пластиды

Лекция 2
Генетическая система пластид
Методы обнаружения ДНК в пластидах (краткая история)
Параметры пластидной ДНК. Нуклеоиды – пластидные ядра
Первичная структура ДНК пластид
Генетическая компетентность пластид
Как формируются ткани растений,
содержащие хлоропласты?
Клетка
меристемы
( 15μm )
Клетка мезофилла
(65 μm)
Превращение меристематической клетки ячменя с
10 пропластидами диаметром 1 μm в мезофильную
клетку листа с 65 хлоропластами диаметром 6-8 μm
пропластида
лейкопласт
хромопласт
хлоропласт
Формирование и взаимопревращение пластид
Пропластида
Этиопласт
Алейропласт
Амилопласт
Элайопласт
Лейкопласт
запасание
Хлоропласт
фотосинтез
Хромопласт
окрашивание
Предыстория…
В конце 18 века итальянец Компаретти:
«пластиды – гранулы растительной клетки».
1846 год Нэгели наблюдал деление пластид у
водоросли нителла
1858 г. Трекул
первый зарисовал пластиды
Термин пластиды появился в конце 19 века
История
обнаружения ДНК в пластидах
Исследование изолированных пластид
1938 – осаждение хлоропластов из листьев шпината,
выделено вещество нуклеопротеиновой природы .
Начало 50-х годов:
в этой фракции были найдены азотистые основания
ДНК и РНК в хлоропластах – 0.1-0.2% от сухого
веса пластид
Гистохимия
Красители: пиронин, метиловый
зеленый, азур, краситель Фельгена
1951-1956
РНК была обнаружена при окраске пиронином
в хромопластах моркови и при окраске азуром
в этиопластах
кукурузы
Окраска на ДНК по Фельгену не всегда давала
положительный результат
Таким образом, гистохимически ДНК не всегда
обнаруживалась, что привело к поиску других,
более чувствительных методов
1957 г
Электронная микроскопия
Рут Сэджер у хламидомонады
увидела рибосомоподобные частицы
диаметром 100-150 А, позднее они
были найдены в хлоропластах высших
растений и у других водорослей
При предварительной обработке
РНКазой частицы не выявлялись
1958 г. Авторадиография
– показано включение в пластиды Н3тимидина (водоросли Acetabularia), через
несколько лет включение Н3- тимидина - в
пластиды табака
Тритий включается только в пластиды из
молодых листьев
1961г. - Совместное применение ЭМ и
АВТР (меченые основания) помогло
показать синтез ДНК в пропластидах
папоротника, а также синтез ДНК+РНК в
этиопластах кукурузы
1961 г.
Рис и Плаут обнаружили в хлоропластах
хламидомонады фибриллы диаметром 2530А, исчезавшие при обработке ДНКазой
и удивительно напоминавшие
бактериальную хромосому.
Подобные нити были найдены позднее и у
других растений (1962)
Электронная микроскопия привела
к обнаружению в пластидах ДНК в виде
фибрилл и РНК в виде
рибосомоподобных гранул
Нуклеоиды хлоропластов – пластидные «ядра»
DAPI-окраска
Фазово-контрастные Cyanidioschyzon merolae – красная водоросль
изображения
Целые клетки
Изолированные пластиды
Субфракция хп-нуклеоидов
ДНК
Аутофлуоресценция
хлорофилла
Blue indicates DNA and red
indicates the chlorophyll
autofluorescence on the
thylakoid. cpn, chloroplast
nucleoids; mtn, mitochondrial
nucleoids; n, nuclei. Bar in (F) =
3 µm for (A) to (F).
