Номинация: «Перспективный проект» Тема проекта: «Разработка альтернативных моделей in vitro для скрининга антидотов при отравлениях фосфорорганическими пестицидами» Организация, представляющая проект: ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных - ВНИВИ» Руководитель проекта: Хамзина Елена Юрьевна, старший научный сотрудник, кандидат биологических наук Аннотация Вопрос внедрения альтернативных методов, в том числе культуральных, для изучения токсичности и безопасности лекарственных средств в систему доклинических исследований в России остается незавершенным, между тем, в Европе оценка токсичности препаратов in vitro активно используется клиническими во многих испытаниями. сферах биотехнологии Основными мотивами для наравне с внедрения альтернативных методов являются этические соображения, исключающие эксперименты на животных и экономические, предусматривающие снижение материальных затрат на оценку безопасности потенциальных лекарственных средств (Л.В. Коломбет и др., 2008; Г.Т. Айтдинов и др., 2008). Интеграция России в европейские экономические структуры, в частности, предполагаемое вступление в ВТО, потребует принятия аналогичных европейским законодательных актов, ограничивающих использование животных для токсикологических испытаний (А.П. Еськов и др., 2003; Т.П. Денисова, Е.В. Симонова, 2008). Положительными сторонами системы альтернативных методов оценки in vitro являются не только этические соображения, но и экономичность, высокая степень воспроизводимости результатов опытов, вследствие идентичности условий его проведения, отсутствие влияния каких-либо дополнительных факторов, и оперативность в получении информации (Н.Р. Дядищев и др., 1998; Г.Т. Айтдинов и др., 2008; J. Norman-Horward, 2000; R. Clothier et al, 2000). В ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» был синтезирован ряд антидотов для лечения отравлений фосфорорганическими пестицидами, эффективность которых установлена, кроме того была прослежена особенность фармакологических и токсикологических эффектов химических препаратов на биообъектах разного уровня организации, начиная от клеточного (культура клеток) и органно-тканевого (изолированный отрезок тощей кишки кролика) до организменного. На базе Испытательного центра, который является структурной единицей ФЦТРБ-ВНИВИ (функция сертифицирование - пищевой продукции, кормов) или лаборатории культур клеток и гибридомной технологии, возможно формирование подразделения, занимающегося тестированием фармакологических средств на биообъектах различного уровня, включая клеточный. Информация о заявителе Название организации: «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных - ВНИВИ» Адрес юридический (он же фактический): РТ, Казань, Научный городок-2. Адрес электронной почты, страницы в Интернете: vnivi@mail.ru, www.vnivi.ru. Фамилия, имя, отчество руководителя организации, номер телефона, факс: Иванов Аркадий Васильевич. Телефон/факс (843)239-53-33. Направления деятельности организации: - экотоксикологический, радиоэкологический и эпизоотологический мониторинг в регионах РФ; - - разработка и совершенствование средств диагностики, профилактики и лечения животных при токсикозах, радиационном и биологическом поражениях; - разработку комплекса мероприятий по предотвращению поступления в РФ токсических веществ, радионуклидов и возбудителей инфекционных заболеваний; - хранение, поддержание и изучение особо опасных микроорганизмов; - производство и реализацию лекарственных средств; - послевузовская образовательная деятельность; - деятельность в качестве Органа по сертификации продукции. Инновационный потенциал: на базе ФГУ "Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных" образован отдел био- и нанотехнологий с целью расширения спектра перспективных исследований на молекулярном уровне. Исследования в нанометровом диапазоне позволят диагностике, предприятию профилактике и создать лечению уникальные технологии инфекционных по заболеваний. Специалистами ФГУ "ФЦТРБ-ВНИВИ" на сегодняшний день разработаны уникальные технологии и лекарственные препараты, позволяющие вести борьбу с такими заболеваниями как, африканская чума свиней, бешенство, сибирская язва и другие. В настоящее время Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных продолжает совместные научные исследования с учреждениями Сибирского отделения РАСХН по проблеме совершенствования средств и методов мониторинга, диагностических тест-систем и эффективных средств защиты животных от опасных болезней и загрязнения окружающей среды техногенными токсическими веществами и радиоактивными элементами. В 2010 году сотрудники отдела радиобиологии проводили локальный научно-практический эксперимент по использованию радиационных технологий для повышения урожайности сельхозкультур, ускорения их развития, созревания и улучшения качества сырья. Используемые технологии полностью безопасны для обслуживающего персонала, не связаны с введением радиоактивных веществ в почву, в обрабатываемые семена и получаемую продукцию Производственный и трудовой потенциал, в т.