1.2.5. Использование антигенов поверхностной мембраны

1.2.5. Использование антигенов поверхностной мембраны
клеток крови для иммунофенотипической диагностики
гематологических заболеваний.
Возможности
ИФТ
в
прогнозировании
течения
и
исхода
онкогематологических заболеваний во многом определяются адекватным
набором антител для первичной диагностики [44, 189]. На основании
информации, накопленной за двадцать лет применения
ИФТ в
диагностике онкогематологических заболеваний, была сделана попытка
разделить используемые маркеры на необходимые и полезные для
диагностики конкретных нозологий [58]. Необходимыми названы
антитела, достаточные для начальной оценки случаев, но не позволяющие
полноценно описать клетки, вовлеченные в патологический процесс, и
установить иммунофенотипический диагноз (табл.12).
Для
характеристики
В-клеточного
лимфопролиферативного
заболевания рекомендовано использовать не менее 12-16 антител, что
позволит
выявить,
но
не
полностью
охарактеризовать
другие
патологические субпопуляции, которые могут существовать параллельно
с В-клеточной опухолью. Для получения аналогичной по качеству
характеристики
происхождения
лимфопролиферативного
информативными
Следовательно, первичная
заболевания
названы
диагностическая
Т-клеточного
другие
панель
маркеры.
ХЛПЗ
должна
включать не менее 16 маркеров, при этом полностью проигнорирован
вопрос диагностически значимой коэкспрессии антигенов.
Таблица 12
Информативность маркеров при диагностике онкогематологических
заболеваний
Заболевание
Маркеры
необходимые
полезные
дополнительные
2
3
4
1
ХЛПЗ
CD5, CD19,
CD30, CD34, TdT,
Kappa, Lambda,
bcl-2, CD1a, CD71
CD3, CD20,
чаще применяются
CD23, CD10,
при работе с
CD45
тканью
В-линия
CD22, FMC7,
CD11c, CD103,
CD38, CD25,
CD79а,b
Т-линия
CD4, CD7, CD2,
CD56, CD16,
TCRalpha/beta,
TCRgamma/delta
1
ОЛ
2
3
4
CD10,
CD19,
CD14,
CD13,
CD33,
CD56, w65, Tdt,
CD34,
CD7,
CD14,
CD3,
cyCD3
HLADR
В-линия
CD20,
CD22,
CD79a,b, µ-цепь
Т-линия
CD1a, CD2, CD4,
CD5, CD8
Миелоряд
CD11b,
CD15,
CD64,
CD117,
MPO
Эритроряд
CD36,
GPhA
CD71.
CD16,
Мегакариоцитарный
CD41, CD61
ряд
Для диагностики ОЛ в качестве необходимых названо также 9
антител, но других специфичностей, оценка экспрессии которых
достаточна для дифференцировки В, Т, миелоидного, эритроидного и
мегакариоцитарного направлений. Однако, при подобном подходе
оказывается
собственно
полностью
лейкозных
проигнорированным
бластов,
и
способа
вопрос
выявления
оценки
экспрессии
дополнительных и полезных маркеров. Можно предположить, что при
диагностике первичных больных, с очень высоким содержанием
трансформированных клеток в образце (75% и более) не возникнет
трудностей при описании суммарного фенотипа опухолевых клеток. Но
совершенно очевидно, что такой подход не приложим для описания
малоклеточных популяций, а, значит, неинформативен при длительном
ведении пациента, для диагностики минимальной остаточной болезни.
Достижение
полного
согласия
при
обсуждении
состава
минимальной панели антител проблематично, но для адекватной оценки
случаев острого лейкоза количество маркеров не может быть меньше 2024. С другой стороны, очевидно, что названные необходимыми маркеры
во многих случаях могут оказаться недостаточными даже для постановки
диагноза согласно современным требованиям. Требования же таковы:
надо не только выявить опухолевую популяцию, но и полноценно описать
ее, сопоставляя по возможности с неизмененными клетками, если таковые
присутствуют в образце. Проблема минимальных потерь антител
решается использованием двухшаговой стратегии (126, 196, 54, 66),
согласно которой первый шаг (CD19, CD79a, CD3, CD7, CD13, CD33,
MPO) позволяет определить линейную принадлежность лейкозных клеток
в большинстве случаев. Выбор антител второго шага для определения
уровня
дифференцировки,
прогностических
характеристик
и
аберрантности фенотипа для мониторинга минимальной остаточной
болезни определяется по результатам первого шага. Подробности выбора
не прописаны. Существует два варианта острых лейкозов, трудных для
определения их линейной принадлежности: ОЛЛ с коэкспрессией
миелоидных антигенов и ОМЛ с коэкспрессией лимфоидных антигенов.
