Слайд 1 - Medcenter.kz

Научный центр педиатрии и детской хирургии,
г.Алматы
Кустова Е.А., к.б.н.
 Трансплантация гемопоэтических стволовых
клеток - быстро развивающаяся технология,
которая позволяет добиться успеха при лечении
злокачественных заболеваниях крови (лейкемии,
лимфомы, миелома) и других гематологических
заболеваний (первичный иммунодефицит,
апластическая анемия, миелодисплазия).
Основные источники ГСК
Кровь
Периферическая(0,05
%)
Продукт
лейкафереза
костный мозг(1,5%)
Пуповинная(0,3%)
Виды трансплантации ГСК
• Аллогенная трансплантация костного мозга-
•
•
•
•
•
источником является костный мозг родственного или
неродственного донора;
Аллогенная трансплантация периферических
стволовых клеток крови, когда используются ПСКК
родственного или неродственного донора;
Аллогенная трансплантация ГСК пуповинной крови,
совместимой с реципиентом по HLA-системе;
Аутологичная ТГСК костного мозга, когда источником
ГСК является костный мозг;
Аутологичная ПСКК;
Сингенная ТКМ, при которой донором является
гомозиготный близнец.
Современная теория кроветворения
Современная теория кроветворения базируется
на унитарной теории А.А. Максимова (1918),
согласно которой все клетки крови происходят
из единой родоначальной клетки,
морфологически напоминающей лимфоцит.
Подтверждение этой гипотезы было получено
лишь в 60-е годы при введении смертельно
облученным мышам донорского костного
мозга. Клетки, способные восстанавливать
гемопоэз после облучения или токсических
воздействий, носят название «стволовых
клеток»
Современная теория
кроветворения
Нормальное
кроветворение
поликлональное, т. е.
осуществляется
одновременно
многими клонами.
Клетки гемопоэза
условно подразделены
на 5-6 отделов,
границы между
которыми весьма
размыты, а между
отделами содержится
много переходных,
промежуточных форм.
Дифференцировка клеток
гемопоэза
 I отдел – тотипотентная
эмбриональная стволовая
клетка (ЭСК), находится на
самом верху иерархической
лестницы
 II отдел - пул поли - или
мультипотентных
стволовых кроветворных
клеток (СКК) - способность
к дифференцировке во все
без исключения линии
гемопоэза.
III отдел - СКК
дифференцируются в
полиолигопотентные
коммитированные
клетки-предшественники
Дифференцировка клеток гемопоэза
Клетки
IV
отдела
монопотентные
коммитированные
предшественники
являются родоначальными
для
одного
ростка
гемопоэза:
V отдел морфологически
распознаваемых клеток включает:
 зрелые клетки всех 8 клеточных
линий, начиная с бластов,
большинство из которых имеют
характерные
морфоцитохимические
особенности.
Стволовые кроветворные
клетки
Одним из основных методов изучения СКК
является метод колониеобразования in vivo
или in vitro, поэтому иначе СКК называют
“колониеобразующими единицами” (КОЕ).
 КОЕ-Г для гранулоцитарного,
 КОЕ-М - для моноцитарно-макрофагального,
 КОЕ-Э и БОЕ-Э (бурстобразующая единица) предшественники эритроидных клеток,
 КОЕ-Мгкц - предшественники мегакариоцитов
Проточная цитофлюориметрия
Проточная цитометрия
является современной
технологией быстрого
оптического измерения
параметров клетки, ее
органелл и происходящих в
ней процессов.
В основе ПЦ лежит проведение фотометрических и
флюоресцентных измерений отдельных клеток,
пересекающих одна за другой вместе с потоком
жидкости лазерный луч монохроматического света.
Стволовые кроветворные клетки
Гетерогенность пула СКК и степень их дифференцировки
устанавливается на основе экспрессии ряда
дифференцировочных мембранных антигенов.
Среди СКК выделены:
 примитивные мультипотентные предшественники
(CD34+Thyl+CD133)
 более дифференцированные предшественники,
характеризующиеся экспрессией антигена
гистосовместимости II класса (HLA-DR), CD38.
Истинные СКК не экспрессируют линейно специфические
маркеры и дают рост всем линиям гемопоэтических клеток.
Количество СКК в костном мозге - около 0,01%, а вместе с
клетками-предшественниками - 0,05%.
Молекула CD34
•CD34- антиген клеток ранних
этапов дифференцировки:
•Ф-ция неизвестна (Адгезия?)
•Транспортный белок, одна
полипептидная цепь 105-120
кДА
•Высоко гликозилирована
•Длинная, муциноподобная
структура
•3 типа эпитопов, разл-ся по
чувствительности к
ферментам
•Ген 1q32
Общелейкоцитарный антиген CD45
Общелейкоцитарный антиген CD45
 Тирозиновая протеинфосфатаза C рецепторного
типа Protein tyrosine phosphatase, receptor type, C;
PTPRC) — фермент
 кодируется у человека геном PTPRC
 дифференцировочный антиген CD45
 LCA (Leukocyte common antigen, общий
лейкоцитарный антиген)
 регулирует рост, дифференцировку, митотический
цикл и злокачественное перерождение клетки.






