного географического происхождения – из Африки, Европы, Ближнего Востока и Северной Америки. На территории России зафиксирована циркуляция, по крайней мере, трех различных генотипов ВЗН – 1, 2 и 4. Проведенные комплексные вирусологические и молекулярно-генетические исследования показали абсолютное доминирование 1-го генотипа. [16, 19]. 1.3. Генетическая организация и репликативный цикл флавивирусов 1.3.1. Общее строение вирусного генома Флавивирусы - это небольшие, размером около 45 нм, РНК-содержащие вирусы с липидной оболочкой. Вирусные частицы состоят из нуклеокапсида размером примерно 30 нм, сформированного вирусным капсидным белком и вирусной РНК, и липидного бислоя, в который погружены два других структурных белка вируса – мембранный M и оболочечный Е. Однонитевая позитивная РНК вируса длиной примерно 11 000 нуклеотидов кодирует одну открытую рамку считывания, которая фланкирована 5’ и 3’ – нетранслируемыми областями (Рис.6). Геномная РНК инфекционна и в клетке функционирует как мРНК. Её 5’-нетранслируемая область кэпирована по первому типу, начинается с консервативного динуклеотида AG нетранслируемая и содержит область примерно неполиаденирована, 90-130 нуклеотидов; варьирует от 3’- 430-760 45 нуклеотидов и заканчивается консервативным динуклеотидом CU [81, 277]. 5’- и 3’- нетранслируемые области играют очень важную роль в процессе репликации флавивирусного генома. В них содержатся консервативные элементы первичной и пространственной структуры РНК вируса, специфичные для различных серологических комплексов. Функциональная значимость этих элементов и их потенциальное взаимодействие с клеточными и вирусными белковыми факторами были вначале постулированы на основе анализа первичной структуры флавивирусных геномов. Позднее, с развитием методов обратной генетики функциональный анализ таких элементов подтвердил эти предположения [73, 194, 277]. Рис. 6. Организация структуры генома флавивирусов. Открытая рамка считывания фланкирована 5’и 3’ – нетранслируемыми областями. 5’ – конец геномной РНК кэпирован. Показаны вирусные белки, образующиеся в результе протеолитического расщепления полипротеин 46 Условная схема репликации флавивирусов изображена на рис. 7. Флавивирусы проникают в клетку путем эндоцитоза, опосредованного рецепторным взаимодействием пока не идентифицированного мембранного белка клетки-хозяина с вирусным оболочечным белком. Внутри эндосомы под влиянием рецепторного взаимодействия и/или более кислой среды запускается механизм конформационного изменения вирусного оболочечного гликопротеина Е, в результате которого пептид слияния, ранее скрытый внутри белка, экспонируется наружу и вставляется в липидную оболочку эндосомальной везикулы. После этого происходит слияние вирусной и эндосомальной мембран, в результате которого вирусный нуклеокапсид “раздевается” и оказывается в цитоплазме клетки-хозяина. Предполагается, что именно пептид слияния играет главную роль в процессе слияния мембран, хотя не исключено, что имеются и другие необходимые факторы, обеспечивающие полное конформационное взаимодействие липидных бислоев. Рис. 7. Условная схема, иллюстрирующая цикл репликации флавивирусов 47 1.3.2. Трансляция вирусного генома Трансляция генома приводит к образованию полипротеина- предшественника длиной примерно 3400 аминокислот, из которого, в результате ко- и посттрансляционного расщепления клеточными и вирусной протеазами, образуются индивидуальные вирусные белки [286]. Структурные белки C, капсидный белок; prM/M, (пре)мембранный белок и Е, гликопротеин внешней оболочки расположены в N-концевой части полипротеинапредшественника и занимают примерно 25 всей открытой рамки считывания. Оставшиеся 75 кодируют неструктурные белки: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5. Хотя структурные и неструктурные белки образуются из одного полипротеина-предшественника, с некоторыми ограничениями можно считать их функции независимыми. Структурные белки отвечают за формирование и сборку вириона, а неструктурные - за репликацию вирусного генома. Это, в частности, приводит к тому, что структурные белки prM и E, экспрессированные отдельно, способны самостоятельно формировать рекомбинантные вирусоподобные частицы (без нуклеокапсида) с идентичной оригинальной структурой и аналогичными рецепторными и фузионными свойствами. С другой стороны, геном вируса, лишенный структурной части, способен к самостоятельной успешной репликации в клетке и упаковке in trans вирусных частиц. Другим важным практическим следствием является возможность создания химерных, или гибридных, флавивирусных частиц, у которых структурная (как правило, prM и E) и неструктурная части принадлежат разным вирусам. Такой подход используется, в частности, при создании флавивирусных вакцин. В клетке полипротеин–предшественник ассоциирован с мембраной эндоплазматического ретикулума (ЭПР) с помощью гидрофобных участков в некоторых вирусных белках. Эти гидрофобные участки, расположенные на Сконцах белков М, Е и NS4А, на N-концах белков NS2A и NS4B и в центральной части белка С, “заякориваются” в мембране ЭПР, в результате 48 чего полипротеин-предшественник занимает в клетке сложное пространственное положение [93, 243, 356]. 1.3.3. Процессинг и биологические функции неструктурных белков Процессинг полипротеина-предшественника является сложным, регулируемым процессом с участием вирусной и клеточных протеаз. Выщепление неструктурных белков, в основном, осуществляется в клеточной цитоплазме вирусспецифической протеазой, расположенной в N–концевом домене белка NS3. Исключения составляют сайты NS1-NS2А, который расщепляется пока неизвестным ферментом, и NS4A-NS4B, который служит мишенью для клеточной сигнальной пептидазы, однако его расщепление происходит эффективно лишь после разрезания вирусной протеазой внутреннего сайта в белке NS4A. Такой механизм регуляции каталитической активности сигнальной пептидазы является необычным и описан пока только для процессинга флавивирусных белков. Выщепление самой вирусной протеазы (по сайтам NS2B-NS3 и NS3-NS4A) происходит автокаталитически. Показано, что она является трипсино-подобной сериновой протеазой с аминокислотным мотивом His51-Asp75-Ser135 в функциональном активном центре, а гидрофильный домен белка NS2B служит кофактором ее каталитической активности. Помимо протеазной активности, за которую отвечает N-концевой домен, белок NS3 проявляет еще, как минимум, три биологических активности, выступая как геликаза, нуклеотидтрифосфатаза и РНК 5’- трифосфатаза, за которые отвечает его C-концевой домен. Неструктурный белок NS1 (46 кДа) – вариабельный гликозилированный протеин, который существует в клетке как димер, а также может секретироваться из инфицированных клеток млекопитающих, но не насекомых, в гексамерной форме. Растворимые формы белка NS1 известны достаточно давно в качестве комплемент-связывающего антигена [89]. Внутри инфицированных клеток NS1 обнаруживается в ассоциации с двухцепочечной репликативной формой вирусной РНК [72]. Основная известная функция NS1 49 – подавлять выработку интерферона (ИФН) инфицированной клеткой путем ингибирования TLR3’ – опосредованной активации фактора 3 (IRF3) регуляции ИФН [298, 349]. Таким образом, NS1 играет роль “усилителя вирулентности” при флавивирусных инфекциях. Мутации, снижающие уровень гликозилирования NS1, приводят к снижению вирулентности, а полная отмена гликозилирования – к неустойчивой репродукции вируса и появлению множественных дополнительных мутаций [96]. NS1 способен вызывать выраженный протективный эффект при иммунизации животных [191, 193]. Неструктурный белок NS2A (22 кДа) обладает выраженной гидрофобностью, имеет трансмембранную локализацию и, по-видимому, участвует в сборке вириона [185, 195]. Неструктурный белок NS2B (14 кДа), как уже упоминалось выше, играет роль кофактора вирусной протеазы NS3. Минимально необходимым фрагментом белка, способным осуществлять эту функцию, является центральный гидрофильный участок протяженностью 40 аминокислотных остатков [185]. Фланкирующие этот участок гидрофобные домены модулируют связывание комплекса NS2B-NS3 с мембранами. Накопление в этих доменах мутаций, повышающих гидрофильность, ведет к снижению вирулентности [70]. Неструктурный белок NS4A (16кДа) в инфицированной клетке колаколизован с NS1 и двухцепочечной репликативной формой вирусной РНК, модулируя снижение выработки ИФН хозяйской клеткой и репликативной активности вируса [194]. Неструктурный белок NS4B (27 кДа) имеет совместную локализацию в инфицированной клетке с NS3 и двухцепочечной репликативной формой вирусной РНК. Наряду с NS4A, белок NS4B способен подавлять выработку интерферона инфицированной клеткой. Показано, что мутация 249 E G на С-конце (“заякоренном” в мембрану эндоплазматического ретикулума) NS4B приводит к снижению репликативной активности вируса и возникновению 50 вблизи частично компенсирующих мутаций [270]. 1.3.4. Репликация вирусного генома Процессинг неструктурных белков приводит к репликации вирусного генома, которая осуществляется в две стадии. На первой стадии образуется негативная цепь РНК, комплементарная исходной (+)РНК вирусного генома. Эта негативная цепь сохраняется и используется в качестве матрицы для наработки новых положительных РНК-цепей. Синтез РНК осуществляет репликативный комплекс, состоящий из вирусных и, вероятно, клеточных белков. Главную роль в этом комплексе играет самый большой (103 кДа) вирусный белок NS5, C-концевой домен которого обладает свойствами РНКзависимой РНК- полимеразы. Помимо этого, N-концевой домен белка NS5 обладает функцией метилтрансферазы и отвечает за образование 5-cap структуры, необходимой для стабилизации и успешной трансляции эукариотической РНК. Обе эти функции были сначала постулированы на основе анализа аминокислотной последовательности белка NS5. Делеции в Nи С- участках NS5 блокируют репродукцию вируса [166]. Детально механизм синтеза вирусной РНК изучен пока недостаточно. Известно, однако, что очень важную роль в этом процессе играет взаимодействие некоторых консервативных структурных элементов вирусной РНК, расположенных вблизи ее 5’ и 3’ – концов. 51 Рис.8. Элементы структуры вирусной РНК, вовлеченные в ее псевдоциркуляцию и репликацию. Показано, что для псевдоциркуляции и успешной репликации вирусной РНК, необходимы, в частности, два вида таких удаленных in cis взаимодействий – между комплементарными участками 5’CS - 3’CS и 5’UAR3’UAR (рис. 8.) Удаление этих участков, подавление их функций с помощью антисмысловых олигомеров или нарушение их взаимодействия у мутантных вирусов приводило к отсутствию репликации (но не трансляции) вирусной РНК [364]. Кроме того, важную роль в процессе репликации генома играет сам 3’- концевой участок РНК вируса (рис.9), формирующий вторичную структуру, чрезвычайно консервативную для флавивирусов и взаимодействующий с эукариотическим фактором элонгации транскрипции eEF1A [57, 58, 105, 196, 302, 303, 318, 319]. 52 Рис.9. Вторичная структура участка 3’SL (stem loop), участвующего в репликации вирусного генома. 1.3.5. Образование зрелых структурных белков и сборка вириона Образование зрелых структурных вирусных белков и сборка вириона происходят поэтапно, с образованием промежуточных белковых комплексов и незрелых вирусных частиц. Как и в случае с NS4A-NS4B, эффективное расщепление клеточной сигнальной пептидазой сайта С-prM регулируется активностью вирусной протеазы, которая сначала разрезает белок С по его внутренней последовательности. После отщепления клеточной сигнальной пептидазой N-концевых сигнальных последовательностей белков prM, E и NS1 в полостях эндоплазматического ретикулума, prM и E образуют нековалентно связанные гетеродимеры, которые встраиваются в незрелые вирусные частицы. Показано, что образование таких prM/E гетеродимеров играет важную роль в правильной укладке и транспорте белка Е. Далее незрелые вирусные частицы, состоящие из вновь синтезированной геномной РНК, капсидного белка С, и prM/E-гетеродимеров, транспортируются из клетки через транспортную сеть аппарата Гольджи. В процессе этого 53 транспорта происходит гликозилирование белков prM и E, после которого клеточная протеаза фурин разрезает prM с образованием зрелой структурной формы мембранного белка M. Такое созревание мембранного белка дестабилизирует общую структуру prM/E-гетеродимера и приводит к его конформационной перестройке, в результате которой образуются гомодимеры оболочечного белка Е, входящие в состав зрелых вирусных частиц. Созревшие вирионы “отпочковываются” от клетки, высвобождаясь во внеклеточную среду путем экзоцитоза. 1.4. Генетические факторы патогенности ВЗН Флавивирусы относятся к нейротропным возбудителям, способным вызывать у человека лихорадки и энцефалиты разной степени тяжести. Классической моделью для изучения патогенеза вызываемых ими заболеваний являются новорожденные и взрослые мыши нескольких линий. Обычно проявление патогенности флавивирусов на мышах тесно связано с возрастными факторами, характеризующими зрелость защитных систем организма, в первую очередь ИФН. Система интерферона обеспечивает состояние невосприимчивости организма к вирусам и является важнейшей составной частью врожденного иммунитета. Активация генов системы ИФН и синтез антивирусных цитокинов приводит к усилению адаптивного и гуморального иммунитета. На специальных линиях мышей, дефектных по ИФН-зависимым генам, при многих вирусных инфекциях показана высокая значимость системы ИФН в развитии заболеваний. Флавивирусы (ВЗН, вирус японского энцефалита, вирус Денге и др.) нарушают клеточный механизм индукции ИФН-зависимых генов, действуя на активацию сигнальных факторов транскрипции STAT [133, 144]. В роли антагонистов ИФН-сигналов выступают неструктурные белки флавивирусов NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5 [55, 192, 195, 349]. Эти вирусные белки, взаимодействуя с тирозиновыми киназами Jak1 и Tyk2, препятствуя их фосфорилированию. Вызываемый флавивирусами блок активности системы 54 действия ИФН на этапе передачи сигналов к антивирусным клеточным генам обеспечивает необходимые условия для вирусной репродукции [192, 195]. Гуморальный иммунитет является важным компонентом в системе защиты организма хозяина от вирусной инфекции. Дефектные по Bлимфоцитам линии мышей погибали при инфицировании ВЗН, но выживали при пассивной иммунизации. Главной мишенью нейтрализующих антител является оболочечный белок Е. Согласно данным рентгеноструктурного анализа белок Е является димером, каждый мономер которого состоит из трех структурных единиц. (рис. 10). Домен I является центральным, несет основную структурную нагрузку, имеет форму -складчатой глобулы, содержит антигенные эпитопы и сайт гликозилирования. Домен II содержит пептид слияния высоко консервативный для флавивирусов DRGWGNGCGLFGK и является pH-лабильным: его конформация изменяется при понижении pH, после чего происходит слияние вирусной и клеточной мембран. Домен III является иммуноглобулиноподобным и содержит сайт связывания с клеточным рецептором, а также эпитопы для вируснейтрализующих антител [48, 183, 217]. Сайт потенциального N-гликозилирования в домене I, находящийся в а.к. 154-156 белка Е имеет важное значение для патогенных свойств вируса. У представителей ВЗН, относящихся к разным генетическим линиям, соответствующие аминокислотные позиции очень вариабельны – NYP, SYS, KYS и т.д. У ряда штаммов, относящихся ко второму и четвертому генотипу, в этом месте наблюдается делеция аминокислот 154-156 [30, 50, 53, 82]. 55 Рис. 10. Схематичная трехмерная структура отдельного мономера оболочечного белка Е ВЗН. Показан олигосахарид, связанный с аспарагином в а.к. позиции 154. Три домена белка изображены разным цветом. Домен слияния (fusion loop) выделен оранжевым цветом, 6 дисульфидных мостиков – зеленым. Иллюстрация взята из работы Kanai R., 2006. В опытах in vivo было показано, что дегликозилирование белка Е в штамме ВЗН, относящемся к первому генотипу, приводило к аттенуации нейроинвазивности, но не нейровирулентности в мышах [49]. Однако некоторые штаммы ВЗН, также относящиеся к первому генотипу и 56 гликозилированные по белку Е, аттенуированны к нейроинвазивности в мышах [82, 135]. Кроме того, описаны случаи энцефалита у людей и животных, вызванные южноафриканскими штаммами ВЗН, относящимися ко второму генотипу с негликозилированными вариантами белка Е [61]. Таким образом, связь между гликозилированием белка Е и нейроинвазивным фенотипом вируса не является взаимно-однозначной. По-видимому, существуют и другие генетические факторы, отвечающие за патогенные свойства вируса, в том числе нейроинвазивные и нейровирулентные. Дегликозилирование белка Е также влияло на сборку вирусных частиц и уменьшало способность вируса реплицироваться in vitro в клетках насекомых, но не млекопитающих [139]. В опытах in vivo при заражении комаров Culex pipiens и Culex tarsalis штаммом ВЗН NY-1999 и его дегликозилированным по белку Е мутантом (NYS IYS) было показано, что потеря гликозилирования существенно снижает способность репликации вируса в организме переносчика и приводит к возникновению обратных реверсий (IYSNYS) [231]. Для успешной циркуляции в природе флавивирусы должны эффективно заражать и реплицироваться в таких отдаленных хозяевах, как насекомые и позвоночные. ВЗН способен успешно инфицировать самые разные линии клеток животных, включая клетки млекопитающих, птиц и насекомых, что, по-видимому, обеспечивается способностью вируса связываться со многими и/или высоко консервативными клеточными рецепторами. Такая относительно широкая тропность, по-видимому, вносит свой вклад и в широкий спектр клинических проявлений ЛЗН. Рецепторы, используемые ВЗН in vivo, в настоящее время активно изучаются. В экспериментах in vitro показано, что рецепторами для ВЗН служат интегрин V3 [184] и/или лектины DC-SIGN, DC-SIGN-R [104]. Вирус Западного Нила, как и другие флавивирусы, является цитолитическим и вызывает апоптоз во многих клетках, включая нейроны. В ряде исследований in vitro показано, что экспрессия отдельных вирусных 57 белков – капсидного или NS3 также вызывает Casp9-зависимый апоптоз [359]. Установлено, что апоптозоиндуцирующий сигнал локализован в С-концевом участке капсидного белка, поэтому мутанты с заменами на С-конце капсидного белка могут обладать пониженной патогенностью. Эпидемия ЛЗН в 1998-1999 гг. в Израиле и Северной Америке сопровождалась массовой гибелью ворон. Как уже упоминалось выше, высокая восприимчивость к вирусу Западного Нила, широкая распространенность почти на всей территории страны, а также плотность популяции этих птиц в населенных пунктах придают им большое эпидемиологическое значение как резервуара в урбанистической циркуляции ВЗН в США. Необычно высокая и не наблюдавшаяся ранее смертность среди птиц, вызванная ЛЗН, привлекла внимание исследователей. В результате был идентифицирован еще один важный фактор патогенности, находящийся в неструктурном белке NS3. Аминокислота пролин в положении 249 белка NS3, как было показано в опытах in vivo при заражении птиц, является “переключателем” низковирулентного фенотипа вируса на высоковирулентный. Единственная замена в этом положении SP приводила к существенному изменению патогенных свойств вируса с увеличением титра виремии больше, чем в 105 раз и повышением уровня смертности до 94% (против исходного в 31%). Напротив, в исходно высокопатогенном штамме обратная замена 249 пролин на треонин приводила к снижению титра виремии с 9.4log10 до 3.6 log10 Б.О.Е, а уровень смертности снизился со 100% до 12,5%. Оба штамма принадлежали к первой генетической линии и имели дополнительно 11 аминокислотных различий [67]. Свой вклад в патогенность ВЗН вносит и генетическое разнообразие вирусной популяции. Все крупные эпидемии ЛЗН последних лет (в России, США, Румынии, Израиле), сопровождавшиеся необычно высоким для ЛЗН уровнем смертности, были вызваны исключительно представителями субкластера 1а первого генотипа ВЗН. Экспериментальные данные, полученные in vivo, также свидетельствуют о повышенной патогенности 58 некоторых штаммов ВЗН, принадлежащих к субкластеру 1а. Чрезвычайно удобной моделью для изучения популяционной динамики ВЗН является его распространение с 1999 года на американском континенте. Штаммы ВЗН, циркулирующие в США в период с 1999 по 2002 гг., были практически идентичны штамму NY-1999, однако в 2003 году появился новый вариант вируса с мутацией в а.к. позиции 159 белка Е (ValAla), быстро распространившийся по всей стране [131, 141]. В настоящее время этот вариант штамма NY-1999 является доминирующим на территории США. В опытах in vivo было показано, что данная аминокислотная замена приводит к эффективной репликации вируса при более высокой температуре [230]. Поиск и идентификация генетических детерминант флавивирусов, отвечающих за их вирулентные и адаптивные свойства, а также молекулярный механизм их действия являются в настоящее время предметом интенсивных исследований. 1.5. Разработка вакцин к вирусу Западного Нила Несмотря на то, что около 80% заболеваний ЛЗН протекает асимптоматично, у пациентов могут развиваться такие клинические проявления, как лихорадка, головная боль, слабость, боли и, иногда, покраснение кожи. По данным центра по контролю и предотвращению заболеваний США (CDC), менее чем у 1% инфицированных людей развиваются тяжелые нейроинвазивные заболевания, такие как, энцефалит, менингит и синдром напоминающий полиомиелит, однако около 10% таких случаев являются фатальными для пациентов. За рекордный по заболеваемости 2003 г. в США было зарегистрировано более 9000 случаев заболевания ЛЗН, среди которых 265 случаев с летальным исходом. За последние 15 лет произошло увеличение количества эпидемических вспышек с большим количеством человеческих жертв, вызванных ВЗН, что связано с повышением нейроинвазивности циркулирующих штаммов. Так или иначе, до последнего времени, большинство случаев были спорадическими. В 59 2012 г. в США произошла вторая сильнейшая вспышка ЛЗН с 5387 зарегистрированными случаями заболевания и, в том числе, с 243 летальными исходами. Треть всех случаев была в штате Техас. В том же году, случаи ЛЗН были зарегистрированы в Италии, Израиле, России, Сербии, Тунисе и Греции (общее количество - 167 случаев) [35]. Последние вспышки ЛЗН характеризуются увеличением пропорции неврологических симптомов у людей и лошадей [38]. Несмотря на то, что в настоящее время существуют коммерческие ветеринарные вакцины для лошадей [47], нет вакцин для защиты людей от ЛЗН [31]. Основным препятствием для их создания является тот факт, что фармацевтические компании заявляют об ограниченности рынка для такой вакцины и о непредсказуемости эпидемических вспышек, что делает крайне затруднительным прогнозирование применения такой вакцины, в случае её создания. 1.5.1 Требования к вакцине против вируса ЗН Вакцина против вируса ЗН должна защищать от всех генотипов вируса, а не только от генотипа 1а, что стало особенно очевидно после вспышки нейроинвазивного штамма генотипа 2 в Европе. Последние испытания вакцины Recombiteck canarypox, содержащей в своем составе премембранный и оболочечный белки (PrM/E) генотипа 1а показали её перекрестную защиту и против патогенных штаммов генотипа 2 [211], и кроме того, вакцины, произведенные на база генотипа 2 продемонстрировали защиту, как против гомологичных, так и гетерологичных штаммов вируса [214]. Наибольшему риску заболевания ЛЗН подвержены пожилые люди и люди с нарушением иммунитета. Таким образом, необходимо разработать вакцину к ВЗН, хотя бы для того, чтобы обеспечить защиту этих групп населения. Уровень защиты вакцин к флавивирусам коррелирует с уровнем индукции нейтрализующих антител, что было показано на вакцинах к вирусам желтой лихорадки, японского и клещевого энцефалитов [142]. Белок 60 оболочки вируса (Е) является основной целью для вируснейтрализующих антител, и, таким образом, является основным для выработки защитного иммунитета против флавивирусов [142]. Кристаллическая структура белка Е ВЗН выявила, что он состоит из трех эктодоменов: домен I (EDI), домен II (EDII) и домен III (EDIII) [159, 244], что ранее также было показано для вируса Денге [225, 226, 238] и вируса клещевого энцефалита [274]. Центральный EDII домен содержит иммунодоминантные эпитопы рядом с соединительной петлей [317]. Эти эпитопы стимулируют выработку кросс-реактивных субнейтрализующих антител, которые могут увеличить риск антителзависимого усиления в клетках несущих Fc рецепторы, после флавивирусной инфекции, что может привести к осложнению протекания болезни [316]. С другой стороны, иммуноглобулиноподобный С-конец домена EDIII, последовательность из 100 ак, стабилизированная дисульфидным мостиком, вовлечена в процесс прикрепления вируса к рецептору и содержит критические нейтрализующие эпитопы, ответственные за прикрепление и дальнейшие этапы проникновения вируса в клетку [111, 261]. Последние исследования, направленные на характеристику гуморального иммунного ответа, запускаемого инфекцией флавивирусов, и работы по картированию эпитопов моноклональных антител приматов показали, что нейтрализующие эпитопы, не содержащиеся в домене EDIII расположены в междоменных регионах белков оболочки флавивирусов. Были также описаны сложные экспонированные эпитопы к четвертичной структуре белка оболочки [340]. Эти эпитопы, существующие в интактных вирионах, но отсутствующие в растворимом рекомбинантном белке Е, состоят из ак, которые взаимодействуют с обоими мономерами в димере белка Е в районе между EDI и EDII [107, 165]. Антитела к этим эпитопам нейтрализуют вирус на этапе после прикрепления вируса, вероятнее всего, препятствуя образованию тримера белка, котрое необходимо для слияния с эндосомами [333]. С другой стороны, сильные нейтрализующие эпитопы, глубоко погруженные в структуру белка Е, вероятно доступны в зависимости от 61 температуры, это подтверждает, что структура белка Е является не такой жесткой, как предполагалось ранее [197]. 1.5.2. Ветеринарные вакцины против вируса Западного Нила В настоящее время доступны несколько ветеринарных вакцин против вируса ЗН (таблица №2). Две из них представляют из себя вакцины, содержащие инактивированный вирус: West Nile Innovator (инактивированный формалином вирус) – вакцина, разработанная Fort Dodge Animal Health и коммерциализованная фирмой Pfizer [239]; Vetera vaccine (Boehringer Ingelheim). Производство вакцины West Nile Innovator, одобренной в 2005 г., к настоящему времени прекращено. Доступна рекомбинантная вакцина на основе вируса оспы канареек, содержащая экспрессированные премебранный (PrM) и оболочечный (E) белки штамма NY99 (Recombiteck Equine West Nile Virus Vaccine, Merial-Sanofi Aventis) [34, 115, 161, 287]. Также доступна химерная вакцина, на основе вакцинного штамма вируса желтой лихорадки 17D, в котором белки PrM и Е заменены на аналогичные вируса Западного Нила штамма NY99 (ChimeriVax WN01). Данная вакцина была лицензирована к применению в 2005 г., департаментом сельского хозяйства США (USDA), однако, в 2010 г. несколько серий вакцины были отозваны из продажи после зарегистрированного большого числа случаев анафилактических реакций, респираторных заболеваний и даже смертей. Все три, доступные в настоящее время коммерческие вакцины предполагают двух- или трех- разовую иммунизацию и бустер по истечении года. Таблица № 2 Ветеринарные вакцины против ВЗН Вакцина Антиген West Nile Innovator-Pfizer Инактивированный ВЗН Vetera vaccine - Boehringer Ingelheim Инактивированный ВЗН West Nile-Innovator DNA Pfizer Плазмида с PrM и Е 62 (производство прекращено) Вирус оспы канареек, экспрессирующий PrM Recombitec-Merial иЕ Prevenile- Intervet (отозвана) Вирус желтой лихорадки YF17D, экспрессирующий PrM и Е [353] 1.5.3. Вакцины против вируса Западного Нила для человека Несмотря на то, что к настоящему времени не существует вакцин, одобренных для применения на людях, несколько кандидатов в такие вакцины находятся в стадии разработки. Однако, несмотря на продемонстрированную высокую эффективность на моделях животных, лишь некоторые кандидаты прошли первую фазу тестирования на людях, что позволяет надеяться на появление таких вакцин на рынке в лучшем случае не ранее, чем через 5-6 лет. 1.5.4. Вакцины, проходящие клинические испытания Вакцина ChimeriVax-WNV, сделанная на основе живого аттенюированного штамма вируса желтой лихорадки 17D (YF-17D), в котором гены PrM и Е были заменены на соответствующие гены ВЗН штамма NY99, была утверждена, как ветеринарная вакцина (ChimeriVax WN01). Для большей аттенюации данной вакцины применительно к людям были введены три дополнительные мутации в ген, кодирующий оболочечный белок Е (E107 Leu>Phe, E316 Ala>Val, E440 Lys>Arg). Данные мутации ответственны за аттенюацию вакцинного штамма японского энцефалита SA14-14-2. Полученная таким образом модифицированная вакцина получила название ChimeriVax WN02. Первая фаза клинических испытаний ChimeriVax WN02, проведенная в возрастной популяции 18-40 лет, показала безопасность данной вакцины для людей. Все вакцинированные продемонстрировали наработку нейтрализующих антител от 103 до 105 БОЕ и большинство сформировало специфическую Т-клеточную память на иммунодоминантный эпитоп белка Е ВЗН [228, 308]. Для второй фазы клинических испытаний вакцинный штамм был рассеян до единичных бляшек, и были отобран вариант ChimeriVax 63 WN02, дающий мелкие бляшки вируса, кодирующий дополнительную мутацию в гене мембранного белка вируса (Leu>Pro), с коротким периодом виремии. Безопасность и иммуногенность данной вакцины была недавно продемонстрирована на двух группах добровольцев: от 41 до 64 лет и старше 65 лет. Во второй группе было отмечено незначительное увеличение виремии [106, 134]. Вторая химерная вакцина, за основу которой был взят вирус Денге 4-го подтипа (WN/DEN4-3’ delta 30), продемонстрировала высокую иммуногенность на моделях мышей, гусей и обезьян [265] и в настоящее время находится в стадии клинических испытаний [108]. ДНК вакцина, кодирующая премембранный и оболочечный гликопротеины штамма NY99 ВЗН под контролем CMV/R промотора (промотор цитомегаловируса с R регионом человеческого Т-клеточного вируса лейкемии 1-го типа), была опробирована в первой фазе тестирования на 30 взрослых (половина 18-50 лет и половина 51-65 лет). Вакцина вводилась троекратно с интервалами в 21 день и индуцировала, как выработку нейтрализующих антител, так и CD4/CD8 N-клеточного ответа у большинства из испытуемых [181, 210]. Еще один вакцинный кандидат (WN-80E), основанный на экпрессированной в Drosophila melanogaster растворимой форме белка Е с удаленным трансмембранным доменом, также был протестирован в первой фазе исследований на человеке. Ранее, данный рекомбинантный белок продемонстрировал способность индуцировать наработку защитных нейтрализующих антител на нескольких животных моделях, включая не человекообразных приматов [154, 188, 189, 336]. На первой фазе клинических испытаний были использованы три дозы белка (5, 15 и 50 мкг) в композиции с 3,5 мг Alhydrogel’85. Безопасность вакцины была продемонстрирована вне зависимости от дозы. У всех добровольцев была отмечена наработка антител после третьей вакцинации, а у некоторых, вакцинированных 15 и 50 мкг белка, нейтрализующие антитела были выявлены уже после второй вакцинации. 