Решение этого вопроса зависит от метода анализа, типов и количества
используемых антител, от состояния образца. Окончательное заключение
по определению линейной принадлежности может отсутствовать в
заключении.
Удивительное
разнообразие
иммунофенотипического
и
молекулярного профиля злокачественных гематологических заболеваний
привело к появлению самых разных оценок информационной значимости
ИФТ
лейкозных
бластов.
Некоторые
авторы
считают,
что
иммунофенотипические характеристики никак не влияют на исход
заболевания. Другие исследователи полагают, что лейкозы надо делить
только на ОМЛ и Т и В линейные ОЛЛ. Несмотря на некоторую
одиозность этих точек зрения, им практически мало что можно
противопоставить, так как терапевтические подходы опираются только на
самые
основные
иммунофенотипические
признаки;
эффективность
протоколов трудно отделить от других связанных прогностических
факторов, крупномасштабные клинические исследования не учитывают
или не оценивают тонкости различия фенотипов отдельных случаев.
Надо отметить, что определенная доля вариабельности данных,
получаемых в разных центрах, связана с качеством и типом реагентов,
используемых в разных лабораториях. Неоднозначность критериев
интерпретации данных ИТФ в сочетании с гетерогенностью самих ОЛ
могут приводить к противоположным результатам разных исследований и
делать неясной роль иммунофенотипического анализа в ведении
(диагностике) лейкозов [49]. На наш взгляд, существует диссонанс между
современными классификациями, в большинстве основанными на
принципе один- маркер (признак) – один диагноз, накоплением случаев с
нетипичным фенотипическим профилем трансформированных клеток,
техническими возможностями ПЦ и недостаточной ассоциированностью
программной
химиотерапии
с
информацией
о
биологических
особенностях опухолевых клеток. Предлагаемое большинством автором
перечисление
информативных
маркеров
не
означает,
что
ИФТ
предназначено только для определения линейной принадлежности
лейкозных бластов (что само по себе не так просто и требует соблюдения
определенных правил) и что не должны быть приложены усилия к
определению прогностического значения опухолевого фенотипа. ИФТ
должно
быть
проведено
всем
первичным
больным,
так
как
технологические успехи в области реагентов и приборов делают
результаты исследований все более надежными. Клональная эволюция во
время или после ХТ может приводить к исчезновению одного или более
маркеров, выявлявшихся при установлении диагноза (53, 113, 139, 183,
184, 34, 231, 240, 153). Биологическое и клиническое значение таких
изменений неясно. С практической точки зрения, они могут быть
причиной
ложно-негативных
иммунологических
методов
результатов
для
при
использовании
мониторирования
для
минимальной
остаточной болезни [67]. Минимальная остаточная болезнь (МОБ), по
сути, это заболевание, неопределяемое морфологическими методами. ПЦ
является более чувствительным по сравнению со световой микроскопией
методом
разделения
лейкемических
гемопоэтических
предшественников
ассоциированный
фенотип
использовании
может
многоцветного
клеток
[182,
быть
(двух-,
от
65,
245].
выявлен
трех-,
нормальных
Лейкоз-
только
при
четырехцветного
окрашивания), что дает чувствительность 1 на 10000 клеток. Для
диагностики МОБ Т-клеточного лейкоза сочетают антиTdt и Т-клеточные
маркеры (cyCD3, CD3, CD5). При слабой или негативной экспрессии Tdt
он может быть заменен на CD34. Белки CD19 и HLADR, редко
выявляемые при Т-ОЛЛ в норме экспрессируются нормальными Tdtпозитивными клетками нормального костного мозга, что дополнительно
усилит возможности выявления лейкозных бластов в костном мозге.
Выявление МОБ В-клеточного происхождения требует более
широкой панели антител, хотя для идентификации незрелых В-клеток
достаточно выявления одновременной экспрессии CD19, CD10 и CD34
или Tdt. Количественная разница в уровне экспрессии этих маркеров
может быть использована как диагностический признак в 30-50% случаев
[66]. Аналогично могут оказаться полезны CD38, CD45, CD22.Лейкозные
бласты
при
ОМЛ
характеризуются
разнообразными
вариантами
аберрантности фенотипа [35, 190, 153, 180, 79, 137] и, следовательно, их
труднее
всего
выявлять
при
диагностике
МОБ.
Гетерогенность
иммунофенотипа при ОМЛ связана также с тем, что при диагностике
часто выявляется несколько вариантов экспрессии маркеров, т.е.
несколько субклонов. Диагностика МОБ иммунологическими методами
должна быть включена в протоколы ведения больных по окончании
индукции ремиссии, после консолидации, в конце терапии, но для
пациентов с положительными результатами выявления МОБ желательно
проведение тестирования во время ремиссии.