МЕТОД ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРОВ ГЛИКОГЕНФОСФОРИЛАЗЫ ... ТЕСТ СИСТЕМЕ IN VITRO О.В. Загребельная, Н.И. Чепляева, А.М. Пятиконнова

МЕТОД ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРОВ ГЛИКОГЕНФОСФОРИЛАЗЫ В
ТЕСТ СИСТЕМЕ IN VITRO
О.В. Загребельная, Н.И. Чепляева, А.М. Пятиконнова
Волгоградский государственный медицинский университет, г. Волгоград
Ингибирование гликогенолиза является одним из перспективных фармакологических
подходов в терапии сахарного диабета типа 2. Ингибиторы гликогенфосфорилазы (ГФ)
снижают распад гликогена и повышенную продукцию глюкозы печенью и
воздействуют на один из основных патогенетических факторов при сахарном диабете.
Снижение активности ГФ значительно ослабляет гипергликемию, но не приводит к
гипогликемии, регулируя, таким образом, гомеостаз глюкозы [1].
Из ингибиторов ГФ, одним из наиболее изученных классов химических веществ
являются производные индолкарбоксамида, к которым относится соединение CP316819 и его аналог CP-91149, они связываются с менее активной b формой ГФ и
препятствуют её переходу в активную конформацию [1, 2]. Поиск новых
высокоактивных ингибиторов ГФ является одним из перспективных направлений в
диабетологии.
Цель исследования адаптировать методы определения активности ГФ для
тестирования новых соединений в условиях in vitro.
Материалы и методы Анализ активности ГФ основан на оценке количества
свободного фосфата, высвобождающегося при синтезе гликогена из глюкозо-1фосфата.
Для оценки ингибиторной активности 100 мкл 50 мМ HEPES буфера с pH 7,2
содержащего 100 мМ хлорид калия, 2,5 мМ хлорид магния, 0,5 мМ глюкозо-1-фосфата
(Sigma,
США),
1
мг/мл
гликогена,
преинкубировали
с
мышечной
гликогенфосфорилазой α кролика (Sigma, США) и исследуемыми соединениями при
30 ̊С 30 минут. После преинкубации количество высвобожденного неорганического
фосфата измеряли через 20 минут после добавления 150 мкл 1 М раствора HCl,
содержащего 10 мг/мл молибдата аммония и 0,38 мг/мл малахитового зеленого.
Развитие окрашивания определяли при 620 нм, используя прибор для считывания
планшетов (ELx800, Bio Tec, США) [3]. В качестве вещества сравнения был выбран
CP316819 (Sigma, США). Для определения ингибирующей концентрации (IC50)
разведения соединении в 14% ДМСО в диапазоне концентрации от 10мМ до 1нМ
добавляли в реакционную смесь, при этом в контрольную смесь без ингибитора
вносили ДМСО в аналогичной концентрации.
Величину ингибирования рассчитывали по следующей формуле: (контроль –
тест/контроль)*100%. Значения IC50 подсчитывали, используя Graphit 4.0.15 (Erithacus
Software, Ltd, UK).
Результаты и обсуждение
CP316819 производное индолкарбоксамида, является селективным ингибитором ГФ и
может применяться в качестве соединения сравнения при тестировании и оценке
эффективности новых веществ in vitro [2]. При исследовании ингибирующей
активности CP316819 выявлено, что зависимость доза – эффект имеет сигмовидный
характер. Величина IC50 для соединения составляет 1,24 мкМ (0,37 – 4,16 мкМ, 95%
C.I) (рис.1).
Рисунок 1. ГФ ингибирующая активность CP316819 в тест-системе in vitro.
Выводы
Таким образом, данный метод оценки активности ГФ может успешно применяться для
поиска и скрининга новых высокоактивных соединений, а CP316819 может быть
соединением сравнения при проведении скрининговых исследований.
Список литературы
1. Wu C., Okar D.A., Kang J. et al. Reduction of hepatic glucose production as a therapeutic
target in the treatment of diabetes. Curr Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord.
2005; 5(1):51-59.
2. Somsák L., Czifrák K., Tóth M. et al. New inhibitors of glycogen phosphorylase as
potential antidiabetic agents. Curr. Med. Chem. 2008; 15(28): 2933-83.
3. Yu L.J., Chen Y., Treadway J.L., Establishment of correlation between in vitro enzyme
binding potency and in vivo pharmacological activity: application to liver glycogen
phosphorylase a inhibitors. J Pharmacol Exp Ther. 2006 Jun;317(3):1230-7.