64 К настоящему времени небольшое количество вакцин, находящихся на стадии клинических испытаний, требуют для достижения сильного защитного иммунитета либо трехкратной вакцинации, либо основаны на стратегиях, которые могут создать трудности при лицензировании в свете их безопасности. Таким образом, необходимо ускорить создание безопасных и иммуногенных стратегий вакцинирования, которые будут нуждаться в однократной или двукратной иммунизации для достижения быстрой защиты населения в случае возникновения эпидемий [186]. Таблица №3. Вакцины, проходящие клинические испытания Вакцина Антиген Фаза клинических испытаний ChimeriVax WN02 Химерный YF17D, Фаза II экспрессирующий PrM/E ВЗН WN/DEN4-3’ delta 30 Химерный Денге 4, Фаза I экспрессирующий PrM/E ВЗН Clinical trial VRC 303 Плазмида, экспрессирующая Фаза I PrM/E ВЗН WN-80E Растворимый гликопротеин Е Фаза I ВЗН, с удаленным трансмембранным доменом 1.5.5. Вакцины, на стадии доклинической разработки 1.5.5.1. Субъединичные вакцины Рекомбинантные кандидаты в вакцины, содержащие растворимую укороченную форму белка Е, экспрессированную в E. coli [293, 335], индуцируют образование нейтрализующих антител у мышей и лошадей и защищают мышей от заражения ВЗН при применении совместно с гидроксидом алюминия [182]. Другой рекомбинантный укороченный Е белок, полученный в бакуловирусной системе, также защищает мышей и хомяков от заражения ВЗН [59]. Рекомбинантный бакуловирус, экспрессирующий премембранный и оболочечный белки ВЗН индуцирует сильный иммунный 65 ответ у мышей после двукратного внутримышечного введения [366]. Домен EDIII флавивирусов, который содержит последовательность соединения с рецептором и является основной целью для вирус нейтрализующих антител, был выбран, как многообещающий кандидат для создания рекомбинантных субъединичных вакцин [111, 261]. Проведенные исследования показывают, что EDIII способен вызывать иммунный ответ и защищать мышей от инфекции в случаях его применения совместно с CpG олигонуклеотидами [87, 211] или в соединении в одном белке с бактериальным флагеллином [214]. Протяженный Т-клеточный эпитоп из домена EDIII ВЗН (ак 355-369) белка Е, получивший название Ep15, может быть вставлен в пептид HSP60 p458, используемый в качестве белка-носителя. Мыши, иммунизированные таким химерным пептидом, устойчивы к летальной дозе заражения тремя различными штаммами ВЗН [126]. Однако, такой кандидат в вакцины, основанный только на одном эпитопе, может легко привести к селекции мутантов вируса, ускользающих от действия нейтрализующих антител, в случае, если при вакцинации будет использоваться белок, не содержащий дополнительных антигенов вируса. Была также предложена вакцина, основанная на EDIII, ковалентно связанным с вирусоподобными частицами на основе бактериофага АР205. Однократная инъекция такого антигена совместно с гидроксидом алюминия была достаточна для выработки вирус нейтрализующих антител для значительной защиты от инфекции ВЗН. Трехкратная вакцинация полностью защищала мышей от ВЗН, вне зависимости от добавления гидроксида алюминия [311]. Вирусоподобные частицы ВЗН, полученные в клетках насекомых путем экспрессии комбинаций премембранного премембранного и оболочечного и белков оболочечного (PrM/E), белков или капсидного, (C-prM/E), также продемонстрировали способность индуцировать защитный иммунитет у мышей [271]. Последние предложенные подходы основываются на создании вирусоподобных частиц ВЗН, содержащих полипротеин Gag ретровирусов, формирующий основу частиц и CD16 эктодомен, соединенный с гамма цепью 66 высоко аффинного IgE рецептора в качестве платформы псевдотипирования. Замена CD16 эктодомена на EDIII белка Е из ВЗН или вируса Денге, позволяет экспонировать EDIII домен на поверхность вирусоподобных частиц и стимулировать выработку специфических антител у мышей [88]. 1.5.5.2. ДНК-вакцины Стратегия ДНК-вакцин также пригодна для иммунизации против ВЗН. Более того, первой коммерциализованной ДНК-вакциной была ветеринарная вакцина против ВЗН (West Nile Innovator DNA vaccine), экспрессирующая PrM-E белок вируса ЗН, способного к сборке в вирусоподобные частицы in vivo. Человеческая вакцина, созданная на данной основе, показала свою иммуногенность в первой фазе клинических испытаний [228, 297, 308]. После исследований, продемонстрировавших способность защищать от заражения ВЗН мышей и лошадей ДНК вакцин, экспрессирующих PrM-E белок вируса ЗН [101], было предложено несколько новых стратегии создания ДНК вакцин против ВЗН. Они включают: совместное применение ДНК вакцины, экспрессирующей PrM-E белок вируса ЗН, с инактивированной вакциной [150]; ДНК вакцину, экспрессирующую консенсусный домен EDIII белка Е ВЗН совместно с оптимизированной дополнительной плазмидой IL15, для усиления Т-клеточной памяти [272]; ко-экспрессию ДНК антигенов ВЗН с лизосомсвязанным мембранным белком (LAMP lysosome-associated membrane protein) [37]. Были описаны кандидаты в ДНК вакцины экспрессирующие полный геном ВЗН с отсутствующим геном капсидного белка С для блокировки формирования инфекционных частиц [299] или экспрессирующие полный геном аттенюированного штамма вируса Кунджин [136]. Эта же группа исследователей разработала новый подход к созданию ДНК вакцин, основанный на геноме вируса Кунджин, с делетированным геном капсидного белка С и ко-экспрессии белка С с независимого промотора, что дает возможность получать инфекционные частицы (SRIPs - single round infectious particles) за один раунд экспресии in vivo, подобно технологии RepliVax [83]. 67 Данная стратегия увеличивает иммуногенность кандидатов в вакцины для мышей и лошадей и защиту мышей от заражения ВЗН по сравнеию с аналогичными конструкциями, не экспрессирующим капсидный белок [347]. Но даже, когда кажется, что вакцина удобна для производства, её эффективность для людей остается основным вопросом. Такие стратегии как, вакцины с разделенным геномом (split-genome vaccine) [347], которые близко воспроизводят естественную вирусную инфекцию только без образования инфекционных частиц вируса, также могут быть частично полезными и востребованными для запуска эффективного иммунного ответа ДНК вакцинами против флавивирусов. 1.5.5.3. Нерепликативные вакцины одного цикла Нерепликативные вакцины одного цикла, такие как RepliVax WN, основаны на экспрессии полного генома ВЗН с удаленным геном, кодирующим капсидный белок С. Они способны инициировать цикл вирусной инфекции с наработкой субвирусных частиц, содержащих PrM/E и упаковку в клетках, экспрессирующих С-белок, путем транс-комплиментации, без образования инфекционных геномов [150, 314, 344, 345, 346, 347]. Вакцина RepliVax WN была модифицирована с целью уменьшения риска рекомбинации с диким типом ВЗН [314]. Одна иммунизация RepliVax WN защищала мышей и хомяков от летальной дозы заражения ВЗН [150, 278, 345] и вызывала иммунный ответ у нечеловекообразных приматов [346]. Другая не способная к репликации ДНК вакцина на основе аденовирусного вектора, экспрессирующая C, PrM, E и NS1 ВЗН, продемонстрировала способность индуцировать как нейтрализующий, так и клеточный иммунный ответ против Е и консервативных участков антигенов С и NS1 [294]. 1.5.5.4. Инактивированные вирусные вакцины Ветеринарная вакцина WNV-Innovator была предназначена для лошадей и готовилась из химически инактивированного высоковирулентного штамма 68 WNV-NY99. В Японии инактивированная формалином вакцина (WN-VAX), также полученная из штамма WNV-NY99, выращенного на клетках Vero, индуцировала полную защиту мышей от летальной дозы заражения штаммом WNV-NY99 [190]. Еще одна инактивированная формалином вакцина на базе штамма ISR98 WNV, выращенного на клетках PER.C6, показала защиту на гусях, с защитным уровнем, коррелирующем с титром вируснейтрализующих антител [288]. Несмотря на то, что подобные вакцины вызывают иммунный ответ, их производство сталкивается с высокими затратами, вызванными необходимостью использования помещений 2-го уровня биобезопасности (biosafety level 3 по международной классификации) для продукции вируса, и требованиями по полной инактивации вируса [239]. Во избежание всех перечисленных проблем, было предложено использовать вирус Кунджин, аттенюированный штамм ВЗН (генотип 1в), изолированный в Северном Квинсленде (Австралия) в 1960-е годы, который на 98% идентичен вирулентному штамму WNV-NY99 по аминокислотной последовательности, включая все нейтрализующие эпитопы [295, 296]. Не было документально подтверждено ни одного летального случая от инфекции вирусом Кунджин, не смотря на то, что 2,5% популяции Северного Квинсленда серопозитивно к этому вирусу. Хотя было описано несколько случаев заболевания с симптомами энцефалита от вируса Кунджин, в любом случае этот штамм дает значительно меньше тяжелых инфекций, чем WNV-NY99 как у людей, так и у животных [122, 130]. Недавно разработанная вакцина на базе инактивированного перекисью водорода вируса Кунджин воспроизводимо вызывала адаптивный В- и Т-клеточный иммунный ответ как у молодых, так и старых мышей и в последствии защищала их от заражения вирулентным негомологичным штаммом WNV-NY99 [262]. Еще одна стратегия, предложенная для продукции вируса, заключается в создании полной копии генома WNV-NY99, состоящего из двух частей и затем получении вируса методом обратной генетики с последующей его инактивацией формалином. Это уменьшает время работы с опасным вирусом в производстве. Кроме того, 69 отпадает необходимость постоянного контроля за появлением мутаций в процессе производства вируса [247]. 1.5.5.5. Рекомбинантные вакцины на основе вирусных векторов Рекомбинантный вирус оспы канареек, экспрессирующий премембранный и оболоченый белки ВЗН, был утвержден для использования в ветеринарии. Эта вакцина требует двукратного введения с финальным годовым бустером для достижения высокого уровня иммунитета [161]. Был также предложен живой аттеньюированный рекомбинантный вирус герпеса лошадей 1-го типа, экспрессирующий премембранный и оболоченый белки ВЗН, но он не показал индукцию сильного иммунного ответа у лошадей [281]. Вирус везикулярного стоматита также был использован в качестве вектора для экспрессии белка Е ВЗН. Этот вариант вакцины вызывал сильные гуморальный и клеточный иммунные ответы и защищал мышей от заражения летальной дозой вирулентного штамма ВЗН из Луизианы LSU-AR01[152]. Лентивирусный вектор HIV1-TRIP, экспрессирующий растворимую форму гликопротеина Е из штамма ВЗН ISR98, вызывал продолжительный и только гуморальный иммунный ответ, уже через неделю после применения [149]. В целях безопасности, аналогичный, но не способный к интеграции лентивирусный вектор был разработан несколько позднее и показал индукцию выработки антител до уровня, полностью защищающего мышей от летального заражения ВЗН [95]. 1.5.5.6. Химерные вакцины Два кандидата в вакцины, проходящие клинические испытания и описанные ранее, представляют из себя химерные вирусы (ChimeriVax-WN02 и Chimeric WN/DEN4). Еще один вариант заключается в использовании аттеньюированного штамма Денге 2 (DEN2 PDK-53) в качестве вектораносителя, экспрессирующего PrM/E штамма WNV NY99. Оптимизированные конструкции с мутациями, усиливающими продукцию вируса в клеточных 70 культурах, показали высокую степень аттеньюации и способность вызывать защитный иммунный ответ у мышей [145, 203, 223, 240, 245]. 1.5.5.7. Живые аттеньюированные вакцины, полученные из полученный из инфекционных клонов Живой аттеньюированный ВЗН генотипа 2, инфекционного клона (WN1415), содержащий ряд неконсервативных замен преимущественно в генах неструктурных белков, оказался высокоаттеньюированным, способным вызывать активный иммунный ответ при малых дозах введения и защищать мышей от заражения вирулентным штаммом первого генотипа NY 99 [354]. Были предложены и другие живые аттеньюированные вакцины, разработанные или на основе мутаций в сайтах гликозилирования генов белков E и NS1, или в тех позициях гена Е, которые известны как маркеры аттеньюации для других флавивирусов, таких, как штамм SA-14142 вируса Японского энцефалита и вакцины ChimeriVAXWN02, в сочетании с мутациями в петле 3'-некодирующей области генома [78, 362]. Было показано, что одна аминокислотная замена в центральной части NS4B [343] или в NS2A [195] способна приводить к высокой степени аттеньюации вируса для мышей. Такие замены также могут быть использованы при создании живых аттеньюированных вакцин к ВЗН. Таблица 4. Вакцины против ВЗН на стадии доклинической разработки Вакцина Укороченный Е Стратегия Животная модель мыши и лошади - (Drosophila) Укороченный Е - мыши и хомяки Активируемые мыши (бакуловирус) Наночастицы укороченного Е, покрытые ЛПС инфламасомами наночастицы + ЛПС CpG наночастицы укороченного Е Активируемые инфламасомами наночастицы + лиганд TLR9 мыши 71 Бактериальный флагеллин лиганд TLR5 мыши - мыши - мыши - мыши Вирусоподобные частицы, мыши EDIII Протяженный В-клеточный эпитоп из EDIII + HSP60 p458 пептид-носитель Вирусоподобные частицы (бактериофаг АР205) - EDIII ВЗН вирусоподобные частицы (клетки насекомых) Ретровирусные вирусоподобные частицы (gag)- экспрессирующие EDIII EDIII Плазмидная ДНК PrM/E - мыши и лошади Плазмидная ДНК PrM/E + Синергический эффект мыши Усиление Т-клеточной мыши инактивированная вакцина Плазмидная ДНК EDIII + плазмида адъювант IL15 Плазмидная ДНК PrM/E памяти Нацеливание на MHC-II мыши Неспособность мыши +LAMP ДНК ВЗН с удаленным геном капсидного белка С формировать инфекционные частицы Инфекционный вакцинный ДНК клон вируса Кунджин Нерепликативная вакцина мыши, хомяки и обезьяны одного цикла (RepliVax) Клон вируса Кунджин с Коэкспрессия in vivo делетированным геном С и инфекционных частиц в один коэкспрессией капсидного белка раунд мыши и лошади (SRIP) Аденовирусный вектор, экспрессирующий C, PrM, E и Вакцина, не способная к мыши репликации NS1 ВЗН Инактивированная - мыши - гуси Использование природно мыши формалином вакцина WN-VAX Инактивированный формалином вирус штамма Israel98 Инактивированный перекисью водорода вирус аттеньюированного вируса Кунджин Кунджин 72 Шесть протяженных Бинарный инфекционный фрагментов кДНК, кодирующих мыши клон геном NY99 Вирус везикулярного Живая аттеньюированная стоматита, экспрессирующий мыши вакцина гликопротеин Е ВЗН Лентивирусный HIV1 - мыши Повышенная безопасность мыши вектор sE ISR98 WNV Неинтегративный лентивирусный HIV1 вектор sE по сравнению с HIV1-TRIP ISR98 WNV Химерный Денге 2, экспрессирующий PrM/E ВЗН Живая вакцина с высокой мыши степенью аттерьюации Инфекционный клон Живая вакцина с высокой мыши степенью аттерьюации WN1415 Живой аттеньюированный вирус с мутациями в сайтах Живая вакцина с высокой мыши степенью аттерьюации гликозилирования E и NS1 Рекомбинантная вакцина против кори, экспрессирующая Е Живая вакцина с высокой мыши и обезьяны степенью аттерьюации из штамма ISR98 ВЗН 1.5.5.8. Кандидаты в вакцины против ВЗН на базе рекомбинантной вакцины против кори Вакцина против кори – это живой аттенюированный вирус с РНКнегативным геномом. Производимая в больших количествах во многих странах и распространяемая по низкой цене, эта вакцина обеспечивает пожизненный иммунитет после одной вакцинации. Однако, несмотря на наличие такой вакцины, уничтожение кори остается весьма трудной задачей и, во всем мире регистрируется около 160,000 смертельных случаев от этого заболевания в год, в основном в бедных развивающихся странах. Даже в Европе за последнее время было зарегистрировано несколько тяжелых вспышек этого заболевания. Необходимо улучшение и постоянное применение вакцины против кори для остановки распространения этого контагеозного заболевания. В этом аспекте, использование рекомбинантной живой вакцины против кори, как в педиатрии, так и для взрослой части 73 населения, является весьма желательным. В настоящее время имеется вектор, полученный из живого, аттенюированного штамма Шварца вируса кори [94], способного стабильно экспрессировать большие количества гетерологичного генетического материала и индуцировать сильный и долговременный гуморальный и клеточный иммунный ответ у мышей и макак, даже при наличии существующего иммунитета к кори [62-66, 109, 198]. Этот вектор был адаптирован для нескольких вариантов применения, включая HIV, Денге и другие опасные арбовирусные заболевания. В зависимости от целевой популяции и эпидемической ситуации, рекомбинантная вакцина может или полностью заменить существующую вакцину против кори (MV) в составе MMR вакцины (вакцина против кори, паротита и краснухи) для педиатрии, или использоваться дополнительно для создания дополнительного иммунитета у взрослых. В случае вирусов Денге и иммунодефицита рекомбинантная вакцина может заменить существующую вакцину против кори в составе MMR. В случае создания дополнительного иммунитета против вирусов Западного Нила и Чикунгунья, вакцина разрабатывается для применения на взрослой части населения и, может быть использована после проведения полной схемы вакцинации против вируса кори тройной вакциной MMR. Коревая вакцина, содержащая эпитопы вируса иммунодефицита (measles-HIV vaccine) в настоящее время находится на стадии клинических испытаний [199, 312], её оценка на первой стадии показала клиническую безопасность и иммуногенность данного вектора. 1.5.5.9. Вакцина MVSchw-sEwnv Наличие инфекционного кДНК клона широко используемого вакцинного штамма Scwarz/Moraten позволяет обходиться без хранения стоковых закладок вируса для последующего заражения и размножения [94]. В вирусный геном были введены дополнительные единицы транскрипции (additional transcription units ATU), для возможности превращения его в вектор, экспрессирующий чужеродные белки. Данная серия векторов позволяет 74 встраивать чужеродные гены в три различные позиции в геноме: первая – перед N геном, вторая – между генами Р и М, и третья – между генами H и L. Каждый отдельный полученный вектор может экспрессировать лишь один чужеродный антиген, но путем рекомбинации между ними можно получить множество векторов, экспрессирующих по два и по три различных чужеродных гена. Для получения рекомбинантной MVSchw-sEwnv вакцины, кДНК, кодирующая укороченный гликопротеин Е, в котором был удален трансмембранный домен из вирулентного штамма ВЗН ISR98-ST1, была вставлена в ATU1 позицию вектора. Рекомбинантный вирус был получен методом обратной генетики. После размножения в клетках Vero вирус экспрессировал большие количества белка Е ВЗН, секретируемого из зараженных клеток, при этом экспрессия оставалась стабильной на протяжении 10 пассажей. В заключение следует отметить, что после интродукции ВЗН в США в 1999 г. и беспрецедентного пика заболеваний в 2003 г. количество случаев резко снизилось в период между 2008 - 2011 гг. Предполагается, что вирус находился в это время на низком уровне передачи. Однако, в 2012 г. США столкнулись с новой эпидемической вспышкой, сопровождающейся высоким уровнем нейрологических заболеваний. Таким образом, возможно возникновение периодических вспышек ЛЗН в будущем, связанных с человеческими заболеваниями и смертностью среди населения. Кроме того, последние случаи, зарегистрированные в Европе, показывают расширение географического ареала ВЗН. По этой причине, разработка эффективной вакцины против ВЗН в кратчайший срок является крайне необходимой для остановки продвижения эпидемий на новые территории и для защиты населения от опасности нейрологических заболеваний [151, 174]. 75 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Места сбора и объем полевого материала Дельта Волги и примыкающие к ней территории бассейна Северного Каспия на протяжении многих лет являются природным очагом ВЗН и других арбовирусов. В настоящей главе мы приводим сведения географического и экологического характера, необходимые для понимания общей картины проведенных нами исследований. Низовья реки Волги протекают по прикаспийской низменности, расположенной на юго-востоке Русской равнины. Перед впадением в Каспийское море Волга почти 500 километров протекает в долине, образуя Волго – Ахтубинскую пойму, а в 120 километрах от моря начинает дробиться, образуя дельту. Волжская дельта имеет вид почти правильного треугольника, при этом протяженность морского края дельты составляет более 200 километров. Климат здесь резко континентальный, засушливый. Средняя температура января -6,9С, июля - +25,1С. Выпадение осадков - 175-244 мм в год. Продолжительность вегетационного периода с температурой выше 5С 216 дней. Дельту Волги можно разделить три основные экологические зоны, каждая из которых обладает уникальными природными особенностями. Самая южная часть дельты - предустьевое взморье Волги – это обширная мелководная акватория Северного Каспия, расположенная к югу от морского края надводной части дельты, удаляющаяся в море до 50 и более километров. Преобладающие глубины на взморье приближаются к полутора метрам, увеличиваясь в половодье до двух метров. Предустьевое взморье Волги называют также авандельтой. У морского края дельты глубины уменьшаются, а в устьях протоков и в образующихся между ними заливах ежегодно формируются новые отмели и косы, что способствует широкому распространению надводной, плавающей и погруженной растительности. Это, 76 в свою очередь, обеспечивает возможность гнездования птиц водного и околоводного комплексов. Более удаленная от моря система водостоков и мелководных озер с тростниковой и кустарниковой растительностью формирует среднюю дельту. Сложная система протоков образует многочисленные острова, различной величины, покрытых кустарником и лесом. В данной зоне дикие биоценозы сочетаются с синантропными вокруг большого количества населенных пунктов. Северная часть дельты (верхняя дельта), является переходной от Волго – Ахтубинской поймы к собственно дельте. В пределах этой зоны расположены крупные населенные пункты, в том числе Астрахань. Основная доля заболеваемости ЛЗН населения приходится на эту часть дельты (Львов, 2000). Птицы дельты Волги, Волго - Ахтубинской поймы и окружающих их пустынных и полупустынных ландшафтов отличаются разнообразием и высокой численностью. В дельте зарегистрировано более 280 видов птиц. В периоды сезонных миграций через дельту Волги пролетают миллионы птиц на места гнездования или зимовки. В южной части дельты многочисленны водоплавающие и околоводные птицы: гуси, лебеди, бакланы, речные и нырковые утки, цапли, чайки и крачки. Некоторые виды встречаются здесь не только в теплое время года, но и зимуют. Среди птиц лесов, расположенных рядом с руслами рек, особое место занимает группа колониально гнездящихся веслоногих и голенастых птиц. В неё входят: большой баклан, серая, большая белая, малая белая и желтая цапли, кваква, колпица и каравайка. Так же, среди них встречается малый баклан. Цапли и бакланы образуют в дельтовых лесах многочисленные гнездовые колонии. Населяя ивовые леса, птицы кормятся на взморье, в мелководных заливах и временных водоемах на островах, образующихся в период весенне-летнего половодья. 77 В средней и верхней частях дельты Волги расположено множество населенных пунктов. В их окрестностях, вследствие сильного антропогенного воздействия на природу, высокую численность приобретают синантропные птицы. На границах синантропных и диких биоценозов происходит контакт синантропных птиц с дикими птицами, в результате может происходить занос ВЗН из природных очагов в антропургические. Этот процесс, как предполагается, лежит в основе развития неблагоприятной эпидемической ситуации в населенных пунктах. Материал был собран в различных природных зонах дельты Волги, в конце июля - августе 2001 и 2002 гг. Кроме того, в 2002 г. материал добывался и в Волго – Ахтубинской пойме. В 2001 г. отстрел птиц производилась в двух районах Астраханской области: Икрянинском и Лиманском. Было охвачено две природные зоны дельты Волги: авандельта и средняя дельта. Всего было добыто 315 птиц, из которых 44 относились к синантропному комплексу, а 271 к дикому (в основном водный и околоводный комплексы). Материал 2002 г. собирался в Икрянинском, Лиманском, Приволжском, Нариманском, Красноярском, Енотаевском и Черноярском районах Астраханской области. Были охвачены все три природные зоны дельты Волги. Отдельно отметим, что птицы также отстреливались в населенных пунктах и их окрестностях: г. Астрахань, г. Ахтубинск, крупные поселки Красный Яр и Харабали. Всего было добыто 808 птиц, из которых 187 были добыты в Волго– Ахтубинской пойме и 621 в дельте Волги. Из птиц, добытых в дельте Волги 255 принадлежали синантропному комплексу, а 366 к дикому комплексу. В Волго - Ахтубинско пойме 97 добытых птиц относились к синантропному комплексу и 90 птиц принадлежали дикому комплексу. На рисунке 11 представлена карта Астраханской области с обозначением районов, где производилась добыча птиц (выделено красной рамкой). 78 79 2.2. Методы сбора, транспортировки, хранения и подготовки полевых материалов Птиц отстреливали из охотничьего оружия. От каждой птицы брали смешанный пул тканей головного мозга и селезенки. Пробы немедленно помещали в сосуд Дюара с жидким азотом (t= -169C), в котором они транспортировались и хранились до обследования. Для дальнейшего обследования материал тщательно растирался в ступке и приготавливалась 10 % суспензия со средой МЭМ, содержащей канамицин и гентамицин в концентрации 100 ЕД/мл. Приготовленную суспензию осветляли центрифугированием 10 мин при 2000 об/мин. 2.3. Вирусологическое обследование Изоляцию вируса проводили на клетках Vero E6 и мышах-сосунках 1-2 дневного возраста. Мышей-сосунков заражали путем внутримозгового введения 0,02 мл осветленной суспензии. После этого их наблюдали до 14 дней. Животных забивали на высоте клинической картины. При изоляции штамма, обязательно проводили его последующую реизоляцию из хранящейся на -70С первичной суспензии. После двух пассажей на животных мозговой материал лиофилизировали и закладывали на хранение. В период изоляции вирусов из полевых материалов не проводилась работа с музейными штаммами арбовирусов. При использовании клеточной культуры, монослой клеток покрывали 0,2 мл суспензии, выдерживали 30 мин на 37С, один раз отмывали средой МЭМ. После этого вносили достаточное количество поддерживающей питательной среды (с 2 % эмбриональной сыворотки) и инкубировали при 37С. Клетки просматривали ежедневно под микроскопом до наступления неспецифической регенерации в контроле. 