По крайней мере у некоторых низших водорослей
ДНК образует нуклеоиды с помощью
гистоноподобных белков
Флуоресцентная
иммунолокализация
белка HC в
нуклеоидах пластид
DAPI-окраска
Одна и та же клетка
у
Особенности организации растительных нуклеоидов
(часть 1)
1. Нуклеоиды – это несколько копий пластидной ДНК, плотно
упакованных в большие нуклеопротеиновые частицы
2. Нуклеоиды можно видеть во флуоресцентном микроскопе после
окрашивания тканей ДНК-интеркалирующими флуоресцентными
красителями, например DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)
3.Число, форма и размеры нуклеоидов варьируют в зависимости от
вида:
-
число нуклеоидов в клетке обычно 5-10 (может быть от 1 до 100)
- у водорослей и высших растений описано 5 вариантов формы
нуклеодиов – от сферической до кольцеобразной;
4. Количество пластомных копий на нуклеоид зависит от вида
растений и от стадии дифференцировки пластид:
- пропластиды часто содержат только один нуклеоид;
- зрелые пластиды могут содержать более 10-12 нуклеоидов;
5. Нуклеоид и, вероятнее всего, каждая отдельная ДНК-копия,
связаны с мембранами пластид: с тилакоидной мембраной и с
внутренней мембраной пластиды;
Кольцевые нуклеоиды пластид
одноклеточной водоросли
Heterosigma akashiwo
токсическая водоросль, распространена
повсеместно в прибрежной зоне
Особенности организации растительных нуклеоидов
(часть 2)
6. Изолированные нуклеоиды сохраняют транскрипционную
активность in vitro: это свидетельствует о том, что
транскрипционный аппарат тесно связан с ДНК пластид;
7. Совершенно неясно, как контролируется число геномных
копий, которые «упаковываются» в один нуклеоид;
8. Обнаружено несколько ДНК-связывающих нуклеоидных
белков, самый изученный Н1р - гистоноподобный
9. Число нуклеоидов на клетку определяется ядерными
генами; признак может мутировать
В норме у Chlamydomonas ~ 7 нуклеоидов
Получены мутанты c резко увеличенным или уменьшенным
числом нуклеоидов:
14-23 нуклеоидов
1 нуклеоид
мутант MOC
(A)
Линейная
молекула
хпДНК.
(B) Два
мономера
хпДНК –
линейный
и
кольцевой
(C) Димер
хпДНК
(180 µm).
(D)
Линейные
молекулы
хпДНК
Хлоропластная ДНК хламидомонады
Каковы молекулы?
Хлоропластные ДНК чаще всего - кольцевые (эвглена, 1971).
Длина
кольца
–
от 36 до 62 микрон
Длина кольца постоянна для каждого вида растений, обычно 44-46 мкм.
Обнаруживаются также линейные молекулы, димеры, сцепленные димеры
У табака и арабидопсиса обнаружены мультимеры: 6-10 геномных копий
Сколько их в клетке ?
Копий пластидной ДНК на органеллу 20-1000
Пластид в клетке несколько сот
Число пластидных геномов на клетку – от 2000 до 50000
В хромопластах геномных копий намного меньше
В онтогенезе число пластидных ДНК копий может меняться в 10-30
раз
Максимальные уровни хлоропластной ДНК в листьях на
свету
% от
тотальной
ДНК
Геномов
на
клетку
Геномов на
пластиду
Горох
12
10000
270
Соя
17
13000
-
Шпинат
23
13000
200
Свекла
11
1900
100
Картофель
8
3000
22
Пшеница
17
50000
900
Растение
Сравнение пластомов некоторых высших растений,
для которых установлена полная нуклеотидная последовательность
LSC
86684
LSC
81095
Табак
155844 п.н.
Маршанция
121024 п.н.
IR
10058
IR 25339
SSC
19813
IR 25339
SSC
18482
LSC
82355
LSC
80592
Кукуруза
140387 п.н.
Рис
134525 п.н.
IR
20799
SSC
12334
IR
20799
LSC
65696
IR 495
Черная сосна
119707 п.н.
SSC
53021
IR
10058
IR 22748
IR 22748
SSC
12356
LSC
19799
IR
22735
Epifagus
virginiana
70028 п.н.
IR 495
IR
22735
SSC
4759
Растение-паразит
(не фотосинтезирует)
Вариации размеров однокопийных районов и
инвертированных повторов хлоропластных
ДНК покрытосеменных: Pelargonium hortorum,
Spinacia oleracea, Coriandrum sativum
кориандр
1976 г. – первая физическая карта
хлоропластного генома кукурузы
Физическая карта дает представление о размере генома и
потенциальной
кодирующей способности, но не о конкретных
генах
Хлоропластная
ДНК
Генетическая карта пластидной ДНК табака -1986 год
Пластидная ДНК сосны
Пластидная ДНК Chlamydomonas
Кольцо показывает гены и
ORFs неизвестной функции.
