Изучение ультраструктурной организации вирулентных форм

WWW.MEDLINE.RU ТОМ 8, МИКРОБИОЛОГИЯ, МАЙ 2007
Дата поступления: 18.04.2007.
Изучение ультраструктурной организации вирулентных форм Trichomonas vaginalis
Раздольская Н.В., Гаврилова О.В., Теличко И.Н., Иванов А.М., Криворучко А.Б.
Биологический
научно-исследовательский
институт
Санкт-Петербургского
государственного университета; Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, СанктПетербург
Введение
Trichomonas vaginalis является гетеротрофным паразитическим жгутиконосцем; в
современной системе протист [1] это простейшее принадлежит к типу Polymastigota,
классу
Parabasalea,
отряду
Trichomonadida,
семейству
Trichomonadidae,
роду
Trichomonas. Трихомонады характеризуются наличием четырех передних и одним задним
жгутиком, сложным кариомастигонтом, включающем уникальные для типа в целом
структуры - косту (исчерченный фибриллярный тяж), пельту (серповидная лента
микротрубочек) и
аксостиль (сократимый тяж, проходящий через центральную ось
клетки). Митохондрии у трихомонад отсутствуют, энергетические функции выполняют
гидрогеносомы - органеллы, лишенные ДНК и цитохромов.
Trichomonas vaginalis вызывает воспалительное заболевание урогенитального тракта
человека
различной
тяжести
–
мочеполовой
трихомониаз.
Инфекция
широко
регистрируется во всех регионах, уровень заболеваемости трихомониазом в России
составляет 261 случай на 100 000 населения ежегодно [5]. Вирулентные формы
трихомонад до сих пор являются трудно культивируемыми, жизненный цикл в человеке
не изучен, в клиническом материале обнаруживаются различные морфотипы паразита [2].
Биологическое значение полиморфизма клеток T. vaginalis не определено.
Основной и типичной цитоморфологической формой урогенитальной трихомонады
является грушевидная, активно подвижная с вращательными и поступательными
движениями клетки, с характерной ундулирующей мембраной, с четырьмя свободными
жгутиками на переднем конце. При микроскопии клинического материала достаточно
часто выявляются неподвижные округлые клетки трихомонад. Округлый морфотип часто
ассоциирован с хронической формой трихомониаза, чаще у мужчин, чем у женщин [2]. До
сих
пор
не
изучена
ультраструктурная
организация
T.
vaginalis
округлой
морфологической формы.
Целью работы являлось выявление полиморфизма T. vaginalis, выделенных методом
культуральной диагностики от пациентов с разными формами заболевания, изучение их
ультраструктуры.
283
WWW.MEDLINE.RU ТОМ 8, МИКРОБИОЛОГИЯ, МАЙ 2007
Дата поступления: 18.04.2007.
Материалы и методы
Для диагностики мочеполового трихомониаза использовалась световая микроскопия
нативного препарата и культуральный метод. В основе культурального метода
исследования
лежал
посев
клинического
материала
пациентов
в
селективную
питательную среду (объем 1 мл), культивирование при температуре 370С, в герметичном
объеме в течение 3-х суток и последующая микроскопия полученного осадка методом
“раздавленная капля” с применением фазового контраста. По данным литературы
питательная среда Даймонд [10] является оптимальной селективной средой для выявления
вирулентных форм трихомонад, именно эта среда использовалась в работе.
Состав среды: глюкоза 5,5г, мальтоза 6,0г, казитон 15г, дрожжевой экстракт 12,0г,
хлористый натрий 2,5г, тиогликолят натрия 0,5г, солянокислый цистеин 0,5г, агар-агар
0,75г, аскорбиновая кислота 0,24г, лошадиная сыворотка 120 мл, бензилпенициллин 1 000
000ЕД/мл, гентамицин 80 мкг/мл, флуконазол 32 мкг/мл.
Светооптические наблюдения проводились на полифункциональном микроскопе
Leica DMXRA, центра коллективного пользования ХРОМАС Биологического НИИ
СПбГУ.
Было обследовано 776 клинических образцов, полученных от женщин с инфекцией
урогенитального тракта неясной этиологии. Урогенитальные трихомонады были
выявлены микроскопически и культуральным методом в 65 случаях; причем в 56 случаях
наблюдались грушевидные, а у 9 пациентов - округлые формы. В каждом случае
обнаруживали только один из морфотипов.