80 2.4 Штаммы, олигонуклеотиды и нуклеотидные последовательности ВЗН, использованные в работе В работе были использованы штаммы ВЗН, хранящиеся в государственной коллекции вирусов института вирусологии им. Д. И. Ивановского, а также, изолированные в Астраханской области в 2001-2005 гг. (Табл.5-6). Таблица 5. Коллекционные штаммы ВЗН, использованные в работе Штамм А-72 А-1628 Источник выделения Клещи (Ornitodorus capensis) птицы Место сбора материала и год выделения Азербайджан (1970) Нуклеотидная последовательность JX041628.1 Азербайджан (1967) JX041629.1 А-1640 птицы Азербайджан (1967) JX041630.1 Eg101 Кровь больного Египет (1951) AF260968 Астрахань, СССР (1963) JX041633.1 Hp-94 Vlg27889 Клещи (Hyalomma pl. Plumbeum) Человек секционный матер. Человек Волгоград Россия(1999) Ast986 Кровь больного Волгоград Россия(2000) Россия (1999) Ast901 Кровь больного Россия (2000) T-1304 Малая крачка Таджикистан (1977) Vlg27924 3266 Ig-2266 Krsn88-190 Грач (C. frugilegus) Culex vishnu Dermaceter Marginatus AY277252 AY278442 JX041634.1 AY278441 JX070655.1 Украина (1980) JX041631.1 Индия, штат Мадрас (1955) Россия (1988) JX041632.1 AY277251 81 Таблица 6. Штаммы ВЗН, изолированные в Астраханской области в 2001-2005 гг Штамм Год Источник выделения 2001 большой баклан (Ph.carbo) Ast01-66 Нуклеотидные последовательности DQ411029 DQ411030 2001 клещ Hyalomma marginatum ворона (C. corone) Ast02-2-25 2002 ворона (C. corone) DQ374653 Ast02-2-26 2002 DQ377178 Ast02-3-146 2002 клещ Hyalomma marginatum голубь (Col. livia) Ast02-3-165 2002 DQ411033 Ast02-3-208 2002 большой баклан (Ph.carbo) грач (C. frugilegus) LEIV-Ast02-2-298 2002 грач (C. frugilegus) DQ377179 Ast02-3-570 2002 сорока (P. pica) DQ374651 Ast02-2-691 2002 комар Anopheles messeae DQ411034 Ast02-2-692 2002 комар Anopheles messeae DQ411035 большой баклан (Ph.carbo) DQ374650 Ast01-182 2001 Ast01-187 Ast02-3-717 2002 DQ411031 DQ411032 DQ377180 Ast04-824 2004 ворона (C. corone) DQ374652 Ast04-404 2005 большой баклан (Ph.carbo) номер не получен Ast04-405 2005 большой баклан (Ph.carbo) номер не получен Ast04-416 2005 ворона (C. corone) номер не получен Ast04-418 2005 ворона (C. corone) номер не получен 82 Таблица 7. Первичная структура олигонуклеотидов, использованных в работе. Название Последовательность праймера 5' - 3' Универсальные праймеры 2F GTAGTTCGCCTGTGTGAGCTGA 3565Funi CTGGTCGTGTTCTTGGCCACCCAGGAG 10620Funi 10780Funi 123Runi TCAGAACCGTCTCGGAAGGAGGACCCCAC GGTGTTAACCAGGGCGAAAGGACTAGAGG TT CCGGGCCCTCCTGGTTTCTTAGACAT 3594Runi CCTCTTGCGAAGGACCTCCTGGGTGG 11029Runi GATCCTGTGTTCTCGCACCACC Праймеры для генотипа 1а 330FE 478F 649F 707FE 826F 1048F 1124FE 1363F 1591FE 1768F 2227FE WN2264 2576FE 2886FE 3088FE 3367FE 3373F 3512FE 3740FE 4009FE 4291FE 4477FE 4616FE 4888FE WN5166 5288FE 5598FE 5793F WN6089 5598FE 5793F WN6089 GAAACACCTTCTGAGTTTTAAGA AACTT(CT)CA(AG)GG(AG)AA(AG)GTGATGA TGC CCAGAAGACATCGACTGTTGGTGCAC GCACCAAGACACGCCACTCAAG TGGTAAAAACAGAATCATGGATC GACAGCTGCGTGACTATCATGTC TGGCAGAGGTCCGCAGTTATTG GAGAATATCAAGTACGAAGT AAGACGTTCTTGGTCCATCGTGAGTGGT GTGGA(AG)TT(TC)TCAAGCAACAC CTAGGAGACACAGCTTGGGACTTTGG GGGTGTTCACCTCAGTAGGG ATAAGGAAGGAGTGTGCGGTCTAC GGAAGTGGAGGATTTTGGATTTGGTC AATGATACGTGGAAGCTTGAAAGGGC AGTGGGAAGCTGATCACGGATTGGTGCTG AAGTTGATCACAGACTGGTGCTGCAG AGTTGGGCCTTCTGGTCGTGTT AGACGTGGTACACTTGGCGCTCATGGC ATCCTGCTGTTGATGGTCGGAATAGG ATTGACTCCATGGCCATTCCAATGAC CTCATGAATGATCCAGGAGCACCTTGGA GGGACACCACCACCGGCGTTTACAG ATGAGGTGCAGATGATTGTGGTGGAACC GAAAAAACAGATCACTGTTCTGGA GGTTGTGGCTGCTGAGATGGCTGAAGC GGCTTGGAACTCTGGATACGAATGG GTACCCAAAATGTAAGAACGATGATTG GAATCATGCTGGACAACATCAACAT GGCTTGGAACTCTGGATACGAATGG GTACCCAAAATGTAAGAACGATGATTG GAATCATGCTGGACAACATCAACAT Назначение ПЦР, секвенирование ПЦР, секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование кДНК, ПЦР, секвенирование кДНК, ПЦР, секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование 83 6232FE 6589FE 6739F 7070F 7367FE WN7372 7473FE WN7838 7968FE 8035F WN8471 WN8871 9084F WN9346 GCAGATCTGCCAGTTTGGCTGGCTTA AGAATGGCCCTGGAGGAACTGCC TGGATGGCTGAAGTTCCAGGAACGAA TGCTAAAGCATCTAATCACGTCA GTAGTGGATGGCATCGTGGCCACGGA GGAATCATGAAGAACGCTGTAGTGG AGTAGTGAACCCGTCTGTGAAGACAGT AGGAAAGAAGGCAATGTCACTGGAGG AGAGTCCAAGAAGTCAGAGGGTACAC TATGGATGGAACATTGTCACCATG GAGGAAGATGTAAACTTGGGAAGTGG CCAGAGAAAAACGTCCCAGAATGTGC AAAGGCCAAGGGAAGCAGAGC CTTGAGCTGCTTGATGGGGAACAT 9430FE 9736F 10137F 10204F 10315F 10360FE 10468F 10575F 392RE 674R 824RE 917R 1322R 1325RE 1635RE 1645R 1690R 1856R cWN2371 2467RE cWN2729 2880RE 3272RE 3344R 3467R 3536R 3604R 3930RE 4325RE 4707RE 5032RE 5174R 5396RE 5816R 5840RE 6085RE 6554RE 6872R ATGCGCCCGGCTGCTGATGGAAGAAC CTCAACGCCATGTCAAAGGT GATTGAGGAGAATGAATGGATGG CCATACTCAGGAAAACGGGAGGACAT TTGGAGATGAGAAGTATGTGGATTA GAGATATGAAGACACAACTTTGGTTGAGG TGATGTTAGTGTAAATAGT GGAGGACTGGGTGAACAAAGC CTCCGCCGATTGATAGCACTGGT GTGCACCAACAGTCGATGTCTTC TACCTTGTGGCCTTGGTGCTGTCCATCCA TGCATGGTGTTGCTTCCAAGC AATTTGGCGCATGTGTCAATGC GGCAAATTTGGCGCATGTGTCAATGCT GAGGTTGAGGTCCATGAACCACTC TACTTCCAGCACTGCTCCA ACTCCATCAACGTCTCTCTGTT AACTGCAATTTTTCCATCTTCAC GCAGAGCCCCCAGCAATCC GTGCACGTTCACGGAGAGGAAGAGCA CTAAGGTCCACACCATTCTC GTCGGACATTCCTTGGTCTCCGGACC CATGGGCCCTGGTTTTGTGTCTTGT CCGCAGCTCTCACTCAG ATACCATACCAACAGCCGCT TCAGCATTGTAAGCATTCACTTGTGACTG TCTTGCGAAGGACCTCCTGGGT TGAATTCAACACATCAGGGATCTCCCA GCGATAGTCATTGGAATGGCCATGGAGT GCGATAGTCATTGGAATGGCCATGGAGT AGCCCAATCACATCACCGTTTTTGTC AGCCCAATCACATCACCGTTTTTGTC CACATGACATCAACAATCTCATTTCCA TCATCGTTCTTACATTTTGGGTACTCCG TCTGTTGTGATAACAAAGTCCCAATCATC TCTGTTGTGATAACAAAGTCCCAATCATC ACGTACATGGTGTCAAGTGCTTCCCA ACGTACATGGTGTCAAGTGCTTCCCA секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование 84 6934R 6990RE 7233RE 7524RE 8052RE 8448RE cWN8564 cWN8917 9311RE 9734RE cWN10148 10337R 10796R 10911R 10960R TAGCCAACCCATTTCGTTGGCTGCC CTCCTTGACCTCAATTCTTTGCCCAAACA GACTTGTCCCCAGCATCCGGCTGCTA GACTTGTCCCCAGCATCCGGCTGCTA GACAATGTTCCATCCATAACTTTGCAC CCTCGTATTGGGGTCCCTTCCAGGTC CCTCGTATTGGGGTCCCTTCCAGGTC ATATGGGTGGTTCTCATCGTGGTGCC ATGCGGGTGTCCCAGCCAGCTGTGTC CACTCTTGGATGTCTTTGCGAACC CACTCTTGGATGTCTTTGCGAACC CTTCCATCCATTCATTCTCCTCTATCC TCGCCCTGGTTAACACCAT ACAGCTTCAG(CT)CAGG(CT)TGGGCCGTGC CAGAAGATCTCCTAGTCTATCCCAG секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование кДНК Праймеры для генотипа 2 1501FS 2268FS 2829FS 3207FS 3427FS 4009FS 4702FS 5187FS 5488FS 6374FS 6591FS 6905FS 7253FS 7511FS 7921FS 8449FS 8809FS 8973FS 9426FS 392RS 948RS 1530RS 1915RS 2432RS 2999RS 3737RS 3990RS 4825RS 5323RS 5349RS 6007RS 6193RS 7025RS 7536RS 7754RS 8098RS TATGGTGAGGTTACGGTTGATTGTG GGGGAAAGCCATACACCAAGTCT TGCGCCAGAACTAGCTAACAACAC CAGAAGCAACCACAACAGGAGACCAG AGACTGAGAATGGCTGTTGGTATGG GATTGAAATGCTTAAACCTTGATGTGTA CAAGCTGGAGCCGGAGTGATGGTA CGGAGCAGGAAAGACACGCAAGATAC TCGCAGCCAGAGGATACATAGC CCTAAGACCCAGGTGGGCAGATGCTA GGAGCTACCGGACGCCCTTCAGAC ATGAAATGGGCTGGCTGGACAAGACC TGCTCTGCTCTTTTGCCACTATGCTTAC CTACAGCAGCAGCAGTCACCCTATG AGAGGCGGCTGGTGCTATTACA TTGGGAAGTGGAACGCGGGCAGTA ACGAACTGGCTGTGGGCTTTTT GGAGATGGTGGATGAGGAGCGTGAAG AGCGGCCGACGGGAAAACTGTG CTCCGGCGGTTGATGGCACTGG CAGGAGCAATAGAATGGCAAACACG TGGCTCACAATCAACCGTAACCT CGTGGCCAGTGTCAGCGGGAGTC AGCAAAACTCCTCCAACCGCAAGAA GAGTCGCATTCCGTTGTGTTCG GACGTCTCCTCCTGAGTTTGCTTCAGC CAGCAGCGGCACCACCACATTTGA GGTCCTCTTTCACGCTCCCCCAGTAG GGAAGTCCTCTCAGGGCCTCAGACAT TCTGTGCACTGCTGAGGTTTGGTA ACTTGTGATGGGTTTCTTCCTATGC TCCGTTCTTCCCCTCTGAGCCTGTAT GTGGCCGGCCGCAGATCAAGTAAGA CCATAGGGTGACTGCTGCTGCTGTA CTGTATCTGGTAAATTCTTCCTTCGTCA TGTGTCGCTCGCTTCTGATGGTCTGTA секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование 85 8097RS 8558RS 9089RS 9668RS 10015RS 10542RS TGTGTCGCTCGCTTCTGATGGTCTGT TGGTGCCATGTGGAGCTGTATTCTTT CTGCCTTTAGCTTTGCCGAACTC CTGACGGCCATGCGACTGAGACG TGGCCATCAATCTCAGGTCTCTAC GCCGCAGGCAGCACCGTCTACT Праймеры для генотипа 4 секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование 1054Fh 2276Fh 2803Fh 3525Fh 4418Fh 5226Fh 6257Fh 6629Fh 7568Fh 8126Fh 8396Fh 9091Fh 9519Fh 691Rh 1183Rh 1677Rh 2052Rh 2621Rh 3692Rh 4582Rh 6692Rh 7344Rh 7819Rh 8293Rh 8705Rh 10075Rh CATAATGGCCAAAGACAGACCGACAAT GCTCAGGTGTGGAAGTGGGGTGTTTAT CATCATTTTTGCTCCCGAACTA AGCTGGGCCTTCTGGTAGTGTTCTTG GTGAAACTTGATGATGACGGAAACT AGAGGCTTCGCACGGCAATACTG CATGATCGGAGGTGGTGCTTTGACG ACTCTCGGGGTGTTCTGCCTCCTTATG ACGTCATGCGCGGAGGCTGGCTATC ACAGAACCGTGCGCGTCCTTGAG GGAAGGGTGCCCACTACGAGGAAGACG CTAGGAGCCCGCTTTCTGGAGTTCG GAGGATGATGGAAGGCGAAGGGGTGAT AGTCCTTGTGCACCTCCCGTATCTT GTGTGCCTCCCCCATCGTAG GCATGTGCCTCTTCAAACTCAACC AAGATTTTGGCGTTGGCTGTGGCTACT AGACCGACCTTACGCCACAGACTCC CAAATGCTGCTCCAACAAGTATC TCTTTTTGTGTACTGGAGCGTGAT CTCCTGCCAGTCCGATTTTGCTCAC GCCGTCGATAACCGCATTTTTCAT GCGAGACGGGATGGCCACCTGTAATG AATTGCGTGACAGTGGGTTCC CCGAAAGGGGTGGTATCAGTCA TCCACTCGCCTCTCGCATGTATTGACC секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование Праймеры для генотипа 5 1275FI 2790FI 3638FI 3906FI 4472FI 5255FI 5589FI 6603FI 7546FI 7999FI 8493FI 9189FI 9575FI 9632FI AAGTATTGACACATGTGCCAGGTTCG TGGAAAGCCTGGGGGAAAAGCATTAT GCTTGGGGGCATTACCTACACTG ACTAGCGGTGGCGTGGATGATTTTGAG GGTGCCCCCTGGAAACTTTGGATGCTA CGCCTACCAGAGTTGTTGCAGCCGAGAT ATAGCGCGACATGCAAACTGAGATA AGACGGTGGCCCTGATAGCAT TGGAACGCAACAACGGCAATCGGACTC CAATTGGTGCAGAGCTACGGATGG GATAAAGAACCGGGTCGAGAGGCTAAA AGGATTGGGCTTGCAGAAACTCG TTGGTAGAGGAAAAGGCCCGAAAGT AGAGACTTGGACGCATGGCTGTTAG секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование 86 817RI 1236RI 1689RI 3444RI 4008RI 4428RI 5146RI 5380RI 5778RI 7488RI 8285RI 8716RI 10151RI 10228RI ATTCAGTTTTCACCAGGTAGCGAGTAG GTCCACAACGCCCTGCTTACACA TGTGGCATGTGGTTCTTCAAAT TGCCATACCAACATCCACTTCTG GCATTTCAAGCCTGGCGTCAACAAG GCGCACGTCCACTCTCTCACTGGAGCCT CTCAACATGTCAGGCTCAAATCC TGGCACATGACATCAACAATCTC GGGTACTCCGTTTCATATGATTTCCTA AGCTTCTCTGACGGTCCTTACTGA TTTCTGACCAATCCTCCTCCGTAAC GGCCGAACGGGGTGGTGTCTGTCA GAGTCTTGTCTTCCATCCATTCATTTT CCGATGAGGCTCCCACACCAGAT секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование секвенирование Таблица 8. Нуклеотидные последовательности штаммов ВЗН, использованные в работе Штамм Vlg99-27889 VLG-4 Vlg2000 Hp-94 Номер GenBank AF236057, AY277252 AF317203 AY278442 AF237565 Год Источник Место изоляции 1999 кровь больного Россия 1999 2000 1963 кровь больного кровь больного Россия Россия Россия Клещи (Hyalema marginatum) кровь больного кровь больного Dermacenter marginatus Дрозд (Turdus merula) Россия Россия Россия Ast986 Ast901 Krsn88-190 AF237562 AY278441 AY277251 1999 2000 1988 Azerb.1628 AF237563 1967 Azerb.A-72 AF237564 1970 Клещи (Ornitodorus capensis) Азербайджан T-1304 AF237566 1977 Таджикистан RO97-50 RO96-1030 ROM-96 FRA-PaH651 Italy PaAn981 HNY1999 NY99-FLA NY00-crow AF260969 AF130363 AF205879 AF001560 AF205883 AF202541 AF198835 AF404756 1997 1996 1996 1965 1999 1999 2000 Крачка (Sterna albifrons) Culex pipiens AF205882 AF205881 AF001567 AF205880 AF205884 AF260968 M12294 AF001561 AF196505 D00246, AF196516 AF196524 1998 - Израиль Израиль 1996 1951 1937 ЮАР Морокко Египет Уганда 1960 Австралия Австралия ISR98-Gool ISR-TL443 ALG-ArDjanet S.Af.H442 Morocco 96-111 Eg101 WNVFCG I.C. Ara3212 Aus-Kunjin KuMRM61C WN-India 1955a ворона (C. Brachyrhynchos) Азербайджан Румыния Румыния Румыния Франция Италия США США США Индия 87 Ig2266 SEN-AnD27875 SEN-ArD93548 SEN-ArD78016 UGA-Ent63134 UGA-MP22 CAR-HB6343 CAR-ArB310 CAR-HB83P55 RCA-ArB3573 MAD-ArMg956 MAD-ArMg978 MAD-AnMg798 KEN3829 KEN-Na1047 JEVKV1899 (вирус ЯЭ) AF196525 AF001569 AF001570 AF001556 AF001573 AF001562 AF001558 AF001566 AF001557 AF196527 AF001564 AF001574 AF001559 AF146082 AF001571 AY316157 Индия Сенегал Сенегал Сенегал Уганда Уганда Центр. Афр. Респ. Центр. Афр. Респ. Центр. Афр. Респ. 1979 1993 1967 Мадагаскар Мадагаскар Мадагаскар Кения Кения 1988 1978 2.5. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью с помощью пакетов программ DNASTAR (Lasergene v.6) и MEGA v.4.1. При анализе использовались также нуклеотидные последовательности различных штаммов ВЗН, опубликованные в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Подбор праймеров для проведения реакций обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции и секвенирования выполняли с помощью программы Primer Premier 5.00 (Premier Biosoft International, США). В работе были использованы синтетические олигонуклеотиды производства фирмы “Литех”. Структура праймеров и их назначение приведены в таблице 3. 2.6. Выделение РНК К 200 мкл суспензии исследуемого образца (мозговой суспензии мышей-сосунков или культуральной жидкости) добавляли 200 мкл лизирующего раствора (4 М гуанидин изотиоцианат, 0,5% саркозил, 100 мМ -меркаптоэтанол, 25 мМ цитрат натрия), перемешивали на вортексе. Добавляли 200 мкл насыщенного водой фенола, 100 мкл хлороформа и 40 мкл ацетата натрия (2 М, рН=4,5), вортексировали и инкубировали 20 мин. при 4 0С. Центрифугировали при 13000g 20 мин. Отбирали водную фазу и добавляли к 88 ней равный объем изопропанола (400 мкл). Инкубировали ночь при –200С. Преципитат осаждали центрифугированием (13000g 20 мин), осадок промывали 70 % этанолом и растворяли в 20 мкл деионизированной воды [84] 2.7. Реакция обратной транскрипциии Реакцию обратной транскрипции для синтеза кДНК проводили в 0,5 мл пробирках для ПЦР, объём реакционной смеси составлял 10 мкл. В пробирку вносили 3,5 мкл РНК, денатурировали её при 720С в течение 2 мин и сразу же вносили в лед. В пробирку с денатурированной РНК добавляли 6,5 мкл смеси следующего состава (приведены конечные концентрации реагентов): 50мМ Трис-НСl, рН=8,3, 10 мМ МgCl2, 50 мМ KCl, 10 мМ DTT, 0,5 мМ спермидина, по 0.5 мМ каждого дНТФ, 0,5 мМ праймера для синтеза кДНК, 16 ед. ингибитора РНКаз (Promega, США) и 12 ед. обратной транскриптазы AMV (Promega, США). Смесь инкубировали в течение 30-60 мин. при 420С. Для инактивации активностей обратной транскриптазы реакционную смесь прогревали 15 мин. при 950С. 2.8. Проведение полимеразной цепной реакции Для получения амплифицированных фрагментов длиной до ~8000 н.п. использовали смесь Taq/Pfu полимераз. Полимеразную цепную реакцию проводили в тонкостенных пробирках объемом 0,2 и 0,5 мл (QSP) на амплификаторах Mastercycler gradient (Eppendorf, Германия) или Терцик (ДНК-технология, Россия). В Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл. В реакционную смесь входили следующие компоненты: ПЦР-буфер (200 мМ NH4SO4, 750 мМ Трис-HCl pH=8,8), 2,5 мМ MgAc, по 0,2 мМ каждого дНТФ, по 5 пМ прямого и обратного праймера, 1 мкл раствора кДНК (тотальной, 0,01-0,1 мкг) и 2,5 ед. смеси Taq/Pfu-полимераз. ПЦР амплификацию осуществляли с использованием следующих параметров: 950 C 40 сек. – 1 цикл; 940 C 20 сек., 55-600 C 20 сек., 720 C 5-6 мин – 30-35 циклов; 720 C 5-10 мин. – 1 цикл. 89 2.9. Клонирование кДНК-фрагментов генома Лигирование фрагментов ДНК, полученных в результате амплификации концевых областей генома, поводили в объеме 10-20 мкл при +160C в течение 12-24 часов. Для лигирования использовали среду следующего состава: 50 мМ Tris-HCl pH=7,5, 1 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол, 1 мМ АТФ, 50 нг вектора pGEM-T (Promega, США) и добавляли 0,5-1 мкг ДНК-вставки. В реакции использовали 0,5 единиц ДНК-лигазы фага Т4. 2.10. Приготовление компетентных клеток E.coli В 100 мл 2хYT бульона следующего состава (на 1 л): бактотриптон – 16 г (Difco, США), дрожжевой экстракт – 10 г (Difco, США), хлорид натрия – 5 г, добавляли 1 мл ночной культуры E.coli и растили до оптической плотности 0,4-0,6 о.е. при 37С. Клетки охлаждали во льду и центрифугировали при +4С в течение 5 мин. при 5 тыс. об/мин. Осадок клеток ресуспендировали в 20 мл буфера RF1 (100 мМ RbCl, 50 мМ MnCl2, 30 мМ ацетат калия, 10 мМ CaCl2, 15% глицерина, рН=5,8) и инкубировали во льду 30 мин. Затем клетки осаждали центрифугированием (5 мин, 5 тыс об/мин, при +4С). Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл буфера RF2 (10 мМ MOPS, 10 мМ RbCl, 75 мМ CaCl2, 15% глицерина, рН=6,8) и инкубировали во льду 20 мин. Приготовленные таким образом клетки разделяли на аликвоты по 100 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -70С до использования. 2.11. Трансформация плазмидной ДНК Непосредственно перед трансформацией клетки размораживали во льду. К суспензии компетентных клеток добавляли 0,1-0,5 мкг плазмидной ДНК и выдерживали на льду 20 мин. Тепловой шок проводили в водяной бане при 42С в течении 1 мин и добавляли 0,5 мл 2хYT бульона. Для фенотипического выражения плазмидных маркеров суспензию клеток инкубировали в течение 90 1 часа при 37С, затем высевали на твердую питательную среду, содержащую антибиотик (ампициллин). Селекцию плазмид проводили на чашках Петри, содержащих 100 мкг/мл ампициллина и по 40 мкл на чашку растворов 100 мМ ИПТГ и 2 % Х-gal. Плазмиды, несущие вставку кДНК, отбирали по белому цвету колоний. Колонии, содержащие рекомбинантные плазмиды со вставками большого размера (5000 н.п. и более) растили при 20-25С в течение 24-48 часов. Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным методом из 2-5 мл ночной бактериальной культуры с применением набора “Wizard plus SV minipreps DNA purification system” (Promega, США) в соответствии с рекомендациями производителя. 2.12. Электрофорез ДНК в агарозном геле Электрофорез препаратов ДНК проводили в 1% агарозном геле, с использованием агарозы фирмы Pharmacia, в 1x трис-ацетатном буфере (ТАЕ) следующего состава: 40 мМ трис-ацетат рН=8,0, 2 мМ ЭДТА, в течение 20-40 минут при 80-120 В. Перед нанесением пробы на гель к ней добавляли 0,1 объем буфера для нанесения, содержащего 30% глицерина, 0,25% бромфенолового синего и 0,25% ксиленцианола. Для визуализации ДНК гель прокрашивали в течение 10-20 минут в растворе бромистого этидия (5 мкг/мл в ТАЕ). Учет результатов проводили в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм. Размеры молекул анализируемых образцов ДНК определяли путем сопоставления их электрофоретической подвижности в геле с подвижностью маркеров – фрагментов ДНК известной молекулярной массы (1kb DNA-Ladder, Gibco). 2.13. Выделение фрагментов ДНК из агарозы Перед реакцией секвенирования амплифицированные фрагменты ДНК вычищали из агарозного геля. После электрофореза зону геля, содержащую нужный фрагмент, вырезали и растворяли в 1 мл раствора NaI (6,6 М NaI, 16 91 мМ Na2SO3). После растворения агарозы добавляли 10 мкл сорбента glass milk. Сорбцию ДНК проводили в течение 30 мин. при 160 C. Затем сорбированный ДНК-фрагмент промывали 80% этанолом и смывали с подсушенного осадка glass milk добавлением 25-50 мкл раствора ТЕ (Трис-ЭДТА) при 500C в течение 5 минут. После центрифугирования супернатант с элюированной ДНК отбирали в отдельную пробирку и использовали в реакции секвенирования. Для выделения фрагментов ДНК, предназначенных для лигирования и последующего клонирования, использовали набор “Wizard plus PCR purification system” (Promega, США) в соответствии с рекомендациями производителя или аналогичный набор фирмы Qiagen. 2.14. Секвенирование ДНК Первичную нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера при помощи прямого использованием BigDye Termination рекомендациям изготовителя. секвенирования Cycle ПЦР-продукта Sequencing Электрофорез ДНК Kit с согласно осуществлялся на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, США). 2.15. Сайт-направленный мутагенез ДНК Сайт-направленный мутагенез ДНК осуществляли с помощью нескольких различных методов. Самый простой из них заключался в мутировании ДНК методом фьюжн-ПЦР (fusion PCR) с использованием двух перекрывающихся праймеров, содержащих нужную замену (или инсерцию/делецию). Другой подход заключался в следующем. Нужную плазмиду использовали в качестве матрицы для длинного и точного однонаправленного ПЦР с использованием мутантного олигонуклеотида и особой смеси ферментов – Pfu-полимеразы, Pfu-dUTP-азы и Pfu-лигазы. После проведения ПЦР в амплифицированную смесь добавляли эндонуклеазу рестрикции DpnI, способную разрезать только метилированную или полуметилированную двухцепоченую ДНК по сайту GmeATC. Таким образом, 92 исходная плазмида, выделенная из бактерий и метилированная по данной последовательности, одноцепочечная разрезалась, мутантная цепь а вновь синтезированная сохранялась и in использовалась vitro для трансформации компетентных клеток E.coli. Последующий скрининг осуществлялся прямым секвенированием отдельных клонов мутагенезированной плазмиды. Эффективность такого метода варьировала в среднем от 50-75%. 93 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН, изолированных до 2001 г К моменту начала работ по определению первичной нуклеотидной последовательности геномов ВЗН в 2000 г. в распоряжении исследователей находилось крайне малое количество последовательностей, депонированных в базы данных. Фактически, был доступен один геном ВЗН генотипа 2 (WNWengler (GenBank #M12294)), один геном вируса Кунджин (MRM61C (GenBank #D00246)), который в то время считался отдельным вирусом, родственным ВЗН и, несколько позже в 2000 г. стал доступен первый геном ВЗН генотипа 1а, изолированный во время эпидемической вспышки в 1999 г. в Нью-Йорке (HNY-99 (GenBank #AF260869). Основное количество доступных на это время последовательностей штаммов ВЗН, в большинстве своем представляли вариабельный участок гена Е, имели длину 200-240 н.о., использовались для построения филогенетических деревьев и определения родства между штаммами ВЗН и, как наиболее вариабельные участки генома вируса, были непригодны для подбора универсальных праймеров, локализованных в консервативных областях и способных амплифицировать в полимеразной цепной последовательности реакции весьма различные по первичной геномы ВЗН, принадлежащие к вирусам разных генотипов. Разделение ВЗН на генотипы, принятое в 2000 г., и основанное на сравнении вариабельного участка гена Е длиной 223 н.о. предполагало наличие двух генотипов ВЗН: к первому генотипу относились штаммы близкие к изолированному в Нью-Йорке (современный генотип 1а), ко второму – штаммы близкие к оригинальному штамму, изолированному в 1936 г. в Уганде (современный генотип 2). К этому времени была известна последовательность этого участка генома для генотипа из Индии (современный генотип 5), но из-за небольшой протяженности и вызванных 94 этим артефактов при анализе, изолят из Индии был отнесен к генотипу 1 [53]. Вирус Кунджин рассматривался как отдельный вирус, хотя и родственный ВЗН (современный генотип 1b). 3.1.1. Стратегия подбора первой пары праймеров для проведения ПЦР Подбор первоначальных праймеров для проведения реакций обратной транскрипции и ПЦР был проведен на выровненных последовательностях доступных полногеномных последовательностей ВЗН, вируса Кунджин и вируса японского энцефалита. Было принято во внимание то обстоятельство, что концевые последовательности геномов достаточно часто являются крайне консервативными, так как формируют вторичные структуры, критичные для размножения вирусов. Логика подбора праймеров заключалась в нахождении консервативных участков генома, с наименьшим количеством замен среди анализируемых последовательностей, при наличии которых выбирался нуклеотид, присутствующий в геноме ВЗН. Дополнительно, последовательность олигонуклеотидного праймера анализировалась на отсутствие повторов, потенциального образования шпилечных структур, температуре отжига и других стандартных параметров, используемых при подборах праймеров. Первым был выбран праймер 2F, находящийся на 5’- конце генома ВЗН, начинающийся со 1-го нуклеотида генома (рис. 12). Рис.12 Положение праймера 2F на последовательностях геномов вирусов Западного Нила генотипов 1a (NY-99), 1b (Kunjin), 2 и вирусе японского энцефалита (JEV). 95 На данном участке наблюдается полная гомология между генотипами 1а и 2 ВЗН, кроме того два последних нуклеотида соответствуют аналогичным в вирусе Кунджин, отличия от последовательности вируса японского энцефалита составляют 7 нуклеотидов из 23, кроме того, это концевой участок генома ВЗН, что повышает вероятность его консервативности у разных генотипов вируса. Трудность вызывал подбор «обратного» праймера для использования в качестве «затравки» при проведении реакции обратной транскрипции и ПЦР. На протяженном участке от праймера 2F в сторону 3’- конца генома ВЗН не просматривалось участка с высокой гомологией между анализируемыми последовательностями и отсутствием жесткой вторичной структуры РНК. Наиболее многообещающим выглядел участок генома ВЗН на расстоянии примерно 3600 н.о. от 5’- конца. В этой части последовательности наблюдалась крайне высокая (100%) гомология между анализируемыми последовательностями, олигонуклеотидных кроме праймеров того программы рекомендовали данный по подбору участок, как пригодный по структуре. Таким образом был выбран праймер 3594Runi (рис. 13). Рис.13 Положение праймера 3594Runi на последовательностях геномов вирусов Западного Нила генотипов 1a (NY-99), 1b (Kunjin), 2 и вирусе японского энцефалита (JEV). К единственному недостатку данного праймера можно отнести его достаточную удаленность от «прямого» праймера 2F что, при выборе его для участия в первой паре ПЦР на матрицах кДНК неизвестных генотипов, могло 96 привести к невозможности получения ПЦР фрагмента и трудности интерпретации данного результата. В этом случае сложно было бы определить причину неудачи получения ПЦР фрагмента: это могло быть вызвано как негомологичной последовательностью праймера, так и неэффективной амплификацией при ПЦР. С другой стороны, у этого подхода были и очевидные плюсы: высокая гомология последовательностей в этом районе генома и достаточно большой участок генома (практически треть) последовательность которого можно было бы определить и проанализировать в случае удачи. Дополнительно, позитивным был тот факт, что РНК была получена из высокотитражных, культивируемых штаммов ВЗН, что позволяло надеяться на эффективную амплификацию достаточно длинного фрагмента ДНК в один раунд ПЦР. Понятно, что такой подход вряд ли оправдал бы себя при работе на матрицах с низким титром РНК, полученных из пулов комаров. В итоге, данная пара праймеров оказалась эффективной на 100% и, были получены ПЦР фрагменты с матриц РНК всех исследуемых штаммов ВЗН. После определения полных нуклеотидных последовательностей штаммов стало очевидным, насколько удачен был выбор праймера 3594Runi (рис. 14 ). 97 Рис.14 Положение праймера 3594Runi на последовательностях геномов вирусов Западного Нила, представляющих все 5 генотипов. 3.1.2. Определение и анализ первичной структуры части генома штаммов ВЗН от 5’-конца до праймера 3594Runi Анализ результатов, полученных при определении нуклеотидной последовательности исследуемых штаммов ВЗН на участках генома 30-500 и 3000-3450 н.о. (нумерация от 5’- конца) показал принадлежность большей части анализируемых штаммов к генотипу 1, одного штамма к генотипу 2 (3266), двух штаммов (Ig2266, Tyr2914) к новой группе, по-видимому изолятов из Индии, и одного штамма (Krnd88-190) к новому неизвестному генотипу. Дальнейшее определение нуклеотидной последовательности исследуемых штаммов требовало подбора праймеров уже на основе исходно используемых полных последовательностей геномов, дополненных вновь определенными последовательностями. Стратегии тут могло быть две: попытка нахождения универсальных праймеров (вероятно вырожденных по нескольким основаниям), пригодных для анализа всех изучаемых штаммов; или подбор независимых праймеров для каждого генотипа. 98 Вариант реализации первой стратегии можно проиллюстрировать на примере праймера 478F, где пришлось в последовательности из 25 нуклеотидов ввести 4 вырожденные позиции (рис. 15). Рис.15 Положение праймера 478F на последовательностях геномов вируса Западного Нила генотипов 1, 2, 4, 5. При использовании данного праймера для секвенирования были получены плохие результаты по качеству и достоверности и, от подобного подхода решено было отказаться. В дальнейшем, праймеры для амплификации и секвенирования подбирались независимо для каждой из четырех групп вирусов. Для групп 25, представленных фактически одним геномом каждая, праймеры выбирались по определенной последовательности без учета консервативности данного места при сравнении с последовательностями других генотипов. В таблице первичной структуры олигонуклеотидов, использованных в работе раздела «Материалы и методы» данные праймеры расположены в разделах «праймеры для генотипов 2-5». Для определения нуклеотидных последовательностей геномов штаммов ВЗН, принадлежащих генотипу 1a, подбирались праймеры пригодные для работы со всеми исследуемыми штаммами этой группы. Это было возможно исходя из высокой гомологии между исследуемыми последовательностями. При этом допускалось отличие последовательности 99 праймера от последовательности исследуемого генома на 1-2 нуклеотида, желательно, расположенных дальше от 3’- конца олигонуклеотида. Пример подобного подбора для праймеров 330FE и 392RE показан на рис. 16. Рис.16 Положение праймеров 330FЕ и 392RE на последовательностях геномов вируса Западного Нила генотипа 1. После определения первичных нуклеотидных последовательностей от 5’конца до праймера 3594Runi для всех исследуемых штаммов ВЗН был проведен филогенетический анализ на основе этого достаточно протяженного участка с целью уточнить их принадлежность к различным известным генотипам ВЗН и прояснить положение индийского штамма Ig2266. На этом этапе работы появилась возможность проанализировать гомологию участка гена Е между определенной последовательностью штамма Ig2266 и опубликованной частичной последовательностью индийских изолятов. Анализ показал практически полную идентичность последовательностей на этом небольшом участке и, что указывало на то, что штамм Ig2266, выделенный в Индии, принадлежит к этой группе. Одновременно, филогенетический анализ, проведенный не на маленьком вариабельном участке гена Е, а на первой трети генома (3500 н.о.), показывал его принадлежность не к генотипу 1, а к своему, отдельному от других генотипу (в настоящее время генотип 5). Это было необходимо для определения стратегии подбора праймеров: либо подбирать универсальные 100 праймеры для генотипа 1 и штамма Ig2266, либо, при серьезных отличиях нуклеотидных последовательностей, для штамма Ig2266 выбирать отдельно, без сравнения с последовательностями 1-го генотипа. На рис. 17 показана радиальная филограмма нуклеотидных последовательностей штаммов вируса Западного Нила с начала открытой рамки считывания до позиции 3450 нуклеотида. Видно, что исследуемые штаммы представляют четыре генотипа: основная масса – генотип 1, штамм 3266 – генотип 2, штаммы Ig2266 и Tyr2914 – индийский генотип 5, штамм Krsn88-190 – новый, неизвестный генотип 4. 101 HNY-1999 Ast901 Ast986 VIg27924 Vlg27889 Kunjin Ig2266 T-1304 Hp-94 Eg101 Tyr-2914 A-1628 A-72 A-1640 M12294 2nd 3266 Krnd88-190 Рис.17 Филогенетическое древо, построенное на основе сравнения участков длиной 3,5 т.п.н. 5’-концевой части генома. 3.1.3. Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН генотипа 1 Основной задачей по оптимизации определения первичных последовательностей геномов ВЗН генотипа 1 была разработка такого набора олигонуклеотидных праймеров, который не только бы позволил решить с наименьшими затратами задачу по исследованию штаммов, находящихся в работе на данный момент, но и сделать существенный шаг для облегчения 102 такой работы в будущем, так как на этом этапе стало очевидно, что ВЗН генотипа 1 наиболее часто встречающиеся на территории России. Необходимо было подобрать такой набор праймеров, учитывая три основных параметра: положение последовательности на геноме (расстояние между соседними праймерами должно быть примерно 500 нуклеотидов, исходя из среднего достоверного результата секвенирования в 600-800 нуклеотидов), положение праймера в консервативном участке генома (праймер должен эффективно работать с последовательностями различных штаммов 1-го генотипа), качество определения последовательности в реакции секвенирования (достаточно сложно предсказываемый параметр, зависящий не только от последовательности и свойств самого олигонуклеотида, фланкирующих последовательностей на геноме). Для но и от определения оптимального набора праймеров для секвенирования полных геномов ВЗН генотипа 1 большой набор праймеров был использован на матрицах ПЦРфрагментов, полученных с 10 различных штаммов ВЗН. В таблице 9 представлены результаты по оценке эффективности использования праймеров для секвенирования. Таблица 9. Эффективность используемых праймеров в реакции секвенирования на матрицах ПЦР фрагментов, содержащих последовательности геномов вирусов Западного Нила 1-го генотипа. Красным цветом выделены результаты с достоверным прочтением до 300, желтым от 300 до 500, зеленым – более 500 нуклеотидов при проведении реакции секвенирования. Слева, в столбце названий праймеров, желтым выделены наиболее эффективные и оптимально расположенные на последовательности генома ВЗН олигонуклеотиды. T1304 Forward 2F 330FE 478F 649F 707FE 826F 1048F 1124FE 1363F 1591FE 1768F 2227FE WN2264 600 450 450 470 <100 460 500 360 <100 <100 530 610 HP94 Eg101 A-72 A1628 A1640 Vlg27889 Vlg27924 Ast901 Ast986 270 510 410 450 480 450 380 390 550 490 <100 510 150 490 450 510 530 500 540 570 440 380 650 450 460 510 530 610 370 270 450 320 510 <100 380 <100 470 480 460 590 <100 520 620 560 650 400 510 610 530 530 <100 520 270 590 390 650 450 550 <100 450 510 530 <100 <100 <100 520 103 2576FE 2886FE 3088FE 3367F 3373F 3512FE 3565Funi 3740FE 4009FE 4291FE 4477FE 4616FE 4888FE WN5166 5288FE 5598FE 5793F WN6089 6232FE 6589FE 6739F 620 520 <100 <100 760 580 770 <100 610 <100 <100 350 <100 690 <100 440 620 540 7070F 7367FE WN7372 7473FE WN7838 7968FE 8035F WN8471 WN8871 9084F WN9346 9430FE 9736F 10137F 10204F 10315F 10360FE 610 <100 560 <100 490 <100 430 610 610 320 570 <100 490 570 470 430 <100 330 end 10468F <100 610 178 650 <100 490 470 <100 470 350 560 320 <100 <100 710 580 450 <100 340 270 600 590 <100 550 490 <100 530 510 <100 450 250 600 240 470 550 480 510 570 540 520 600 380 600 510 510 520 570 520 600 560 530 480 450 540 560 550 600 590 550 510 530 520 450 600 590 290 520 520 350 end 380 350 end <100 <100 530 510 620 510 510 550 <100 510 <100 540 <100 600 230 550 530 650 <100 <100 530 550 600 <100 510 510 530 600 400 480 <100 450 540 620 350 end 520 350 end <100 560 500 520 <100 270 500 520 410 530 350end 410 <100 540 470 <100 <100 600 350 end <100 610 350 end 460 410 <100 540 400 <100 560 350 end 350 end 430 410 410 400 420 410 410 500 520 210 530 570 400 <100 <100 550 600 <100 290 530 600 <100 530 520 150 510 320 290 550 600 490 530 540 <100 450 150 170 590 450 170 450 290 510 560 540 270 520 580 410 550 420 520 170 530 520 <100 450 450 <100 330 end 330 end 330 end 330 end 330 end 330 end 330 end 330 end 330 end 220 end 330 end 430 330 end 320 330 end 350 330 end <100 330 end 230 330 end 180 330 end 210 330 end 350 330 end 190 330 end 470 330 560 <100 <100 500 570 600 600 <100 620 600 520 520 430 520 <100 <100 610 620 650 590 520 410 520 600 450 500 550 600 500 570 750 620 450 520 520 400 600 570 590 620 580 510 560 560 600 550 530 450 560 590 290 490 <100 410 550 <100 10620Funi 10780Funi Reverse 123Runi 392RE 674R 824RE 917R 1322R 1325RE 1635RE 1645R 1690R 1856R cWN2371 2467RE 104 cWN2729 2880RE 3272RE 3344R 3467R 3536R 3594Runi 3604R 3930RE 4268R 4325RE 4707RE 5032RE 5174R 5396RE 5816R 5840RE 6085RE 6554RE 6872R 6934R 6990RE 7233RE 7524RE 8052RE 8448RE cWN8564 cWN8917 630 <100 550 430 630 490 610 590 570 600 <100 640 250 <100 590 620 <100 630 680 440 600 <100 760 170 800 250 590 420 9311RE 9734RE cWN10148 10337R uniprime 10796R 10911R 10960R 11029Runi 750 760 640 470 250 600 250 <100 250 170 580 520 640 620 580 550 350 570 530 400 590 450 520 600 580 530 600 450 620 600 450 590 590 510 540 570 610 230 550 600 520 420 650 390 480 480 600 450 420 550 290 530 570 540 <100 510 350 <100 430 470 360 510 470 640 <100 600 <100 510 550 540 530 520 410 630 510 650 550 620 510 520 560 250 530 520 580 <100 720 <100 600 490 510 <100 550 470 510 700 630 <100 510 680 620 160 <100 <100 570 660 <100 600 600 560 560 550 600 570 540 530 590 560 550 570 680 610 570 520 600 390 560 510 480 510 600 550 610 490 500 590 590 580 510 550 520 600 570 520 600 590 510 550 510 600 520 490 570 620 510 580 420 550 480 460 450 450 650 540 <100 610 570 620 590 570 420 510 610 480 420 580 570 550 550 450 380 570 540 650 470 340 550 480 450 620 450 570 570 570 510 520 630 570 <100 330 end 560 580 580 <100 570 <100 650 <100 640 580 550 <100 250 <100 <100 <100 510 510 <100 Таблица 10. Первичная структура олигонуклеотидов, использованных для оптимизированного определения нуклеотидной последовательности штаммов ВЗН 1го генотипа. Последовательность олигонуклеотидного праймера 5' – 3' Название GATCCTGTGTTCTCGCACCACC 10960R ACAGCTTCAG(CT)CAGG(CT)TGGGCCGTGC 10796R GGCTTGGAACTCTGGATACGAATGG 5598FE Назначение кДНК ПЦР, секвенирование ПЦР, секвенирование 105 GTAGTTCGCCTGTGTGAGCTGA 2F ПЦР, секвенирование CCTCAGTCCAATGGGCGAAGTT 6085RE ПЦР, секвенирование 478F секвенирование TGGCAGAGGTCCGCAGTTATTG 1124FE секвенирование TACTTCCAGCACTGCTCCA 1645R секвенирование GTGGA(AG)TT(TC)TCAAGCAACAC 1768F секвенирование ATAAGGAAGGAGTGTGCGGTCTAC 2576FE секвенирование 3367F секвенирование AAGTTGATCACAGACTGGTGCTGCAG 3373FE секвенирование CATGGGCCCTGGTTTTGTGTCTTGT 3272RE секвенирование AGTTGGGCCTTCTGGTCGTGTT 3512FE секвенирование AACTT(CT)CA(AG)GG(AG)AA(AG)GTGATGATGC AGTGGGAAGCTGATCACGGATTGGTGCTG CCTCTTGCGAAGGACCTCCTGGGTGG 3594RUni секвенирование ATCCTGCTGTTGATGGTCGGAATAGG 4009FE секвенирование GGGACACCACCACCGGCGTTTACAG 4616FE секвенирование GCCGAGCAGCCCACGAGTC 4707RE секвенирование CACATGACATCAACAATCTCATTTCCA 5396RE секвенирование TGGATGGCTGAAGTTCCAGGAACGAA 6739F секвенирование TCTTGGTCTTATCCAGCCAACCCAT 6934R секвенирование TGCTAAAGCATCTAATCACGTCA 7070F секвенирование 106 GGAATCATGAAGAACGCTGTAGTGG 7372FE секвенирование CGTGATCAAAATTCCGGCTTCTCG 7524RE секвенирование AGGAAAGAAGGCAATGTCACTGGAGG 7838FE секвенирование GAGGAAGATGTAAACTTGGGAAGTGG 8471F секвенирование ATATGGGTGGTTCTCATCGTGGTGCC 8564R секвенирование CCAGAGAAAAACGTCCCAGAATGTGC 8871F секвенирование GATTGAGGAGAATGAATGGATGG 10137F секвенирование CTTCCATCCATTCATTCTCCTCTATCC 10148R GGAGGACTGGGTGAACAAAGC 10575F секвенирование секвенирование 3.1.4. Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН генотипов 2,4 и 5 Для получения кДНК на матрицах РНК использовались праймеры 3594RUni и 10960R. Праймеры для секвенирования подбирались по полученной последовательности штаммов, отдельно для каждого генотипа. Амплификацию на матрицах кДНК проводили с помощью праймеров специфических для каждого генотипа. 3.1.5. Определение и анализ 5’-концевых последовательностей геномов штаммов ВЗН Для определения 5’-концевой последовательности геномов штаммов ВЗН использовали кДНК, полученную с помощью праймера 3594RUni. На 3’концевую последовательность кДНК с помощью терминальной трансферазы присоединяли последовательно 12-20 нуклеотидов C, затем амплифицировали ПЦР фрагмент с помощью праймера, имеющего структуру 5’- 107 tgattaagaatcatgtgtctatgggggggggg-3’ и подходящего для генотипа обратного праймера, отстоящего от 5’-конца генома не более чем, на 1000 нуклеотидов. Полученный ПЦР-продукт использовали в качестве матрицы для секвенирования с другим обратным праймером, находящимся к 5’-концу генома ближе, чем праймер, использованный для ПЦР. Результаты, полученные этим методом показаны на рис.19. Для большинства штаммов результаты были получены достоверные, хорошего качества, за исключением штамма Krsn88-190. В случае штамма 4-го генотипа, более достоверным представляется 5’-начало генома с нуклеотидов 5’-TGTAGTT, а не 5’AGTAGTT, как у остальных анализируемых штаммов. Рис. 19 Определение 5’- концевой последовательности геномов для генотипов 1, 2, 4 и 5 ВЗН. 3.2. Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН, изолированных после 2001 г На рис. 20 представлена общая конечная для всех штаммов генотипа 1 108 схема получения и амплификации кДНК фрагментов вирусной РНК. Данная схема позволяет оптимизировать получение перекрывающихся ПЦРфрагментов и определение их полной нуклеотидной последовательности. КДНК, полученная с использованием праймера 10960R, была использована для амплификации двух перекрывающихся фрагментов длиной около 6000 и 5500 нуклеотидных пар. Два амплифицированных ПЦР-фрагмента, охватывающие примерно 98% генома вируса, использовались далее в качестве матрицы для прямого секвенирования. Концевые участки генома, соответствующие позициям 1-23 на 5’-конце и 10835-11029 на 3’- конце вирусного генома не анализировались. Была выбрана стратегия определения нуклеотидной последовательности генома вируса методом секвенирования на фрагменте, т.к. позволяет читать “усредненную” или консенсусную последовательность ДНК и, таким образом, избегать ошибок, которые вносит Taq-полимераза при синтезе новых индивидуальных ДНК-цепей в процессе ПЦР. Рис. 20. Стратегия получения и амплификации кДНК-фрагментов генома ВЗН 3.3. ОТ-ПЦР тест система для обнаружения РНК ВЗН 3.3.1. Создание ОТ-ПЦР тест системы для обнаружения РНК ВЗН в клинических образцах и пробах полевого материала. Учитывая большую вариабельность генома ВЗН, при его обнаружении необходимо использовать праймеры, соответствующие наиболее 109 консервативным участкам вирусного генома. В качестве таких участковмишеней предлагается использовать те, которые совпадают по нуклеотидной последовательности в штаммах вируса ЛЗН, принадлежащих к различным филогенетическим группам. Одним из наиболее консервативных участков генома вируса является 5’- нетранслируемая область, область гена core и preM. В связи с этим, основой для поиска мишеней стало сопоставление нуклеотидных последовательностей по всей длине генома для ВЗН с помощью программы Megalign (DNASTAR). Для синтеза на матрице вирусной РНК комплиментарной ДНК был предложен праймер 626R. Здесь и далее номерное обозначение праймера соответствует позиции его посадки на геноме вируса ЗН. Буквами R и F обозначаются праймеры обратной и прямой (соответственно) посадки. Место посадки праймера 626R расположено в области гена preM, при этом в реакции обратной транскрипции синтезируется кДНК длинной 626 н.о. Для последующего проведения на матрице полученной кДНК ПЦР, были подобраны две пары праймеров. Первая пара 1F и 518R для использования в первом раунде ПЦР и праймеры 26F и 518R для второго раунда. Как видно из рисунка 21 ОТ-ПЦР тест - система является «полугнездовой». Таблица 11. Праймеры, подобранные для детекции вируса ЗН методом ОТ-ПЦР Праймер Нуклеотидная последовательность 5’3’ 2F AGTAGTTCGCCTGTGTGAGCTGA 26F AACTTAGTAGTGTTTGTGAGGA 518R TCAGTAGCATTTACCGTCATCAT 626R GGGCATTCATAAGTGATAGTATC Длина (н.о.) (полу-гнездовой способ) Место посадки (позиция на геноме) Расчетная температура отжига (С) 23 1 – 23 (5’НТР) 64,6 22 26 – 47 (5’НТР) 56,4 23 496-518 (preM) 59,2 23 604-626 (preM) 59,1 110 Также была разработана модификация ОТ-ПЦР тест-системы, повышающая специфичность и чувствительность системы, что немаловажно при работе с образцами членистоногих, т.к. концентрация РНК вируса в этом материале очень невелика. Способ выявления РНК вируса основан на реакции обратной транскрипции участка вирусного генома в районе гена, кодирующего лидерную последовательность мембранного белка с помощью праймера 650R. Таблица 12. Праймеры, подобранные для детекции ВЗН методом ОТ-ПЦР (гнездовой Праймер Нуклеотидная последовательность 5’3’ 2F AGTAGTTCGCCTGTGTGAGCTGA 26F AACTTAGTAGTGTTTGTGAGGA 326R GCTGTTTGTTTGTTCACACCTCTCCA 518R TCAGTAGCATTTACCGTCATCAT 626R GGGCATTCATAAGTGATAGTATC Длина (н.о.) способ) Место посадки (позиция на геноме) Расчетная температура отжига (С) 23 1 – 23 (5’НТР) 64,6 22 26 – 47 (5’НТР) 56,4 26 326-352 66,2 23 496-518 (preM) 59,2 23 627-650 59,1 (preM) из 23 звеньев и последующей двойной амплификации с “гнездовой” системой праймеров, имеющих следующие последовательности: праймер 2F, 22 звенa; праймер 26F, 22 звенa; праймер 326R, 26 звеньев, и праймер 518R, 23 звенa. Вирус выявляется, если после разделения части реакционной смеси в агарозном геле в анализируемом образце присутствует полоса размером 300 нуклеотидных пар. (Рис. 23). 111 5’-NTR core preM 5’ 3’ кДНК 626R 1-й раунд ПЦР 2-й раунд ПЦР 1F 518R 518R 26F Рисунок 21. Схематичное изображение посадки на геноме праймеров, подобранных для детекции ВЗН методом ОТ-ПЦР (полугнездовой) 112 5’-NTR core preM 5’ 3’ кДНК 626R 1-й раунд ПЦР 2-й раунд ПЦР 2F 518R 26F 326R Рис 22. Схематичное изображение посадки на геноме праймеров, подобранных для детекции ВЗН методом ОТ-ПЦР (гнездовой) 113 Предложенный способ включает в себя две основные стадии. Первая это построение кДНК-копии части генома вируса ЗН с помощью обратной транскриптазы. Матрицей для этой реакции служит одноцепочечная РНК вируса ЗН, а затравкой – праймер 626R, комплементарный последовательности участка генома вируса ЛЗН, кодирующей лидер белка М. Результатом этой реакции является гибридная РНК-ДНК молекула, которая служит матрицей для последующей амплификации с внешней парой праймеров. Вторая стадия состоит из двух последовательных амплификаций с двумя различными парами праймеров – внешней и внутренней. Матрицей для первой амплификации (с внешней парой праймеров 2F и 518R) служит гибридная РНК-ДНК молекула, получающаяся в результате реакции обратной транскрипции, а матрицей для второй амплификации (с внутренней парой праймеров 26F и 326R) – фрагмент, полученный в результате первой амплификации. Следует отметить, что использование разных пар праймеров при двойной амплификации существенно улучшает специфичность конечного продукта. По этой же причине для синтеза кДНК цепи используется праймер, отличный от праймеров, используемых для амплификации. Предложенный метод является высокочувствительным и высокоспецифичным для детекции РНК вируса Западного Нила и позволяет достоверно определять наличие РНК вируса в пробах крови больных, образцах секционного материала и в переносчиках арбовирусных инфекций. Разработанная тест – система «Способ обнаружения вируса лихорадки Западного Нила», авторы изобретения: Прилипов А.Г., Львов Д.К., Самохвалов Е.И., Садыкова Г.К., Альховский С.В., Воронина А.Г. защищена патентом РФ №2199589 от 27.02.2003. 3.3.2. Разработка параметров проведения ПЦР для первого и второго раундов амплификации Для определения оптимальных температурных режимов проведения амплификации был проведен анализ вариабельности последовательностей 114 генома ВЗН в местах посадки выбранных праймеров. На рис. 23 представлены выровненные последовательности штаммов ВЗН всех известных к настоящему времени генотипов и места посадки праймеров 2F и 26F. Видно, что данные праймеры полностью соответствуют последовательностям первого генотипа, праймер 26F не имеет некомплиментарных нуклеотидов для всех генотипов, праймер 2F имеет от одной до трех замен для генотипов 3-5. Рис. 23 Последовательности штаммов ВЗН всех известных к настоящему времени генотипов и места посадки праймеров 2F и 26F. 115 Рис.24 Выровненные последовательности штаммов ВЗН всех известных к настоящему времени генотипов и место посадки праймера 326R. Рис.25 Выровненные последовательности штаммов ВЗН всех известных к настоящему времени генотипов и место посадки праймера 518R. 116 Праймер 326R имеет от одной до двух замен для генотипов 2-5. Праймер 518R имеет от одной до четырех замен для генотипов 1-5, что видно на рис. 25. Для определения наиболее оптимальных температур отжига праймеров при проведении первого и второго раундов ПЦР были поставлены серии реакций амплификации с градиентом по температуре отжига праймеров на матрице. В качестве матриц использовались кДНК штаммов Ast986 и Krnd88190, представляющих первый и четвертый генотипы вируса соответственно. Это было сделано в связи с наличием замен в штамме Krnd88-190 в местах посадки праймеров и ожидаемой более низкой температурой, требуемой для отжига на матрице этого штамма. Рис. 26 Проведение первого раунда ПЦР на матрицах генотипов 1 (вверху) и 4 (внизу) вируса ВЗН с градиентом температур отжига праймеров. 117 Рис. 27 Проведение второго раунда ПЦР на матрицах генотипов 1 (вверху) и 4 (внизу) ВЗН с градиентом температур отжига праймеров. Под лунками указаны соответствующие температуры отжига. 3.3.3. Определение чувствительности ОТ-ПЦР тест системы Для определения чувствительности ОТ-ПЦР тест системы было проведено титрование штамма LEIV-Ast989 в культуре клеток Vero E6 и параллельное тестирование разведений вируса в ОТ-ПЦР. Титрование вируса проводилось методом бляшек под агаровым покрытием. Результаты этого эксперимента представлены на рис. 28 А, Б, В. 118 А. Первый раунд Б. Второй раунд (полугнездовой вариант) 119 В. Второй раунд (гнездовой вариант) Рисунок 28. Определение чувствительности разработанной ОТ-ПЦР тест – системы (гнездовой). Результаты тестирования в ОТ-ПЦР разведений штамма Ast986 после Iго (А.) и II-го (Б,В) раундов ПЦР. Над лунками указан соответствующий титр вируса. Как видно на электрофореграмме, после первого раунда ПЦР специфический, положительный ответ детектируется до разведения, соответствующего 103 БОЕ/мл., хотя четкий, хорошо видимый сигнал детектируется до разведения, соответствующего 104 БОЕ/мл. После второго раунда положительный ответ детектируется до разведения, соответствующего 50 БОЕ/мл. Что касается полугнездового варианта, то он продемонстрировал результаты даже хуже, чем однораундовый вариант. До разведения, соответствующего 104 БОЕ/мл. сигнал можно признать удовлетворительным, но при более низких концентрациях матрицы в результате ПЦР нарабатывается набор неспецифических продуктов, образующих характерный «шмер» на электрофореграмме. непригодность полугнездового Данные результаты демонстрируют варианта ОТ-ПЦР тест системы для детектирования низких концентраций РНК вируса в исследуемых образцах, а 120 для более высоких концентраций, очевидно, более приемлим вариант проведения ПЦР в один раунд, так как полугнездовой вариант требует проведения второго раунда, при этом результаты ухудшаются. Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными при работе с пробами комаров из Астраханской области. На рис.29 представлены результаты проведения гнездового и полугнездового вариантов ПЦР после анализа в агарозном геле. А. Б. Рис 29. Сравнение гнездовой (А) и полу-гнездовой (Б) ПЦР тест-систем. При сравнительном анализе электрофорезных гелей можно сделать вывод, что при использовании гнездовой (А) тест-системы значительно сокращается количество неспецифических продуктов амплификации, фрагменты получаются более четкими, что немаловажно при работе с такими объектами, 121 как членистоногие. При анализе членистоногих переносчиков мы сталкиваемся с крайне низким содержанием вирусной РНК и большим количеством неспецифических продуктов амплификации. 3.3.4. Проверка работы ОТ-ПЦР тест-системы на различных генотипах вируса ЗН Представляло интерес также проверить разработанную тест-систему на способность выявлять РНК ВЗН всех четырех известных к моменту проведения работы генотипах ВЗН. (Рис. 30). Для проведения эксперимента использовали в качестве представителя первого генотипа ВЗН: LEIV-Vlg9927889-human; второго генотипа вируса ЗН: LEIV-Ukr80-3266-rook; третьего генотипа ВЗН: Ig2266; четвертого генотипа ВЗН: Krnd88-190, титр вируса составлял 100 БОЕ/мл. Как следует из представленных данных, все четыре генотипа детектировались с помощью разработанной ОТ-ПЦР тест-системы. Рис. 30. Проверка тест-системы с четырьмя различными генотипами ВЗН. 1 - Vlg9927889; 2 - Ukr80-3266; 3 - Ig2266; 4 - Krnd88-190. 122 Таким образом, на данном этапе работы была разработана высоко чувствительная ОТ-ПЦР тест-система для детекции всех четырех генотипов вируса Западного Нила. Определенная нами чувствительность системы как 50 БОЕ/мл является достаточной для исследований, связанных с детекцией ВЗН в биологических образцах. Вместе с этим, универсальность позволяют рассматривать разработанную тест-систему как методический инструмент, который может быть использован и в диагностических целях. 3.4. Исследование полевого материала 3.4.1. Исследование комаров и клещей Астраханской области на наличие вируса ЛЗН при помощи ОТ-ПЦР системы Возникшие в 2001-2004 гг. на юге России вспышки лихорадки Западного Нила (ЛЗН) свидетельствуют о приоритетной значимости проблемы новых и возвращающихся инфекций в системе биобезопасности [11, 12]. Данные по эндемичности территорий по ЛЗН в северной части Каспийского бассейна накапливались на протяжении около 40 лет [3, 4, 5, 26, 27, 28]. Однако эпидемическая вспышка, возникшая в 1999г. отличалась массивной заболеваемостью и высокой смертностью [11, 12]. На основании предшествующих исследований можно предположить, что основным природным очагом инфекции в России является дельта Волги. Сбор репрезентативного полевого материала в этом регионе и его последующей обработкой вирусологическими, серологическими и молекулярно-генетическими методами может дать объяснение возникшей здесь эпидемической вспышки с необычными параметрами. Наравне с использованием патологоанатомических, вирусологических и серологических методов исследования, широко применяются и молекулярно-генетические методы определения вирусной РНК в ОТ-ПЦР. Метод ОТ-ПЦР должен использоваться наряду с другими методами для изучения степени активности ВЗН в природных очагах. Кроме того, он 123 позволяет выявлять генетические характеристики циркулирующих вирусных популяций. Задачей этого этапа исследования было установление процента зараженности членистоногих переносчиков (комаров и клещей) в различных частях экосистем дельты Волги и Волго-Ахтубинской поймы и молекулярнобиологическая характеристика штаммов циркулирующих здесь ВЗН, материал за 2001-2004 гг. Для определения наличия РНК вируса Западного Нила в пробах полевого материала, мы использовали ОТ-ПЦР тест систему. При получении положительного результата, мы считали, что в данном пуле комаров (100 комаров) находится одна особь, имеющая РНК ВЗН. Таблица 13. Год сбора материала/ анализа материала 2001/2002 2002/2003 Кол-во особей Процент зараженности 19425 комаров 77419 комаров 4563 клещей Кол-во «+» особей 5 комаров 34 комаров 49 клещей 2003/2004 113082 комары 2740 клещей 18 комаров 5 клещей 0,015% 2004/2004 (перезимовавшие) ИТОГО: 74547 комаров 36 комара 0,18% 0,075% 289782 комаров 7303 клещей 93 комаров 54 клещи 0,032% 0,740% 0,026% 0,043% 1,073% 124 1,2 1 0,8 комары клещи 0,6 0,4 0,2 0 Рис. 31. Полученные результаты свидетельствуют о высокой активности циркуляции ВЗН среди членистоногих, обитающих в этом регионе. Итого процент зараженности членистоногих переносчиков (комаров) за 2001 г. 0,025%, за 2002 г. – 0,043%, за 2003 г. – 0,015%, а также среди перезимовавших комаров2003 – 2004 г. – 0,075%, клещей за 2002 г. – 1,073%, за 2003г. – 0,18%. Суммарный процент зараженности комаров за 2001-2004 гг. – 0,018%, клещей – 0,74%. 3.4.2. Анализ зараженности видового состава комаров Далее, мы рассматривали видовой состав комаров, и, соответственно, зараженность каждого вида. Всего обследовано 303733 комаров, принадлежащих к 7 различным видам, собранных как в диких, так и в антропогенных биоценозах. Т.к. все проанализированные пулы клещей 125 включали в себя только один вид – Hyalomma marginatum, то оценка зараженности видового состава клещей не представляется возможной. Таблица 14. Видовой состав и зараженность комаров, собранных в 2001 году Название вида Кол-во Положитель Процент обследованных ные зараженности, % 11200 1 0,009 500 0 0 395 0 0 2450 0 0 4880 4 0,080 19425 5 0,026 особей Culex modestus Culex pipiens Anopheles messeae Anopheles hyrcanus Coquillettidia richiardii Всего Таблица 15. Видовой состав и зараженность комаров, собранных в 2002 году Название вида Кол-во Положитель Процент обследованных ные зараженности, % 8596 3 0,035 21585 8 0,046 29460 13 0,044 27135 8 0,026 6700 2 0,030 93476 34 0,036 особей Culex modestus Culex pipiens Anopheles messeae Anopheles hyrcanus Coquillettidia richiardii Всего Таблица 16. Видовой состав и зараженность комаров, собранных в 2003 году Название вида Кол-во Положитель Процент обследованных ные зараженности, % 1683 0 0 9850 0 0 32089 3 0,010 особей Culex modestus Culex pipiens Anopheles messeae 126 21813 8 0,037 46907 7 0,015 320 0 0 100 0 0 112762 18 0,016 Anopheles hyrcanus Coquillettidia richiardii Aedes caspius Aedes vexans Всего Таблица 17. Видовой состав и зараженность комаров, собранных в 2004 году (весналето) Название вида Кол-во Положите Процент обследованных льные зараженности, % 600 0 0 13522 8 0,059 26183 11 0,004 11700 2 0,002 21300 13 0,061 600 1 недостоверно 600 0 0 4 1 недостоверно 38 0 0 74547 36 0,048 особей Culex modestus Culex pipiens Anopheles messeae Anopheles hyrcanus Coquillettidia richiardii Aedes caspius Aedes vexans Culiseta annulata Aedes flavescens Всего Таблица 18. Видовой состав и зараженность комаров за 2001-2004 гг Название вида Кол-во Положитель Процент обследованных ные зараженности, % 22079 4 0,018 45057 16 0,035 84227 27 0,032 особей Culex modestus Culex pipiens Anopheles messeae 127 63098 18 0,027 79787 26 0,033 920 1 0,11 700 0 0 4 1 25,000 285444 93 0,033 Anopheles hyrcanus Coquillettidia richiardii Aedes caspius Aedes vexans Culiseta annulata Всего 80000 70000 60000 50000 40000 Кол-во обслед. 30000 20000 10000 0 Cul. Mod. Cul.pip An.mess An.hirc Coq.rich Aed.casp Aed.vex Рис 32. Количество обследованных комаров каждого вида 128 зараженность Culex modestus Culex pipiens Anopheles messeae Anopheles hyrcanus Coquilettidia richiardii Рис 33. Зараженность комаров ВЗН (данные за 2001-2004 гг.) В данной схеме не указаны данные по видам Aedes vexans и Aedes caspius При анализе вышеприведенных данных можно отметить, что уровень зараженности комаров различных видов является сравнимым (от 0,018% до 0,037%) и мы не можем утверждать о предпочтительности заражения ВЗН какого-либо вида. Также необходимо отметить, что, из-за крайне небольшой выборки комаров видов Aedes vexans и Aedes caspius, мы не можем сделать достоверный вывод о реальной зараженности комаров этогих видов. Можно только утверждать, что комары вида Aedes caspius также могут являться переносчиками ВЗН. 3.4.3. Анализ положительных проб для определения генотипа вируса при помощи определения частичной нуклеотидной последовательности По данным частичного секвенирования 5’-концевой области генома положительные пробы и полученные штаммы, при обработке данных пакетом 129 программ DNASTAR, были отнесены к первому, второму и четвертому генотипу ВЗН. Для секвенирования использовали ПЦР – фрагмент ДНК, образующийся в результате +/- анализа проб комаров после второго раунда nested – ПЦР (фрагмент фланкирован праймерами 26F и 326R, и содержит участок генома ВЗН от 26 по 326 нуклеотид от 5’- конца). Для филогенетического анализа использовался несколько меньший фрагмент последовательности ДНК (последовательность без участков, соответствующих фланкирующим праймерам). В качестве стандартных последовательностей для сравнения были использованы аналогичные участки штаммов из коллекции Института вирусологии им.Д.И.Ивановского. Штаммы первой группы ВЗН: Ast986, Vlg27889; второй группы ВЗН: 3266; третьей группы ВЗН: Ig2266; четвертой группы ВЗН: 190. 3.4.4 Статистическая обработка результатов На основании полученных результатов с помощью программы DNASTAR был проведен филогенетический анализ данных последовательностей, который отражен в дендрограмме, приведенной ниже. 130 генотип 1 ВЗН генотип 2 ВЗН генотип 4 ВЗН Рис 34. Дендрограмма, отражающая родство штаммов ВЗН, выделенных из полевого материала. 131 3.5. Клонирование кДНК-копии генома вируса Западного Нила 3.5.1. Получение плазмид, несущих кДНК-фрагменты вирусной РНК Целью данной работы являлось клонирование полноразмерной кДНК копии генома вируса (в рамках работы по созданию обратной генетической системы для ВЗН). Для этой цели был выбран штамм LEIV-Krd88-190, изолированный на территории России в 1988 году из клеща Dermacenter marginatum и относящийся к отдельной, IV филогенетической группе. Эти фрагменты вирусной кДНК были использованы для получения рекомбинатной плазмиды pGEM-WN190int, несущей полноразмерную копию кДНК вируса. При этом был использован подход, описанный Ямщиковым и др., [355] при создании инфекционных копий вирусов Западного Нила и японского энцефалита. Суть метода заключается в введении короткого (133 н.п.) интрона вируса SV40 в структурную область генома вируса. Такой интрон вызывает сбой открытой рамки считывания, и, как было показано авторами, стабилизирует плазмидную конструкцию с кДНК копией вирусного генома. После трансфекции клеточной культуры плазмидой, содержащей вирусную кДНК под контролем эукариотического промотора, интрон удаляется из транскрибированной in situ вирусной РНК в результате посттранскрипционной модификации. Заметим, что простая замена прокариотического промотора на эукариотический часто не решает проблемы, связанной с нестабильностью плазмид E.coli, несущих большие последовательности эукариотических рекомбинантных ДНК. Химерный интрон вируса SV40 длиной 133 н.п. был амплифицирован из плазмиды pCIneo с помощью праймеров pCI_intF: 5’ GTAAGTATCAAGGTTACAAG 3’ и pCI_intR: 5’ CTGTGGAGAGAAAGGCAAAG 3’, а затем введен в область гена Е по исскуственно созданному сайту Pvu II (CAGCTG). В получена плазмида, названная pGEM-WN190int результате была размером ~14 000 н.п. Дополнительно была получена рекомбинантная плазмида pGEM-T7_3286, несущая всю область структурных белков вируса (без интрона), 132 расположенную непосредственно под промотором бактериофага Т7. Все нуклеотидные замены, приводящие к изменению аминокислот, были исправлены с помощью сайт-специфического мутагенеза на стадиях клонирования и объединения исходных ПЦР-фрагментов. 3.5.2. Транскрипция РНК in vitro Полученные плазмиды использовали для получения РНК in vitro. Для этого к линеаризованной по уникальному сайту XhoI плазмиде pGEM-T7_3286 добавляли соответствующий фрагмент XhoI-NotI из плазмиды pGEMWN190int. После лигирования лигазную смесь использовали в качестве матрицы в реакции транскрипции РНК in vitro (рис.35). A) 133 В) 1 2 3 4 5 Рис.35. A) Схема транскрипции вирусной РНК in vitro. В) Электорофорез в 1% агарозном геле: 1. ДНК-маркер;2. плазмида pGEM-T7_3286; 3. плазмида pGEMWN190int; 4. РНК-транскрипт ВЗН; 5. РНК-маркер. 134 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 4.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей штаммов ВЗН 4.1.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей штаммов ВЗН первого генотипа Четыре штамма ВЗН были изолированы во время эпидемии 1999-2000 гг. (Ast99-901, Ast99-986, Vlg27889 (секционный материал) и Vlg27924) из крови больных людей, штамм Hp94, был изолирован в дельте Волги из клеща Hyalommа. marginatum в 1963 году и использовался для сравнения. Филогенетический анализ этих штаммов показал, что все они относятся к субкластеру 1а первого генотипа ВЗН. Эти пять штаммов мы использовали в данной работе как референтные для анализа первичной структуры исследуемых штаммов ВЗН 2001-2005 года. Нуклеотидные последовательности всех 18-ти штаммов ВЗН были депонированы в международный банк данных GenBank. Нуклеотидные последовательности и присвоенные им номера в базе данных приведены в таблицах 5 и 6 (стр.80, 81). Анализ первичной структуры геномов состоял из нескольких этапов. Сначала, с помощью программного пакета DNASTAR (Lasergene), мы определили процент нуклеотидного сходства, или идентичности, нуклеотидных последовательностей новых (2001-2005гг.) и пяти референтных (Ast99-901, Ast99-986, Vlg27889, Vlg27924 и Hp94) штаммов. Результат представлен в таблице 19. Как видно из приведенных данных, процент нуклеотидной идентичности между новыми исследуемыми штаммами 20012005 годов варьировал от 99,6% до 99,9%, а между новыми и выделенными в 1999-2000 гг. Ast99-986 и Ast99-901 - от 99,1% до 99,7% соответственно. Процент нуклеотидной идентичности между старым штаммом HP-94 и остальными (включая Ast99-986 и Ast99-901) cоставлял 94,5%-94,9%. Таким образом, штамм HP-94 1963 года был максимально и равным образом удален 135 от всех новых (2001-2005 гг.) и двух референтных Ast99-986 и Ast99-901 (1999г.) штаммов. Процент нуклеотидной идентичности между старыми штаммами (Eg101, Az-72, Az-1628, Az-1640, 1304Taj) и остальными (включая Ast99-986 и Ast99-901) cоставлял 94,6%-95,2%. Кроме того, штаммы из Волгограда 1999-2000 гг. отличались от штаммов из Астрахани того же времени, процент нуклеотидной идентичности между ними составлял 96,2%96,4%. Затем, с помощью полученных данных мы оценили эволюционную генетическую дистанцию между штаммами вируса Западного Нила, изолированными в 2001-2005 годах и его более ранними вариантами, которые циркулировали на территории Астраханской области. Таблица 19. Процент нуклеотидной идентичности и дивергенции между исследуемыми и референтными штаммами ВЗН Эволюционная дистанция (p-distance) между двумя очень близкими последовательностями может быть определена в простейшем случае как p=Nd/N, где Nd – число наблюдаемых нуклеотидных замен, а N – общее число нуклеотидов. Отметим также, что в данном случае она может также пониматься и как средняя частота замены каждого нуклеотида, и как процент нуклеотидной дивергенции между анализируемыми последовательностями. Как видно из табл. 19, нуклеотидная дивергенция между новыми штаммами 136 ВЗН варьирует от 0,1-0,4%, а ее вычисленное среднее значение составляет 0,22%. Таким образом, средняя наблюдаемая генетическая дистанция между новыми штаммами составляет 0,22%. Вычисленное среднее значение эволюционной дистанции между новыми штаммами и штаммами ВЗН 1999 года составляет 0,28%, а эволюционная генетическая дистанция между старым Hp-94 1993 года и всеми остальными - 5,42%. Более наглядно генетическое родство старого и новых астраханских штаммов ВЗН иллюстрирует филограмма, изображенная на рис. 35. Рис.35. Генетическое родство штаммов ВЗН, выделенных на территории Астраханской области Все нуклеотидные замены между исследуемыми новыми штаммами ВЗН и штаммами ВЗН 1999 г. Ast99-901 и Ast99-986, суммированы в таблице 20. Общее число нуклеотидных замен в новых штаммах варьирует от 16 до 34. Большинство из них (больше 80%) являются синонимическими и, не приводят к замене аминокислот. Наиболее часто встречаются замены пиримидин на пиримидин. Так, замена СU наблюдается в 36%, обратная ей UC также в 36%. Заметно реже встречаются замены пурин на пурин AG (5%) и GA (11%). Еще более редкими являются замены пурин на пиримидин AC (3%), AU (4%), GU (<1%). Замены пиримидин на пурин (СA, UA, UG) 137 встречались менее, чем в 1% случаев. Совсем не обнаружилось замен СG и GC. Хотя, большая часть нуклеотидных замен является синонимическими, их распределение по геному не является совершенно случайным. Из таблицы 20 видно, например, что нуклеотидные замены в 5’-нетранслируемой области, а также в области генома, кодирующей капсидный белок и белок M, почти не встречаются. Характерным является также то, что позиции, в которых происходили нуклеотидные замены в разных штаммах, часто совпадали. Так, например, в гене, кодирующем белок Е, в позициях генома 2319 и 2409 у большинства штаммов происходила синонимическая замена CU и A U, соответственно (рис. 36). Рис. 36. Характерные нуклеотидные позиции в гене Е. Аналогично, в гене, кодирующем неструктурный белок NS5, в позициях генома 8401, 10305 и 10314 встречаются синонимические замены СU (рис. 37). В 6-ти позициях вирусного генома замены наблюдаются во всех новых штаммах (2361GA, 4537GA, 5185UC, 6303UC, 7452UC и 8691UC) относительно штаммов Ast99-901 и Ast99-986. Хотя синонимические замены и не приводят к замене соответствующей 138 аминокислоты, но, поскольку геном флавивирусов представлен однонитевой положительной РНК, которая не только кодирует вирусные белки, но и содержит важные для репликации вируса элементы вторичной и третичной структуры, даже синонимические нуклеотидные замены могут, тем не менее, влиять на репродукцию вируса через структуру и функции вирусной РНК. Рис.37. Характерные нуклеотидные позиции в гене NS5. Рис.38 иллюстрирует распределение характерных позиций относительно геномной вирусной РНК. Характерными мы считали позиции, в которых замены происходили минимум в 10-ти из 18-ти исследуемых штаммов относительно сразу двух референтных штаммов – Ast-901 и Ast-986. Синонимические замены обозначены зеленым цветом, а замены, приводящие к замещению аминокислот – красным (число в скобках означает количество изолятов ВЗН, у которых в данной позиции генома имеется нуклеотидная замена). 