РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ TRICHOMONAS VAGINALIS НА ОСНОВЕ ТЕХНОЛОГИИ НАСБА В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ Рыжих П.Г., Гущин А.Е., Шипулин Г.А. ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, г. Москва, Россия Введение Trichomonas vaginalis играет важную роль в развитии воспалительных заболеваний урогенитального тракта мужчин и женщин. Клинические симптомы трихомонадной инфекции довольно часто стерты и не специфичны, что делает необходимым применение лабораторных методов диагностики. На сегодняшний день культуральный метод диагностики трихомониаза, является «золотым стандартом» - высокочувствительным и высокоспецифичным. Но его существенными минусами являются длительность исполнения (от 2-х до 7-ми суток), высокие требования к качеству питательных сред и условиям транспортировки клинического материала. Более быстрый и недорогой метод микроскопии окрашенного мазка наиболее популярен среди методов лабораторной диагностики трихомонадной инфекции в Российской Федерации. Однако высокая субъективность и низкая чувствительность микроскопии при бессимптомной инфекции существенно перевешивают плюсы метода. С появлением методов амплификации нуклеиновых кислот, наиболее известный из которых – ПЦР, появились новые возможности для диагностики T.vaginalis. Данные методы становятся инструментами выбора в диагностике многих инфекций благодаря высокой чувствительности и специфичности. Помимо ПЦР – метода амплификации ДНК, все больше внимания стали привлекать методы амплификации РНК, к которым относится реакция транскрипционной амплификации НАСБА (NASBA – Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) (BioMerieux). Использование в качестве мишени РНК дает целый ряд преимуществ перед ПЦР. Во-первых, количество рибосом в одной клетке содержится от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч, в зависимости от фазы жизненного цикла микроорганизма. Во-вторых, в то время как ДНК – достаточно стабильный материал и обнаружение ДНК еще не означает наличие жизнеспособных микроорганизмов, РНК – наоборот крайне нестабильный материал и достаточно быстро деградирует при гибели и разрушении клеток микроорганизмов. Это дает возможность не только более правильно судить о наличии текущей инфекции, но и более точно и надежно оценивать результаты проведенного лечения. В-третьих, поскольку, метод ПЦР является наиболее чувствительным и специфичным методом для диагностики T.vaginalis по сравнению с бактериоскопией и культуральным посевом, то НАСБА может использоваться в качестве референсного метода для подтверждения результатов ПЦР. Целью нашей работы стала разработка и апробация набора реагентов для диагностики T.vaginalis на основе технологии НАСБА в реальном времени. Материалы и методы В работе был использован «Базовый набор «Nuclisens», который включает в себя комплект реагентов для экстракции РНК из клинического материала и комплект реагентов для проведения амплификации (солевые компоненты, дНТФ, комплекс ферментов в виде лиофилизированной сферы с AMV- обратной транскриптазой, Т7 РНК-полимеразой, РНКазойН и необходимые для их растворения компоненты). Нами были разработаны реагенты, специфичные к мишени. Были выбраны праймеры и флуоресцентно-меченый зонд для специфического участка 18S рРНК T.vaginalis на основе информации международного банка генетической информации GenBank; получены рекомбинантные количественно охарактеризованные препараты внутреннего контрольного образца (ВКО) и положительного контрольного образца (ПКО), а также флуоресцентно-меченый зонд к ВКО. Реакцию NASBA с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени проводили с использованием прибора «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия). В рамках апробации разработанного набора реагентов проводили сравнение с зарегистрированным набором реагентов на основе ПЦР «АмплиСенс Trichomonas vaginalis-FL» (№ ФСР 2009/06556 от 31 декабря 2009 г.) производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии согласно инструкции производителя на чистой культуре T.vaginalis, которую получали с помощью диагностической среды «Vagicult» («Orion Diahnostica», Финляндия), согласно инструкции производителя. Кроме того было проведено исследование на клиническом материале – соскобного отделяемого урогенитального тракта мужчин и женщин. Результаты В результате проведенной работы по оптимизации условий анализа был разработан набор реагентов «АмплиСенс Trichomonas vaginalis-РИБОТЕСТ» на основе технологии НАСБА в реальном времени. С использованием рекомбинантного препарата РНК ПКО было установлено, что предел детекции реакции амплификации набора составил 50-100 копий РНК. Сравнение пределов детекции двух технологий – ПЦР и НАСБА проводилось на чистой культуре T.vaginalis, полученной из клинического материала. Для этого из исходного образца культуры готовили серию 10-кратных разведений, из которых выделяли нуклеиновые кислоты и проводили амплификацию разработанным набором для НАСБА в сравнении с ПЦР тест-системой «АмплиСенс Trichomonas vaginalis-FL», использующей праймеры к фрагменту ДНК повторов в геноме трихомонад. Каждое разведение тестировалось в трех повторах. Исследования показали как минимум стократное превышение предела детекции НАСБА по сравнению с ПЦР (см. таблицу 1) на трех образцах культуры, полученных от трех разных пациентов в разные временные периоды. Таблица 1. Сравнение пределов детекции методов ПЦР и НАСБА на 10х разведениях культуры T.vaginalis Разведения Культура 2 Культура 3 ПЦР* NASBA ПЦР* NASBA ПЦР* NASBA -1 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 -2 10 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 10-3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 -4 3 из 3 3 из 3 2 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 -5 1 из 3 3 из 3 0 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 -6 0 из 3 3 из 3 0 из 3 1 из 3 0 из 3 3 из 3 -7 0 из 3 1 из 3 0 из 3 0 из 3 1 из 3 3 из 3 -8 0 из 3 0 из 3 0 из 3 0 из 3 0 из 3 0 из 3 10 10 10 10 10 10 * Культура 1 «АмплиСенс Trichomonas vaginalis-FL» Расчеты показали, что указанный предел детекции обеспечивает аналитическую чувствительность ПЦР позволяющую определять возбудитель, в концентрации 5х102 клеток T.vaginalis на мл. С учетом полученных результатов методом НАСБА можно обнаруживать возбудитель при концентрации как минимум в 10-100 раз меньше, т.е. до 550 клеток в мл. Апробация набора реагентов «Амплисенс Trichomonas vaginalis-РИБОТЕСТ» на основе НАСБА в реальном времени была проведена на клиническом материале (соскобах из уретры и цервикального канала) полученном от 154 пациентов, которые были разделены на 2 группы. У пациентов первой группы (n=54) трихомонадная инфекция была установлена на основании ПЦР-исследования с помощью набора реагентов «Амплисенс Trichomonas vaginalis-FL». РНК Trichomonas vaginalis была обнаружена с помощью разработанного набора реагентов в 54 образцах из 54. Вторая группа пациентов (n=100) выступала в качестве контрольной. У пациентов данной группы результаты ПЦР на T.vaginalis были отрицательными. РНК T.vaginalis также не была обнаружена методом НАСБА ни в одном из образцов контрольной группы. Заключение Впервые был разработан набор реагентов для выявления T.vaginalis в клиническом материале на основе технологии НАСБА в реальном времени - «Амплисенс Trichomonas vaginalis-РИБОТЕСТ». Предел детекции данного набора на чистой культуре в 100 раз выше по сравнению с ПЦР. Диагностическая чувствительность двух молекулярнобиологических методов на исследованном клиническом материале совпадала. Разработанный набор реагентов может использоваться для лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза. На данный набор получено регистрационное удостоверение (№ ФСР 2010/07305 от 22 апреля 2010 г) разрешающее его использование в клинической лабораторной практике.