Для электронно-микроскопического исследования использовали трехсуточную
накопительную культуру вирулентных форм трихомонад. Материал предварительно
смешивали с равным объемом прогретого до 370С 3%-ного глутаральдегида, через 10 мин
отделенный центрифугированием осадок заливали прогретым 3% глутаровым альдегидом
в 0,1М какодилатном буфере (рН 7,2). Время фиксации - 4 часа при 370С, через два часа
проводили замену фиксатора на новую порцию. Клетки трихомонад 3-х кратно
промывали 0,1М какодилатным буфером (рН 7,2) и дофиксировали смесью 1% OsO4, 5мМ
CaCl2, 0,4% K3[Fe(CN)6] в 0,1М какодилатном буфере при комнатной температуре в
течение 2-х часов. Обезвоживали в этиловом спирту возрастающей концентрации, 100%
ацетоне и заключали в смесь смол (Spurr, Sigma). Ультратонкие срезы клеток готовили на
ультрамикротоме “Reichert-Jung” (Австрия), контрастировали 1% уранил-ацетатом и
цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе JEM-100M при ускоряющем
напряжении 70кВ.
284
WWW.MEDLINE.RU ТОМ 8, МИКРОБИОЛОГИЯ, МАЙ 2007
Дата поступления: 18.04.2007.
Результаты и обсуждения
При клиническом обследовании пациентов были выделены два морфотипа
вирулентных форм T. vaginalis. Грушевидные формы в среднем размером 10-20 мкм, от
переднего конца клетки отходят четыре жгутика, достигающие 2\3 длины клетки,
отчетливо
выражены
колебательные
движения
ундулирующей
мембраны,
ядро
удлиненной формы расположено в передней дистальной зоне клетки, немногочисленные
включения (гидрогеносомы) сконцентрированы в проксимальной околоядерной области.
Размер округлой формы несколько меньше, составляет 10-12 мкм, на переднем конце
находятся пять свободных жгутиков, достигающих 1\2 длины клетки, но клетка
неподвижна, ундулирующая мембрана не наблюдается, округлое ядро расположено в
передней
части,
цитоплазма
выглядит
гранулированной,
с
многочисленными
включениями, различного размера, расположенными по всему объему клетки (таблица 1).
Электронно-микроскопическое изучение ультраструктурной организации двух
морфологических форм T. vaginalis показало что, и округлая, и грушевидная формы
окружены только унитарной цитоплазматической мембраной, гликопротеиновый слой не
выявляется, дополнительные оболочки отсутствуют.
Неподвижные округлые формы отмечены у трихомонад из кишечника грызунов и
амфибий [4]. Они рассматриваются как покоящиеся стадии - псевдоцисты, устойчивые к
недостатку влаги, температурным колебаниям. Псевдоцисты лишены свободных жгутиков
и покрыты утолщенной оболочкой. Округлые формы урогенитальных трихомонад по
морфологии существенно отличаются от покоящихся стадий других парабазалий.
У округлых и у грушевидных форм ядро содержит постоянно конденсированные
хромосомы и единственное ядрышко, но его трудно различить среди конденсированного
хроматина, не связанного с хромосомами. Нуклеоплазма у грушевидных форм
гомогенная, у округлых гетерогенная по плотности. Поровые комплексы встречаются на
срезах редко у обоих морфотипов. Следует отметить, что форма ядра используется для
дифференцировки видов трихомонад. T. vaginalis обладает удлиненным ядром и этим
отличается от обладающих округлым ядром T. hominis, обитателя кишечного тракта
человека и животных [12]. По-видимому, этот признак нельзя считать надежным,
поскольку наблюдается варьирование ядерной морфологии у разных морфотипов одного
вида.
Таблица 1
Сравнительная характеристика грушевидных и округлых форм T. vaginalis
при электронно-микроскопическом исследовании
285
WWW.MEDLINE.RU ТОМ 8, МИКРОБИОЛОГИЯ, МАЙ 2007
Дата поступления: 18.04.2007.
