4.2.1.4. Определение уровня дифференцировки

4.2.1.4. Определение уровня дифференцировки основной массы
бластов.
Определение уровня дифференцировки основной массы бластов
включало в себя
• выявление якорных маркеров CD34, Tdt, HLA-DR и
• определение
степени
зрелости
по
маркерам
линейной
принадлежности.
При выявлении маркеров ранних предшественников основное
внимание было уделено уровню экспрессии CD34, так как его наличие на
лейкозных бластах
• может быть оценено (определено) при невысоком содержании
патологических клеток в образце;
• не требует дополнительной пробоподготовки с использованием
пермеабилизации мембраны (в отличие от Tdt).
В связи с этим оценка экспрессии CD34 была проведена для всех
образцов биологического материала с предположительным диагнозом
ОЛ, а оценка экспрессии Tdt осуществлена для образцов костного мозга
детей до 15 лет и для взрослых пациентов с высоким уровнем бластоза.
Традиционно уровнем позитивности бластной популяции по тому или
иному маркеру является наличие его экспрессии не менее, чем на 20%
клеток. Для CD34 многими группами гематологов этот порог снижен до
10%. Нами приведены данные представленности этого маркера для ОЛЛ
детского возраста при 10% и 20% пороге позитивности. Для каждой
нозологической группы приведены относительное (%) и абсолютное
количество случаев, позитивных или негативных по CD34, а также
усредненные данные по относительному содержанию CD34-позитивных
бластов (табл.49).
Анализ данных, представленных в табл.49, показывает, что
основная масса вошедших в исследование случаев позитивна по CD34,
вне зависимиости от выбранного порога позитивности. Другими словами,
экспрессия этого маркера в большинстве случаев гомогенна, представлена
на всех клетках бластной популяции.
Таблица 49
Экспрессия CD34 как один из показателей уровня
дифференцировки бластов при ОЛ
CD34+
Нозологическая группа
n
CD34%
n
%
CD34+
M±σ
позитивных
случаев
ОЛЛ
до15
лет,
n=15,
порог
13
86,7
2
13,3
50,9±24,9
n=15,
порог
11
73,3
1
26,7
63,7±20,1
ОЛЛ после 15 лет, n=14, порог
10
66,7
5
33,3
45,6±28,0
20
69
9
31
52,6±26,0
ОМЛ, n=18
13
72,2
4
22,2
48,9±23,9
Всего ОЛ, n=47
33
70,2
13
27,7
52,2±24,9
позитивности 10%
ОЛЛ
до15
лет,
позитивности 20%
позитивности 10%
ОЛЛ, n=29, порог позитивности
10%
Анализ данных, представленных в табл.49, показывает, что
основная масса вошедших в исследование случаев позитивна по CD34,
вне зависимиости от выбранного порога позитивности. Другими словами,
экспрессия этого маркера в большинстве случаев гомогенна, представлена
на всех клетках бластной популяции.
Оценка
уровня
экспрессии
Tdt
для
больных
ОМЛ
(предварительный диагноз установлен по наличию экспрессии линейно
комиттированных якорных маркеров миелоидного ряда) проведена
только трем пациентам (16,7 % от когорты больных ОМЛ):
больной 33 лет с высоким уровнем бластоза (87%) и
гиперлейкоцитозом
(228х109/л).
По
параметрам
светорассеяния
и
экспрессии CD45 неизмененные лимфоциты не выявляены, бласты по
размерам занимают промежуточное положение между лимфоцитами и
моноцитами,
обладают
низким
уровнем
экспрессии
CD45
(СИФ=90,0±19,0). Основная масса бластов позитивна по линейным
маркерам CD13 и CD33, что по сумме первых двух шагов интерпретации
данных ИФТ позволило предположить диагноз ОМЛ. Для определения
степени незрелости клеток была оценена экспрессия CD34, Tdt, а также
CD117 как маркера предшественников миелоряда. Бласты оказались
высокопозитивны по CD34 и CD117 и негативны по Tdt, что позволило
исключить такие варианты ОМЛ как М0 и все варианты, более
дифференцированные, чем М3. Последующий анализ выявил полное
отсутствие HLADR на бластных клетках, что при ОМЛ патогномонично
для варианта М3. Таким образом, все опухолевые клетки обладают
суммарным фенотипом Tdt-CD117+CD13+CD33+CD34+CD45dim+HLADR-,
что соответствует только промиелоцитарному лейкозу (М3 вариант
ОМЛ);
больной 29 лет с высоким уровнем бластоза (72%) костного
мозга и периферической крови (90%). По параметрам светорассеяния и
экспрессии CD45 неизмененные лимфоциты не выявлены, бласты по
размерам занимают промежуточное положение между лимфоцитами и
моноцитами, по уровню экспрессии CD45 формируют два кластера
(СИФ=68,7±18,9 и 110,7±9,1). Основная масса бластов позитивна по
линейным маркерам CD13 и CD33, что по сумме первых двух шагов
интерпретации данных ИФТ позволило предположить диагноз ОМЛ. Для
определения степени незрелости клеток была оценена экспрессия CD34,
Tdt, а также CD117 как маркера предшественников миелоряда. 40%
бластов оказались позитивны по CD34, а также по CD2. Все
трансформированные клетки негативны по CD117 и Tdt, что позволило
исключить такие варианты ОМЛ как М0-М2. Последующий анализ
выявил полное отсутствие HLADR на бластных клетках, что при ОМЛ
патогномонично для варианта М3. Выявлена экспрессия CD33 и
отсутствие экспрессии таких маркеров как CD14, CD15, CD65. Таким
образом, суммарный фенотип опухолевых клеток Tdt-CD117-CD13+CD14CD15-CD33+CD45dim+HLADR-, часть бластов также позитивна по CD34 и
CD2,
что
популяции.
