Сельскохозяйственная биотехнология как основа повышения урожайности растений и продуктивности животных и птиц
реклама
Сельскохозяйственная биотехнология как основа повышения урожайности растений и продуктивности животных и птиц 1 1 1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир.- 2000. 2. Завертяев Б. П. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота.- Л.: «Агропромиздат», 1989. 3. Готтфрид Брем и др. Экспериментальная генетика в животноводстве.- М.: Россельхозакадемия, 1995. 4. Семенова М.Л. Зачем нужны трансгенные животные //Соровсовский образовательный журнал.- Т. 7.- № 4.2001. 5. Шевелуха В.С. Сельскохозяйственная биотехнология.М.: Высшая школа, 2008. 2 Фитобиотехнология Зообиотехнология Ветеринарная биотехнология Биотехнология в кормовой промышленности Биотехнология переработки с.-х. отходов 3 Фитобиотехнология – использование биотехнологических методов в растениеводстве 4 Этапы развития фитобиотехнологии: I период – 1892-1922 гг. нем. Фехтинг, Рехингер и Габерландт – первые попытки выращивания каллусной ткани; выдвинута теория полярности органов растений и отдельных клеток; теория о тотипотентности растительных клеток. 5 II период – 1922-1939 гг. – Уайт, Готре и др. продемонстрирована способность к неограниченному росту in vitro изолированных растительных клеток; совершенствование питательных сред 6 III период – 1940 – 1960 гг. –изучено значение микро-и макроэлементов для поддержания нормальной ростовой активности растительной ткани; выявлена потребность в витаминах и стимуляторах роста; открыт класс фитогормонов – цитокинины. 7 IV период – 1960 -1975 гг. – предложен метод получения изолированных протопластов путем обработки растительных клеток смесью пектолитических и целлюлолитических ферментов, а так же найдены условия их культивирования, при которых они образуют новую клеточную стенку, делятся и дают начало новым клеточным линиям; разработан метод гибридизации соматических клеток при обработке полиэтиленгликолем (ПЭГ) и введением в них вирусных РНК, клеточных органелл, клеток бактерий; 8 V период – с 1976 г – разработан метод электрослияния изолированных протопластов и методы селекции гибридных клеток, разработан способ переноса генов для двудольных растений на основе Ti- плазмиды Agrobacterium tumefaciens, предложен метод биобаллистической трансформации 9 Направления генетической модификации растений: • Получение с/ х культ ур с более высокой урожайнос тью; • Получение с/ х культ ур , дающих несколько урожаев в год; • Создание сор т ов с/ х культ ур , т оксичных для некот орых видов вредит елей (карт офель, лис тья кот орого содержат прот оксин для колорадского жука); 10 • Создание с/ х культ ур , ус т ойчивых к неблагоприятным климатическим условиям (трансгенные рас т ения, ус т ойчивые к засухе – несу т ген скорпиона); • Создание сорт ов рас т ений, способных синт езировать белки животного происхождения ( т абак, синт езирующий лакт оферрин человека). 11 Этапы получения трансгенных растений: • Выбор гена и его клонирование – определяется необходимостью передачи растению определенного хозяйственнополезного признака (большинство генов выделены из бактериальных геномов, диких видов растений, реже из геномов насекомых или животных); • Подбор генотипа растения-реципиента. В идеале подбирают растения, имеющие только одно отрицательное свойство (слабая устойчивость к засухе) ; 12 • Введение гена и его экспрессия в геноме растения-реципиента. Для введения гена применяют трансформацию с помощью векторов, а также методы прямого переноса генов в геном растительных клеток. • Регенерация трансформированных растительных клеток и отбор трансгенных растений. Зависит от тотипотентности клеток – способность регенерации фертильного растения (способного завязывать семена) из недифференцированных соматических клеток. Тотипотентность наиболее выражена у двудольных растений(картофель, свекла, рапс, томаты, морковь, капуста) , у однодольных (рис, кукуруза, пшеница)- слабее. Отбор модифицированных растительных клеток проводят на селективных средах, содержащих гербициды. 13 Трансформация растений с помощью агробактерий 14 Структура Ti-плазмиды 15 Сигналами, обеспечивающими перенос и стабильную интеграцию генов в ядерную ДНК растений является virобласть (область вирулентности) Tiплазмид. Vir-область состоит из семи локусов: vir-А, vir-B, vir-C, vir-D, vir-E, vir-G, vir-F. В определенной последовательности белковые продукты этих генов приводят к вырезанию Т-ДНК из состава Ti-плазмиды и встраиванию ее в растительный геном. 