Проявление признака у
морфологических форм T. vaginalis
Признак
Грушевидная
Округлая
Конденсация хромосом
наблюдается
наблюдается
Зона околоядерного
эндоплазматического
ретикулума
присутствует
отсутствует
состоит из нескольких
диктиосом
типичные диктиосомы
отсутствуют
равномерное,
собраны в полисомы
неравномерное,
собраны в агрегаты
присутствует
отсутствует
4 кинетосомы
параллельно друг другу,
1- под углом
5 кинетосом параллельно
друг другу
присутствует
отсутствует
Пельта
отчетливо выражена
частично
редуцирована
Коста
присутствует
присутствует
плотный гомогенный
матрикс
частичная деградация
матрикса
Аппарат Гольджи
Расположение рибосом
Ундулирующая мембрана
Расположение
кинетосом жгутиков
Аксостиль
Содержимое
гидрогеносом
Ядро окружено типичной двухслойной оболочкой. У грушевидных форм в
околоядерной области наблюдается система дополнительных эндоплазматических
мембран. Цистерны шероховатого эндоплазматического ретикулума (ЭР) огибают ядро на
расстоянии от оболочки. Рибосомы, организованные в полисомы, расположены на
внешней стороне цистерн. Между ЭР и ядерной мембраной наблюдаются отдельные
везикулы и скопления рибосом. Околоядерная ЭР со всех сторон охватывает ядро и дает
286
WWW.MEDLINE.RU ТОМ 8, МИКРОБИОЛОГИЯ, МАЙ 2007
Дата поступления: 18.04.2007.
выросты и разветвления в цитоплазму. Можно предположить, что разветвленная область
ЭР взаимодействует с цис-зоной аппарата Гольджи.
Околоядерная ЭР развита у T. vaginalis в большей степени, чем у других видов
трихомонад. Во многих опубликованных работах [3] можно видеть эту систему на
представленных микрофотографиях, однако ее значение не обсуждается. У округлых
форм ЭР в околоядерной области отсутствует.
Аппарат Гольджи грушевидных форм имеет сложное строение: состоит из двух
диктиосом с сильно уплощенными цистернами [6]. Диктиосомы расположены возле ядра,
но не связаны с ним напрямую. Диктиосомы соединены с базальными телами жгутиков
фибриллярным парабазальным тяжем, который не сохраняется при химической фиксации
препаратов [6]. Косвенным признаком транс-области аппарата Гольджи могут служить
многочисленные округлые везикулы. В накопительной культуре вирулентных форм
трихомонад типичные диктиосомы присутствуют достаточно редко. В цитоплазме
грушевидной формы имеются стопки уплощенных мембранных цистерн. У трихомонад
аппарат Гольджи проходит сложный цикл деления – “гольджикинезис”, включающий
слияние цистерн и редукцию диктиосом [7, 14]. Этот процесс происходит в интерфазе.
Очевидно, кажущееся отсутствие диктиосом у грушевидных форм связано с этапом
“гольджикинезиса”. У округлых форм также не отмечено типичных диктиосом и
уплощенных цистерн. В околоядерной области наблюдается скопление различных по
форме и по плотности везикул.
Рибосомы грушевидных форм многочисленны, локализованы во всех областях
клетки. В области ядра, ЭР, вблизи парабазального аппарата, базальных тел жгутиков,
аксостилярного комплекса и различных включений они организованы в полисомы,
преимущественно на мембранах ЭПС. Упорядоченность в расположении рибосом
совершенно не свойственна округлым формам. В цитоплазме рибосомы распределены
неравномерно, в отдельных областях они собираются в агрегированные кластеры, а
некоторые зоны цитоплазмы свободные от рибосом. Следует отметить, что у округлых
форм происходит частичная редукция системы внутренних мембран, увеличивается
вакуолизация клеток. Отсутствие полисом и перераспределение рибосом может быть
связано с редукцией ЭПС.
Грушевидные формы обладают выраженной ундулирующей мембраной - вырост
цитоплазматической
мембраны,
укрепленный
цитоскелетными
фибриллярными
элементами. Внутри ундулирующей мембраны проходит маргинальная ламелла. У
округлых форм ундулирующая мембрана и ее цитоскелет не обнаружены.
287
WWW.MEDLINE.RU ТОМ 8, МИКРОБИОЛОГИЯ, МАЙ 2007
Дата поступления: 18.04.2007.