ч.: а) среднесписочная численность работающих: 400 человек. б) наличие производственных мощностей: для выполнения НИР и дальнейшей коммерциализации проекта задействованы сотрудники 2 лабораторий, научно - исследовательская деятельность проводится на базе лаборатории культур клеток и гибридомной технологии, обеспечена необходимым оборудованием и расходными материалами. Для выполнения поставленных задач ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» имеет лицензии на: образовательную деятельность (№ 283173 от 7.11.2007 г.); выполнение работ с микроорганизмами и ядами биологического происхождения 2-4 групп патогенности (№77.99.18.001.Л.000223.01.07 от 18.01.2007 г.); деятельность по производству лекарственных средств, предназначенных для животных (№ 00-08-1-000072 от 28.07.08 г.); фармацевтическая деятельность, включающая оптовую и розничную торговлю лекарственными средствами (№ 00-08-2-000071 от 28.07.08 г.); работы с использованием облучательной техники (№ВО-03-205-1435 от 27.09.06 г.) и др. Данные о руководителе проекта. Ф.И.О.: Хамзина Елена Юрьевна. Основное место работы: ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Должность: старший научный сотрудник. Почтовый адрес: г. Казань, ул. Парковая, д.4, кв.7. Электронная почта: lenahamina@yandex.ru Ученая степень: кандидат биологических наук. Перечень важнейших работ: 1.Хамзина, Е.Ю. Определение токсических доз карбофоса и хлорофоса на перевиваемых культурах клеток MDBK и ВНК 21/13-02. Э.М. Зухрабова, Е.Ю. Хамзина, Р.Я. Гильмутдинов, Р.М. Асланов// Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. – 2008. – т. 195. - С. 103-105. 2.Хамзина, Е.Ю. Использование экстрактов из тканей органов плодов коров при культивировании перевиваемых клеток. А.В. Иванов, Э.М. Плотникова, Е.Ю. Хамзина, Ю.М. Кириллова// Ветеринарный врач.- Казань. - 2010.- №2.С.33-37. Современное состояние исследований и разработок в области реализации проекта. Новизна предлагаемого подхода по сравнению с известными. В 1998г в ЕС была принята директива о косметике (76/768/ЕЕС), ограничивающая токсикологические тестирования средств личной гигиены, косметики, бытовых продуктов на животных, если есть альтернативные методы анализа in vitro. В Европе оценка токсичности препаратов in vitro сопоставима по сложности и тщательности с клиническими испытаниями. Широкое количество применение животных, уже имеющихся необходимых тестов для позволило реализации сократить Европейской программы REACH, на 70-80%. В 1998г Малышевой М.В. и Рязановой Р.А. разработана схема тестирования химических веществ на клеточных культурах. Описаны приемы определения нормативов для альтернативных методов, где тестобъектами являются клетки млекопитающих, при токсикологических испытаниях сложных смесей неустановленного химического состава ( ЗАО Фирма “ ВМК-ИНВЕСТ”, Москва, Еськов А.П., Каюмов Р.И., Соколов А.Е. Токсикологические испытания. Альтернативные методы. Токсикологический вестник №5, сентябрь-октябрь 2003 С.25-29, Москва). В России разработана и проходит регистрацию в Росздравнадзоре первая альтернативная методика с использованием пресноводных плоских червей – планарий. Методика основана на прижизненной компьютерной морфометрии процесса регенерации планарий, при которой измеряется величина отрастания регенерирующей головной части тела животного с использованием видеокомпьтерного комплекса, оснащенного оригинальным программным обеспечением (Л.