Сочетание антител для характеристики клетокпредшественников:
- CD14/CD34/CD45 для определения региона для
количественного учета ГСК
- CD71/CD34/CD45 для выявления клетокпредшественников, эритроидных клеток, клеток,
имеющих рецептор к трансферрину
- CD41/CD34/CD45 для выявления предшественников и
мегакариоцитов
- CD38/CD34/HLA-DR для оценки экспрессии молекул
HLA II класса на клетках- предшественниках
- CD5/CD34/CD19 и CD7/CD34/CD2 для выявления Т, В,
НК–клеток и их предшественников
- СD15/СD34/СD56 и CD33/CD34/CD4 для оценки
субпопуляций предшественников миелоидного ряда
 Целью данного исследования явился
сравнительный анализ определения стволовых
гемопоэтических клеток в процессе афереза.
 Всего было проведено 11 ауто- и 3
аллотрансплантации.
 Аллотрансплантацию проводили детям с острым
лимфобластным лейкозом, острым
миелобластным лейкозом, миелодиспластическим
синдромом;
 Аутотрансплантацию – детям с лимфомой
Ходжкина, нейробластомой, ретинобластомой.
Аферез осуществляется на аппарате Cobe
Spectra
Пробоподготовка для выявления ГСК
 Двухплатформенный метод по




принципу окрашивание-лизисотмывка.
Клетки (не менее 2-3х106/мл) были
окрашены в течение 15 минут CD45
FITC, CD34 PE, (Becton Dickinson,
USA) из набора Stem Cell
Enumeration Kit.
Для лизирования эритроцитов был
внесен раствор Ammonium Chloride
Lysing Solution, подготовленный
согласно рекомендациям
производителя.
Далее был добавлен 7-AAD (7амино-актиномицин D) для
окрашивания нежизнеспособных
клеток.
Клетки были анализированы на
проточном цитометре FacsCanto II
в течение часа.
 CD45- общелейкоцитарный антиген,
ГСК-CD45 dim
Определение CD34+ клеток
 Низкое FSC
 Низкое / промежуточное SSC
 Dim CD45
7-AAD- 7 амино-актиномицин D, жизнеспособность
клеток
 Нежиснеспособные клетки могут быть выявлены и
исключены из анализа с помощью окраски 7-AAD,
жизнеспособные клетки остаются неокрашенными
(негативными)
 Разработанный алгоритм получения и анализа данных




включал:
- определение содержания ядросодержащих событий,
- идентификация кластера CD45+ событий на
проточном цитофлюориметре,
- при помощи специальной функции цитометра из
анализа исключаются нежизнеспособные клетки 7AAD+,
- гейтирование кластера CD45+CD34+ позитивных
событий по параметрам светорассеяния
осуществляется на основе живых ЯСК
(ядросодержащих клеток).
Гистограмма показателей
светорассеяния CD45/SSC.
Гистограмма с добавлением
внутриклеточного красителя 7-AAD для
определения нежизнеспособных клеток
Гистограмма CD45+CD34+7-AAD- для выявления
относительного количества ГСК
 Абсолютное количество стволовых
гемопоэтических клеток рассчитывалось на
основании показателей относительного
количества CD45+CD34+ клеток, объема
полученного образца и массы тела реципиента.
 Многолетний опыт
трансплантаций костного
мозга и периферической
крови за рубежом
свидетельствует о том, что
для успешного
восстановления
кроветворения необходимо
собрать не менее 3х106/кг
CD34+ стволовых
гемопоэтических клеток. Это
является ключевым
моментом для исхода
трансплантации
 На этапе замораживания с целью сохранения
выделенных в ходе трансплантации ГСК к ним
добавлялся клеточный криопротектор
диметилсульфокскида (ДМСО). Это позволяет
максимально сохранить жизнеспособность
ядросодержащих клеток (ЯСК). Далее, пакеты с
ГСК поместили в специальные дюары для
хранения при t=-180°С. После размораживания
образцы снова подвергались проверке на
количество ГСК перед введением пациенту.
Содержание ГСК в периферической крови
с ДМСО
Аутологич V, мл ЯСКх109/ %CD34 CD34+х106
/кг
ная ТГСК,
л
+
с ДМСО
M±m
60,0 79,0±18,6 2,8±0,3 6,1±1,0
Min
8
1,0
1,4
max
227
5,3
12,2
Содержание ГСК в костном
мозге
Аллогенн V, мл ЯСКх109/л %CD34+ CD34+х106/
ая ТГСК, с
кг
ДМСО
M±m
60,0
33,3±22
2,7±0,7 4,7±2,5
Min
19,7
1,9
2,9
max
58,8
3,2
5,4
 Таким образом, включение протокола определения
количества CD34+ клеток в процедуру ауто и
аллотрансплантации позволяет оценить
количественное содержание малоклеточной
популяции ГСК в продукте афереза.
 Общепринятое количество CD34+ клеток для
успешной трансплантации считается не менее
3х106/кг CD34+, следовательно, в ходе
проведения процедур ауто и
аллотрансплантации стволовых
гемопоэтических клеток у детей было получено
достаточное количество CD34+ клеток. Для
успешной трансплантации главное –
содержание CD34 в аферезном продукте, но не
содержание ЯСК, то есть предиктором качества
запланированного афереза является сбор
достаточного количества ГСК с целью
дальнейшего введения их пациентам.
 У всех пациентов после ГСК получен хороший
клинический эффект. Однако, количество
стволовых клеток, инфузируемых пациенту при
ауто и аллотрансплантации не является
единственным условием, определяющим
успешность трансплантации. Большое
значение имеют режим кондиционирования,
возраст пациента, степень совместимости по
системе HLA донора и реципиента и ряд других
факторов.
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!