Жгутиковый аппарат T. vaginalis организован достаточно сложно. У грушевидных
форм 4 кинетосомы располагаются параллельно на переднем конце клетки. Кинетосома
возвратного жгутика располагается под углом. Нумерация кинетосом осуществляется в
зависимости от отходящих от них корешковых структур [12]. От кинетосомы 1 отходит
пучок микротрубочек пельты. Пельта - высокоупорядоченная лента микротрубочек
серповидной формы, расположенная на переднем конце клетки [1]. От кинетосомы 2
отходит коста, исчерченный фибриллярный корешок, поддерживающий ундулирующую
мембрану [12] и сигмовидная фибрилла. Дополнительные фибриллярные корешки отходят
от базальных тел жгутиков 3 и 4.
У округлых форм, также как и у грушевидных присутствуют 5 кинетосом (базальные
тела), но все они располагаются параллельно друг другу. В отличие от грушевидных
клеток,
у
округлых
форм
происходит
редукция
фибриллярных
связок
между
кинетосомами. У T. vaginalis округлой формы пельта сохраняется лишь частично. В
области кинетосом отчетливо видна коста.
Аксостиль – система упорядоченных микротрубочек, у грушевидных форм отходит
от ядра к заднему концу клетки. В области аксостиля накапливаются гранулы гликогена,
вдоль микротрубочек располагаются гидрогеносомы. У округлых форм происходит
редукция аксостиля.
В цитоплазме грушевидной клетки T. vaginalis присутствует большое количество
разнообразных везикул (классификация по Овчинникову и Делекторскому, 1986):
везикулы с остаточным органическим веществом, по-видимому, это лизосомы или
фагосомы; мембрано-окаймленные электронно-прозрачные везикулы с утолщенной
мембраной, имеющей ворсинчатое строение, секреторные везикулы. У округлых форм
более
выражена
вакуолизация,
преобладают
электронно-прозрачные,
лишенные
содержимого везикулы неправильной формы.
Вакуолизация и частичная редукция внутренних мембран, включая диктиосомы,
продемонстрирована у округлых форм T. foetus. Эти неподвижные формы, без свободных
жгутиков, без клеточной стенки наблюдались in vivo и присутствуют в накопительных
культурах полученных из урогенитального тракта крупного рогатого скота [13]. Эти
формы названы “псевдоцистами”, но показано, что их формирование обратимо [11]. У
“псевдоцист” сохраняются коста, пельта (как у округлых форм T. vaginalis), аксонема
ундулирующей мембраны, аксостиль (в отличие от T. vaginalis, где эти структуры
редуцированы) [13].
Своеобразными клеточными компартментами T. vaginalis являются гидрогеносомы.
Они представляют собой электронно-плотные везикулы с гомогенным содержимым. В
288
WWW.MEDLINE.RU ТОМ 8, МИКРОБИОЛОГИЯ, МАЙ 2007
Дата поступления: 18.04.2007.
цитоплазме грушевидных форм эти органеллы с плотным гомогенным содержимым
достаточно однородны и расположены в средней и задней части клетки возле пельта –
аксостилярного комплекса. У округлых форм T. vaginalis гидрогеносомы значительно
варьируют по размерам, форме и плотности содержимого, расположены хаотично по
всему объему клетки. Такое расположение и варьирование размеров наблюдаются и у
“псевдоцист” T. foetus [13].
В целом округлые формы T. vaginalis сохраняют общий план строения клетки и
типичные для трихомонад органеллы: свободные аксонемы, кинетосомы, пельту, косту и
гидрогеносомы.
Округлые неподвижные формы обнаружены у интестинальных и свободноживущих
трихомонад, эти формы выдерживают резкие колебания температуры, недостаток влаги и
обладают клеточной стенкой [8]. Эти формы рассматриваются как покоящиеся стадии
жизненного цикла [15] и по своей организации совсем не похожи на округлые формы T.
vaginalis. Переход в неподвижные, округлые безжгутиковые формы, сохраняющие
способность
к
делению,
к
цитоадгезии,
инфекционность
зарегестрированы
у
урогенитальных трихомонад крупного рогатого скота [11, 13], а также у интестинальных
трихомонад птиц [9, 16]. Ультраструктура округлых форм T. vaginalis и T. foetus сходна:
редуцируется
ундулирующая
мембрана,
аксостиль,
ЭПС;
перераспределяются
гидрогеносомы, рибосомы, отсутствует клеточная стенка и псевдоподии. Псевдоцисты T.
foetus без сомнения являются вирулентными формами и присутствуют в популяции
наряду с типичными грушевидными [13]. В проведенном исследовании морфологически
гетерогенные популяции T. vaginalis не наблюдались и вопросы о возможности перехода
из одной формы в другую, а также об условиях этой трансформации остаются открытыми.