139 Рис.38. Расположение характерных позиций в геноме изолятов ВЗН относительно двух референтных штаммов Ast99-901 и Ast99-986. 4.1.2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей штаммов ВЗН первого генотипа, выделенных после 1999 г Таблица 20. Аминокислотные различия между штаммами ВЗН С M E NS1 NS2A NS2B Ast99-901 156S 105V Ast99-986 156P 105I Ast01-66 156P Ast01-182 156P Ast01-187 154S, 156S Ast02-2-25 156P/S Ast02-2-26 156P Ast02-2-298 156S Ast02-3-208 NS3 NS4A NS4B NS5 169LM 101RK 125AG 682SA 682SA 66AV 682SA 156P 682SA Ast02-3-691 156P 682SA Ast02-3-692 156S Ast02-3-146 Ast02-3-165 128LI 682SA 28SN 154N/K 21MK 156P/S 682SA 48MV 682SA 156Y 156S Ast02-3-570 66AV 253LI 682SA Ast02-3-717 156S 158NS 41KQ 140 682SA 156P Ast04-824A 156S,207GE Ast05-404 169LM 465NS 61GS 215SN 682SA Ast05-405 156S 134YF Ast05-416 154S, 156S 134YF Ast05-418 154I, 156S 682SA Число аминокислотных замен, выявленных при сравнении штаммов ВЗН 2001-2005 гг. с двумя референтными штаммами Ast99-901 и Ast99-986, варьирует от одной до пяти (таблица 20). Степень аминокислотного сходства, таким образом, составляет больше 99,8%. Аминокислотные замены наблюдаются как в структурных, так и в неструктурных белках вируса и, как правило, носят индивидуальный характер. Исключение составляют замена 169LM в белке NS1 у штаммов Ast01-66 и Ast04-824, замена 66AV в белке NS2B у Ast02-2-298 и Ast02-3-570, а также замена 134YF у Ast05-405 и Ast05-416. Однако, глядя на филограмму на рис. 38, можно сделать вывод о том, что эти замены не являлись следствием независимых эволюционных событий. Одна аминокислотная замена SA в позиции 682 белка NS5 встречается у 12-ти из 18-ти анализируемых штаммов. Эта аминокислотная позиция локализована в С-концевом полимеразном домене самого большого и самого консервативного флавивирусного белка NS5, между двумя α-спиралями (α19 и α20 рисунке 39A). Интересно, что у представителей других генетических линий ВЗН в этом положении находится только серин (данные не представлены), а у вирусов японского энцефалита, желтой лихорадки и Денге также встречается аланин (рис.39B). Это свидетельствует о неслучайном характере этой аминокислотной замены и ее возможном биологическом значении для функциональных или структурных свойств белка. 141 Рис. 39 A Схематичная трехмерная структура С-концевого полимеразного домена белка NS5 вируса Денге. В) Выровненные аминокислотные последовательности вирусов Денге (DEN), японского энцефалита (JEV), желтой лихорадки (YF) и вируса Западного Нила (WNV) в области 682 а.к. белка NS5. Иллюстрация из работы Yap T.L., 2007. Как показал филогенетический анализ, из ВЗН выделенных до 1999 г. к первому генотипу (если точнее к субгенотипу 1а) относятся 6 штаммов: 3 штамма выделенных в Азербайджане (1967 и 1970 гг.); штамм Т-1304, 142 выделенный в 1977 г. в Таджикистане; штамм Hp-94 (Астрахань 1963 г.) и классический штамм из Египта (Eg101) 1951 г. Причины, по которой они рассматриваются отдельно от других штаммов первого генотипа, описываемых в данной работе следующие. Во-первых, их анализ проводился в условиях, когда в базе данных была фактически только одна последовательность полного генома ВЗН субгенотипа 1а, поэтому сама работа по подбору праймеров и проведению секвенирования полного генома этих вирусов резко отличается от аналогичной проведенной позднее для штаммов, выделенных после 1999 г., когда были подобраны совершенно другие схемы по оптимальной амплификации фрагментов и праймеры для секвенирования. Во-вторых, при филогенетическом сравнении группы более ранних штаммов ВЗН первого генотипа (1а) со штаммами, выделенными в Астраханской области в 2001-2005 гг. хорошо заметно их отличие. (рис.40) Рис. 40. Сравнение штаммов ВЗН генотипа 1а, выделенных в разные годы на территории Астраханской и Волгоградской областей, штамм 1304Taj из Таджикистана взят в качестве аутгруппы. Следует отметить, что штаммы ВЗН, выделенные в Волгограде и 143 Астраханской области в 1999-2000гг. существенно различаются, что говорит об отсутствии взаимосвязи между этими эпидемическими вспышками. С другой стороны, современные штаммы из Астраханской области достаточно сильно удалены от штамма Hp-94 (Астрахань 1963 г.), который, в свою очередь, близок к штамму из Египта 1951 г. В целом, можно констатировать, что фактор времени изоляции штаммов ВЗН более значим, чем, территориальный фактор, но в тоже время, в одно и тоже время вирусы, выделенные на разных территориях отличаются. 4.1.3. Анализ штамма 3266 2-го генотипа При сравнении полной последовательности генома штамма 3266 с последовательностями других штаммов, для которых были известны полные последовательности геномов, стало очевидно, что штамм 3266 принадлежит ко второму генотипу ВЗН. Гомология с единственными штаммами второго генотипа, для которых были известны полные последовательности геномов была 98,6% при сравнении открытой рамки считывания. Табл. 21 Сравнение штамма 3266 со штаммами генотипов 1, 2, 4 и 5. Единственное серьезное различие двух последовательностей – это делеции, расположенные в 3’-нетранслируемой области, после открытой 144 рамки считывания полипептида. (рис. 41). Вполне возможно, что это - ошибка, допущенная при определении нуклеотидной последовательности штамма М12294, так как – это первая полная последовательность генома ВЗН, заложенная в базу данных, и, поэтому авторы не имели возможности сравнить полученные ими результаты с последовательностями других штаммов и обратить внимание на несоответствие получаемых результатов. В качестве аргумента в пользу такой трактовки можно заметить, что подобная делеция отсутствует у всех других штаммов, причем различных генотипов. Но, конечно, возможен вариант правильного определения последовательности штамма М12294 и, в таком случае, данная делеция является характерной особенностью данного штамма. К настоящему времени в GenBank доступно большое количество последовательностей полных геномов ВЗН генотипа 2. Хотя у некоторых штаммов, в том числе и у штамма 3266, в данной области встречаются небольшие делеции, делеция опубликованная в штамме М12294 не имеет аналогов. 145 Рис. 41 Делеции, расположенные в 3’-нетранслируемой области штаммов генотипа 2 ВЗН. 146 До недавнего времени, не совсем ясен был вопрос о способности штаммов ВЗН второго генотипа вызывать эпидемии у людей. С одной стороны, не было известно ни об одной серьезной эпидемической вспышке, вызванной подобным вирусом, с другой стороны, вирусы ВЗН второго генотипа регулярно выделяются от людей (Южно-Африканская Республика, Сенегал, Конго) [327], собственно, самый первый штамм B956, давший название вирусу, выделенный в 1937г. в провинции Западный Нил (Уганда) из крови заболевшей женщины, принадлежал ко второму генотипу. Тем не менее, до 2004 г. считалось, что ВЗН второго генотипа не вызывает заболеваний, по крайней мере тяжелых, у людей и лошадей. После 2004 г. ситуация резко изменилась [110, 218, 284]. В 2004 г. было зафиксировано заболевание у людей, вызванное ВЗН второго генотипа в России, в 2004-2008 гг. в Венгрии, среди диких птиц в Австрии в 2008 г., серьёзная эпидемическая вспышка среди людей в Греции в 2010 г. [46, 79, 80, 98, 250-254], в том же 2010 г. в Румынии [170, 307], в 2011 г. в России и Италии [43, 44, 45, 204, 233], в 2012 г. в Италии (Сардиния) [291, 292] и Сербии [219, 266, 267], в 2013 г. в Италии и Хорватии [176, 221, 222, 255]. На рис.42 изображена карта Европы с локализацией эпидемических вспышек, вызванных ВЗН второго генотипа. 147 Рис.42 Эпидемические вспышки ВЗН второго генотипа в Европе. Венгрия (1), Австрия (2), Греция (3), Италия (4), Сардиния (5), Россия (6), Сербия (7), и Румыния (8). Рисунок взят из статьи [143]. Несмотря на то, что заболевания, вызванные ВЗН не обнаружены в северной Европе, возможны случаи завоза из других стран. Так, например, случай с заболеванием 73-летней женщины из Бельгии, посетившей Грецию в 2012 г. [91, 97, 124]. Достаточна интересна в связи с вышесказанным структура потенциального сайта гликозилирования в белке Е. 148 Рис. 43 Сравнение потенциальных сайтов гликозилирования в белке Е штаммов генотипа 2 ВЗН. В более ранних штаммах таких, как ArD76104 (Сенегал 1990 г.), B956 (Уганда 1937 г.), LEIV3266 (Украина 1980 г.), WNFCG наблюдается делеция четырех аминокислот; у штамма ArB3573/82 (Центральноафрикансквя республика 1972 г.) сайт NYS заменен на DYS, у штамма из Конго 1958 г. сайт NYS заменен на NYP. Штаммы, выделенные в период эпидемических вспышек в Южной Европе (2004-2013 гг.) [90] содержат мотив NYS в сайте потенциального гликозилирования белка Е. 4.1.4. Анализ штамма Ksnd190 4-го генотипа В процессе проведения работы по определению полной нуклеотидной последовательности генома штамма Ksnd190 стало очевидно, что данный штамм достаточно сильно отличается от других, использованных в данной работе. После анализа частичной последовательности генома штамма Ksnd190 149 это привело к изменению стратегии подбора праймеров для проведения секвенирования, а именно к отказу от использования универсальных праймеров и подбору их специально для данного штамма (раздел результаты). После определения полной последовательности генома штамма Ksnd190 и сравнении её с другими последовательностями ВЗН было показано, что уровень нуклеотидных различий между штаммом Ksnd190 и представителями как генотипа 1, так и генотипа 2 лежит в пределах 28.6–29.7 %. Уровень нуклеотидных различий между штаммом Ksnd190 и штаммом из Индии Ig2266 достигает 30.5%. Следует отметить, что под уровнем нуклеотидных различий между штаммами понимается сумма различий первого штамма от второго плюс второго от первого, то есть, например, если между двумя последовательностями есть различие в 3 нуклеотида на каждые 100, что соответствует уровню замен в 3%, то уровень нуклеотидных различий между штаммами будет равен 6%. Эти данные указывают на то, что штамм Ksnd190 не принадлежит ни к одному из известных ранее генотипов ВЗН, а является представителем нового генотипа (по современной классификации генотип 4). Табл. 22 Сравнение штамма Ksnd190 со штаммами генотипов 1, 2 и 5. К настоящему времени в базе данных появилось еще 4 полных 150 последовательности генома штаммов ВЗН 4-го генотипа: три из Волгоградской области (два штамма выделены в 2005 г. и один в 2006 г.), и один из Австрии 2013 г. выделения [248]. В Волгограде и его окрестностях с помощью ПЦР "в реальном времени" были изучены ткани 95 озерных лягушек Rana ridibunda и около 1300 питающихся на земноводных комаров Uranotaenia unguiculata, собранных в 2002—2006 гг. в г. Инфицированностъ лягушек вирусом Западного Нила (ВЗН) составляла от 2 до 16%. Уровень инфицированности U. unguiculata достигал 5,7% (95% доверительный интервал 4,2—7,6%). Гомология нуклеотидных последовательностей фрагмента гена Е (973 п.о.) 44 изолятов из лягушек и U. unguiculata между собой и с последовательностью штамма LEIV-Krnd88-190 составляла 97,2— 98,5%, т. е. все эти изоляты входили в генотип 4 ВЗН. Попытки заражения этими изолятами культур клеток млекопитающих и комаров, а также новорожденных белых мышей не принесли успеха. Цитопатогенный эффект в культуре и смертность мышей отсутствовали. Анализ потенциального сайта гликозилирования в белке Е N-X-S/T показал во всех штаммах, кроме LEIV-Krnd88-190 наличие последовательности NLS, в штамме LEIV-Krnd88-190 в данном участке присутствует делеция двух аминокислот (рис. 44). Рис. 44 Сравнение потенциальных сайтов гликозилирования в белке Е штаммов генотипа 4 ВЗН. 4.1.5. Анализ штамма Ig2266 5-го генотипа На момент проведения данной работы информация о нуклеотидных 151 последовательностях генома штаммов ВЗН, изолированных в Индии, была представлена крайне скудно. К 2002 году для определения родства штаммов ВЗН из Индии с другими представителями ВЗН было доступно несколько последовательностей гена Е (не всегда полных). На основании их сравнения с аналогичными последовательностями других штаммов ВЗН делался вывод о принадлежности этих штаммов в генотипу 1, субгенотипу 1с [53, 76, 155, 180, 212, 263, 268, 296]. В тоже время, сравнительные исследования изолятов ВЗН из Индии и представителей ВЗН генотипа 1 по таким характеристикам, как антигенные свойства, нейроинвазивность и патогенез в мышах, указывали на заметные различия индийских изолятов и ВЗН первого генотипа. В данной работе, для более точной локализации положения штамма Ig2266 среди других представителей ВЗН, использовалась полная последовательность генома вируса. При сравнении полных последовательностей геномов, было показано, что уровень нуклеотидных различий между штаммом Ig2266 и представителями как генотипа 1, так и генотипа 2 лежит в пределах 24–25 %. Исходя из того, что различия между генотипами 1 и 2 составляют 23–25 %, логично отнести индийский штамм Ig2266 к новому генотипу (в настоящее время - генотип 5). Табл. 23 Сравнение штамма Ig2266 со штаммами генотипов 1, 2 и 4. 152 В дальнейшем, при определении полных нуклеотидных последовательностей других изолятов ВЗН их Индии, этот вывод был подтвержден другими авторами [36, 41, 60, 85, 153, 285]. Анализ потенциального сайта гликозилирования в белке Е в штамме Ig2266 показал последовательность SYS, что указывает на отсутствие гликозилирования данного участка белка. В данной работе был проведен анализ еще одного штамма (Tyr2914), формально попадающего в 5-ый индийский генотип ВЗН, но так как при сравнении его полной нуклеотидной последовательности генома с последовательностью штамма Ig2266 не было обнаружено ни одной нуклеотидной замены, был сделан вывод о контаминации при культивировании вирусов, таким образом последовательности штамма Tyr2914 не закладывались в базу данных и в данной работе не анализируются. 4.2. Анализ генетических детерминант патогенности ВЗН Отдельно, для всех исследуемых штаммов, были проанализированы известные к настоящему моменту генетические детерминанты вируса ЗН, отвечающие за его патогенные свойства. К таким известным факторам патогенности вируса относится, в частности, потенциальный сайт Nгликозилирования оболочечного белка Е, находящийся в позиции 154-156 а.к. (подробная информация о структуре белка Е и его функциональных свойствах содержится в главе 1.4 литературного обзора). Здесь расположен потенциальный сайт N-гликозилирования N-X-S/T у многих флавивирусов, включая ВЗН. На рис.45 показаны выровненные нуклеотидные и аминокислотные последовательности всех исследуемых штаммов, а также некоторых других, в области белка Е в районе 154-156 а.о. При анализе потенциального сайта N-гликозилирования штаммов ВЗН первого генотипа было обнаружено: у 6 из 18 современных штаммов из Астрахани (Ast02-2-298, Ast02-3-717, Ast02-3-570, Ast01-692, Ast05-404, Ast05-405) присутствует мотив NYS, а еще у трех (Ast02-2-25, Ast02-3-208, Ast01-182) изолятов при 153 анализе хроматограмм секвенирования позиция 1434 н.п. гена Е оказалась гетерогенной и содержала смесь нуклеотидов С/U, обозначенная на рис. 45 как Y. Это свидетельствует об исходном генетическом полиморфизме гена Е в этих штаммах, который приводит к появлению соответствующей смешанной позиции серин/пролин позиции в белке Е. Таким образом, частично мотив NYS присутствует и в этих 3 штаммах. У остальных штаммов сайт гликозилирования отсутствует, а вместо мотива NYS присутствуют варианты – NYP (Ast01-66, Ast02-2-26, Ast04-824, Ast02-3-691), SYS (Ast01-187, Ast05416), NYY (Ast02-3-165), IYS (Ast05-418). У штамма Ast02-3-146 гетерогенными оказались позиции 1427(A/C), обозначенная на рис. 45 как М, и 1434(C/U), что потенциально допускает частичное гликозилирование белка Е и в этом штамме. Референтные штаммы Ast99-901 и Ast99-986 имеют мотив NYS и NYP соответственно. Штамм Hp94 также содержит сайт гликозилирования NYS. Рис.45 Выровненные нуклеотидные и аминокислотные последовательности штаммов ВЗН в области гликозилирования белка Е. У штаммов из Волгограда Vlg27889 и Vlg27924 в данной позиции расположены соответственно, аминокислотные что говорит последовательности о потенциально KYS более и NYS, высокой 154 нейроинвазивности второго штамма. В тоже время, штамм Vlg27889 был изолирован из секционного материала от умершего больного. Как уже упоминалось выше, в опытах in vivo было показано, что дегликозилирование участка 154-156 а.к. вирусного белка Е приводило к аттенуации нейроинвазивности (но не нейровирулентности) в мышах. В коллекционных штаммах Eg101 и трех штаммах из Азербайджана присутствует мотив NYP, а в штамме из Таджикистана (1977 г.) – NYF, что говорит об отсутствии гликозилирования белка в этом сайте. Сайты гликолилирования в районе 154156 а.к. вирусного белка Е для представителей 2, 4 и 5 генотипов вируса ЗН рассмотрены выше в соответствующих разделах, посвященных этим генотипам ВЗН. Еще несколько важных потенциальных сайтов гликозилирования находятся в белке NS1 в аминокислотных позициях 130, 175 и 203. Мутанты вируса, дегликозилированные по двум или трем из них, вызывали пониженную виремию и уменьшали уровень летальности in vivo [96]. Все три потенциальных сайта гликозилирования белка NS1 сохранились во всех исследуемых и референтных штаммах. Недавно был идентифицирован еще один важный генетический фактор патогенности вируса, связанный с 249 аминокислотой неструктурного белка NS3. Анализируя аминокислотные последовательности разных представителей вируса Западного Нила, относящихся к разным генетическим линиям, можно убедиться, что эта аминокислотная позиция является очень вариабельной. В частности, она может быть представлена треонином или пролином. Рис. 46 иллюстрирует вариабельность этой аминокислотной позиции среди представителей разных генетических линий ВЗН. Недавно с помощью эволюционного анализа было показано, что эта аминокислота подвержена высокой адаптивной селекции и, по-видимому, играет важную роль в приспособлении вируса к популяциям различных хозяев. 155 Рис. 46 Вариабельность позиции 249P в белке NS3 среди различных генетических линий ВЗН (a) и ее связь с географическим распределением ВЗН (b). Иллюстрация взята из работы Brault et. al., 2007. В опытах in vivo было показано, что в низкопатогенном исходно для американского вида ворон Corvus brachyrhynchos штамме ВЗН, единственная замена в белке NS3 по позиции 249 треонина на пролин приводила к существенному изменению патогенных свойств вируса с увеличением титра виремии больше, чем в 105 раз и повышением уровня смертности до 94% (против исходного в 31%). Напротив, в исходно высокопатогенном штамме обратная замена 249 пролин на треонин приводила к снижению титра виремии с 9.4log10 до 3.6 log10 Б.О.Е, а уровень смертности снизился со 100% до 12,5%. Оба штамма принадлежали к первой генетической линии и имели дополнительно 11 аминокислотных различий в геноме [67]. Все штаммы, выделенные в Астраханской области в 1999-2005 гг., включая референтные Ast99-901, Ast99-986, а также штамм Hp94 1963 года, имеют в данной аминокислотной позиции пролин и, таким образом, содержат в себе важный фактор патогенности ВЗН. 4.3. ОТ-ПЦР тест система для обнаружения РНК ВЗН Как показали исследования вариантов ОТ-ПЦР (один раунд, 156 «полугнездовой», «гнездовой») тест систем, наилучшим является использование «гнездового» метода, который позволяет обнаружить РНК вируса ЗН до концентрации 50 БОЕ/мл. С учетом того, что объем пробы для выделения РНК составлял 200 мкл., и только половина выделенной РНК использовалась в реакции получения кДНК для дальнейшего проведения ПЦР, это означает, что порог чувствительности данного метода лежит около 5 копий на пробу. Дополнительно, данная система показала возможность выявлять РНК ВЗН 1го, 2-го, 4-го и 5-го генотипов. При анализе пулов комаров из Астраханской области, хотя основную часть (96%) положительных проб составляли вирусы ЗН первого генотипа, были выявлены пробы, содержащие РНК вируса Западного Нила 2-го и 4-го генотипов (по 2% соответственно). Все ПЦР фрагменты, для которых была определена первичная нуклеотидная последовательность, содержали предполагаемый участок генома ВЗН, что говорит о высокой специфичности метода. Так как, нельзя исключить наличия дополнительных, пока неизвестных генотипов и вариантов ВЗН, последовательности которых могут иметь большее количество нуклеотидных замен в местах посадки праймеров и, как следствие, более низкую оптимальную температуру отжига праймеров при проведении ПЦР, эта температура сознательно была снижена до 50 0С, тем более, что проведенные постановки ПЦР с использованием градиента температур при отжиге праймеров позволяют это сделать. Реакции и при достаточно низких температурах проходят эффективно и чисто (рис. 27). 4.4. Исследование комаров и клещей Астраханской области на наличие ВЗН при помощи ОТ-ПЦР системы При проведении исследований была продемонстрирована способность выбранного варианта ОТ-ПЦР системы работать со сложными и высокозагрязненными пробами, содержащими РНК ВЗН в низкой концентрации такими, как пулы комаров. 157 В результате проведенной работы по определению нуклеотидных последовательностей вируса ЛЗН из положительных пулов комаров можно сделать следующие замечания. Во-первых, все положительные ПЦР – пробы содержали действительно фрагмент последовательности вируса ЛЗН и не являлись ложно- положительными результатами ПЦР-анализа. Во-вторых, практически все последовательности хотя бы минимально отличаются друг от друга, что указывает на их независимый первичный источник и отсутствие контаминации при проведении молекулярнобиологических манипуляций с материалом. В-третьих, впервые показано на пробах полевого материала (пулы комаров) возможность разработанной ранее ОТ-ПЦР тест–системы выявлять наличие РНК вариантов вируса ЛЗН, относящихся ко второй и четвертой группам. Дополнительно, следует отметить, что РНК ВЗН 4-го генотипа была выявлена в комарах видов, отличающихся от Uranotaenia unguiculata, что говорит о возможном распространении этого генотипа не только комарами вида Uranotaenia unguiculata, хотя, вероятно, этот вид комаров, как переносчик и резервуар, более важен для этого генотипа вируса. Кроме того, топотипный штамм вируса 4-го генотипа LEIV-Krd88-190, исследуемый в данной работе, был изолирован из клеща Dermacenter marginatum, что также указывает на то, что комары вида Uranotaenia unguiculata не являются уникальными резервуарами и переносчиками этого генотипа ВЗН. 4.5. Клонирование кДНК-копии генома вируса Западного Нила Целью данной работы являлось клонирование полноразмерной кДНК копии генома вируса (в рамках работы по созданию обратной генетической системы для ВЗН). Для этой цели был выбран штамм LEIV-Krd88-190, изолированный на территории России в 1988 году из клеща Dermacenter marginatum и относящийся к отдельной, IV филогенетической группе. 158 Выбор штамма для проведения этой работы был сделан исходя из того, что, в отличии от генотипов 1 и 2, до настоящего времени не показана способность 4-го генотипа ВЗН вызывать заболевания у людей. Распространение вирусов ЗН 5-го (индийского) генотипа до настоящего времени не показано на других территориях, кроме Индии, кроме того, исходя их последних данных, крайне высока вероятность 5-го генотипа вызывать эпидемические вспышки среди людей [60]. Так как, работа по созданию полноразмерной копии генома ВЗН проводилась с расчетом на дальнейшее создание вакцинных штаммов, то данный выбор обоснован, хотя, к потенциальным минусам такого выбора следует отнести возможно, некоторые различия антигенных детерминант вирусов ВЗН разных генотипов [148, 160]. 4.6. Значимость полученных данных о нуклеотидных последовательностях ВЗН, заложенных в базу данных К моменту начала данной работы в 2000 г. в базе данных было 3 последовательности полных геномов ВЗН: две последовательности для первого генотипа, по одной для субгенотипов 1а и 1 b (вирус Кунджин, на тот момент, считавшийся самостоятельным вирусом), одна последовательность для генотипа 2. Следует отметить, что для вируса ЗН средняя задержка по времени между изоляцией вируса и доступностью его последовательности в базе данных составляла в 2000-х годах около 8 лет. Возможно, это было связано с коммерциализацией проектов по созданию вакцинных препаратов, возможно, с лавинообразным распространением вируса по американскому континенту и, с закрытостью связанных с этим проектов по исследованию свойств вируса. Для иллюстрации приведены сравнительные диаграммы изоляции и доступности последовательностей в GenBank в США за период 1999-2011 гг. 159 250 200 150 100 изоляция США 50 GenBank США 2011 изоляция США 2010 2009 2008 2007 2006 2005 2004 2003 2002 2001 2000 1999 0 К настоящему времени (данные на середину 2014 г.), информация о последовательность ВЗН, изолированных в США составляет около 80% общемировой. Все эти последовательности (США) представляют субгенотип 1а и достаточно близки между собой, так как происходят от одного варианта вируса ЗН, завезенного на американский континент в 1999 г. В сумме это примерно 400 полногеномных последовательностей вируса. Остальные (около 100) последовательностей распределены следующим образом: Африка – 22, Южная и Центральная Америка – 15 [117], Азия (Китай и Япония) – 3 [236, 237], Австралия – 4, Индия – 8, Европа без России – 28, Россия – 29. Вклад данной работы в базу данных – это 24 последовательности вирусов, изолированных в России, 3 – из Азербайджана, по одному из Индии, Украины, Египта и Таджикистана. Наиболее важным является тот факт, что в данной работе было показано наличие у ВЗН двух дополнительных генотипов (4 и 5), впервые определены полные нуклеотидные последовательности для референтных штаммов этих генотипов (LEIV-Krd88-190 для генотипа 4 и Ig-2266 для генотипа 5). Эти данные значительно облегчили поиск и анализ последовательностей ВЗН, 160 входящих в эти генотипы. Выводы, сделанные о генотипической принадлежности были позднее полностью подтверждены анализом других вирусов, относящихся к этим группам. Понятно, что наличие в базе данных нуклеотидных последовательностей полных геномов вирусов, максимально близких к исследуемым значительно упрощает и, даже, в корне меняет саму схему выбора праймеров и проведение секвенирования геномов вирусов. Такая информация крайне важна и для создания тест-систем для обнаружения РНК ВЗН в пробах, так как позволяет подобрать праймеры и режимы ПЦР, позволяющие не пропустить положительные пробы из-за отличий в выбранных местах посадок праймеров, или из-за неверных режимов проведения ОТ-ПЦР. 161 ВЫВОДЫ 1. Анализ первичной структуры 13 полных геномов вирусов Западного Нила, циркулировавших на территории Евразии в период с 1955 по 2000 гг. показал принадлежность этих штаммов к различным генотипам вируса Западного Нила и позволил установить различия в последовательностях, влияющих на патогенные свойства вируса. Получены новые знания о генетическом разнообразии ВЗН. 2. Показано, что из 31 штамма вируса Западного Нила, исследованного в работе путем полногеномного секвенирования, 28 принадлежат к субгенотипу 1a. Ранее данные штаммы были охарактеризованы только на основании антигенных свойств вирусов. 3. Штамм ВЗН 3266 (Украина, 1980 г.) принадлежит генотипу 2 и является первым охарактеризованным штаммом этого генотипа, выделенным на территории Евразии. 4. Получены новые знания, позволившие выявить новый генотип ВЗН. Установлено, что штамм Krnd88-190 (Россия, 1988 г.) вируса Западного Нила представляет новый генотип 4 и является для него топотипным штаммом. 5. Впервые установлено, что штамм Ig2266 (Индия, 1955 г.) вируса Западного Нила представляет новый генотип 5 и является для него топотипным штаммом. Получены новые знания, позволившие внести коррективы в существующую таксономию ВЗН. 6. Установлено, что 18 штаммов вируса Западного Нила, изолированных в 2001-2005 гг. в Астраханской области РФ, имеют высокую гомологию как между собой (99,6% - 99,9%), так и со штаммами ВЗН Ast99-901 и Ast99-986 (99,1% - 99,7%), которые вызвали эпидемические вспышки в этом регионе в 1999-2000 гг. Показано, что у 6 из 18 проанализированных штаммов присутствует потенциальный сайт N гликозилирования (NYS). У 9 из 18 штаммов сайт потенциального гликозилирования отсутствует (вместо мотива NYS присутствуют мотивы NYP, SYS, NYY и IYS), а у 3 штаммов содержится частично, так как соответствующая позиция в геноме гетерогенна. 