Набор реагентов для определения белковых - Эко

КлиниТест-ЭФ
ЭКО
СЕРВИС
ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО
РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ СЫВОРОТКИ КРОВИ НА МЕМБРАНАХ ИЗ АЦЕТАТЦЕЛЛЮЛОЗЫ (КАТ.¹ B-41324)
Утверждена приказом Росздравнадзора от 26.11.2007 г. № 4230-Пр/07
РУ № ФСР 2007/01209 от 26.11.2007 г.
НАЗНАЧЕНИЕ
Íàáîð ïðåäíàçíà÷åí äëÿ ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîãî ðàçäåëåíèÿ
áåëêîâ ñûâîðîòêè êðîâè íà ìåìáðàíàõ èç àöåòàòöåëëþëîçû ñ
ïîñëåäóþùèì äåíñèòîìåòðè÷åñêèì îïðåäåëåíèåì áåëêîâûõ
ôðàêöèé â êëèíèêî-äèàãíîñòè÷åñêèõ ëàáîðàòîðèÿõ è â
íàó÷íî-èññëåäîâàòåëüñêîé ïðàêòèêå. Êîíòðîëüíàÿ ñûâîðîòêà
ïðåäíàçíà÷åíà äëÿ êîíòðîëÿ êà÷åñòâà ðàçäåëåíèÿ áåëêîâûõ
ôðàêöèé ñûâîðîòêè êðîâè íà ìåìáðàíàõ èç àöåòàòöåëëþëîçû.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Ïðèíöèï ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîãî ðàçäåëåíèÿ áåëêîâ
îñíîâàí íà ðàçëè÷íîé ñêîðîñòè äâèæåíèÿ ìîëåêóë áåëêîâ
ñûâîðîòêè êðîâè â ïîñòîÿííîì ýëåêòðè÷åñêîì ïîëå
îïðåäåë¸ííîé íàïðÿæåííîñòè. Ðàçäåë¸ííûå áåëêîâûå ôðàêöèè îêðàøèâàþòñÿ êðàñèòåëåì. После денситометрического
сканирования окрашенных фореграмм получают гистограмму
распределения белковых фракций. Площадь под пиком белковой фракции пропорциональна содержанию этой фракции
в сыворотке крови.
СОСТАВ НАБОРА
Реагент 1 (Р1). Áóôåðíûé ðàñòâîð, êîíöåíòðàò......... 200 ìë
Реагент 2 (Р2). Êðàñèòåëü Ïóíöîâûé Ñ..................... 250 ìë
Реагент 3 (Р3). Êîíòðîëüíàÿ ñûâîðîòêà, ëèîôèëèçàт... 1 ôë.
Реагент 4 (Р4). Ðàñòâîðèòåëü..................................... 2 ìë
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ РЕАГЕНТЫ
(в комплект поставки не входят)
Óêñóñíàÿ êèñëîòà.
АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
Ñûâîðîòêà êðîâè, ñâîáîäíàÿ îò ãåìîëèçà, ëèïåìèè è íå
æåëòóøíàÿ.
Áåëêîâûå ôðàêöèè ñûâîðîòêè êðîâè ñòàáèëüíû â ïëîòíî
çàêðûòîé ïðîáèðêå ïðè 18-25°Ñ â òå÷åíèå 8 ÷àñîâ, ïðè 2-8°Ñ
– â òå÷åíèå 3 äíåé, ïðè -20°Ñ – â òå÷åíèå 1 ìåñÿöà [1].
ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ
Ïðèáîð äëÿ ýëåêòðîôîðåçà íà ìåìáðàíàõ èç àöåòàòöåëëþëîçû,
ìåìáðàíû èç àöåòàòöåëëþëîçû, äåíñèòîìåòð èëè ñêàíåð.
ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА
1.1. Приготовление буферного раствора
Áóôåðíûé ðàñòâîð ñëåäóåò ãîòîâèòü çàðàíåå. Ãîòîâûé
ðàñòâîð äîëæåí áûòü âûäåðæàí íå ìåíåå ñóòîê äî
ïðèìåíåíèÿ.
Êîíöåíòðàò áóôåðíîãî ðàñòâîðà ðàçâåñòè äèñòèëëèðîâàííîé
âîäîé â 5 ðàç, готовый раствор имеет рН 8,6-8,8. Õðàíèòü
ãîòîâûé áóôåðíûé ðàñòâîð ñëåäóåò â õîëîäèëüíèêå è
çàëèâàòü â êàìåðó äëÿ ýëåêòðîôîðåçà õîëîäíûì. Áóôåðíûé
ðàñòâîð ñòàáèëåí íå ìåíåå 3 ìåñÿöåâ ïðè õðàíåíèè ïðè 2-8°Ñ.
