ФГБНУ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК РАСТИТЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ В КАЧЕСТВЕ БИОРЕАКТОРОВ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Дейнеко Елена Викторовна, д.б.н., проф., зав. Лабораторией биоинженерии растений Лекция 1. Беларусский госуниверситет (апрель, 19-20, 2019) МИНСК, РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ ФГБНУ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК СИБИРСКИЙ НИИ РАСТИЕНИЕВОДСТВА И СЕЛЕКЦИИ РАСХН НИИ ТЕРАПИИ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ НИИ КЛИНИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЛИМФОЛОГИИ РАСТЕНИЯ – источник различных лекарственных субстанций Ткани различных органов растений – природные экстракты Получение вторичных метаболитов при культивировании клеток растений in vitro Культивирование клеток растений, модифицированных A. rhizogenes, in vitro Получение рекомбинантных аналогов фармацевтически ценных белков - БИОСИМИЛЯРОВ БИОСИМИЛЯРЫ – препараты, полученные на основе рекомбинантных белков Производство лекарственных препаратов для фармацевтики - важнейшая и динамично развивающуюся часть мировой индустрии К концу 2019 объем продаж биосимиляров на мировом рынке достигнет до 6.2 миллиардов долларов США, с тенденцией роста к 2023 году до 23.6 млрд. долларов США Большую часть среди биосимиляров составят гликозилированные белки, т.е. синтезированные в эукариотических системах экспрессии. Основные производители: США: Германия: Израиль: Южная Корея: Индия: Pfizer, Amgen; Sandoz International; Teva Pharmaceuticals; Samsung Biologics; Celltrion; Biocon; Dr. Reddy's Laboratories. По материалам: marketsandmarkets.com Общая схема получения рекомбинантных белков - клонирование целевого гена; - перенос целевого гена в геном клетки-продуцента; - отбор клеток с целевым геном и их размножение; - синтез рекомбинантного белка, его выделение и очистка из полученной биомассы Системы экспрессии рекомбинантных белков Промышленное производство биофармацевтиков основано на клеточных линиях бактерий и млекопитающих клетки яичников китайского хомячка (СНО); > 70 E. сoli; > 60 Простые белки: -инсулин; -интерфероны; - гормон роста человека - соматотропин - Сложные белки: антитела; ферменты; антигены Растения – перспективная альтеративная система экспрессии синтеза рекомбинантных белков для биофармацевтики Простота и дешевизна Способность к пост-трансляционным модификациям Отсутствие заражения вирусами и прионами д ж МОЛЕКУЛЯРНОЕ ФЕРМЕРСТВО Трансгенные растения, ядерная трансформация Транзиентная экспрессия Биореакторы Растительные системы экспрессии: Высокий коммерческий потенциал технологии Способность конкурировать с другими системами эспрессии ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ Ядерная трансформация Хлоропластная трансформация Ферменты, гормоны, антитела, вакцины. Авидин – 1 бушель (25 кг) кукурузы = 1 т белков куриных яиц авидин из кукурузы = 0,5% от стоимости авидина из куриных яиц α-интерферон человека – хлоропласты табака = 20% ОРБ = 3 мг/г сырой массы Трипсин бычий – зёрна кукурузы = 3,3% ОРБ = 58 мг/кг зёрен Концепция «съедобной вакцины» ПЕЙЕРОВА БЛЯШКА М-клетка АГ Эпителий • чужеродные белки способны синтезироваться в клетках трансгенных растений в их природной, иммунологически активной форме • антигены (природный и синтезируемый трансгенными растениями) вызывают однотипные иммунологические реакции • при пероральной доставке антигены способны проходить через желудочнокишечный тракт теплокровных • стабильность целевого иммуногена при хранении • стандартизация иммуногена Т В Дендритна я клетка Т Т Макрофа г Схема формирования мукозального ответа в тонком кишечнике Создание трансгенных растений моркови с генами est6, cfp10 M.tuberculosis и dIFN человека Вестерн-блот-анализ белковых экстрактов из корнеплодов трансгенных растений моркови. а б Результаты ПЦР с геномными ДНК трансгенной моркови 50 kDa 32 kDa CFP10-ESAT6 –dIFN 16 kDa CFP10-ESAT6 6 kDa ESAT6 1 – 3– ДНК трансгенных растений; 4 - ДНК нетрансгенного растения; 5– положительный контроль (pBi121-CFP10-ESAT6-dIFN); 6- отрицательный контроль (без матричной ДНК); 7– маркёр длин фрагментов ДНК (в bp). а) контроль - очищенный rCFP10-ESAT6-dIFN, наработанный в E. сoli (10 нг); b) экстракт корнеплодов трансгенной моркови. Средняя прибавка массы тела морских свинок в течение эксперимента 0.25 0.25 253,3±76,9 2 0.5 0.5 357,6±67,9 3 1.0 1.0 260,0±40,4 4 2.0 2.0 220,0±70,2 5 4.0 4.0 196,6±13,3 6 1.0 - 240,0±60,3 7 - 4.0 286,6±12,0 Контр. 1 Туберкулин Туберкулин 140,0±15,3 Контр. 