162 Представленные данные свидетельствуют об одновременной циркуляции различных по патогенности вариантов ВЗН в Астраханской области в 20022005 гг. 7. У исследованных в данной работе 18 штаммов вируса Западного Нила 2001-2005 гг. (Астраханская область РФ) в геликазном домене неструктурного белка NS3 в положении 249 содержится аминокислота пролин, что коррелирует с высокопатогенными свойствами вируса Западного Нила in vivo. 8. Разработанная ОТ-ПЦР тест- система обладает высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет выявленять РНК вируса Западного Нила в биопробах птиц, комаров и клещей. Тест – система защищена патентом РФ №2199589 от 27.02.2003 г. 9. В Астраханской области в 2001-2004 гг. зараженность комаров вирусом Западного Нила составляла от 0,016% до 0,048%, преобладающим был субгенотип 1а (96%), на генотипы 2 и 4 приходилось по 2%. 10. Зараженность птиц вирусом Западного Нила в дельте Волги составляла 13,3 % и 9,6 % в 2001 и 2002 гг. соответственно. Зараженность птиц Волго – Ахтубинской поймы составляла в 2002 г. 3,3 %. 11. Разработана авторская экспериментальная система для транскрипции вирусной РНК in vitro на основе бактериальной высококопийной плазмиды, которая содержит полноразмерную кДНК копию генома штамма Krnd88-190, и может быть использована для получения измененных вариантов вируса Западного Нила методом обратной генетики. 163 БЛАГОДАРНОСТИ Автор приносит искреннюю благодарность всем своим коллегам, в тесном сотрудничестве с которыми была выполнена данная работа: сотрудникам лаборатории «Молекулярной генетики» за помощь в работе, всему коллективу лаборатории «Экологии вирусов» за предоставленный материал для исследований. Автор благодарен директору Института вирусологии им.Д.И. Ивановского, академику РАН Д.К.Львову за возможность проведения данных исследований и руководство в работе. Автор выражает огромную благодарность члену-корреспонденту РАН, профессору, д.м.н. Л.В.Урываеву и профессору, д.б.н. Т.В.Гребенниковой за неоценимую помощь в обсуждении работы и подготовке её к защите. 164 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Березин В.В., Семенов Б.Ф., Решетников И.А., Башкирцев В.Н. Значение птиц в естественном цикле арбовирусов, передаваемых комарами, в дельте Волги. Трансконтинентальные связи перелетных птиц и их роль в распространении арбовирусов. Под ред. В.Р. Обухова. Новосибирск.: Наука, 1972. 310-313 с. 2. Булычев В.П., Данияров А., Гордеева З.Е. Выделение вируса Западного Нила от комаров Culex pipiens в Таджикистане. Арбовирусы. Инст.вирусологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР.М. 1981. 95-96 с. 3. Бутенко А.М.,Чумаков М.П., Беляева А.П. Серологическая идентификация астраханского вируса из клещей. Клещевой энцефалит, кемеровская клещевая лихорадка и другие арбовирусные инфекции. Под ред.М.П.Чумакова. 1964. М. 7-9 с. 4. Бутенко А.М.,Чумаков М.П., Башкирцев В.Н. Новые данные об изучении инфекции Западного Нила в СССР. Материалы 15-й научн. сессии ИПВЭ АМН СССР. 1968. Вып.3. 175-176 с. 5. Бутенко А.М.,Чумаков М.П., Башкирцев В.Н. Выделение штамма вируса Западного Нила в Астраханской области из комаров и вороны. Этиология, эпидемиология и клиника КГЛ и лихорадки Западного Нила. под ред. М.П. Чумакова. Астрахань. 1969. 39-40 с. 6. Виноград И.А., Белетская Г.В., Чумаченко С.С., Ардаматская Т.Б., Рогочий Е.Г. Изоляция вируса Западного Нила в южной Украине. Вопр. вирус. 1982. №5. 55-57 с. 7.Войнов И.Н., Рытик П.Г., Григорьев А.И. Арбовирусные инфекции в Белоруссии. Вирусы и вирусные инфекции человека. 1981 .86-87 с. 165 8. Гайдамович С.Н., Никифоров Л.П., Червонский В.И., Клисенко Г.А., Громашевский В.Л., Обухова В.Р. Выделение вируса Западного Нила у черных дроздов и поползней в Азербайджане. Трансконтинентальные связи перелетных птиц и их роль в распространении арбовирусов. Под ред. В.Р. Обухова. Новосибирск.: Наука. 1972. 229-313 с. 9. Жданов В.М., Львов Д.К. Эволюция возбудителей инфекционных болезней. М.: Медицина. 1984. 270 с. 10. Ковтунов А. И., Колобухина Л. В., Москвина Т. М., Шишкина Е. О., Джаркенов А. Ф., Кистенева Д. Н., Львов Д. Н., Щелканов М. Ю., Аристова В. А., Ларичев В.Ф., Злобина Л. В., Гришанова А. П., Гренкова Е. П., Аршба Т. Е., Оганесян Ю. В. Заболеваемость и заражаемость населения Астраханской области лихорадкой Западного Нила в 2002 г. Вопр. вирусол. 2003. №5. 9-28 с. 11. Львов Д.К. Лихорадка Западного Нила. Вопр. вирусол. 2000. №2. 24-34 с. 12. Львов Д.К., БутенкоА.М., Гайдамович С.Я., Ларичев В.Ф., Лещинская Е.В., Лазаренко В.В., Петров В.Р., Триханов С.Т., Хуторецкая Н.В., Шишкина Е.О., Яшков А.Б. Эпидемия менингоэнцефалита в Краснодарском крае и Волгоградской области, вызванная вирусом Западного Нила. Вопр.вирусол.2000. №1. 37-38 с. 13. Львов Д.К., БутенкоА.М., Вышемирский О.И., Гайдамович С.Я., Громашевский В.Л., Ларичев В.Ф., Морозова Т.Н., Скворцова Т.М., Хуторецкая Н.В., Шишкина Е.О., Яшков А.Б., Платонов А.Е., Шипулин Г.А., Шипулина О.Ю., Жуков А.Н., Лазоренко В.В., Русакова Н.В., Азарян А.А., Гришанова А.П., Глимзянов Х.М., Гринкова Е.П. Выделение вируса лихорадки Западного Нила от больных людей в период эпидемической вспышки в Волгоградской и Астраханской областях. Вопр. вирусол. 2000. №3. 56-64 с. 14. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. Москва.: Медицина. 1986. 336 с. 166 15. Львов Д. К., Ковтунов А. И., Яшкулов К. Б., Громашевский В. Л., Джаркенов А. Ф., Щелканов М. Ю., Куликова Л. Н., Сэвидж Г., Чимидова Н. М., Михаляева Л. Б., Васильев А. В., Галкина И. В., Прилипов А. Г., Кинни Р., Самохвалов Е. И., Бушкиева Б. Ц., Гублер Д., Альховский С. К., Аристова В. А., Дерябин П. Г., Бутенко А. М., Москвина Т. М., Львов Д. Н., Злобина Л. В., Ляпина О. В., Садыкова Г. К., Шаталов А. Г., Усачев В. Е., Воронина А. Г., Лунева Л. И. Особенности циркуляции вируса Западного Нила (Flaviviridae, Flavivirus) и некоторых других арбовирусов в экосистемах дельты Волги, Волго-Ахтубинской поймы и сопредельных аридных ландшафтах (2000— 2002 гг.). Вопросы вирусологии 2004. №3. 45-51 с. 16. Львов Д. К., Ковтунов А. И., Яшкулов К. Б., Громашевский В. Л., Джаркенов А. Ф., Щелканов М. Ю., Куликова Л. Н., Сэвидж Г., Чимидова Н. М., Михаляева Л. Б., Васильев А. В., Галкина И. В., Прилипов А. Г., Кинни Р., Самохвалов Е. И., Бушкиева Б. Ц., Гублер Д., Альховский С. К., Аристова В. А., Дерябин П. Г., Бутенко А. М., Москвина Т. М., Львов Д. Н., Злобина Л. В., Ляпина О. В., Садыкова Г. К., Шаталов А. Г., Усачев В. Е., Воронина А. Г., Лунева Л. И. Проблемы безопасности при новых и вновь возникающих инфекциях. Вестник РАМН. 2004. №5. 20-25 с. 17. Львов Д.К., Лебедев А.Д. Экология арбовирусов. Москва.: Медицина.1974. 184 с. 18. Прилипов А.Г., Самохвалов Е.И., Львов Д.К., Громашевский В.Л., Бутенко А.М., Вышемирский О.И., Ларичев В.Ф., Гайдамович С.Я, Хуторецкая Н.В., Воронина А.Г., Новиков Д.В., Мохонов В.В. Альховский С.В. Генетический анализ вирусов лихорадки Западного Нила, выделенных на юге Русской равнины. Вопр. вирусол. 2001. №1. 8-12 с. 19. Прилипов А.Г., Кинни Р.М., Самохвалов Е.И., Сэведж Г., Альховский С.В., Тсучия Р., Громашевский В.Л., Садыкова Г.К., Шаталов А., Вышемирский О., Усачев Е., Мохонов В., Воронина А., Бутенко А.М., Ларичев В.Ф., Жуков А., 167 Ковтунов А., Гублер Д., Львов Д.К. Анализ новых вариантов вируса лихорадки Западного Нила. Вопр. вирусол. 2002. №4. 36-41 с. 20. Сиденко Б.Ф., Думина А.Л., Грекова В.С. Циркуляция вируса Западного Нила среди птиц Украинского Причерноморья. В кн.: Экология вирусов. Вып I. Москва. 1973. 164-169 с. 21. Сидорова Г.А., Громашевский В.Л., Веселовская О.В., Неронов В.М., Рустамова Б.Р., Мусатова А.И., Ипатов В.И. Изоляция вирусов Западного Нила из иксодовых и аргасовых клещей, собранных в аридных районах Узбекистана. В кн.: Экология вирусов. Вып.I. Москва. 1973. 87-90 с. 22. Субботина Е.Л., Локтев В.Б. Молекулярная эволюция вируса Западного Нила. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2014. №1. 31-37 с. 23. Ставицкий А.В. Изучение восприимчивости диких уток к вирусу Западного Нила. В кн.: Вирусы, экологически связанные с птицами. Омск. инст. проиродноочаг. инф. Омск. 1971. 18-19 с. 24. Федорова М.В., мат. конф. Арбовирусы и арбовирусные инфекции 2006. 25. Федотова Т.Н., Ставский А.В., Федоров В.Г. Лихорадка Западного Нила у эксперементально инифицированных грачей. В кн.: Вирусы, экологически связанные с птицами. Омск. инст. проиродноочаг. инф. Омск. 1971. 19-22 с. 26. Чумаков М.П., Беляева А.П., Бутенко А.М. Выделение и изучение своеобразного вируса из клещей Hyalomma plumbeum и из крови лихорадящего больного в Астраханской области. В кн.: Клещевой энцефалит, кемеровская клещевая лихорадка и другие арбовирусные инфекции. Под ред.М.П.Чумакова. Москва. 1964. 5-7 с. 27. Чумаков М.П., Беляева А.П., Бутенко А.М., Мартьянова Л.И. Вирус Западного Нила в СССР. Эпидемиология вирусных инфекций. 1968. Т.12. 365373 с. 168 28. Чумаков М.П., Бутенко А.М., Башкирцев В.Н. Выделение вируса Западного Нила от больных людей в Астраханской области. Этиология, эпидемиология и клиника крымской геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила. Астрахань. 1969. 36-38 с. 29. Шишкина Е. О., Бутенко А.М., Гайдамович С.Я., Ларичев В. Ф., Журавлев В.И., Щербакова С. А., Ковтунов А. И., Джаркенов А. Ф., Ситков В. Г., Донская М. Г. Изучение иммуноструктуры населения Астраханской области к вирусу Западного Нила в 1998 и 1999 гг. Вопр.вирусол. 2002. №6. 13-17 с. 30. Adams, S.C., Broom, A.K., Sammels, L.M., Hartnett, A.C., Howard, M.J., Coelen, R.J., Mackenzie, J.S., and Hall, R.A.Glycosylation and antigenic variation among Kunjin virus isolates. // Virology.1995.V.206 (1). P. 49-56. 31. Amanna, I.J. and Slifka, M.K.Current trends in West Nile virus vaccine development. // Expert Rev Vaccines.2014.V.13 (5). P. 589-608. 32. Anderson, J.F., Andreadis, T.G., Vossbrinck, C.R., Tirrell, S., Wakem, E.M., French, R.A., Garmendia, A.E., and Van Kruiningen, H.J.Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut. // Science.1999.V.286 (5448). P. 2331-3. 33. Andreadis, T.G., Anderson, J.F., and Vossbrinck, C.R.Mosquito surveillance for West Nile virus in Connecticut, 2000: isolation from Culex pipiens, Cx. restuans, Cx. salinarius, and Culiseta melanura. // Emerg Infect Dis.2001.V.7 (4). P. 670-4. 34. Angenvoort, J., Fischer, D., Fast, C., Ziegler, U., Eiden, M., de la Fuente, J.G., Lierz, M., and Groschup, M.H.Limited efficacy of West Nile virus vaccines in large falcons (Falco spp.). // Vet Res.2014.V.45. P. 41. 35. Anis, E., Grotto, I., Mendelson, E., Bin, H., Orshan, L., Gandacu, D., Warshavsky, B., Shinar, E., Slater, P.E., and Lev, B.West Nile fever in Israel: the reemergence of an endemic disease. // J Infect.2014.V.68 (2). P. 170-5. 169 36. Anukumar, B., Sapkal, G.N., Tandale, B.V., Balasubramanian, R., and Gangale, D.West Nile encephalitis outbreak in Kerala, India, 2011. // J Clin Virol.2014.V.61 (1). P. 152-5. 37. Anwar, A., Chandrasekaran, A., Ng, M.L., Marques, E., and August, J.T.West Nile premembrane-envelope genetic vaccine encoded as a chimera containing the transmembrane and cytoplasmic domains of a lysosome-associated membrane protein: increased cellular concentration of the transgene product, targeting to the MHC II compartment, and enhanced neutralizing antibody response. // Virology.2005.V.332 (1). P. 66-77. 38. Arnold, C.West Nile virus bites back. // Lancet Neurol.2012.V.11 (12). P. 1023-4. 39. Bakonyi, T., Ferenczi, E., Erdelyi, K., Kutasi, O., Csorgo, T., Seidel, B., Weissenbock, H., Brugger, K., Ban, E., and Nowotny, N.Explosive spread of a neuroinvasive lineage 2 West Nile virus in Central Europe, 2008/2009. // Vet Microbiol.2013.V.165 (1-2). P. 61-70. 40. Bakonyi, T., Hubalek, Z., Rudolf, I., and Nowotny, N.Novel flavivirus or new lineage of West Nile virus, central Europe. // Emerg Infect Dis.2005.V.11 (2). P. 225-31. 41. Balakrishnan, A., Butte, D.K., and Jadhav, S.M.Complete genome sequence of west nile virus isolated from alappuzha district, kerala, India. // Genome Announc.2013.V.1 (3). P. 42. Banet-Noach, C., Malkinson, M., Brill, A., Samina, I., Yadin, H., Weisman, Y., Pokamunski, S., King, R., Deubel, V., and Stram, Y.Phylogenetic relationships of West Nile viruses isolated from birds and horses in Israel from 1997 to 2001. // Virus Genes.2003.V.26 (2). P. 135-41. 43. Barzon, L., Pacenti, M., Franchin, E., Lavezzo, E., Masi, G., Squarzon, L., Pagni, S., Toppo, S., Russo, F., Cattai, M., Cusinato, R., and Palu, G.Whole genome 170 sequencing and phylogenetic analysis of West Nile virus lineage 1 and lineage 2 from human cases of infection, Italy, August 2013. // Euro Surveill.2013.V.18 (38). P. 44. Barzon, L., Pacenti, M., Franchin, E., Pagni, S., Lavezzo, E., Squarzon, L., Martello, T., Russo, F., Nicoletti, L., Rezza, G., Castilletti, C., Capobianchi, M.R., Salcuni, P., Cattai, M., Cusinato, R., and Palu, G.Large human outbreak of West Nile virus infection in north-eastern Italy in 2012. // Viruses.2013.V.5 (11). P. 282539. 45. Barzon, L., Pacenti, M., Franchin, E., Squarzon, L., Lavezzo, E., Toppo, S., Martello, T., Cattai, M., Cusinato, R., and Palu, G.Novel West Nile virus lineage 1a full genome sequences from human cases of infection in north-eastern Italy, 2011. // Clin Microbiol Infect.2012.V.18 (12). P. E541-4. 46. Barzon, L., Papa, A., Pacenti, M., Franchin, E., Lavezzo, E., Squarzon, L., Masi, G., Martello, T., Testa, T., Cusinato, R., and Palu, G.Genome sequencing of West Nile Virus from human cases in Greece, 2012. // Viruses.2013.V.5 (9). P. 2311-9. 47. Beasley, D.W.Vaccines and immunotherapeutics for the prevention and treatment of infections with West Nile virus. // Immunotherapy.2011.V.3 (2). P. 26985. 48. Beasley, D.W. and Barrett, A.D.Identification of neutralizing epitopes within structural domain III of the West Nile virus envelope protein. // J Virol.2002.V.76 (24). P. 13097-100. 49. Beasley, D.W., Li, L., Suderman, M.T., and Barrett, A.D.Mouse neuroinvasive phenotype of West Nile virus strains varies depending upon virus genotype. // Virology.2002.V.296 (1). P. 17-23. 50. Beasley, D.W., Whiteman, M.C., Zhang, S., Huang, C.Y., Schneider, B.S., Smith, D.R., Gromowski, G.D., Higgs, S., Kinney, R.M., and Barrett, A.D.Envelope 171 protein glycosylation status influences mouse neuroinvasion phenotype of genetic lineage 1 West Nile virus strains. // J Virol.2005.V.79 (13). P. 8339-47. 51. Bell, J.A., Brewer, C.M., Mickelson, N.J., Garman, G.W., and Vaughan, J.A.West Nile virus epizootiology, central Red River Valley, North Dakota and Minnesota, 2002-2005. // Emerg Infect Dis.2006.V.12 (8). P. 1245-7. 52. Bernkopf, H., Levine, S., and Nerson, R.Isolation of West Nile virus in Israel. // J Infect Dis.1953.V.93 (3). P. 207-18. 53. Berthet, F.X., Zeller, H.G., Drouet, M.T., Rauzier, J., Digoutte, J.P., and Deubel, V.Extensive nucleotide changes and deletions within the envelope glycoprotein gene of Euro-African West Nile viruses. // J Gen Virol.1997.V.78 (9). P. 2293-7. 54. Besselaar, T.G. and Blackburn, N.K.Antigenic analysis of West Nile virus strains using monoclonal antibodies. // Arch Virol.1988.V.99 (1-2). P. 75-88. 55. Best, S.M., Morris, K.L., Shannon, J.G., Robertson, S.J., Mitzel, D.N., Park, G.S., Boer, E., Wolfinbarger, J.B., and Bloom, M.E.Inhibition of interferonstimulated JAK-STAT signaling by a tick-borne flavivirus and identification of NS5 as an interferon antagonist. // J Virol.2005.V.79 (20). P. 12828-39. 56. Bin, H., Grossman, Z., Pokamunski, S., Malkinson, M., Weiss, L., Duvdevani, P., Banet, C., Weisman, Y., Annis, E., Gandaku, D., Yahalom, V., Hindyieh, M., Shulman, L., and Mendelson, E.West Nile fever in Israel 1999-2000: from geese to humans. // Ann N Y Acad Sci.2001.V.951. P. 127-42. 57. Blackwell, J.L. and Brinton, M.A.BHK cell proteins that bind to the 3' stem- loop structure of the West Nile virus genome RNA. // J Virol.1995.V.69 (9). P. 56508. 58. Blackwell, J.L. and Brinton, M.A.Translation elongation factor-1 alpha interacts with the 3' stem-loop region of West Nile virus genomic RNA. // J Virol.1997.V.71 (9). P. 6433-44. 172 59. Bonafe, N., Rininger, J.A., Chubet, R.G., Foellmer, H.G., Fader, S., Anderson, J.F., Bushmich, S.L., Anthony, K., Ledizet, M., Fikrig, E., Koski, R.A., and Kaplan, P.A recombinant West Nile virus envelope protein vaccine candidate produced in Spodoptera frugiperda expresSF+ cells. // Vaccine.2009.V.27 (2). P. 213-22. 60. Bondre, V.P., Jadi, R.S., Mishra, A.C., Yergolkar, P.N., and Arankalle, V.A.West Nile virus isolates from India: evidence for a distinct genetic lineage. // J Gen Virol.2007.V.88 (3). P. 875-84. 61. Botha, E.M., Markotter, W., Wolfaardt, M., Paweska, J.T., Swanepoel, R., Palacios, G., Nel, L.H., and Venter, M.Genetic determinants of virulence in pathogenic lineage 2 West Nile virus strains. // Emerg Infect Dis.2008.V.14 (2). P. 222-30. 62. Brandler, S., Lucas-Hourani, M., Moris, A., Frenkiel, M.P., Combredet, C., Fevrier, M., Bedouelle, H., Schwartz, O., Despres, P., and Tangy, F.Pediatric measles vaccine expressing a dengue antigen induces durable serotype-specific neutralizing antibodies to dengue virus. // PLoS Negl Trop Dis.2007.V.1 (3). P. e96. 63. Brandler, S., Marianneau, P., Loth, P., Lacote, S., Combredet, C., Frenkiel, M.P., Despres, P., Contamin, H., and Tangy, F.Measles vaccine expressing the secreted form of West Nile virus envelope glycoprotein induces protective immunity in squirrel monkeys, a new model of West Nile virus infection. // J Infect Dis.2012.V.206 (2). P. 212-9. 64. Brandler, S., Ruffie, C., Combredet, C., Brault, J.B., Najburg, V., Prevost, M.C., Habel, A., Tauber, E., Despres, P., and Tangy, F.A recombinant measles vaccine expressing chikungunya virus-like particles is strongly immunogenic and protects mice from lethal challenge with chikungunya virus. // Vaccine.2013.V.31 (36). P. 3718-25. 65. Brandler, S., Ruffie, C., Najburg, V., Frenkiel, M.P., Bedouelle, H., Despres, P., and Tangy, F.Pediatric measles vaccine expressing a dengue tetravalent antigen 173 elicits neutralizing antibodies against all four dengue viruses. // Vaccine.2010.V.28 (41). P. 6730-9. 66. Brandler, S. and Tangy, F.Vaccines in development against West Nile virus. // Viruses.2013.V.5 (10). P. 2384-409. 67. Brault, A.C., Huang, C.Y., Langevin, S.A., Kinney, R.M., Bowen, R.A., Ramey, W.N., Panella, N.A., Holmes, E.C., Powers, A.M., and Miller, B.R.A single positively selected West Nile viral mutation confers increased virogenesis in American crows. // Nat Genet.2007.V.39 (9). P. 1162-6. 68. Brault, A.C., Langevin, S.A., Bowen, R.A., Panella, N.A., Biggerstaff, B.J., Miller, B.R., and Komar, N.Differential virulence of West Nile strains for American crows. // Emerg Infect Dis.2004.V.10 (12). P. 2161-8. 69. Briese, T., Jia, X.Y., Huang, C., Grady, L.J., and Lipkin, W.I.Identification of a Kunjin/West Nile-like flavivirus in brains of patients with New York encephalitis. // Lancet.1999.V.354 (9186). P. 1261-2. 70. Brinkworth, R.I., Fairlie, D.P., Leung, D., and Young, P.R.Homology model of the dengue 2 virus NS3 protease: putative interactions with both substrate and NS2B cofactor. // J Gen Virol.1999.V.80 (5). P. 1167-77. 71. Brinton, M.A.The molecular biology of West Nile Virus: a new invader of the western hemisphere. // Annu Rev Microbiol.2002.V.56. P. 371-402. 72. Brinton, M.A. and Dispoto, J.H.Sequence and secondary structure analysis of the 5'-terminal region of flavivirus genome RNA. // Virology.1988.V.162 (2). P. 290-9. 73. Brinton, M.A., Fernandez, A.V., and Dispoto, J.H.The 3'-nucleotides of flavivirus genomic RNA form a conserved secondary structure. // Virology.1986.V.153 (1). P. 113-21. 74. Brugger, K. and Rubel, F.Simulation of climate-change scenarios to explain Usutu-virus dynamics in Austria. // Prev Vet Med.2009.V.88 (1). P. 24-31. 174 75. Bryant, J.E., Holmes, E.C., and Barrett, A.D.Out of Africa: a molecular perspective on the introduction of yellow fever virus into the Americas. // PLoS Pathog.2007.V.3 (5). P. e75. 76. Burt, F.J., Grobbelaar, A.A., Leman, P.A., Anthony, F.S., Gibson, G.V., and Swanepoel, R.Phylogenetic relationships of southern African West Nile virus isolates. // Emerg Infect Dis.2002.V.8 (8). P. 820-6. 77. Campbell, G.L., Marfin, A.A., Lanciotti, R.S., and Gubler, D.J.West Nile virus. // Lancet Infect Dis.2002.V.2 (9). P. 519-29. 78. Campbell, M.S. and Pletnev, A.G.Infectious cDNA clones of Langat tick- borne flavivirus that differ from their parent in peripheral neurovirulence. // Virology.2000.V.269 (1). P. 225-37. 79. Chaintoutis, S.C., Chaskopoulou, A., Chassalevris, T., Koehler, P.G., Papanastassopoulou, M., and Dovas, C.I.West Nile virus lineage 2 strain in Greece, 2012. // Emerg Infect Dis.2013.V.19 (5). P. 827-9. 80. Chaintoutis, S.C., Dovas, C.I., Papanastassopoulou, M., Gewehr, S., Danis, K., Beck, C., Lecollinet, S., Antalis, V., Kalaitzopoulou, S., Panagiotopoulos, T., Mourelatos, S., Zientara, S., and Papadopoulos, O.Evaluation of a West Nile virus surveillance and early warning system in Greece, based on domestic pigeons. // Comp Immunol Microbiol Infect Dis.2014.V.37 (2). P. 131-41. 81. Chambers, T.J., Hahn, C.S., Galler, R., and Rice, C.M.Flavivirus genome organization, expression, and replication. // Annu Rev Microbiol.1990.V.44. P. 64988. 82. Chambers, T.J., Halevy, M., Nestorowicz, A., Rice, C.M., and Lustig, S.West Nile virus envelope proteins: nucleotide sequence analysis of strains differing in mouse neuroinvasiveness. // J Gen Virol.1998.V.79 (10). P. 2375-80. 83. Chang, D.C., Liu, W.J., Anraku, I., Clark, D.C., Pollitt, C.C., Suhrbier, A., Hall, R.A., and Khromykh, A.A.Single-round infectious particles enhance 175 immunogenicity of a DNA vaccine against West Nile virus. // Nat Biotechnol.2008.V.26 (5). P. 571-7. 84. Chomczynski, P. and Sacchi, N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Anal Biochem.1987.V.162 (1). P. 156-9. 85. Chowdhury, P., Khan, S.A., Dutta, P., Topno, R., and Mahanta, J.Characterization of West Nile virus (WNV) isolates from Assam, India: insights into the circulating WNV in northeastern India. // Comp Immunol Microbiol Infect Dis.2014.V.37 (1). P. 39-47. 86. Chowers, M.Y., Lang, R., Nassar, F., Ben-David, D., Giladi, M., Rubinshtein, E., Itzhaki, A., Mishal, J., Siegman-Igra, Y., Kitzes, R., Pick, N., Landau, Z., Wolf, D., Bin, H., Mendelson, E., Pitlik, S.D., and Weinberger, M.Clinical characteristics of the West Nile fever outbreak, Israel, 2000. // Emerg Infect Dis.2001.V.7 (4). P. 675-8. 87. Chu, J.H., Chiang, C.C., and Ng, M.L.Immunization of flavivirus West Nile recombinant envelope domain III protein induced specific immune response and protection against West Nile virus infection. // J Immunol.2007.V.178 (5). P. 2699705. 88. Chua, A.J., Vituret, C., Tan, M.L., Gonzalez, G., Boulanger, P., Ng, M.L., and Hong, S.S.A novel platform for virus-like particle-display of flaviviral envelope domain III: induction of Dengue and West Nile virus neutralizing antibodies. // Virol J.2013.V.10. P. 129. 89. Chung, K.M., Liszewski, M.K., Nybakken, G., Davis, A.E., Townsend, R.R., Fremont, D.H., Atkinson, J.P., and Diamond, M.S.West Nile virus nonstructural protein NS1 inhibits complement activation by binding the regulatory protein factor H. // Proc Natl Acad Sci U S A.2006.V.103 (50). P. 19111-6. 176 90. Ciccozzi, M., Peletto, S., Cella, E., Giovanetti, M., Lai, A., Gabanelli, E., Acutis, P.L., Modesto, P., Rezza, G., Platonov, A.E., Lo Presti, A., and Zehender, G.Epidemiological history and phylogeography of West Nile virus lineage 2. // Infect Genet Evol.2013.V.17. P. 46-50. 91. Cnops, L., Papa, A., Lagra, F., Weyers, P., Meersman, K., Patsouros, N., and Van Esbroeck, M.West Nile virus infection in Belgian traveler returning from Greece. // Emerg Infect Dis.2013.V.19 (4). P. 684-5. 92. Cohen, D., Zaide, Y., Karasenty, E., Schwarz, M., LeDuc, J.W., Slepon, R., Ksiazek, T.G., Shemer, J., and Green, M.S.Prevalence of antibodies to West Nile fever, sandfly fever Sicilian, and sandfly fever Naples viruses in healthy adults in Israel. // Public Health Rev.1999.V.27 (1-3). P. 217-30. 93. Coia, G., Parker, M.D., Speight, G., Byrne, M.E., and Westaway, E.G.Nucleotide and complete amino acid sequences of Kunjin virus: definitive gene order and characteristics of the virus-specified proteins. // J Gen Virol.1988.V.69 (1). P. 1-21. 94. Combredet, C., Labrousse, V., Mollet, L., Lorin, C., Delebecque, F., Hurtrel, B., McClure, H., Feinberg, M.B., Brahic, M., and Tangy, F.A molecularly cloned Schwarz strain of measles virus vaccine induces strong immune responses in macaques and transgenic mice. // J Virol.2003.V.77 (21). P. 11546-54. 95. Coutant, F., Frenkiel, M.P., Despres, P., and Charneau, P.Protective antiviral immunity conferred by a nonintegrative lentiviral vector-based vaccine. // PLoS One.2008.V.3 (12). P. e3973. 96. Crabtree, M.B., Kinney, R.M., and Miller, B.R.Deglycosylation of the NS1 protein of dengue 2 virus, strain 16681: construction and characterization of mutant viruses. // Arch Virol.2005.V.150 (4). P. 771-86. 177 97. D, V.D.B., Cnops, L., Meersman, K., Domingo, C., A, V.A.N.G., and M, V.A.N.E.Chikungunya virus and West Nile virus infections imported into Belgium, 2007-2012. // Epidemiol Infect.2014.V.14 P. 1-10. 98. Danis, K., Papa, A., Theocharopoulos, G., Dougas, G., Athanasiou, M., Detsis, M., Baka, A., Lytras, T., Mellou, K., Bonovas, S., and Panagiotopoulos, T.Outbreak of West Nile virus infection in Greece, 2010. // Emerg Infect Dis.2011.V.17 (10). P. 1868-72. 99. Darwish, M.A. and Ibrahim, A.H.Prevalence of antibodies to arboviruses in Egypt. Results of a serologic survey among 1,113 university students. // Am J Trop Med Hyg.1975.V.24 (1). P. 981-5. 100. Dauphin, G., Zientara, S., Zeller, H., and Murgue, B.West Nile: worldwide current situation in animals and humans. // Comp Immunol Microbiol Infect Dis.2004.V.27 (5). P. 343-55. 101. Davis, B.S., Chang, G.J., Cropp, B., Roehrig, J.T., Martin, D.A., Mitchell, C.J., Bowen, R., and Bunning, M.L.West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays. // J Virol.2001.V.75 (9). P. 4040-7. 102. Davis, C.T., Beasley, D.W., Guzman, H., Siirin, M., Parsons, R.E., Tesh, R.B., and Barrett, A.D.Emergence of attenuated West Nile virus variants in Texas, 2003. // Virology.2004.V.330 (1). P. 342-50. 103. Davis, C.T., Ebel, G.D., Lanciotti, R.S., Brault, A.C., Guzman, H., Siirin, M., Lambert, A., Parsons, R.E., Beasley, D.W., Novak, R.J., Elizondo-Quiroga, D., Green, E.N., Young, D.S., Stark, L.M., Drebot, M.A., Artsob, H., Tesh, R.B., Kramer, L.D., and Barrett, A.D.Phylogenetic analysis of North American West Nile virus isolates, 2001-2004: evidence for the emergence of a dominant genotype. // Virology.2005.V.342 (2). P. 252-65. 178 104. Davis, C.W., Nguyen, H.Y., Hanna, S.L., Sanchez, M.D., Doms, R.W., and Pierson, T.C.West Nile virus discriminates between DC-SIGN and DC-SIGNR for cellular attachment and infection. // J Virol.2006.V.80 (3). P. 1290-301. 105. Davis, W.G., Blackwell, J.L., Shi, P.Y., and Brinton, M.A.Interaction between the cellular protein eEF1A and the 3'-terminal stem-loop of West Nile virus genomic RNA facilitates viral minus-strand RNA synthesis. // J Virol.2007.V.81 (18). P. 10172-87. 106. Dayan, G.H., Bevilacqua, J., Coleman, D., Buldo, A., and Risi, G.Phase II, dose ranging study of the safety and immunogenicity of single dose West Nile vaccine in healthy adults >/= 50 years of age. // Vaccine.2012.V.30 (47). P. 665664. 107. de Alwis, R., Smith, S.A., Olivarez, N.P., Messer, W.B., Huynh, J.P., Wahala, W.M., White, L.J., Diamond, M.S., Baric, R.S., Crowe, J.E., Jr., and de Silva, A.M.Identification of human neutralizing antibodies that bind to complex epitopes on dengue virions. // Proc Natl Acad Sci U S A.2012.V.109 (19). P. 7439-44. 108. De Filette, M., Ulbert, S., Diamond, M., and Sanders, N.N.Recent progress in West Nile virus diagnosis and vaccination. // Vet Res.2012.V.43. P. 16. 109. Despres, P., Combredet, C., Frenkiel, M.P., Lorin, C., Brahic, M., and Tangy, F.Live measles vaccine expressing the secreted form of the West Nile virus envelope glycoprotein protects against West Nile virus encephalitis. // J Infect Dis.2005.V.191 (2). P. 207-14. 110. Di Sabatino, D., Bruno, R., Sauro, F., Danzetta, M.L., Cito, F., Iannetti, S., Narcisi, V., De Massis, F., and Calistri, P.Epidemiology of West Nile disease in Europe and in the Mediterranean Basin from 2009 to 2013. // Biomed Res Int.2014.V.2014. P. 907852. 179 111. Diamond, M.S., Pierson, T.C., and Fremont, D.H.The structural immunology of antibody protection against West Nile virus. // Immunol Rev.2008.V.225. P. 21225. 112. Draganescu, N., Iftimovici, R., Mutiu, A., Girjabu, E., Iacobescu, V., Lapusneanu, C., Ignatescu, B., and Manolescu, G.Detection of antibodies to alphaviruses and flaviviruses in some migratory birds of the Danube Delta. // Virologie.1978.V.29 (2). P. 113-6. 113. Eidson, M., Komar, N., Sorhage, F., Nelson, R., Talbot, T., Mostashari, F., McLean, R., and West Nile Virus Avian Mortality Surveillance, G.Crow deaths as a sentinel surveillance system for West Nile virus in the northeastern United States, 1999. // Emerg Infect Dis.2001.V.7 (4). P. 615-20. 114. Eidson, M., Kramer, L., Stone, W., Hagiwara, Y., Schmit, K., and New York State West Nile Virus Avian Surveillance, T.Dead bird surveillance as an early warning system for West Nile virus. // Emerg Infect Dis.2001.V.7 (4). P. 631-5. 115. El Garch, H., Minke, J.M., Rehder, J., Richard, S., Edlund Toulemonde, C., Dinic, S., Andreoni, C., Audonnet, J.C., Nordgren, R., and Juillard, V.A West Nile virus (WNV) recombinant canarypox virus vaccine elicits WNV-specific neutralizing antibodies and cell-mediated immune responses in the horse. // Vet Immunol Immunopathol.2008.V.123 (3-4). P. 230-9. 116. Estrada-Franco, J.G., Navarro-Lopez, R., Beasley, D.W., Coffey, L., Carrara, A.S., Travassos da Rosa, A., Clements, T., Wang, E., Ludwig, G.V., Cortes, A.C., Ramirez, P.P., Tesh, R.B., Barrett, A.D., and Weaver, S.C.West Nile virus in Mexico: evidence of widespread circulation since July 2002. // Emerg Infect Dis.2003.V.9 (12). P. 1604-7. 117. Fabbri, C.M., Garcia, J.B., Morales, M.A., Enria, D.A., Levis, S., and Lanciotti, R.S.Complete genome sequences and phylogenetic analysis of two West Nile virus strains isolated from equines in Argentina in 2006 could indicate an early 180 introduction of the virus in the Southern Cone. // Vector Borne Zoonotic Dis.2014.V.14 (11). P. 794-800. 118. Faggioni, G., De Santis, R., Pomponi, A., Fantini, M., Savini, G., Monaco, F., Polci, A., Bei, R., and Lista, F.Rapid molecular detection and genotyping of West Nile Virus lineages 1 and 2 by real time PCR and melting curve analysis. // J Virol Methods.2014.V.207. P. 54-9. 119. Filipe, A.R.Isolation in Portugal of West Nile virus from Anopheles maculipennis mosquitoes. // Acta Virol.1972.V.16 (4). P. 361. 120. Filipe, A.R. and de Andrade, H.R.Arboviruses in the Iberian Peninsula. // Acta Virol.1990.V.34 (6). P. 582-91. 