Наружное кольцо – гены с
известной или
предполагаемой функцией
Пластидный геном
водоросли
Nephroselmis olivacea
содержит больше всего
генов – 127
7 генов хп
ДНКNephroselmis есть
только у этой
водоросли:
это РНК компонент
РНКазы P (rnpB),
ген trnS(cga),
5 белок-кодирующих
генов
из них
гены ycf81 и ftsI
раньше обнаруживались
только у бактерий
Перечень известных генов некоторых секвенированных геномов
Наземные
растения
Фотоcин
тетикиb
Всего
Генетическая
система
Водоросли
Epifagus
Chlorella
Euglena
Odontella
Porphyra
Cyanelle
105~113
40
105
87
129
183
145
59~63
38
61
58
78
98
79
Фотосинтез
Rbc- тилакоиды
NADHдегидрогеназы
Фикобилисомы
Биосинтез и
прочие гены
31~32
11
0
2~8
0
0
0
2
32
0
0
27
0
0
11
2
42
0
0
44
0
10
9
31
41
0
7
18
Гены белков рибосом пластид
30S субъединица (12 генов из 24 – в пластидной ДНК)
rps2 rps3 rps4 rps7 rps8 rps11 rps12i rps14 rps15 rps16i rps18 rps19
50S субъединица (9 генов из 34 – в пластидной ДНК)
rpl2I rpl14 rpl16i rpl20 rpl21 rpl22 rpl23 rpl32 rpl33 rpl36
!
Гены рибосомальных белков пластид собраны в опероны
L23
L2
S19 L22
S3
L16
L14
S8 IF1 L36 S11
α
12 генов пластид собраны
в самый большой хлоропластный кластер ctL23
Только немногие пластидные гены транскрибируются моноцистронно
(например, psba, rbcL), все остальные по полицистронному типу
(как у прокариот)
За 20 лет (1986-2006) полностью секвенировано
58 пластидных геномов:
40 – семенных растений
5 – зеленых водорослей
4 - красных водорослей
9 – других организмов (водоросли, токсоплазмы и пр.)
Генетическая
компетентность
пластид разных
систематических
групп
тРНК гены: 25-35 (17)
рРНК гены: 3-5
Белок-кодирующие
гены: 21-133
Вид
Обший
размер
генома,
т.п.н.
ТРНК
РРНК
гены
гены
Белоккодиру
ющие
гены
Неизвестные ORFs
Marchantia polymorpha
(1986)
121.024
32
4
55
30
Nicotiana tabacum
(1986)
155.844
155.939
30
30
4
5
55
78
30
6
Oryza sativa
(1989)
134.525
30 +
4
56
35
Zea mays
(1995)
140.387
30
4
70
Epifagus virginiana
(1992)
70.028
17 +
4
21
Pinus thunbergii
1994
119.707
32
4
62
Euglena gracilis
(1993)
143.170
27
3
51
Porphyra purpurea
(1995)
191.028
35
3
133
Cyanophora paradoxa
(1995)
135.599
33
3
192
Odontella sinensis
(1995)
119.704
25
3
174
3 псевд
5 псевд
11
более 10
65
РНК-полимераза пластид кодируется четырьмя генами rpo
РНК-полимераза
E. сoli
4 субъединицы
а2ββ'
rpoA
rpoB
rpoC
хлоропласт
N и С- части
β'-субъединицы
кодируются
разными генами
5 субъединиц
а2ββ'β''
rpoA
rpoB
rpoC1
rpoC2
Гены rpo E.coli гибридизуются с ДНК пластид, что помогло
обнаружить и локализовать rpo гены в хпДНК
РДФК (RBC) - основной белок стромы хлоропластов
состоит из одинаковых 8 больших и 8 малых субъединиц.
Ядерный
Белок кодируется двумя геномами:
Хлоропластный
rbcS
rbcL
SS – малая
субъединица
LS – большая
субъединица
12-15 kD
50-55 kD
Гены мембран тилакоидов:
гены ФС1; (5 генов psa)
гены ФС2; (12 генов psb).
ген psbА один из наиболее изученных, так как
связывается с атразином и др. гербицидами.
цитохромный комплекс b/f (5 из 7 кодируются хп
геномом)
У бурых и красных
водорослей оба
гена кодируются
пластидной ДНК
Гены NADHдегидрогеназы
Выявлены участки,
кодирующие посл-ти,
гомологичные белкам
дыхат. цепи митохондрий.
Эти гены активно
транскрибируются, но роль
их в хп пока неясна.
ATФ-синтаза (два комплекса, 5 и 4 субъединицы; хп
геном кодирует по 3 субъединицы каждого комплекса). У хп водорослей эти гены
не найдены!
Итак, за 50 лет:
• построены полные карты нуклеотидных
последовательностей хлоропластной
ДНК для 88 разных в систематическом
отношении групп растений
( год назад – 58!)
• идентифицировано на этих картах
множество генов, относящихся к разным
функциональным группам;
• выяснены особенности группировки
этих генов в кластеры.