1.2. Приготовление контрольной сыворотки
Îñòîðîæíî âñêðûòü ôëàêîí, äîáàâèòü â íåãî точно 2,0 ìë
ðàñòâîðèòåëÿ. Çàêóïîðèòü ôëàêîí ïðîáêîé è îñòîðîæíî ïåðåìåøàòü, èçáåãàÿ ïåíîîáðàçîâàíèÿ. Äàòü ïîñòîÿòü â òå÷åíèå
30 ìèíóò, íåñêîëüêî ðàç ïåðåìåøèâàÿ. Èñïîëüçîâàòü òîëüêî
ïîñëå ïîëíîãî ðàñòâîðåíèÿ ëèîôèëèçàòà. Ðàçâåä¸ííóþ
1
ñûâîðîòêó ìîæíî õðàíèòü â ïëîòíî çàêðûòîì ôëàêîíå ïðè
òåìïåðàòóðå 2-80Ñ – 3 ñóòîê, ïðè -200Ñ – 1 ìåñÿö, ïðè -700Ñ
– íåîïðåäåë¸ííî äîëãîå âðåìÿ.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА, КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
1. Проведение электрофореза
1.1. Ñóõèå ìåìáðàíû îñòîðîæíî çàìî÷èòü â áóôåðå äëÿ ýëåêòðîôîðåçà, èçáåãàÿ áûñòðîãî èõ ïîãðóæåíèÿ è îáðàçîâàíèÿ
ïóçûðåé íà ïîâåðõíîñòè. Âûäåðæàòü 10 ìèíóò. Ñìî÷åííûå
ìåìáðàíû àêêóðàòíî ïðîìîêíóòü ìåæäó ëèñòàìè ïëîòíîé
ôèëüòðîâàëüíîé áóìàãè, íå äîïóñêàÿ èõ âûñûõàíèÿ (ïðè
âûñûõàíèè íà ìåìáðàíå ïîÿâëÿþòñÿ áåëûå ïÿòíà).
1.2. Ñ ïîìîùüþ àïïëèêàòîðà íàíåñòè àíàëèçèðóåìûå
îáðàçöû ñûâîðîòêè êðîâè èëè êîíòðîëüíóþ ñûâîðîòêó íà
ìåìáðàíó. Ìåìáðàíó ïîìåñòèòü â ýëåêòðîôîðåòè÷åñêóþ
êàìåðó è ïîäêëþ÷èòü òîê. Êîíêðåòíûå óñëîâèÿ ïðîâåäåíèÿ
ýëåêòðîôîðåçà (íàïðÿæåíèå, время фореза и др.) çàâèñÿò îò
êîíñòðóêöèè ïðèìåíÿåìîé àïïàðàòóðû.
2. Обработка электрофореграммы
2.1. Ïîñëå îòêëþ÷åíèÿ òîêà ìåìáðàíó îñòîðîæíî ïåðåíåñòè
â ðàñòâîð êðàñèòåëÿ Ïóíöîâûé Ñ íà 5-10 ìèíóò, çàòåì поместить â 5-7% ðàñòâîð óêñóñíîé êèñëîòû (íàáîð «ÊëèíèÒåñò-ÝÔ
Ïл) и, меняя раствор уксусной кислоты, отмыть мембрану äî
îòáåëèâàíèÿ ôîíà.
Äëÿ ïîëó÷åíèÿ õîðîøåé ôîðåãðàììû при использовании
мембраны «Владипор» на плёночной основе ñëåäóåò èçáåãàòü
äåôîðìàöèé ìåìáðàíû, ïîýòîìó ëó÷øå íå ïåðåìåùàòü
ìåìáðàíó, à îñòîðîæíî ìåíÿòü îáðàáàòûâàþùèå ðåàãåíòû.
2.2. Ýëåêòðîôîðåãðàììó промерить íà äåíñèòîìåòðå ïðè
äëèíå âîëíû 540 íì èëè îáðàáîòàòü ñ ïîìîùüþ ïðîãðàììû
àíàëèçà ýëåêòðîôîðåãðàìì, ïîñòàâëÿåìîé èçãîòîâèòåëÿìè
ïðèáîðîâ äëÿ ýëåêòðîôîðåçà.
2.3. Ïðè íåîáõîäèìîñòè ìåìáðàíó ìîæíî ñäåëàòü ïðîçðà÷íîé,
ïîãðóæàÿ å¸ â îñâåòëÿþùèé ðàñòâîð (íàáîð «ÊëèíèÒåñò-ÝÔ
Îл).
ПРОВЕДЕНИЕ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Êîíòðîëüíóþ ñûâîðîòêó ñëåäóåò ïðèìåíÿòü â òåõ æå óñëîâèÿõ,
ñ òåìè æå ðåàãåíòàìè è îáîðóäîâàíèåì, ÷òî è àíàëèçèðóåìûå
îáðàçöû.
1. Ãèñòîãðàììà ðàñïðåäåëåíèÿ ôðàêöèé êîíòðîëüíîé
ñûâîðîòêè äîëæíà ñîîòâåòñòâîâàòü ãèñòîãðàììå, ïðèâåä¸ííîé
â íàñòîÿùåé èíñòðóêöèè. Çíà÷åíèÿ áåëêîâûõ ôðàêöèé
äîëæíû óêëàäûâàòüñÿ â äèàïàçîí àòòåñòîâàííûõ çíà÷åíèé.