121. Filipe, A.R. and Pinto, M.R.Survey for antibodies to arboviruses in serum of animals from southern Portugal. // Am J Trop Med Hyg.1969.V.18 (3). P. 423-6. 122. Frost, M.J., Zhang, J., Edmonds, J.H., Prow, N.A., Gu, X., Davis, R., Hornitzky, C., Arzey, K.E., Finlaison, D., Hick, P., Read, A., Hobson-Peters, J., May, F.J., Doggett, S.L., Haniotis, J., Russell, R.C., Hall, R.A., Khromykh, A.A., and Kirkland, P.D.Characterization of virulent West Nile virus Kunjin strain, Australia, 2011. // Emerg Infect Dis.2012.V.18 (5). P. 792-800. 123. Fyodorova, M.V., Savage, H.M., Lopatina, J.V., Bulgakova, T.A., Ivanitsky, A.V., Platonova, O.V., and Platonov, A.E.Evaluation of potential West Nile virus vectors in Volgograd region, Russia, 2003 (Diptera: Culicidae): species composition, bloodmeal host utilization, and virus infection rates of mosquitoes. // J Med Entomol.2006.V.43 (3). P. 552-63. 124. Gabriel, M., Emmerich, P., Frank, C., Fiedler, M., Rashidi-Alavijeh, J., Jochum, C., Gunther, S., Auerhammer, K., Rupprecht, H.J., Blank, R.T., Sacher, N., Pertzborn, L., Stark, K., Schrauzer, T., and Schmidt-Chanasit, J.Increase in West Nile virus infections imported to Germany in 2012. // J Clin Virol.2013.V.58 (3). P. 587-9. 181 125. Gaunt, M.W., Sall, A.A., de Lamballerie, X., Falconar, A.K., Dzhivanian, T.I., and Gould, E.A.Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their epidemiology, disease association and biogeography. // J Gen Virol.2001.V.82 (8). P. 1867-76. 126. Gershoni-Yahalom, O., Landes, S., Kleiman-Shoval, S., Ben-Nathan, D., Kam, M., Lachmi, B.E., Khinich, Y., Simanov, M., Samina, I., Eitan, A., Cohen, I.R., Rager-Zisman, B., and Porgador, A.Chimeric vaccine composed of viral peptide and mammalian heat-shock protein 60 peptide protects against West Nile virus challenge. // Immunology.2010.V.130 (4). P. 527-35. 127. Goddard, L.B., Roth, A.E., Reisen, W.K., and Scott, T.W.Vector competence of California mosquitoes for West Nile virus. // Emerg Infect Dis.2002.V.8 (12). P. 1385-91. 128. Goldblum, N., Jasinska-Klingberg, W., Klingberg, M.A., Marberg, K., and Sterk, V.V.The natural history of West Nile Fever. I. Clinical observations during an epidemic in Israel. // Am J Hyg.1956.V.64 (3). P. 259-69. 129. Gonzalez, M.T. and Filipe, A.R.Antibodies to arboviruses in northwestern Spain. // Am J Trop Med Hyg.1977.V.26 (4). P. 792-7. 130. Gray, T.J., Burrow, J.N., Markey, P.G., Whelan, P.I., Jackson, J., Smith, D.W., and Currie, B.J.West nile virus (Kunjin subtype) disease in the northern territory of Australia--a case of encephalitis and review of all reported cases. // Am J Trop Med Hyg.2011.V.85 (5). P. 952-6. 131. Grinev, A., Daniel, S., Stramer, S., Rossmann, S., Caglioti, S., and Rios, M.Genetic variability of West Nile virus in US blood donors, 2002-2005. // Emerg Infect Dis.2008.V.14 (3). P. 436-44. 132. Gubler, D.J.The continuing spread of West Nile virus in the western hemisphere. // Clin Infect Dis.2007.V.45 (8). P. 1039-46. 182 133. Guo, J.T., Hayashi, J., and Seeger, C.West Nile virus inhibits the signal transduction pathway of alpha interferon. // J Virol.2005.V.79 (3). P. 1343-50. 134. Guy, B., Guirakhoo, F., Barban, V., Higgs, S., Monath, T.P., and Lang, J.Preclinical and clinical development of YFV 17D-based chimeric vaccines against dengue, West Nile and Japanese encephalitis viruses. // Vaccine.2010.V.28 (3). P. 632-49. 135. Halevy, M., Akov, Y., Ben-Nathan, D., Kobiler, D., Lachmi, B., and Lustig, S.Loss of active neuroinvasiveness in attenuated strains of West Nile virus: pathogenicity in immunocompetent and SCID mice. // Arch Virol.1994.V.137 (34). P. 355-70. 136. Hall, R.A., Nisbet, D.J., Pham, K.B., Pyke, A.T., Smith, G.A., and Khromykh, A.A.DNA vaccine coding for the full-length infectious Kunjin virus RNA protects mice against the New York strain of West Nile virus. // Proc Natl Acad Sci U S A.2003.V.100 (18). P. 10460-4. 137. Hall, R.A., Scherret, J.H., and Mackenzie, J.S.Kunjin virus: an Australian variant of West Nile? // Ann N Y Acad Sci.2001.V.951. P. 153-60. 138. Hammam, H.M. and Price, W.H.Further observations on geographic variation in the antigenic character of West Nile and Japanese B viruses. // Am J Epidemiol.1966.V.83 (1). P. 113-22. 139. Hanna, S.L., Pierson, T.C., Sanchez, M.D., Ahmed, A.A., Murtadha, M.M., and Doms, R.W.N-linked glycosylation of west nile virus envelope proteins influences particle assembly and infectivity. // J Virol.2005.V.79 (21). P. 13262-74. 140. Hannoun, C., Panthier, R., Mouchet, J., and Eouzan, J.P.[Isolation in France of the West Nile Virus from Patients and from the Vector Culex Modestus Ficalbi]. // C R Hebd Seances Acad Sci.1964.V.259. P. 4170-2. 183 141. Hayes, E.B., Komar, N., Nasci, R.S., Montgomery, S.P., O'Leary, D.R., and Campbell, G.L.Epidemiology and transmission dynamics of West Nile virus disease. // Emerg Infect Dis.2005.V.11 (8). P. 1167-73. 142. Heinz, F.X. and Stiasny, K.Flaviviruses and flavivirus vaccines. // Vaccine.2012.V.30. (29) P. 4301-6. 143. Hernandez-Triana, L.M., Jeffries, C.L., Mansfield, K.L., Carnell, G., Fooks, A.R., and Johnson, N.Emergence of west nile virus lineage 2 in europe: a review on the introduction and spread of a mosquito-borne disease. // Front Public Health.2014.V.2. P. 271. 144. Ho, L.J., Hung, L.F., Weng, C.Y., Wu, W.L., Chou, P., Lin, Y.L., Chang, D.M., Tai, T.Y., and Lai, J.H.Dengue virus type 2 antagonizes IFN-alpha but not IFN-gamma antiviral effect via down-regulating Tyk2-STAT signaling in the human dendritic cell. // J Immunol.2005.V.174 (12). P. 8163-72. 145. Huang, C.Y., Silengo, S.J., Whiteman, M.C., and Kinney, R.M.Chimeric dengue 2 PDK-53/West Nile NY99 viruses retain the phenotypic attenuation markers of the candidate PDK-53 vaccine virus and protect mice against lethal challenge with West Nile virus. // J Virol.2005.V.79 (12). P. 7300-10. 146. Hubalek, Z. and Halouzka, J.West Nile fever--a reemerging mosquito-borne viral disease in Europe. // Emerg Infect Dis.1999.V.5 (5). P. 643-50. 147. Hurlbut, H.S., Rizk, F., Taylor, R.M., and Work, T.H.A study of the ecology of West Nile virus in Egypt. // Am J Trop Med Hyg.1956.V.5 (4). P. 579-620. 148. Hurrelbrink, R.J., Nestorowicz, A., and McMinn, P.C.Characterization of infectious Murray Valley encephalitis virus derived from a stably cloned genomelength cDNA. // J Gen Virol.1999.V.80 (12). P. 3115-25. 149. Iglesias, M.C., Frenkiel, M.P., Mollier, K., Souque, P., Despres, P., and Charneau, P.A single immunization with a minute dose of a lentiviral vector-based 184 vaccine is highly effective at eliciting protective humoral immunity against West Nile virus. // J Gene Med.2006.V.8 (3). P. 265-74. 150. Ishikawa, T., Widman, D.G., Bourne, N., Konishi, E., and Mason, P.W.Construction and evaluation of a chimeric pseudoinfectious virus vaccine to prevent Japanese encephalitis. // Vaccine.2008.V.26 (22). P. 2772-81. 151. Iyer, A.V. and Kousoulas, K.G.A review of vaccine approaches for West Nile virus. // Int J Environ Res Public Health.2013.V.10 (9). P. 4200-23. 152. Iyer, A.V., Pahar, B., Boudreaux, M.J., Wakamatsu, N., Roy, A.F., Chouljenko, V.N., Baghian, A., Apetrei, C., Marx, P.A., and Kousoulas, K.G.Recombinant vesicular stomatitis virus-based west Nile vaccine elicits strong humoral and cellular immune responses and protects mice against lethal challenge with the virulent west Nile virus strain LSU-AR01. // Vaccine.2009.V.27 (6). P. 893903. 153. Jamgaonkar, A.V., Yergolkar, P.N., Geevarghese, G., Joshi, G.D., Joshi, M.V., and Mishra, A.C.Serological evidence for Japanese encephalitis virus and West Nile virus infections in water frequenting and terrestrial wild birds in Kolar District, Karnataka State, India. A retrospective study. // Acta Virol.2003.V.47 (3). P. 185-8. 154. Jarvi, S.I., Hu, D., Misajon, K., Coller, B.A., Wong, T., and Lieberman, M.M.Vaccination of captive nene (Branta sandvicensis) against West Nile virus using a protein-based vaccine (WN-80E). // J Wildl Dis.2013.V.49 (1). P. 152-6. 155. Jia, X.Y., Briese, T., Jordan, I., Rambaut, A., Chi, H.C., Mackenzie, J.S., Hall, R.A., Scherret, J., and Lipkin, W.I.Genetic analysis of West Nile New York 1999 encephalitis virus. // Lancet.1999.V.354 (9194). P. 1971-2. 156. Jupp, P.G. and McIntosh, B.M.Quantitative experiments on the vector capability of Culex (Culex) pipiens fatigans Wiedemann with West Nile and Sindbis viruses. // J Med Entomol.1970.V.7 (3). P. 353-6. 185 157. Jupp, P.G. and McIntosh, B.M.Quantitative experiments on the vector capability of Culex (Culex) univittatus Theobald with West Nile and Sindbis viruses. // J Med Entomol.1970.V.7 (3). P. 371-3. 158. Juricova, Z., Pinowski, J., Literak, I., Hahm, K.H., and Romanowski, J.Antibodies to alphavirus, flavivirus, and bunyavirus arboviruses in house sparrows (Passer domesticus) and tree sparrows (P. montanus) in Poland. // Avian Dis.1998.V.42 (1). P. 182-5. 159. Kanai, R., Kar, K., Anthony, K., Gould, L.H., Ledizet, M., Fikrig, E., Marasco, W.A., Koski, R.A., and Modis, Y.Crystal structure of west nile virus envelope glycoprotein reveals viral surface epitopes. // J Virol.2006.V.80 (22). P. 11000-8. 160. Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P.M., and Padmanabhan, R.Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain). // Gene.1995.V.162 (2). P. 175-80. 161. Karaca, K., Bowen, R., Austgen, L.E., Teehee, M., Siger, L., Grosenbaugh, D., Loosemore, L., Audonnet, J.C., Nordgren, R., and Minke, J.M.Recombinant canarypox vectored West Nile virus (WNV) vaccine protects dogs and cats against a mosquito WNV challenge. // Vaccine.2005.V.23 (29). P. 3808-13. 162. Kariwa, H., Murata, R., Totani, M., Yoshii, K., and Takashima, I.Increased pathogenicity of West Nile virus (WNV) by glycosylation of envelope protein and seroprevalence of WNV in wild birds in Far Eastern Russia. // Int J Environ Res Public Health.2013.V.10 (12). P. 7144-64. 163. Katz, G., Rannon, L., Nili, E., and Danon, Y.L.West Nile fever--occurrence in a new endemic site in the Negev. // Isr J Med Sci.1989.V.25 (1). P. 39-41. 164. Kaufman, D.S., Schneider, D.P., McKay, N.P., Ammann, C.M., Bradley, R.S., Briffa, K.R., Miller, G.H., Otto-Bliesner, B.L., Overpeck, J.T., Vinther, B.M., 186 and Arctic Lakes 2k Project, M.Recent warming reverses long-term arctic cooling. // Science.2009.V.325 (5945). P. 1236-9. 165. Kaufmann, B., Vogt, M.R., Goudsmit, J., Holdaway, H.A., Aksyuk, A.A., Chipman, P.R., Kuhn, R.J., Diamond, M.S., and Rossmann, M.G.Neutralization of West Nile virus by cross-linking of its surface proteins with Fab fragments of the human monoclonal antibody CR4354. // Proc Natl Acad Sci U S A.2010.V.107 (44). P. 18950-5. 166. Khromykh, A.A., Sedlak, P.L., Guyatt, K.J., Hall, R.A., and Westaway, E.G.Efficient trans-complementation of the flavivirus kunjin NS5 protein but not of the NS1 protein requires its coexpression with other components of the viral replicase. // J Virol.1999.V.73 (12). P. 10272-80. 167. Khromykh, A.A. and Westaway, E.G.Completion of Kunjin virus RNA sequence and recovery of an infectious RNA transcribed from stably cloned fulllength cDNA. // J Virol.1994.V.68 (7). P. 4580-8. 168. Khromykh, A.A. and Westaway, E.G.Subgenomic replicons of the flavivirus Kunjin: construction and applications. // J Virol.1997.V.71 (2). P. 1497-505. 169. Kinney, R.M., Huang, C.Y., Whiteman, M.C., Bowen, R.A., Langevin, S.A., Miller, B.R., and Brault, A.C.Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus. // J Gen Virol.2006.V.87 (12). P. 361122. 170. Kolodziejek, J., Marinov, M., Kiss, B.J., Alexe, V., and Nowotny, N.The complete sequence of a West Nile virus lineage 2 strain detected in a Hyalomma marginatum marginatum tick collected from a song thrush (Turdus philomelos) in eastern Romania in 2013 revealed closest genetic relationship to strain Volgograd 2007. // PLoS One.2014.V.9 (10). P. e109905. 171. Komar, N., Langevin, S., Hinten, S., Nemeth, N., Edwards, E., Hettler, D., Davis, B., Bowen, R., and Bunning, M.Experimental infection of North American 187 birds with the New York 1999 strain of West Nile virus. // Emerg Infect Dis.2003.V.9 (3). P. 311-22. 172. Kramer, L.D., Styer, L.M., and Ebel, G.D.A global perspective on the epidemiology of West Nile virus. // Annu Rev Entomol.2008.V.53. P. 61-81. 173. Kumar, J.S., Saxena, D., and Parida, M.Development and comparative evaluation of SYBR Green I-based one-step real-time RT-PCR assay for detection and quantification of West Nile virus in human patients. // Mol Cell Probes.2014.V.28 (5-6). P. 221-7. 174. Kumar, M., O'Connell, M., Namekar, M., and Nerurkar, V.R.Infection with non-lethal West Nile virus Eg101 strain induces immunity that protects mice against the lethal West Nile virus NY99 strain. // Viruses.2014.V.6 (6). P. 2328-39. 175. Kuno, G., Chang, G.J., Tsuchiya, K.R., Karabatsos, N., and Cropp, C.B.Phylogeny of the genus Flavivirus. // J Virol.1998.V.72 (1). P. 73-83. 176. Kurolt, I.C., Krajinovic, V., Topic, A., Kuzman, I., Barsic, B., and Markotic, A.First molecular analysis of West Nile virus during the 2013 outbreak in Croatia. // Virus Res.2014.V.189. P. 63-6. 177. Lai, C.J., Zhao, B.T., Hori, H., and Bray, M.Infectious RNA transcribed from stably cloned full-length cDNA of dengue type 4 virus. // Proc Natl Acad Sci U S A.1991.V.88 (12). P. 5139-43. 178. Lanciotti, R.S. and Kerst, A.J.Nucleic acid sequence-based amplification assays for rapid detection of West Nile and St. Louis encephalitis viruses. // J Clin Microbiol.2001.V.39 (12). P. 4506-13. 179. Lanciotti, R.S., Kerst, A.J., Nasci, R.S., Godsey, M.S., Mitchell, C.J., Savage, H.M., Komar, N., Panella, N.A., Allen, B.C., Volpe, K.E., Davis, B.S., and Roehrig, J.T.Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. // J Clin Microbiol.2000.V.38 (11). P. 4066-71. 188 180. Lanciotti, R.S., Roehrig, J.T., Deubel, V., Smith, J., Parker, M., Steele, K., Crise, B., Volpe, K.E., Crabtree, M.B., Scherret, J.H., Hall, R.A., MacKenzie, J.S., Cropp, C.B., Panigrahy, B., Ostlund, E., Schmitt, B., Malkinson, M., Banet, C., Weissman, J., Komar, N., Savage, H.M., Stone, W., McNamara, T., and Gubler, D.J.Origin of the West Nile virus responsible for an outbreak of encephalitis in the northeastern United States. // Science.1999.V.286 (5448). P. 2333-7. 181. Ledgerwood, J.E., Pierson, T.C., Hubka, S.A., Desai, N., Rucker, S., Gordon, I.J., Enama, M.E., Nelson, S., Nason, M., Gu, W., Bundrant, N., Koup, R.A., Bailer, R.T., Mascola, J.R., Nabel, G.J., Graham, B.S., and Team, V.R.C.S.A West Nile virus DNA vaccine utilizing a modified promoter induces neutralizing antibody in younger and older healthy adults in a phase I clinical trial. // J Infect Dis.2011.V.203 (10). P. 1396-404. 182. Ledizet, M., Kar, K., Foellmer, H.G., Wang, T., Bushmich, S.L., Anderson, J.F., Fikrig, E., and Koski, R.A.A recombinant envelope protein vaccine against West Nile virus. // Vaccine.2005.V.23 (30). P. 3915-24. 183. Lee, E., Hall, R.A., and Lobigs, M.Common E protein determinants for attenuation of glycosaminoglycan-binding variants of Japanese encephalitis and West Nile viruses. // J Virol.2004.V.78 (15). P. 8271-80. 184. Lee, J.W., Chu, J.J., and Ng, M.L.Quantifying the specific binding between West Nile virus envelope domain III protein and the cellular receptor alphaVbeta3 integrin. // J Biol Chem.2006.V.281 (3). P. 1352-60. 185. Leung, D., Schroder, K., White, H., Fang, N.X., Stoermer, M.J., Abbenante, G., Martin, J.L., Young, P.R., and Fairlie, D.P.Activity of recombinant dengue 2 virus NS3 protease in the presence of a truncated NS2B co-factor, small peptide substrates, and inhibitors. // J Biol Chem.2001.V.276 (49). P. 45762-71. 186. Li, X.F., Zhao, W., Lin, F., Ye, Q., Wang, H.J., Yang, D., Li, S.H., Zhao, H., Xu, Y.P., Ma, J., Deng, Y.Q., Zhang, Y., Qin, E.D., and Qin, C.F.Development of 189 chimaeric West Nile virus attenuated vaccine candidate based on the Japanese encephalitis vaccine strain SA14-14-2. // J Gen Virol.2013.V.94 (12). P. 2700-9. 187. Licciardi, J.M., Schaefer, J.M., Taggart, J.R., and Lund, D.C.Holocene glacier fluctuations in the Peruvian Andes indicate northern climate linkages. // Science.2009.V.325 (5948). P. 1677-9. 188. Lieberman, M.M., Clements, D.E., Ogata, S., Wang, G., Corpuz, G., Wong, T., Martyak, T., Gilson, L., Coller, B.A., Leung, J., Watts, D.M., Tesh, R.B., Siirin, M., Travassos da Rosa, A., Humphreys, T., and Weeks-Levy, C.Preparation and immunogenic properties of a recombinant West Nile subunit vaccine. // Vaccine.2007.V.25 (3). P. 414-23. 189. Lieberman, M.M., Nerurkar, V.R., Luo, H., Cropp, B., Carrion, R., Jr., de la Garza, M., Coller, B.A., Clements, D., Ogata, S., Wong, T., Martyak, T., and WeeksLevy, C.Immunogenicity and protective efficacy of a recombinant subunit West Nile virus vaccine in rhesus monkeys. // Clin Vaccine Immunol.2009.V.16 (9). P. 13327. 190. Lim, C.K., Takasaki, T., Kotaki, A., and Kurane, I.Vero cell-derived inactivated West Nile (WN) vaccine induces protective immunity against lethal WN virus infection in mice and shows a facilitated neutralizing antibody response in mice previously immunized with Japanese encephalitis vaccine. // Virology.2008.V.374 (1). P. 60-70. 191. Lin, C.W., Liu, K.T., Huang, H.D., and Chen, W.J.Protective immunity of E. coli-synthesized NS1 protein of Japanese encephalitis virus. // Biotechnol Lett.2008.V.30 (2). P. 205-14. 192. Lin, R.J., Chang, B.L., Yu, H.P., Liao, C.L., and Lin, Y.L.Blocking of interferon-induced Jak-Stat signaling by Japanese encephalitis virus NS5 through a protein tyrosine phosphatase-mediated mechanism. // J Virol.2006.V.80 (12). P. 5908-18. 190 193. Lin, Y.L., Chen, L.K., Liao, C.L., Yeh, C.T., Ma, S.H., Chen, J.L., Huang, Y.L., Chen, S.S., and Chiang, H.Y.DNA immunization with Japanese encephalitis virus nonstructural protein NS1 elicits protective immunity in mice. // J Virol.1998.V.72 (1). P. 191-200. 194. Lindenbach, B.D. and Rice, C.M.Genetic interaction of flavivirus nonstructural proteins NS1 and NS4A as a determinant of replicase function. // J Virol.1999.V.73 (6). P. 4611-21. 195. Liu, W.J., Wang, X.J., Clark, D.C., Lobigs, M., Hall, R.A., and Khromykh, A.A.A single amino acid substitution in the West Nile virus nonstructural protein NS2A disables its ability to inhibit alpha/beta interferon induction and attenuates virus virulence in mice. // J Virol.2006.V.80 (5). P. 2396-404. 196. Lo, M.K., Tilgner, M., Bernard, K.A., and Shi, P.Y.Functional analysis of mosquito-borne flavivirus conserved sequence elements within 3' untranslated region of West Nile virus by use of a reporting replicon that differentiates between viral translation and RNA replication. // J Virol.2003.V.77 (18). P. 10004-14. 197. Lok, S.M., Kostyuchenko, V., Nybakken, G.E., Holdaway, H.A., Battisti, A.J., Sukupolvi-Petty, S., Sedlak, D., Fremont, D.H., Chipman, P.R., Roehrig, J.T., Diamond, M.S., Kuhn, R.J., and Rossmann, M.G.Binding of a neutralizing antibody to dengue virus alters the arrangement of surface glycoproteins. // Nat Struct Mol Biol.2008.V.15 (3). P. 312-7. 198. Lorin, C., Mollet, L., Delebecque, F., Combredet, C., Hurtrel, B., Charneau, P., Brahic, M., and Tangy, F.A single injection of recombinant measles virus vaccines expressing human immunodeficiency virus (HIV) type 1 clade B envelope glycoproteins induces neutralizing antibodies and cellular immune responses to HIV. // J Virol.2004.V.78 (1). P. 146-57. 199. Lorin, C., Segal, L., Mols, J., Morelle, D., Bourguignon, P., Rovira, O., Mettens, P., Silvano, J., Dumey, N., Le Goff, F., Koutsoukos, M., Voss, G., and Tangy, F.Toxicology, biodistribution and shedding profile of a recombinant measles 191 vaccine vector expressing HIV-1 antigens, in cynomolgus macaques. // Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.2012.V.385 (12). P. 1211-25. 200. Lu, Z., Fu, S.H., Cao, L., Tang, C.J., Zhang, S., Li, Z.X., Tusong, M., Yao, X.H., Zhang, H.L., Wang, P.Y., Wumaier, M., Yuan, X.Y., Li, M.H., Zhu, C.Z., Fu, L.P., and Liang, G.D.Human infection with West Nile Virus, Xinjiang, China, 2011. // Emerg Infect Dis.2014.V.20 (8). P. 1421-3. 201. Lvov, D.K., Butenko, A.M., Gromashevsky, V.L., Kovtunov, A.I., Prilipov, A.G., Kinney, R., Aristova, V.A., Dzharkenov, A.F., Samokhvalov, E.I., Savage, H.M., Shchelkanov, M.Y., Galkina, I.V., Deryabin, P.G., Gubler, D.J., Kulikova, L.N., Alkhovsky, S.K., Moskvina, T.M., Zlobina, L.V., Sadykova, G.K., Shatalov, A.G., Lvov, D.N., Usachev, V.E., and Voronina, A.G.West Nile virus and other zoonotic viruses in Russia: examples of emerging-reemerging situations. // Arch Virol Suppl.2004.V (18). P. 85-96. 202. Lvov, D.K., Butenko, A.M., Gromashevsky, V.L., Larichev, V.P., Gaidamovich, S.Y., Vyshemirsky, O.I., Zhukov, A.N., Lazorenko, V.V., Salko, V.N., Kovtunov, A.I., Galimzyanov, K.M., Platonov, A.E., Morozova, T.N., Khutoretskaya, N.V., Shishkina, E.O., and Skvortsova, T.M.Isolation of two strains of West Nile virus during an outbreak in southern Russia, 1999. // Emerg Infect Dis.2000.V.6 (4). P. 373-6. 203. Magnusson, S.E., Karlsson, K.H., Reimer, J.M., Corbach-Sohle, S., Patel, S., Richner, J.M., Nowotny, N., Barzon, L., Bengtsson, K.L., Ulbert, S., Diamond, M.S., and Stertman, L.Matrix-M adjuvanted envelope protein vaccine protects against lethal lineage 1 and 2 West Nile virus infection in mice. // Vaccine.2014.V.32 (7). P. 800-8. 204. Magurano, F., Remoli, M.E., Baggieri, M., Fortuna, C., Marchi, A., Fiorentini, C., Bucci, P., Benedetti, E., Ciufolini, M.G., Rizzo, C., Piga, S., Salcuni, P., Rezza, G., and Nicoletti, L.Circulation of West Nile virus lineage 1 and 2 during an outbreak in Italy. // Clin Microbiol Infect.2012.V.18 (12). P. E545-7. 192 205. Malkinson, M. and Banet, C.The role of birds in the ecology of West Nile virus in Europe and Africa. // Curr Top Microbiol Immunol.2002.V.267. P. 309-22. 206. Malkinson, M., Banet, C., Weisman, Y., Pokamunski, S., King, R., Drouet, M.T., and Deubel, V.Introduction of West Nile virus in the Middle East by migrating white storks. // Emerg Infect Dis.2002.V.8 (4). P. 392-7. 207. Mandl, C.W., Ecker, M., Holzmann, H., Kunz, C., and Heinz, F.X.Infectious cDNA clones of tick-borne encephalitis virus European subtype prototypic strain Neudoerfl and high virulence strain Hypr. // J Gen Virol.1997.V.78 (5). P. 1049-57. 208. Mann, M.E., Zhang, Z., Rutherford, S., Bradley, R.S., Hughes, M.K., Shindell, D., Ammann, C., Faluvegi, G., and Ni, F.Global signatures and dynamical origins of the Little Ice Age and Medieval Climate Anomaly. // Science.2009.V.326 (5957). P. 1256-60. 209. Marin, M.S., Zanotto, P.M., Gritsun, T.S., and Gould, E.A.Phylogeny of TYU, SRE, and CFA virus: different evolutionary rates in the genus Flavivirus. // Virology.1995.V.206 (2). P. 1133-9. 210. Martin, J.E., Pierson, T.C., Hubka, S., Rucker, S., Gordon, I.J., Enama, M.E., Andrews, C.A., Xu, Q., Davis, B.S., Nason, M., Fay, M., Koup, R.A., Roederer, M., Bailer, R.T., Gomez, P.L., Mascola, J.R., Chang, G.J., Nabel, G.J., and Graham, B.S.A West Nile virus DNA vaccine induces neutralizing antibody in healthy adults during a phase 1 clinical trial. // J Infect Dis.2007.V.196 (12). P. 1732-40. 211. Martina, B.E., Koraka, P., van den Doel, P., van Amerongen, G., Rimmelzwaan, G.F., and Osterhaus, A.D.Immunization with West Nile virus envelope domain III protects mice against lethal infection with homologous and heterologous virus. // Vaccine.2008.V.26 (2). P. 153-7. 212. Mathiot, C.C., Georges, A.J., and Deubel, V.Comparative analysis of West Nile virus strains isolated from human and animal hosts using monoclonal antibodies and cDNA restriction digest profiles. // Res Virol.1990.V.141 (5). P. 533-43. 193 213. May, F.J., Davis, C.T., Tesh, R.B., and Barrett, A.D.Phylogeography of West Nile virus: from the cradle of evolution in Africa to Eurasia, Australia, and the Americas. // J Virol.2011.V.85 (6). P. 2964-74. 214. McDonald, W.F., Huleatt, J.W., Foellmer, H.G., Hewitt, D., Tang, J., Desai, P., Price, A., Jacobs, A., Takahashi, V.N., Huang, Y., Nakaar, V., Alexopoulou, L., Fikrig, E., and Powell, T.J.A West Nile virus recombinant protein vaccine that coactivates innate and adaptive immunity. // J Infect Dis.2007.V.195 (11). P. 160717. 215. McIntosh, B.M. and Jupp, P.G.Infections in sentinel pigeons by Sindbis and West Nile viruses in South Africa, with observations on Culex (Culex) univittatus (Diptera: Culicidae) attracted to these birds. // J Med Entomol.1979.V.16 (3). P. 2349. 216. McIntosh, B.M., McGillivray, G.M., Dickinson, D.B., and Taljaard, J.J.Ecological studies on Sindbis and West Nile viruses in South Africa. IV. Infection in a wild avian population. // S Afr J Med Sci.1968.V.33 (4). P. 105-12. 217. McMinn, P.C.The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses. // J Gen Virol.1997.V.78 (11). P. 2711-22. 218. McMullen, A.R., Albayrak, H., May, F.J., Davis, C.T., Beasley, D.W., and Barrett, A.D.Molecular evolution of lineage 2 West Nile virus. // J Gen Virol.2013.V.94 (2). P. 318-25. 219. Medic, S., van den Hoven, R., Petrovic, T., Lupulovic, D., and Nowotny, N.Serological evidence of West Nile virus infection in the horse population of northern Serbia. // J Infect Dev Ctries.2014.V.8 (7). P. 914-8. 220. Mehla, R., Kumar, S.R., Yadav, P., Barde, P.V., Yergolkar, P.N., Erickson, B.R., Carroll, S.A., Mishra, A.C., Nichol, S.T., and Mourya, D.T.Recent ancestry of Kyasanur Forest disease virus. // Emerg Infect Dis.2009.V.15 (9). P. 1431-7. 194 221. Merdic, E., Peric, L., Pandak, N., Kurolt, I.C., Turic, N., Vignjevic, G., Stolfa, I., Milas, J., Bogojevic, M.S., and Markotic, A.West Nile virus outbreak in humans in Croatia, 2012. // Coll Antropol.2013.V.37 (3). P. 943-7. 222. Merdic, E., Vignjevic, G., Turic, N., Bogojevic, M.S., Milas, J., Vrucina, I., and Zahirovic, Z.Mosquito survey during West Nile virus outbreak 2012 in northeast Croatia. // Coll Antropol.2014.V.38 (2). P. 423-8. 223. Merino-Ramos, T., Blazquez, A.B., Escribano-Romero, E., Canas-Arranz, R., Sobrino, F., Saiz, J.C., and Martin-Acebes, M.A.Protection of a single dose west nile virus recombinant subviral particle vaccine against lineage 1 or 2 strains and analysis of the cross-reactivity with Usutu virus. // PLoS One.2014.V.9 (9). P. e108056. 224. Messer, W.B., Gubler, D.J., Harris, E., Sivananthan, K., and de Silva, A.M.Emergence and global spread of a dengue serotype 3, subtype III virus. // Emerg Infect Dis.2003.V.9 (7). P. 800-9. 225. Modis, Y., Ogata, S., Clements, D., and Harrison, S.C.A ligand-binding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein. // Proc Natl Acad Sci U S A.2003.V.100 (12). P. 6986-91. 226. Modis, Y., Ogata, S., Clements, D., and Harrison, S.C.Structure of the dengue virus envelope protein after membrane fusion. // Nature.2004.V.427 (6972). P. 3139. 227. Molaei, G., Andreadis, T.G., Armstrong, P.M., Anderson, J.F., and Vossbrinck, C.R.Host feeding patterns of Culex mosquitoes and West Nile virus transmission, northeastern United States. // Emerg Infect Dis.2006.V.12 (3). P. 46874. 228. Monath, T.P., Liu, J., Kanesa-Thasan, N., Myers, G.A., Nichols, R., Deary, A., McCarthy, K., Johnson, C., Ermak, T., Shin, S., Arroyo, J., Guirakhoo, F., Kennedy, J.S., Ennis, F.A., Green, S., and Bedford, P.A live, attenuated recombinant West Nile virus vaccine. // Proc Natl Acad Sci U S A.2006.V.103 (17). P. 6694-9. 195 229. Mostashari, F., Bunning, M.L., Kitsutani, P.T., Singer, D.A., Nash, D., Cooper, M.J., Katz, N., Liljebjelke, K.A., Biggerstaff, B.J., Fine, A.D., Layton, M.C., Mullin, S.M., Johnson, A.J., Martin, D.A., Hayes, E.B., and Campbell, G.L.Epidemic West Nile encephalitis, New York, 1999: results of a householdbased seroepidemiological survey. // Lancet.2001.V.358 (9278). P. 261-4. 230. Moudy, R.M., Meola, M.A., Morin, L.L., Ebel, G.D., and Kramer, L.D.A newly emergent genotype of West Nile virus is transmitted earlier and more efficiently by Culex mosquitoes. // Am J Trop Med Hyg.2007.V.77 (2). P. 365-70. 231. Moudy, R.M., Zhang, B., Shi, P.Y., and Kramer, L.D.West Nile virus envelope protein glycosylation is required for efficient viral transmission by Culex vectors. // Virology.2009.V.387 (1). P. 222-8. 232. Mughini-Gras, L., Mulatti, P., Severini, F., Boccolini, D., Romi, R., Bongiorno, G., Khoury, C., Bianchi, R., Montarsi, F., Patregnani, T., Bonfanti, L., Rezza, G., Capelli, G., and Busani, L.Ecological niche modelling of potential West Nile virus vector mosquito species and their geographical association with equine epizootics in Italy. // Ecohealth.2014.V.11 (1). P. 120-32. 233. Mulatti, P., Ferguson, H.M., Bonfanti, L., Montarsi, F., Capelli, G., and Marangon, S.Determinants of the population growth of the West Nile virus mosquito vector Culex pipiens in a repeatedly affected area in Italy. // Parasit Vectors.2014.V.7. P. 26. 234. Murata, R., Hashiguchi, K., Yoshii, K., Kariwa, H., Nakajima, K., Ivanov, L.I., Leonova, G.N., and Takashima, I.Seroprevalence of West Nile virus in wild birds in far eastern Russia using a focus reduction neutralization test. // Am J Trop Med Hyg.2011.V.84 (3). P. 461-5. 235. Murgue, B., Zeller, H., and Deubel, V.The ecology and epidemiology of West Nile virus in Africa, Europe and Asia. // Curr Top Microbiol Immunol.2002.V.267. P. 195-221. 196 236. Myint, K.S., Kosasih, H., Artika, I.M., Perkasa, A., Puspita, M., Ma'roef, C.N., Antonjaya, U., Ledermann, J.P., Powers, A.M., and Alisjahbana, B.West Nile virus documented in Indonesia from acute febrile illness specimens. // Am J Trop Med Hyg.2014.V.90 (2). P. 260-2. 237. Naficy, K. and Saidi, S.Serological survey on viral antibodies in Iran. // Trop Geogr Med.1970.V.22 (2). P. 183-8. 238. Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., and Modis, Y.Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion. // J Virol.2009.V.83 (9). P. 4338-44. 239. Ng, T., Hathaway, D., Jennings, N., Champ, D., Chiang, Y.W., and Chu, H.J.Equine vaccine for West Nile virus. // Dev Biol (Basel).2003.V.114. P. 221-7. 240. Nikolay, B., Fall, G., Boye, C.S., Sall, A.A., and Skern, T.Validation of a structural comparison of the antigenic characteristics of Usutu virus and West Nile virus envelope proteins. // Virus Res.2014.V.189. P. 87-91. 241. Nir, Y., Avivi, A., Lasovski, Y., Margalit, J., and Goldwasser, R.Arbovirus activity in Israel. // Isr J Med Sci.1972.V.8 (10). P. 1695-701. 242. Nir, Y., Goldwasser, R., Lasowski, Y., and Avivi, A.Isolation of arboviruses from wild birds in Israel. // Am J Epidemiol.1967.V.86 (2). P. 372-8. 243. Nowak, T., Farber, P.M., Wengler, G., and Wengler, G.Analyses of the terminal sequences of West Nile virus structural proteins and of the in vitro translation of these proteins allow the proposal of a complete scheme of the proteolytic cleavages involved in their synthesis. // Virology.1989.V.169 (2). P. 36576. 