В. Коломбет и др., 2008). В Татарстане клеточные культуры для оценки токсичности веществ, в частности фосфорорганических пестицидов и их антидотов, используют лишь в ФГУ ФЦТРБ г. Казань. Новизна предлагаемого нами подхода заключается в том, что культуры клеток используются для предварительного скрининга препаратов, обладающих потенциальными лечебными свойствами применительно к фосфорорганическим пестицидам. При этом определяется как цитотоксичность нового антидота, так и его терапевтический эффект, проявляющийся при сокультивировании его с пестицидом на клеточном монослое. Если антидот обладает высокой цитотоксичностью или слабыми антидотными свойствами, то вносятся корректировки в его состав. Сущность предлагаемой разработки. Согласно рекомендациям организации экономического сотрудничества и развития, для того чтобы оценить воздействие на организм того или иного вещества, необходимо поставить опыты на 430 животных. Тестирование одного пестицида занимает около двух лет и требует извращенного убийства 10 000 различных животных. Многочисленными и длительными исследованиями ведущих ученых – токсикологов опровергнута очередная ложь об экспериментах на животных организмах как о достоверном, дешевом и единственно возможном способе проверки новых компонентов в пищевой, фармакологической или косметической промышленности (J. Hughes et al, 1996; C. Grillo et al, 1999; B. Chlopkicz, 2001; C. Clemendson et al, 2002). Использование культуральных моделей позволяет сократить сроки биологических испытаний и оценить степень риска отдаленных последствий различных ксенобиотиков (Т.В. Бойко, 1999; С.И. Успенская и др., 1999; О.Б. Серегина, Н.Б. Леонидов, 2000; А. Warshavsky et al, 2001; J. Kialy et al, 2008). Учитывая сельскохозяйственную направленность предприятия, в разрабатываемых тест- системах были использованы перевиваемые линии клеток животных. Все линии были проверены на соответствие требованиям каталога «Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных» и паспортизированы. В опытах для экспериментальной затравки клеточного монослоя использовали фосфорорганические пестициды: карбофос (АДВ 50%) и хлорофос (АДВ 94,7%), а также холинолитики А-2, А-3, А-4, А-5, А-6, А-7, ГС-2, ГС-3, которые были синтезированы в лаборатории химического синтеза отдела токсикологии ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», под руководством д.х.н., профессора Р.Д. Гареева. Из проведенных цитотоксикологических исследований с применением почечных линий перевиваемых культур клеток животных был произведен отбор холинолитиков перспективных для дальнейшего использования в качестве терапевтических средств. Проводимые определения нами исследования положительных позволили терапевтических сократить эффектов, срок оказываемых новыми антидотами, до 3 мес. Следует учесть, что за этот период было протестировано 8 антидотов. Полученные нами данные позволили выбрать лучший антидот, его защитные свойства были подтверждены в ходе последующих экспериментов на животных. В результате сократилось количество лабораторных животных и снизились экономические потери, связанные с их содержанием. Рис. 1 - Контроль, чистая среда без добавления веществ Рис. 2 - Проявление цитотоксического эффекта при внесении в культуральную среду карбофоса в дозе 0,008 мг/мл клеточной суспензии Рис. 3 - Уменьшение цитотоксического эффекта при совместном культивировании карбофоса и антидота А-7 Права на интеллектуальную собственность. Патент на стадии оформления. Рынок сбыта. Вопрос внедрения альтернативных методов, в том числе культуральных, для изучения токсичности и безопасности лекарственных средств в систему доклинических исследований в России остается незавершенным, между тем, в Европе оценка токсичности препаратов in vitro активно используется во многих сферах биотехнологии наравне с клиническими испытаниями. Основными мотивами для внедрения альтернативных методов являются этические соображения, исключающие эксперименты на животных и экономические, предусматривающие снижение материальных затрат на оценку безопасности потенциальных лекарственных средств (Л.В. Коломбет и др., 2008; Г.Т. Айтдинов и др., 2008). Потребители фармацевтические институты, компании, разрабатывающие химические композитные научно-исследовательские материалы для медицины, сельского хозяйства, пищевой промышленности. Порядок коммерциализации результатов разработки. По данной теме защищена одна кандидатская диссертация. В данный момент проводиться исследование цитотоксического влияния нового токсического агента - БИ-58 на культуру клеток НГУК-1. Исследования проводятся силами сотрудников лаборатории культур клеток и лаборатории сильнодействующих и ядовитых веществ. В 2010 г работа стала победителем программы "Участник Молодежного Научно- Инновационного Конкурса" ("У.М.Н.И.К."), проводившегося в г.Казани. После завершения лабораторных исследований планируется запатентовать методы определения токсичности веществ на культурах клеток животных, а затем и вывод на фармацевтический рынок предлагаемых тест - систем. Состояние и источники инвестирования в реализацию проекта. НИР проводится за счет средств бюджета.