16 Идеальная векторная система на основе Ti-плазмиды должна включать: • Сигналы, необходимые для переноса и стабильной интеграции в ядерную ДНК растений; • Систему для экспрессии чужеродных генов в растениях (узнаваемый растительными полимеразами промотор); • Маркер, необходимый для селекции трансформированных клеток • Не содержать онкогенов, подавляющих дифференцировку растительных клеток 17 В качестве промотора для экспрессии (функционирования) чужеродных генов в геноме растения наиболее часто используют промотор 35S-РНК вируса мозаики цветной капусты (СаМV), обеспечивающий постоянную сильную экспрессию чужеродного гена, находящегося под его регуляцией, во всех тканях трансгенного растения. 18 В векторе обязательно должны быть предусмотрены гены-маркеры (репортерные гены), на основе которых проводят отбор модифицированных растений. Например LuxA и LuxB – это гены, выделенные из ДНК светлячков, контролирующие синтез люциферазы, которая обеспечивает переход люциферинов из окисленной формы в основную, что обеспечивает свечение модифицированного растения. Наиболее часто в качестве генов маркеров используют гены устойчивости к гербицидам (хлорсульфорону или фосфинотрицину). 19 • Т-сегмент вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в плазмиду E.coli (pBR322), которая способна к многократной саморепликации, что приводит к увеличению числа копий участков Tiплазмиды (клонирование); • В Т-сегмент встраивают определенный ген и снова размножают в E.coli; • Выделяют гибридные плазмиды, а затем вводят в A.tumefaciens, несущие полную Ti-плазмиду. В результате обмена идентичными участками (гомологичная рекомбинация), происходит встраивание сконструированных Т-сегментов в нативные Ti-плазмиды, в результате чего получают Ti-плазмиды со встроенным в Т-сегмент чужеродным геном; • Заражают растения модифицированными агробактериями. Клетки полученных трансгенных растений будут содержать интегрированную Т-ДНК со встроенным чужеродным геном. 20 Метод трансформации растительных клеток путем кокультивации с агробактерией • Применяется для двудольных растений (эффективность до 60%). • В качестве эксплантов для трансформации используются стерильные листовые диски, корешки, семядоли, междоузлия. Экспланты инокулируют жидкой средой, содержащей агробактерию с векторной конструкцией. После 24-48 часов кокультивирования в некоторых клетках происходит встраивание в растительный геном Т-ДНК с чужеродным геном. • Экспланты переносят на среду, содержащую антибиотик (для подавления агробактерий) и гербициды для селективного отбора трансформированных клеток. • Через 2-5 недель на трансформированном экспланте развиваются побеги модифицированных растений. 21 Методы прямого переноса генов (перенос осуществляется в протопласты растительных клеток) • Микроинъекция ДНК – аналогично микроинъекциям в животные клетки (эффективность 10-15%); • Электропорация – на протопласты, находящиеся в растворе, содержащем ДНК-векторы действуют высоковольтными импульсами (напряжение 200-350 В). При этом обратимо образуются поры в мембране, через которые клетки поглощают молекулы ДНК; • Биобаллистическая трансформация - растительные клетки помещают в чашку Петри и выстреливают по ним из вакуумной пушки потоком мельчайших частичек вольфрама, платины или золота (d – 0,4 -1,2 мкм) с напылёнными на них молекулами ДНК. 22 Получение трансгенных растений: а-метод биобаллистики; б-кокультивация с агробактерией 23 Доказательство трансформации растительных клеток Проводят выявлением генов-маркеров (например генов устойчивости к антибиотикам канамицину (nptII) или гигромицину (hptII) и др.) - С использованием ПЦР (полимеразно-цепной реакции) и молекулярного анализа; - На основании блот-гибридизации хромосомной ДНК трансгенного растения с использованием в качестве радиоактивного зонда фрагмента Т-ДНК. 24 Возможные негативные эффекты использования генетически-модифицированного сырья • В настоящее время методы генной инженерии технически несовершенны, исследователи не в состоянии управлять процессом встраивания нового гена и возникающие впоследствии эффекты его проявления; • В результате искусственного добавления чужеродного гена непредвиденно могут образоваться опасные вещества (токсины, аллергены и т.д.); • Не существует совершенно надежных методов проверки полученных растений на безвредность (более 10% серьезных побочных эффектов новых лекарств невозможно выявить, несмотря на тщательные исследования); 25 • Знания о действии на окружающую среду модифицированных организмов недостаточны. Имеется множество возможностей для неконтролируемого распространения потенциально опасных генов, в том числе и передача генов бактериями и вирусами; • Знания о наследственном носителе ДНК – очень неполны. На настоящее время известно о функции лишь трех процентов ДНК. Рискованно манипулировать сложными системами, знания о которых неполны. Обширный опыт в области биологии, экологии и медицины показывает, что модификация организмов может вызвать серьезные непредсказуемые проблемы. 