244. Nybakken, G.E., Nelson, C.A., Chen, B.R., Diamond, M.S., and Fremont, D.H.Crystal structure of the West Nile virus envelope glycoprotein. // J Virol.2006.V.80 (23). P. 11467-74. 197 245. Nzonza, A., Lecollinet, S., Chat, S., Lowenski, S., Merour, E., Biacchesi, S., and Bremont, M.A recombinant novirhabdovirus presenting at the surface the E Glycoprotein from West Nile Virus (WNV) is immunogenic and provides partial protection against lethal WNV challenge in BALB/c mice. // PLoS One.2014.V.9 (3). P. e91766. 246. Ocal, M., Orsten, S., Inkaya, A.C., Yetim, E., Acar, N.P., Alp, S., Kasap, O.E., Gunay, F., Arsava, E.M., Alten, B., Ozkul, A., Us, D., Niedrig, M., and Ergunay, K.Ongoing activity of Toscana virus genotype A and West Nile virus lineage 1 strains in Turkey: a clinical and field survey. // Zoonoses Public Health.2014.V.61 (7). P. 480-91. 247. Orlinger, K.K., Holzer, G.W., Schwaiger, J., Mayrhofer, J., Schmid, K., Kistner, O., Noel Barrett, P., and Falkner, F.G.An inactivated West Nile Virus vaccine derived from a chemically synthesized cDNA system. // Vaccine.2010.V.28 (19). P. 3318-24. 248. Pachler, K., Lebl, K., Berer, D., Rudolf, I., Hubalek, Z., and Nowotny, N.Putative new West Nile virus lineage in Uranotaenia unguiculata mosquitoes, Austria, 2013. // Emerg Infect Dis.2014.V.20 (12). P. 2119-22. 249. Panella, N.A., Kerst, A.J., Lanciotti, R.S., Bryant, P., Wolf, B., and Komar, N.Comparative West Nile virus detection in organs of naturally infected American Crows (Corvus brachyrhynchos). // Emerg Infect Dis.2001.V.7 (4). P. 754-5. 250. Papa, A., Papadopoulou, E., Gavana, E., Kalaitzopoulou, S., and Mourelatos, S.Detection of West Nile virus lineage 2 in Culex mosquitoes, Greece, 2012. // Vector Borne Zoonotic Dis.2013.V.13 (9). P. 682-4. 251. Papa, A., Papadopoulou, E., Kalaitzopoulou, S., Tsioka, K., and Mourelatos, S.Detection of West Nile virus and insect-specific flavivirus RNA in Culex mosquitoes, central Macedonia, Greece. // Trans R Soc Trop Med Hyg.2014.V.108 (9). P. 555-9. 198 252. Papa, A., Politis, C., Tsoukala, A., Eglezou, A., Bakaloudi, V., Hatzitaki, M., and Tsergouli, K.West Nile virus lineage 2 from blood donor, Greece. // Emerg Infect Dis.2012.V.18 (4). P. 688-9. 253. Papa, A., Testa, T., and Papadopoulou, E.Detection of West Nile virus lineage 2 in the urine of acute human infections. // J Med Virol.2014.V.86 (12). P. 2142-5. 254. Papa, A., Xanthopoulou, K., Gewehr, S., and Mourelatos, S.Detection of West Nile virus lineage 2 in mosquitoes during a human outbreak in Greece. // Clin Microbiol Infect.2011.V.17 (8). P. 1176-80. 255. Pem-Novosel, I., Vilibic-Cavlek, T., Gjenero-Margan, I., Pandak, N., Peric, L., Barbic, L., Listes, E., Cvitkovic, A., Stevanovic, V., and Savini, G.First outbreak of West Nile virus neuroinvasive disease in humans, Croatia, 2012. // Vector Borne Zoonotic Dis.2014.V.14 (1). P. 82-4. 256. Pepperell, C., Rau, N., Krajden, S., Kern, R., Humar, A., Mederski, B., Simor, A., Low, D.E., McGeer, A., Mazzulli, T., Burton, J., Jaigobin, C., Fearon, M., Artsob, H., Drebot, M.A., Halliday, W., and Brunton, J.West Nile virus infection in 2002: morbidity and mortality among patients admitted to hospital in southcentral Ontario. // CMAJ.2003.V.168 (11). P. 1399-405. 257. Perelman, A. and Stern, J.Acute pancreatitis in West Nile Fever. // Am J Trop Med Hyg.1974.V.23 (6). P. 1150-2. 258. Phillips, J.E., Stallknecht, D.E., Perkins, T.A., McClure, N.S., and Mead, D.G.Evolutionary dynamics of West Nile virus in Georgia, 2001-2011. // Virus Genes.2014.V.49 (1). P. 132-6. 259. Pierre, V., Drouet, M.T., and Deubel, V.Identification of mosquito-borne flavivirus sequences using universal primers and reverse transcription/polymerase chain reaction. // Res Virol.1994.V.145 (2). P. 93-104. 199 260. Pierson, T.C., Diamond, M.S., Ahmed, A.A., Valentine, L.E., Davis, C.W., Samuel, M.A., Hanna, S.L., Puffer, B.A., and Doms, R.W.An infectious West Nile virus that expresses a GFP reporter gene. // Virology.2005.V.334 (1). P. 28-40. 261. Pierson, T.C., Fremont, D.H., Kuhn, R.J., and Diamond, M.S.Structural insights into the mechanisms of antibody-mediated neutralization of flavivirus infection: implications for vaccine development. // Cell Host Microbe.2008.V.4 (3). P. 229-38. 262. Pinto, A.K., Richner, J.M., Poore, E.A., Patil, P.P., Amanna, I.J., Slifka, M.K., and Diamond, M.S.A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. // J Virol.2013.V.87 (4). P. 1926-36. 263. Platonov, A.E., Shipulin, G.A., Shipulina, O.Y., Tyutyunnik, E.N., Frolochkina, T.I., Lanciotti, R.S., Yazyshina, S., Platonova, O.V., Obukhov, I.L., Zhukov, A.N., Vengerov, Y.Y., and Pokrovskii, V.I.Outbreak of West Nile virus infection, Volgograd Region, Russia, 1999. // Emerg Infect Dis.2001.V.7 (1). P. 128-32. 264. Platonov, A.E., Tolpin, V.A., Gridneva, K.A., Titkov, A.V., Platonova, O.V., Kolyasnikova, N.M., Busani, L., and Rezza, G.The incidence of West Nile disease in Russia in relation to climatic and environmental factors. // Int J Environ Res Public Health.2014.V.11 (2). P. 1211-32. 265. Pletnev, A.G., Swayne, D.E., Speicher, J., Rumyantsev, A.A., and Murphy, B.R.Chimeric West Nile/dengue virus vaccine candidate: preclinical evaluation in mice, geese and monkeys for safety and immunogenicity. // Vaccine.2006.V.24 (4041). P. 6392-404. 266. Popovic, N., Milosevic, B., Urosevic, A., Poluga, J., Lavadinovic, L., Nedelijkovic, J., Jevtovic, D., and Dulovic, O.Outbreak of West Nile virus infection among humans in Serbia, August to October 2012. // Euro Surveill.2013.V.18 (43). P. 200 267. Popovic, N., Milosevic, B., Urosevic, A., Poluga, J., Popovic, N., Stevanovic, G., Milosevic, I., Korac, M., Mitrovic, N., Lavadinovic, L., Nikolic, J., and Dulovic, O.Clinical characteristics and functional outcome of patients with West Nile neuroinvasive disease in Serbia. // J Neurol.2014.V.261 (6). P. 1104-11. 268. Porter, K.R., Summers, P.L., Dubois, D., Puri, B., Nelson, W., Henchal, E., Oprandy, J.J., and Hayes, C.G.Detection of West Nile virus by the polymerase chain reaction and analysis of nucleotide sequence variation. // Am J Trop Med Hyg.1993.V.48 (3). P. 440-6. 269. Prow, N.A., Setoh, Y.X., Biron, R.M., Sester, D.P., Kim, K.S., HobsonPeters, J., Hall, R.A., and Bielefeldt-Ohmann, H.The West Nile virus-like flavivirus Koutango is highly virulent in mice due to delayed viral clearance and the induction of a poor neutralizing antibody response. // J Virol.2014.V.88 (17). P. 9947-62. 270. Puig-Basagoiti, F., Tilgner, M., Bennett, C.J., Zhou, Y., Munoz-Jordan, J.L., Garcia-Sastre, A., Bernard, K.A., and Shi, P.Y.A mouse cell-adapted NS4B mutation attenuates West Nile virus RNA synthesis. // Virology.2007.V.361 (1). P. 229-41. 271. Qiao, M., Ashok, M., Bernard, K.A., Palacios, G., Zhou, Z.H., Lipkin, W.I., and Liang, T.J.Induction of sterilizing immunity against West Nile Virus (WNV), by immunization with WNV-like particles produced in insect cells. // J Infect Dis.2004.V.190 (12). P. 2104-8. 272. Ramanathan, M.P., Kutzler, M.A., Kuo, Y.C., Yan, J., Liu, H., Shah, V., Bawa, A., Selling, B., Sardesai, N.Y., Kim, J.J., and Weiner, D.B.Coimmunization with an optimized IL15 plasmid adjuvant enhances humoral immunity via stimulating B cells induced by genetically engineered DNA vaccines expressing consensus JEV and WNV E DIII. // Vaccine.2009.V.27 (32). P. 4370-80. 273. Reisen, W.K., Fang, Y., and Martinez, V.M.Effects of temperature on the transmission of west nile virus by Culex tarsalis (Diptera: Culicidae). // J Med Entomol.2006.V.43 (2). P. 309-17. 201 274. Rey, F.A., Heinz, F.X., Mandl, C., Kunz, C., and Harrison, S.C.The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. // Nature.1995.V.375 (6529). P. 291-8. 275. Riabi, S., Gaaloul, I., Mastouri, M., Hassine, M., and Aouni, M.An outbreak of West Nile Virus infection in the region of Monastir, Tunisia, 2003. // Pathog Glob Health.2014.V.108 (3). P. 148-57. 276. Rice, C.M., Grakoui, A., Galler, R., and Chambers, T.J.Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. // New Biol.1989.V.1 (3). P. 285-96. 277. Rice, C.M., Lenches, E.M., Eddy, S.R., Shin, S.J., Sheets, R.L., and Strauss, J.H.Nucleotide sequence of yellow fever virus: implications for flavivirus gene expression and evolution. // Science.1985.V.229 (4715). P. 726-33. 278. Roby, J.A., Bielefeldt-Ohmann, H., Prow, N.A., Chang, D.C., Hall, R.A., and Khromykh, A.A.Increased expression of capsid protein in trans enhances production of single-round infectious particles by West Nile virus DNA vaccine candidate. // J Gen Virol.2014.V.95 (10). P. 2176-91. 279. Roby, J.A., Hall, R.A., and Khromykh, A.A.West Nile virus genome with glycosylated envelope protein and deletion of alpha helices 1, 2, and 4 in the capsid protein is noninfectious and efficiently secretes subviral particles. // J Virol.2013.V.87 (23). P. 13063-9. 280. Rosa, R., Marini, G., Bolzoni, L., Neteler, M., Metz, M., Delucchi, L., Chadwick, E.A., Balbo, L., Mosca, A., Giacobini, M., Bertolotti, L., and Rizzoli, A.Early warning of West Nile virus mosquito vector: climate and land use models successfully explain phenology and abundance of Culex pipiens mosquitoes in north-western Italy. // Parasit Vectors.2014.V.7. P. 269. 281. Rosas, C.T., Tischer, B.K., Perkins, G.A., Wagner, B., Goodman, L.B., and Osterrieder, N.Live-attenuated recombinant equine herpesvirus type 1 (EHV-1) 202 induces a neutralizing antibody response against West Nile virus (WNV). // Virus Res.2007.V.125 (1). P. 69-78. 282. Rossini, G., Carletti, F., Bordi, L., Cavrini, F., Gaibani, P., Landini, M.P., Pierro, A., Capobianchi, M.R., Di Caro, A., and Sambri, V.Phylogenetic analysis of West Nile virus isolates, Italy, 2008-2009. // Emerg Infect Dis.2011.V.17 (5). P. 903-6. 283. Rossini, G., Carletti, F., Rigoli, R., Piga, S., Bagnarelli, P., Gaibani, P., Pierro, A., Costa, A.N., Grossi, P., Ippolito, G., Landini, M.P., Di Caro, A., Capobianchi, M.R., and Sambri, V.Heterogeneity of West Nile virus genotype 1a in Italy, 2011. // J Gen Virol.2013.V.94 (2). P. 314-7. 284. Rudolf, I., Bakonyi, T., Sebesta, O., Mendel, J., Pesko, J., Betasova, L., Blazejova, H., Venclikova, K., Strakova, P., Nowotny, N., and Hubalek, Z.West Nile virus lineage 2 isolated from Culex modestus mosquitoes in the Czech Republic, 2013: expansion of the European WNV endemic area to the North? // Euro Surveill.2014.V.19 (31). P. 2-5. 285. Rutvisuttinunt, W., Chinnawirotpisan, P., Klungthong, C., Shrestha, S., Thapa, A., Pant, A., Yingst, S.L., Yoon, I.K., Fernandez, S., and Pavlin, J.A.Evidence of West Nile virus infection in Nepal. // BMC Infect Dis.2014.V.14 (1). P. 606. 286. Ryan, M.D., Monaghan, S., and Flint, M.Virus-encoded proteinases of the Flaviviridae. // J Gen Virol.1998.V.79 (5). P. 947-59. 287. Saiyasombat, R., Carrillo-Tripp, J., Miller, W.A., Bredenbeek, P.J., and Blitvich, B.J.Substitution of the premembrane and envelope protein genes of Modoc virus with the homologous sequences of West Nile virus generates a chimeric virus that replicates in vertebrate but not mosquito cells. // Virol J.2014.V.11. P. 150. 288. Samina, I., Havenga, M., Koudstaal, W., Khinich, Y., Koldijk, M., Malkinson, M., Simanov, M., Perl, S., Gijsbers, L., Weverling, G.J., Uytdehaag, F., and 203 Goudsmit, J.Safety and efficacy in geese of a PER.C6-based inactivated West Nile virus vaccine. // Vaccine.2007.V.25 (49). P. 8338-45. 289. Samuel, C.E.Host genetic variability and West Nile virus susceptibility. // Proc Natl Acad Sci U S A.2002.V.99 (18). P. 11555-7. 290. Sardelis, M.R., Turell, M.J., Dohm, D.J., and O'Guinn, M.L.Vector competence of selected North American Culex and Coquillettidia mosquitoes for West Nile virus. // Emerg Infect Dis.2001.V.7 (6). P. 1018-22. 291. Savini, G., Capelli, G., Monaco, F., Polci, A., Russo, F., Di Gennaro, A., Marini, V., Teodori, L., Montarsi, F., Pinoni, C., Pisciella, M., Terregino, C., Marangon, S., Capua, I., and Lelli, R.Evidence of West Nile virus lineage 2 circulation in Northern Italy. // Vet Microbiol.2012.V.158 (3-4). P. 267-73. 292. Savini, G., Puggioni, G., A, D.I.G., G, D.I.F., Rocchigiani, A.M., Polci, A., Marini, V., Pinoni, C., Rolesu, S., Marruchella, G., Lorusso, A., and Monaco, F.West Nile virus lineage 2 in Sardinian wild birds in 2012: a further threat to public health. // Epidemiol Infect.2013.V.141 (11). P. 2313-6. 293. Saxena, D., Parida, M., Rao, P.V., and Kumar, J.S.Cloning and expression of an envelope gene of West Nile virus and evaluation of the protein for use in an IgM ELISA. // Diagn Microbiol Infect Dis.2013.V.75 (4). P. 396-401. 294. Schepp-Berglind, J., Luo, M., Wang, D., Wicker, J.A., Raja, N.U., Hoel, B.D., Holman, D.H., Barrett, A.D., and Dong, J.Y.Complex adenovirus-mediated expression of West Nile virus C, PreM, E, and NS1 proteins induces both humoral and cellular immune responses. // Clin Vaccine Immunol.2007.V.14 (9). P. 111726. 295. Scherret, J.H., Mackenzie, J.S., Hall, R.A., Deubel, V., and Gould, E.A.Phylogeny and molecular epidemiology of West Nile and Kunjin viruses. // Curr Top Microbiol Immunol.2002.V.267. P. 373-90. 204 296. Scherret, J.H., Poidinger, M., Mackenzie, J.S., Broom, A.K., Deubel, V., Lipkin, W.I., Briese, T., Gould, E.A., and Hall, R.A.The relationships between West Nile and Kunjin viruses. // Emerg Infect Dis.2001.V.7 (4). P. 697-705. 297. Schneeweiss, A., Chabierski, S., Salomo, M., Delaroque, N., Al-Robaiy, S., Grunwald, T., Burki, K., Liebert, U.G., and Ulbert, S.A DNA vaccine encoding the E protein of West Nile virus is protective and can be boosted by recombinant domain DIII. // Vaccine.2011.V.29 (37). P. 6352-7. 298. Scholle, F. and Mason, P.W.West Nile virus replication interferes with both poly(I:C)-induced interferon gene transcription and response to interferon treatment. // Virology.2005.V.342 (1). P. 77-87. 299. Seregin, A., Nistler, R., Borisevich, V., Yamshchikov, G., Chaporgina, E., Kwok, C.W., and Yamshchikov, V.Immunogenicity of West Nile virus infectious DNA and its noninfectious derivatives. // Virology.2006.V.356 (1-2). P. 115-25. 300. Setoh, Y.X., Prow, N.A., Hobson-Peters, J., Lobigs, M., Young, P.R., Khromykh, A.A., and Hall, R.A.Identification of residues in West Nile virus premembrane protein that influence viral particle secretion and virulence. // J Gen Virol.2012.V.93 (9). P. 1965-75. 301. Shah-Hosseini, N., Chinikar, S., Ataei, B., Fooks, A.R., and Groschup, M.H.Phylogenetic analysis of West Nile virus genome, Iran. // Emerg Infect Dis.2014.V.20 (8). P. 1419-21. 302. Shi, P.Y., Brinton, M.A., Veal, J.M., Zhong, Y.Y., and Wilson, W.D.Evidence for the existence of a pseudoknot structure at the 3' terminus of the flavivirus genomic RNA. // Biochemistry.1996.V.35 (13). P. 4222-30. 303. Shi, P.Y., Li, W., and Brinton, M.A.Cell proteins bind specifically to West Nile virus minus-strand 3' stem-loop RNA. // J Virol.1996.V.70 (9). P. 6278-87. 205 304. Shi, P.Y., Tilgner, M., Lo, M.K., Kent, K.A., and Bernard, K.A.Infectious cDNA clone of the epidemic west nile virus from New York City. // J Virol.2002.V.76 (12). P. 5847-56. 305. Shirato, K., Miyoshi, H., Goto, A., Ako, Y., Ueki, T., Kariwa, H., and Takashima, I.Viral envelope protein glycosylation is a molecular determinant of the neuroinvasiveness of the New York strain of West Nile virus. // J Gen Virol.2004.V.85 (12). P. 3637-45. 306. Shrestha, B., Gottlieb, D., and Diamond, M.S.Infection and injury of neurons by West Nile encephalitis virus. // J Virol.2003.V.77 (24). P. 13203-13. 307. Sirbu, A., Ceianu, C.S., Panculescu-Gatej, R.I., Vazquez, A., Tenorio, A., Rebreanu, R., Niedrig, M., Nicolescu, G., and Pistol, A.Outbreak of West Nile virus infection in humans, Romania, July to October 2010. // Euro Surveill.2011.V.16 (2). P. 308. Smith, H.L., Monath, T.P., Pazoles, P., Rothman, A.L., Casey, D.M., Terajima, M., Ennis, F.A., Guirakhoo, F., and Green, S.Development of antigenspecific memory CD8+ T cells following live-attenuated chimeric West Nile virus vaccination. // J Infect Dis.2011.V.203 (4). P. 513-22. 309. Sotelo, E., Fernandez-Pinero, J., Llorente, F., Vazquez, A., Moreno, A., Aguero, M., Cordioli, P., Tenorio, A., and Jimenez-Clavero, M.A.Phylogenetic relationships of Western Mediterranean West Nile virus strains (1996-2010) using full-length genome sequences: single or multiple introductions? // J Gen Virol.2011.V.92 (11). P. 2512-22. 310. Spissu, N., Panichi, G., Montisci, A., and Fiore, F.West Nile Virus outbreak in Sardinia, Italy, in 2011. // J Infect Dev Ctries.2013.V.7 (1). P. 6-9. 311. Spohn, G., Jennings, G.T., Martina, B.E., Keller, I., Beck, M., Pumpens, P., Osterhaus, A.D., and Bachmann, M.F.A VLP-based vaccine targeting domain III of 206 the West Nile virus E protein protects from lethal infection in mice. // Virol J.2010.V.7. P. 146. 312. Stebbings, R., Fevrier, M., Li, B., Lorin, C., Koutsoukos, M., Mee, E., Rose, N., Hall, J., Page, M., Almond, N., Voss, G., and Tangy, F.Immunogenicity of a recombinant measles-HIV-1 clade B candidate vaccine. // PLoS One.2012.V.7 (11). P. e50397. 313. Sumiyoshi, H., Hoke, C.H., and Trent, D.W.Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates. // J Virol.1992.V.66 (9). P. 5425-31. 314. Suzuki, R., Fayzulin, R., Frolov, I., and Mason, P.W.Identification of mutated cyclization sequences that permit efficient replication of West Nile virus genomes: use in safer propagation of a novel vaccine candidate. // J Virol.2008.V.82 (14). P. 6942-51. 315. Szentpali-Gavaller, K., Antal, L., Toth, M., Kemenesi, G., Soltesz, Z., Dan, A., Erdelyi, K., Banyai, K., Balint, A., Jakab, F., and Bakonyi, T.Monitoring of West Nile virus in mosquitoes between 2011-2012 in Hungary. // Vector Borne Zoonotic Dis.2014.V.14 (9). P. 648-55. 316. Thomas, S., Redfern, J.B., Lidbury, B.A., and Mahalingam, S.Antibodydependent enhancement and vaccine development. // Expert Rev Vaccines.2006.V.5 (4). P. 409-12. 317. Throsby, M., Geuijen, C., Goudsmit, J., Bakker, A.Q., Korimbocus, J., Kramer, R.A., Clijsters-van der Horst, M., de Jong, M., Jongeneelen, M., Thijsse, S., Smit, R., Visser, T.J., Bijl, N., Marissen, W.E., Loeb, M., Kelvin, D.J., Preiser, W., ter Meulen, J., and de Kruif, J.Isolation and characterization of human monoclonal antibodies from individuals infected with West Nile Virus. // J Virol.2006.V.80 (14). P. 6982-92. 207 318. Tilgner, M., Deas, T.S., and Shi, P.Y.The flavivirus-conserved pentanucleotide in the 3' stem-loop of the West Nile virus genome requires a specific sequence and structure for RNA synthesis, but not for viral translation. // Virology.2005.V.331 (2). P. 375-86. 319. Tilgner, M. and Shi, P.Y.Structure and function of the 3' terminal six nucleotides of the west nile virus genome in viral replication. // J Virol.2004.V.78 (15). P. 8159-71. 320. Totani, M., Yoshii, K., Kariwa, H., and Takashima, I.Glycosylation of the envelope protein of West Nile Virus affects its replication in chicks. // Avian Dis.2011.V.55 (4). P. 561-8. 321. Triki, H., Murri, S., Le Guenno, B., Bahri, O., Hili, K., Sidhom, M., and Dellagi, K.[West Nile viral meningo-encephalitis in Tunisia]. // Med Trop (Mars).2001.V.61 (6). P. 487-90. 322. Tsai, T.F., Popovici, F., Cernescu, C., Campbell, G.L., and Nedelcu, N.I.West Nile encephalitis epidemic in southeastern Romania. // Lancet.1998.V.352 (9130). P. 767-71. 323. Turell, M.J., O'Guinn, M., and Oliver, J.Potential for New York mosquitoes to transmit West Nile virus. // Am J Trop Med Hyg.2000.V.62 (3). P. 413-4. 324. Ulbert, S. and Magnusson, S.E.Technologies for the development of West Nile virus vaccines. // Future Microbiol.2014.V.9 (10). P. 1221-32. 325. van Marle, G., Antony, J., Ostermann, H., Dunham, C., Hunt, T., Halliday, W., Maingat, F., Urbanowski, M.D., Hobman, T., Peeling, J., and Power, C.West Nile virus-induced neuroinflammation: glial infection and capsid protein-mediated neurovirulence. // J Virol.2007.V.81 (20). P. 10933-49. 326. Vandergaast, R., Hoover, L.I., Zheng, K., and Fredericksen, B.L.Generation of West Nile virus infectious clones containing amino acid insertions between capsid and capsid anchor. // Viruses.2014.V.6 (4). P. 1637-53. 208 327. Venter, M. and Swanepoel, R.West Nile virus lineage 2 as a cause of zoonotic neurological disease in humans and horses in southern Africa. // Vector Borne Zoonotic Dis.2010.V.10 (7). P. 659-64. 328. Venter, M., van Vuren, P.J., Mentoor, J., Paweska, J., and Williams, J.Inactivated West Nile Virus (WNV) vaccine, Duvaxyn WNV, protects against a highly neuroinvasive lineage 2 WNV strain in mice. // Vaccine.2013.V.31 (37). P. 3856-62. 329. Verstrepen, B.E., Fagrouch, Z., van Heteren, M., Buitendijk, H., Haaksma, T., Beenhakker, N., Palu, G., Richner, J.M., Diamond, M.S., Bogers, W.M., Barzon, L., Chabierski, S., Ulbert, S., Kondova, I., and Verschoor, E.J.Experimental infection of rhesus macaques and common marmosets with a European strain of West Nile virus. // PLoS Negl Trop Dis.2014.V.8 (4). P. e2797. 330. Verstrepen, B.E., Oostermeijer, H., Fagrouch, Z., van Heteren, M., Niphuis, H., Haaksma, T., Kondova, I., Bogers, W.M., de Filette, M., Sanders, N., Stertman, L., Magnusson, S., Lorincz, O., Lisziewicz, J., Barzon, L., Palu, G., Diamond, M.S., Chabierski, S., Ulbert, S., and Verschoor, E.J.Vaccine-induced protection of rhesus macaques against plasma viremia after intradermal infection with a European lineage 1 strain of West Nile virus. // PLoS One.2014.V.9 (11). P. e112568. 331. Victor, T.J., Malathi, M., Ravi, V., Palani, G., and Appavoo, N.C.First outbreak of Japanese encephalitis in two villages of Dharmapuri district in Tamil Nadu. // Indian J Med Res.2000.V.112. P. 193-7. 332. Vilibic-Cavlek, T., Kaic, B., Barbic, L., Pem-Novosel, I., Slavic-Vrzic, V., Lesnikar, V., Kurecic-Filipovic, S., Babic-Erceg, A., Listes, E., Stevanovic, V., Gjenero-Margan, I., and Savini, G.First evidence of simultaneous occurrence of West Nile virus and Usutu virus neuroinvasive disease in humans in Croatia during the 2013 outbreak. // Infection.2014.V.42 (4). P. 689-95. 333. Vogt, M.R., Moesker, B., Goudsmit, J., Jongeneelen, M., Austin, S.K., Oliphant, T., Nelson, S., Pierson, T.C., Wilschut, J., Throsby, M., and Diamond, 209 M.S.Human monoclonal antibodies against West Nile virus induced by natural infection neutralize at a postattachment step. // J Virol.2009.V.83 (13). P. 6494-507. 334. Vrioni, G., Mavrouli, M., Kapsimali, V., Stavropoulou, A., Detsis, M., Danis, K., and Tsakris, A.Laboratory and clinical characteristics of human West Nile virus infections during 2011 outbreak in southern Greece. // Vector Borne Zoonotic Dis.2014.V.14 (1). P. 52-8. 335. Wang, T., Anderson, J.F., Magnarelli, L.A., Wong, S.J., Koski, R.A., and Fikrig, E.Immunization of mice against West Nile virus with recombinant envelope protein. // J Immunol.2001.V.167 (9). P. 5273-7. 336. Watts, D.M., Tesh, R.B., Siirin, M., Rosa, A.T., Newman, P.C., Clements, D.E., Ogata, S., Coller, B.A., Weeks-Levy, C., and Lieberman, M.M.Efficacy and durability of a recombinant subunit West Nile vaccine candidate in protecting hamsters from West Nile encephalitis. // Vaccine.2007.V.25 (15). P. 2913-8. 337. Weinberger, M., Pitlik, S.D., Gandacu, D., Lang, R., Nassar, F., Ben David, D., Rubinstein, E., Izthaki, A., Mishal, J., Kitzes, R., Siegman-Igra, Y., Giladi, M., Pick, N., Mendelson, E., Bin, H., and Shohat, T.West Nile fever outbreak, Israel, 2000: epidemiologic aspects. // Emerg Infect Dis.2001.V.7 (4). P. 686-91. 338. Weissenbock, H., Kolodziejek, J., Url, A., Lussy, H., Rebel-Bauder, B., and Nowotny, N.Emergence of Usutu virus, an African mosquito-borne flavivirus of the Japanese encephalitis virus group, central Europe. // Emerg Infect Dis.2002.V.8 (7). P. 652-6. 339. Wengler, G., Castle, E., Leidner, U., Nowak, T., and Wengler, G.Sequence analysis of the membrane protein V3 of the flavivirus West Nile virus and of its gene. // Virology.1985.V.147 (2). P. 264-74. 340. White, L.J., Sariol, C.A., Mattocks, M.D., Wahala, M.P.B.W., Yingsiwaphat, V., Collier, M.L., Whitley, J., Mikkelsen, R., Rodriguez, I.V., Martinez, M.I., de Silva, A., and Johnston, R.E.An alphavirus vector-based tetravalent dengue vaccine 210 induces a rapid and protective immune response in macaques that differs qualitatively from immunity induced by live virus infection. // J Virol.2013.V.87 (6). P. 3409-24. 341. Whiteman, M.C., Popov, V., Sherman, M.B., Wen, J., and Barrett, A.D.Attenuated West Nile Virus Mutant NS1130-132QQA/175A/207A Exhibits Virus-Induced Ultrastructural Changes and Accumulation of Protein in the Endoplasmic Reticulum. // J Virol.2015.V.89 (2). P. 1474-8. 342. Whiteman, M.C., Wicker, J.A., Kinney, R.M., Huang, C.Y., Solomon, T., and Barrett, A.D.Multiple amino acid changes at the first glycosylation motif in NS1 protein of West Nile virus are necessary for complete attenuation for mouse neuroinvasiveness. // Vaccine.2011.V.29 (52). P. 9702-10. 343. Wicker, J.A., Whiteman, M.C., Beasley, D.W., Davis, C.T., McGee, C.E., Lee, J.C., Higgs, S., Kinney, R.M., Huang, C.Y., and Barrett, A.D.Mutational analysis of the West Nile virus NS4B protein. // Virology.2012.V.426 (1). P. 22-33. 344. Widman, D.G., Frolov, I., and Mason, P.W.Third-generation flavivirus vaccines based on single-cycle, encapsidation-defective viruses. // Adv Virus Res.2008.V.72. P. 77-126. 345. Widman, D.G., Ishikawa, T., Fayzulin, R., Bourne, N., and Mason, P.W.Construction and characterization of a second-generation pseudoinfectious West Nile virus vaccine propagated using a new cultivation system. // Vaccine.2008.V.26 (22). P. 2762-71. 346. Widman, D.G., Ishikawa, T., Giavedoni, L.D., Hodara, V.L., Garza Mde, L., Montalbo, J.A., Travassos Da Rosa, A.P., Tesh, R.B., Patterson, J.L., Carrion, R., Jr., Bourne, N., and Mason, P.W.Evaluation of RepliVAX WN, a single-cycle flavivirus vaccine, in a non-human primate model of West Nile virus infection. // Am J Trop Med Hyg.2010.V.82 (6). P. 1160-7. 211 347. Widman, D.G., Ishikawa, T., Winkelmann, E.R., Infante, E., Bourne, N., and Mason, P.W.RepliVAX WN, a single-cycle flavivirus vaccine to prevent West Nile disease, elicits durable protective immunity in hamsters. // Vaccine.2009.V.27 (41). P. 5550-3. 348. Williams, J.H., Mentoor, J.D., Van Wilpe, E., and Venter, M.Comparative Pathology of Neurovirulent Lineage 1 (NY99/385) and Lineage 2 (SPU93/01) West Nile Virus Infections in BALBc Mice. // Vet Pathol.2015.V.52 (1). P. 140-51. 349. Wilson, J.R., de Sessions, P.F., Leon, M.A., and Scholle, F.West Nile virus nonstructural protein 1 inhibits TLR3 signal transduction. // J Virol.2008.V.82 (17). P. 8262-71. 350. Wodak, E., Richter, S., Bago, Z., Revilla-Fernandez, S., Weissenbock, H., Nowotny, N., and Winter, P.Detection and molecular analysis of West Nile virus infections in birds of prey in the eastern part of Austria in 2008 and 2009. // Vet Microbiol.2011.V.149 (3-4). P. 358-66. 351. Work, T.H., Hurlbut, H.S., and Taylor, R.M.Isolation of West Nile virus from hooded crow and rock pigeon in the Nile delta. // Proc Soc Exp Biol Med.1953.V.84 (3). P. 719-22. 352. Work, T.H., Hurlbut, H.S., and Taylor, R.M.Indigenous wild birds of the Nile Delta as potential West Nile virus circulating reservoirs. // Am J Trop Med Hyg.1955.V.4 (5). P. 872-88. 353. Yamshchikov, G., Borisevich, V., Kwok, C.W., Nistler, R., Kohlmeier, J., Seregin, A., Chaporgina, E., Benedict, S., and Yamshchikov, V.The suitability of yellow fever and Japanese encephalitis vaccines for immunization against West Nile virus. // Vaccine.2005.V.23 (39). P. 4785-92. 354. Yamshchikov, G., Borisevich, V., Seregin, A., Chaporgina, E., Mishina, M., Mishin, V., Kwok, C.W., and Yamshchikov, V.An attenuated West Nile prototype 212 virus is highly immunogenic and protects against the deadly NY99 strain: a candidate for live WN vaccine development. // Virology.2004.V.330 (1). P. 304-12. 355. Yamshchikov, V., Mishin, V., and Cominelli, F.A new strategy in design of +RNA virus infectious clones enabling their stable propagation in E. coli. // Virology.2001.V.281 (2). P. 272-80. 356. Yamshchikov, V.F. and Compans, R.W.Regulation of the late events in flavivirus protein processing and maturation. // Virology.1993.V.192 (1). P. 38-51. 357. Yamshchikov, V.F., Trent, D.W., and Compans, R.W.Upregulation of signalase processing and induction of prM-E secretion by the flavivirus NS2B-NS3 protease: roles of protease components. // J Virol.1997.V.71 (6). P. 4364-71. 358. Yamshchikov, V.F., Wengler, G., Perelygin, A.A., Brinton, M.A., and Compans, R.W.An infectious clone of the West Nile flavivirus. // Virology.2001.V.281 (2). P. 294-304. 359. Yang, J.S., Ramanathan, M.P., Muthumani, K., Choo, A.Y., Jin, S.H., Yu, Q.C., Hwang, D.S., Choo, D.K., Lee, M.D., Dang, K., Tang, W., Kim, J.J., and Weiner, D.B.Induction of inflammation by West Nile virus capsid through the caspase-9 apoptotic pathway. // Emerg Infect Dis.2002.V.8 (12). P. 1379-84. 360. Yap, T.L., Xu, T., Chen, Y.L., Malet, H., Egloff, M.P., Canard, B., Vasudevan, S.G., and Lescar, J.Crystal structure of the dengue virus RNAdependent RNA polymerase catalytic domain at 1.85-angstrom resolution. // J Virol.2007.V.81 (9). P. 4753-65. 361. Young, L.B., Melian, E.B., Setoh, Y.X., Young, P.R., and Khromykh, A.Last twenty amino acids of the West Nile Virus NS1' protein are responsible for its retention in cells and formation of unique heat-stable dimers. // J Gen Virol.2015.V. P. 213 362. Yu, L., Robert Putnak, J., Pletnev, A.G., and Markoff, L.Attenuated West Nile viruses bearing 3'SL and envelope gene substitution mutations. // Vaccine.2008.V.26 (47). P. 5981-8. 363. Zanotto, P.M., Gould, E.A., Gao, G.F., Harvey, P.H., and Holmes, E.C.Population dynamics of flaviviruses revealed by molecular phylogenies. // Proc Natl Acad Sci U S A.1996.V.93 (2). P. 548-53. 364. Zhang, B., Dong, H., Stein, D.A., Iversen, P.L., and Shi, P.Y.West Nile virus genome cyclization and RNA replication require two pairs of long-distance RNA interactions. // Virology.2008.V.373 (1). P. 1-13. 365. Zhou, Y., Ray, D., Zhao, Y., Dong, H., Ren, S., Li, Z., Guo, Y., Bernard, K.A., Shi, P.Y., and Li, H.Structure and function of flavivirus NS5 methyltransferase. // J Virol.2007.V.81 (8). P. 3891-903. 366. Zhu, B., Ye, J., Lu, P., Jiang, R., Yang, X., Fu, Z.F., Chen, H., and Cao, S.Induction of antigen-specific immune responses in mice by recombinant baculovirus expressing premembrane and envelope proteins of West Nile virus. // Virol J.2012.V.9. P. 132.