Вместе с тем можно рассматривать округлые формы как вирулентные, а не
дегенеративные или покоящиеся на основании следующих наблюдений: клетки имеют
нормальную морфологическую организацию, воспроизводятся в хозяине и вызывают
воспалительный процесс, а также накапливаются на селективных питательных средах.
Выводы
1. Результаты исследования свидетельствуют о том, что округлые формы T. vaginalis
являются одной из стадий жизненного цикла простейшего. Структурные изменения,
наблюдаемые
в
цитоплазме
клетки
округлых
форм,
указывают
на
снижение
физиологической активности простейшего.
2. У округлых форм T. vaginalis отсутствуют ключевые особенности, характерные
для цист (изменение в организации ядра, наличие дополнительных покровов). Округлые
289
WWW.MEDLINE.RU ТОМ 8, МИКРОБИОЛОГИЯ, МАЙ 2007
Дата поступления: 18.04.2007.
формы T. vaginalis нельзя рассматривать как стадии покоя, хотя их появление
свидетельствует о неблагоприятных условиях.
Список литературы
1. Карпов С. А. 2001. Строение клетки протистов. СПб, Тесса, 382 с.
2. Клименко Б. В., Авазов Э. Р., Барановская В. Б., Степанова М. С. 2001.
Трихомониаз мужчин, женщин и детей. СПб, Сюжет, 183 с.
3. Овчинников Н. М., Делекторский В. В. 1986. Ультраструктура возбудителей
венерических заболеваний и ее клиническое значение. М., Медицина, 224 с.
4. Суханова К. М. 2000. Класс Parabasalea: В кн.: Протисты. Часть 1. Руководство по
зоологии. СПб, Наука : 357-368 c.
5. Ресурсы и деятельность кожно-венерологических учреждений. Заболеваемость за
2002-2003 годы (статистический материал). 2005. М.: 124 с.
6. Benchimol M., Ribeiro K., Mariante R. M., Alderete J. F. 2001. Structure and division of
the Golgi complex in Trichomonas vaginalis and Trichomonas foetus. Eur. J. Cell Biol.
80 : 593-607.
7. Benchimol M. 2004. Trichomonads under microscopy. Microsc. Microanal. 10 : 528550.
8. Farmer M. A. 1993. Ultrastructure of Ditrichomonas honigbergii n. g., sp. (Parabasalia)
and its relationships to amitochondrial protests. J. Eukaryot. Microbiol. 40 : 619-626.
9. Friedhoff K. T., Kuhnigk C., Muller I. 1991. Experimental infections in chicken with
Chilomastix gallinarum, Tetratrichomonas gallinarum and Tritrichomonas eberthi.
Parasitol. Res. 77 : 329-334.
10. Gelbart S. M., Thomason J. L., Osypowski P. J., James J. A., Hamilton P. R. 1989.
Comparison of Diamond medium modified and Kupferberg medium for detection of
Trichomonas vaginalis. J. Clin. Microbiol. 27 : 1095-1096.
11. Granger B. L., Warwood S. J., Benchimol M., De Souza W. 2000. Transient invagination
of flagella by Trichomonas foetus. Parasitol. Res. 86 : 699-709.
12. Honingberg B. M., Brugerolle G. 1990. Structure. In: Trichomonads parasitic in human.
Berlin, Springer, 4-35.
13. Mariante R. M., Lopes L. C., Benchimol M. 2004. Tritrichomonas foetus pseudocysts
adhere to vaginal epithelial cells in a contact-dependent manner. Parasitol. Res. 92 : 303312.
290
WWW.MEDLINE.RU ТОМ 8, МИКРОБИОЛОГИЯ, МАЙ 2007
Дата поступления: 18.04.2007.
14. Pelletier L., Stern C. A., Pypaert M., Sheff D., Ngo H. M., He C. Y., Hu K., Toomre D.,
Coppens I., Roos D., Joiner K. A., Warren G. 2002. Golgi biogenesis in Toxoplasma
gondii. Nature. 418 : 548-552.
15. Pereira-Neves A., Ribeiro K. C., Benchimol M. 2003. Pseudocysts in trichomonads-new
insights. Protist. 154 : 313-329.
16. Stachan R., Nicol C., Kunstyr I. 1984. Heterogeneity of Trichomonas muris
pseudocysts. Protistol. 20 : 157-163.
291