2. Åñëè âíåøíèé âèä ãèñòîãðàììû ðàñïðåäåëåíèÿ ôðàêöèé
êîíòðîëüíîé ñûâîðîòêè ñîîòâåòñòâóåò ïðèâåä¸ííîìó â
èíñòðóêöèè, íî çíà÷åíèÿ ñîäåðæàíèÿ áåëêîâûõ ôðàêöèé íå
óêëàäûâàþòñÿ â èíòåðâàëû äîïóñòèìûõ çíà÷åíèé, ýòî ìîæåò
áûòü âûçâàíî ñëåäóþùèìè ïðè÷èíàìè:
- èçáûòî÷íîå êîëè÷åñòâî íàíåñåííîé ñûâîðîòêè (ôîðåãðàììà
ïåðåãðóæåíà, âèäíû âûñîêèå ôîíîâûå çíà÷åíèÿ áåëêà,
ìèíèìóìû íà ôîðåãðàììå âûñîêèå, ïèêè ðàñïîëîæåíû
áëèçêî äðóã ê äðóãó);
НПЦ «ЭКО-СЕРВИС» Тел.(812)70-210-44, 450-67-79, (921)77-525-88 www.ecoservice-spb.ru
КлиниТест-ЭФ
- íåäîñòàòî÷íîå êîëè÷åñòâî íàíåñåííîé ñûâîðîòêè (ôîðåãðàììà áëåäíàÿ, ïèêè áåëêîâûõ ôðàêöèé íåâûñîêèå,
íåðîâíûå);
3. Åñëè âíåøíèé âèä ãèñòîãðàììû ðàñïðåäåëåíèÿ ôðàêöèé
êîíòðîëüíîé ñûâîðîòêè íå ñîîòâåòñòâóåò ïðèâåäåííîìó â
èíñòðóêöèè, ïðè÷èíîé ìîæåò áûòü:
- íåïðàâèëüíûé ðåæèì ýëåêòðîôîðåçà;
- «âûðàáîòàííîñòü» áóôåðà, î ÷¸ì ñâèäåòåëüñòâóþò
ñîêðàùåíèå äëèíû ðàçãîííîé äîðîæêè, «íàëîæåíèå»
áåëêîâûõ ôðàêöèé äðóã íà äðóãà ïðè îáû÷íûõ çíà÷åíèÿõ
òîêà, íàïðÿæåíèÿ, âðåìåíè ýëåêòðîôîðåçà;
- íàðóøåíèå óñëîâèé è ñðîêîâ õðàíåíèÿ êîíòðîëüíîé
ñûâîðîòêè.
АТТЕСТАТ
НОРМАЛЬНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
ПРИМЕР ГИСТОГРАММЫ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ
ФРАКЦИЙ КОНТРОЛЬНОЙ СЫВОРОТКИ
Àëüáóìèí
46,9-61,4%
Ãëîáóëèíû
àëüôà 1
2,2-4,2%
àëüôà 2
7,9-10,9%
áåòà
10,2-18,3%
ãàììà
17,6-25,4%
Ïðèìå÷àíèå: Ïðèâåäåíû íîðìàëüíûå çíà÷åíèÿ ñîãëàñíî
Пðèêàçó Ìèíçäðàâà ÑÑÑÐ N 1175 îò 21.11.1979 «Оá óíèôèêàöèè
êëèíè÷åñêèõ ëàáîðàòîðíûõ ìåòîäîâ èññëåäîâàíèÿ».
Ñåðèÿ ¹ Ñîäåðæàíèå, %
Ñðåäíåå çíà÷åíèå*
Ãîäåí äî
Äèàïàçîí
Àëüáóìèí
α1−ãëîáóëèí α2−ãëîáóëèí β−ãëîáóëèí γ−ãëîáóëèí 56,3-68,7
2,7-4,5
7,3-11,9
9,1-14,8
9,4-15,4
62,5
3,6 9,6 11,9
12,4 * Çíà÷åíèÿ êîíöåíòðàöèé ïðèâåäåíû â êà÷åñòâå ïðèìåðà.
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
Íàáîð íåîáõîäèìî õðàíèòü ïðè òåìïåðàòóðå 2-8°Ñ â óïàêîâêå
ïðåäïðèÿòèÿ-èçãîòîâèòåëÿ â òå÷åíèå âñåãî ñðîêà ãîäíîñòè
(18 ìåñÿöåâ).
ЛИТЕРАТУРА
1. Îáåñïå÷åíèå êà÷åñòâà ëàáîðàòîðíûõ èññëåäîâàíèé.
Ïðåàíàëèòè÷åñêèé ýòàï. Ïîä ðåä. Â.Â. Ìåíüøèêîâà, Ì., 1999,
«Ëàáèíôîðì», ñ. 138-139.
2
НПЦ «ЭКО-СЕРВИС» Тел.(812)70-210-44, 450-67-79, (921)77-525-88 www.ecoservice-spb.ru