2 - - 63,3±32,8 Группа 2 1 Морфологический анализ печени Контроль 1 Средняя прибавка массы тела в течение эксперимента, г. Контроль 2 Группы животных Количество рекомбинантного белка для вакцинации, мкг 1-ая 2-ая • Затраты на производство 1 г антигена: - клетки млекопитающих – 367-618 USD -клетки растений – 39-125 USD Kaufmann S., 2013 • Лигнин, фенольные соединения, протеазы, пигменты • Большие продукта. вложения в процесс сертификации ТРАНЗИЕНТНАЯ ЭКСПРЕССИЯ Преимущества: -высокая продуктивность (до 80% ОРБ); -короткие сроки производства; -быстрое масштабирование при экстренном реагировании. Вирус гриппа H5N1 (AIV) и H1N1 – 50 мг/кг антигена наработано в N.benthamiana за 3 недели от выделения вируса; Вирус Эбола - ZMappTM – «коктейль» из трех антигенов БИОРЕАКТОРЫ данные производства полностью соответствуют существующим правилам GMP Для производства биофармацевтиков используются: клетки табака (BY-2), риса, люцерны, моркови Фирма Protalix (Израиль): - создание первого коммерческого продукта – рекомбинантного белка, глюкоцереброзидазы; - линейка новых рекомбинантных белков: альфагалактозидаза, фактор некроза опухоли, улучшенные формы глюкоцереброзидазы. Экспрессионные платформы GMP: клетки табака (BY-2), моркови. Препарат Элелисо - талиглюцераза альфа (Elelyso / taliglucerase alfa) производства Pfizer. Лекарственное средство было одобрено FDA в качестве заместительной терапии болезни Гоше. Совершенствование биореакторов для культивирования клеток РАЗРАБОТАННЫЕ ПЛАТФОРМЫ ЭКСПРЕССИИ НА ОСНОВЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК Платформа Компания Продукты Concert TM Dow AgroSciences Вакцина против болезни Ньюкасл кур ProCellExR Protalix Pfizer Талиглюцеразаальфа Проблемы адаптации растительных систем экспрессии для синтеза рекомбинантных белков: недостаточно высокий выход рекомбинантного белка посттрансляционные модификации 1. Классические подходы повышения выхода рекомбинантных белков в клетках растений 2. Новые современные подходы повышения выхода рекомбинантных белков в клетках растений - технологии геномного редактирования с применением системы CRISPR/Cas9 Методические подходы к повышению продукции рекомбинантных белков в культуре растительных клеток целевой ген Оптимизация экспрессии трансгенов на уровне транскрипции и трансляции Оптимизация культивирования растительных клеток in vitro клетки-продуценты Оптимизация культивирования растительных клеток в биореакторах Оптимизация условий выделения и очистки рекомбинантных белков целевой белок В итоге: Случайная интеграция трансгенов в геном растительной клетки может нивелировать усилия исследователей за счет вариабельности экспрессии трансгена и выходу рекомбинантного белка по Проблемы адаптации растительных систем экспрессии для синтеза рекомбинантных белков: • • • • • внутриклеточная локализация: - цитозоль; - апопласт; - ЭПР; - вакуоль деградация посттрансляционные модификации выделение и очистка недостаточно высокий выход рекомбинантного белка. Внутриклеточная локализация рекомбинантного белка Цитозоль – менее 0.1% ОРБ Сигнальные пептиды: - апопласт; - ЭПР; - вакуоль (литическая и белок-запасающая) Деградация рекомбинантного белка Снижение активности протеолитических ферментов: - нокаутирование генов, кодирующих протеазы; - РНК-интерференция; - ингибиторы протеаз (ко-экспрессия генов, кодирующих ингибиторы протеаз с целевым белком) Выделение и очистка рекомбинантного белка Вторичные соединения: лигнины, фенольные соединения, пигменты и т.д. Широкий спектр собственных белков растения 50 kDa 32 kDa CFP10-ESAT6 –dIFN 16 kDa CFP10-ESAT6 Применение афинных меток: – полигистидиновые метки (poly-His) – металлоафинная хроматография Различия в гликозилировании белков клетками растений и млекопитающих Получение коммерческого препарата связано с дополнительными этапами, включающими ферментативное дегликозилирование Посттрансляционное созревание белка в компартментах растительной клектки Особенности гликозилирования белков растений и млекопитающих клетками Подходы к улучшению профиля гликозилирования (гликоинженерия) 1. Использование сигнальных последовательностей: H/KDEL; 2. Элиминирование растительных гликозилтрансфераз (XylT и FucT): Нокауты FucTA FucTB XylT FucT XylT α(1,3)-фукоза β(1,2)-ксилоза 3. Перенос гена β(1,4)-галактозилтрансферазы человека ВЫХОД РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ОСТАЕТСЯ ВСЕ ЕЩЕ НЕДОСТАТОЧНО ВЫСОКИМ В настоящее время проблема повышения биосинтеза рекомбинантных белков решается за счет: - оптимизации генетических конструкций с целевым геном; - оптимизации условий культивирования растительных клеток; - поиска «благоприятных» событий интеграции целевого гена. мкМ 4-MU/ мкг белка/ мин Активность β-глюкуронидазы у трансгенных растений табака с одной копией гена uidA 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 121.9 121.49 Т0 121.54 121.63 121.71 Т1 121.84 121.94 Предлагается принципиально новый подход: интеграция целевых генов в транскрипционно активные районы генома высших растений (CRISPR/Cas 9)