26 Цель зообиотехнологии: 1. Увеличение продуктивности животных 2. Повышение оплодотворяемости животных и воспроизводства стада 3. Улучшение качества животноводческой продукции 4. Получение животных, устойчивых к заболеваниям 27 1. Трансплантация эмбрионов 2. Получение трансгенных животных 3. Клонирование животных 4. Получение химер 28 Трансплантация эмбрионов - это метод биотехнологии, позволяющий ускоренно размножать высокоценных племенных животных 1. Отбор доноров. 2. 3. 4. 5. Суперовуляция. Осеменение коров-доноров. Извлечение и оценка эмбрионов. Кратковременное культивирование и хранение эмбрионов. 6. Пересадка эмбрионов реципиентам. 7. Криоконсервация эмбрионов. 29 Трансгенные животные (Transgenic animals) – это животные, несущие встроенный генно-инженерным способом ген другого организма, способный экспрессировать специфические для этого организма продукты 30 Технология получения трансгенов 1. Микроинъекция чужеродной ДНК в оплодотворенную яйцеклетку – зиготу 2. Метод эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) 31 32 Этапы получения трансгенных животных 33 Доение трансгенной мыши 34 Применение трансгенных животных • • • • • Трансгенные животные – биореакторы Модели наследственных болезней Источник органов для пересадки человеку Получение гормона роста Повышение количества и качества продукции сельскохозяйственных животных • Получение животных, устойчивых к различным заболеваниям 35 это популяция клеток или организмов, произошедших от общего предка путём бесполого размножения, при котором потомок генетически идентичен своему предку это точное воспроизведение того или иного живого объекта в каком-то количестве копий, имеющих идентичный набор генов 36 Cхема получения клонированной овцы Долли 20 37 (мозаичные животные или генетический мозаик) - это искусственно созданные организмы, не известные в природе, состоящие из генетически различных клеточных популяций и происходящие более чем от одной оплодотворенной яйцеклетки. - это продукт объединения двух и более ранних эмбрионов, вследствие чего они обладают сложным комбинированным генотипом. 38 Методика создания химер • выделяют яйцеклетки из доноров с различающимися генотипами; • культивируют эмбрионы на стандартных питательных средах (основа-солевой буфер, ПВК и лактат, глюкоза, альбумин) до стадии 8 бластомеров; • агрегируют морулы (8-кл.) (агрегационный метод) и культивируют in vitro до стадии бластоцисты; • имплантируют химерный эмбрион в матку самкирецепиента 39 Создание аллофенных мышей 2 линии мышей, отличающихся по окраске и характеру волосяного покрова HRS/J – линия, мыши которой несут рецессивный ген hairless (hr ) – обусловливающий полное отсутствие волосяного покрова линия С57BL/6 – черная окраска шерсти 40 Для гомозигот линии HRS/J характерно нарушение формирования волосяного покрова. До 10 дневного возраста развивается нормальный покров, который начинает выпадать, в результате трехнедельные мыши полностью его теряют. На рисунке слева направо показан характер волосяного покрова у 12,15 17 и 21-дневных мышат 41 Гомозигота hr/hr в 4-х недельном возрасте. У человека обнаружен ортолог этого гена (некоторые палестинские племена), он также приводит к отсутствию волосяного покрова и узелковую атрихию (эффекты этого гена у человека начинают проявляться в 7-летнем возрасте), ортологи этого гена найдены и у 42 др. млекопитающих (крысы, обезьяны). При половом скрещивании нормальных и мутантных линий образуется потомство с нормальной шерстью. При получении химер возможны различные варианты распределения волосяного покрова и его окраса: 8-дневные химеры 19-дневные химеры Распределение волосяного покрова зависит от % мутантного компонента у химеры 43 2-месячные химерные мыши. У крайней правой мыши 51% мутантного компонента и наблюдаются четкие чередующиеся полосы с шерстью и без, эти данные указывают, что ген действует в эпидермальных клетках волосяного фолликула. Клоны эпидермальных клеток кожи зародышей в эмбриогенезе мигрируют в латерально-вентральном направлении когерентно, не перемешиваясь друг с другом. В случае, если ген действует в мезодерме, распределение мутантных и нормальных клеток в шерстном покрове будет мозаичным. 44 22 45 Биотехнология в кормовой промышленности Использование различных видов микроорганизмов, в первую очередь, дрожжей, для получения кормового белка, витаминов, кормовых добавок с целью повышения питательной ценности кормов, а также переработка отходов молокоперерабатывающих заводов и мясокомбинатов с целью получения белково-витаминных препаратов и др. 46 Схема получения кормовых дрожжей 47 Целью биотехнологии переработки сельскохозяйственных отходов является не только охрана окружающей среды от загрязнения, но и получение веществ и продуктов, полезных для человека и животных Наиболее перспективные направления: 1. Переработка навоза сельскохозяйственных животных и куриного помета методом анаэробной ферментации с целью получения биогаза и органических удобрений. 2. Переработка отходов растениеводства с целью получения биогумуса. 48