является
свидетельством
Установлен
вариант
неоднородности
М3
ОМЛ,
в
опухолевой
последующем
подтвержденный цитогенетически выявлением t(15;17). Неоднородность
опухолевой популяции расценена как неблагоприятный прогностический
признак. Несмотря на проведение адекватной агрессивной ХТ, больной
скончался при явлениях кровоточивости.
больная 40 лет, заболела остро: на фоне симптомов острого
респираторного заболевания и назначения амоксициллина развилось
тяжелое маточное кровотечение. При обследовании выявлена анемия
(гемоглобин 65 г/л), тромбоцитопения (тромбоциты 12х109/л), бласты в
периферической крови - 15%, в миелограмме - 33%, гепатоспленомегалия
(по данным УЗИ). По параметрам светорассеяния и экспрессии CD45
неизмененные лимфоциты составляли не более 20% клеточного состава
костного мозга, зрелые гранулоциты отсутствовали. СИФ экспрессии
CD45 на бластах 100,6±14,2 усл.ед.; по уровню гранулярности кластер
бластов соответствовал нижней трети оси SSC. При анализе линейно-
коммиттированных маркеров клетки позитивны только по CD13, что
позволило установить миелоидное происхождение опухолевых бластов.
Выявлена более интенсивная экспрессия Tdt по сравнению с экспрессией
CD34, что практически не встречается при более или менее высокой
дифференцировке бластов и позволило предположить варианты М0-М2.
Последующий анализ показал высокую экспрессию HLADR на бластных
клетках, однако никакие другие маркеры миелоидного и лимфоидного
направлений дифференцировки выявлены не были. Таким образом,
суммарный
фенотип
бластов
Tdthigh+CD13+CD34+CD45+HLADr+
свидетельствовал о низком уровне дифференцировки клеток и на
основании экспрессии только одного маркера миелоряда позволял
идентифицировать случай как М0 вариант ОМЛ. При проведении ХТ по
схеме «7+3» ответа получено не было, больная скончалась при явлениях
острой сердечной недостаточности через 20 дней после установления
диагноза.
В группе пациентов, основная масса бластов которых была
позитивна по CD19, и которым в соответствии с этим предварительно был
диагностирован В-ОЛЛ, бласты были также позитивны по Tdt и CD34 в
17 случаях:
• количество Tdt+ бластов превышало количество CD34+ клеток у
всех больных, по совокупности клинико-лабораторных данных
отнесенных к группе высокого риска (n=6);
• экспрессия Tdt выявлена на значительно меньшем количестве
бластов по сравнению с экспрессией CD34+ у больных, которые по
совокупности клинико-лабораторных данных были отнесены к
группе низкого риска (n=3);
• при монотонной коэкспрессии маркеров Tdt и CD34 на всех
лейкозных клетках пациенты могли принадлежать к любой группе
риска (n=8), т.е. корреляция (взаимозависимость) не выявлена.
Сопоставление относительного количества Tdt и CD34-позитивных
клеток при Т-линейной принадлежности бластов проведено не было в
связи с малочисленностью группы.
В результате последовательного проведения анализа данных ИФТ
выявлено, что бласты двух третей больных ОЛ позитивны по одному (или
нескольким) ранним маркерам предшественникам, что свидетельствует о
превалировании
случаев
низкого
исследованной нами группе больных.
уровня
дифференцировки
в