4.4 Иммобилизованные клетки и ферменты их использование в различных отраслях науки и производства

Иммобилизованные клетки и
ферменты, их использование в
различных отраслях науки и
производства
Общие принципы иммобилизации и
характеристика носителей
Иммобилизованными называют такие клетки, для которых созданы
искусственные ограничения подвижности во внешней среде, а материальный
посредник, обеспечивающий эти ограничения подвижности, считается
носит елем. В целом система клетка–носитель называется иммобилизованным
биокат ализат ором.
Проблема использования ферментативной активности иммобилизованных
микроорганизмов имеет глубокие корни. Более 150 лет назад быстрый способ
получения уксуса был основан на применении микроорганизмов,
адсорбированных на древесной стружке. В 70-х годах XX в. появились первые
научные публикации об иммобилизации клеток микроорганизмов, а первое
промышленное применение иммобилизованных клеток было осуществлено в
Японии в 1974 г. С их помощью получали аспарагиновую кислоту.
Существуют по меньшей мере четыре области, в которых могут найти
применение иммобилизованные ферменты и клетки, а именно:
промышленность, охрана окружающей среды, различные анализы и
производство лекарственных препаратов. Примерами первой области
являются синтез аминокислот, антибиотиков, трансформация стероидов,
производство сахарных сиропов и молочных продуктов. К применениям
для охраны окружающей среды относятся обработка сточных вод и
гидролиз городских, промышленных и сельскохозяйственных стоков,
содержащих целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин. Помимо того что эти
процессы имеют социальное значение, они выгодны с экономической
точки зрения, так как при этом утилизируется энергия в форме метана или
этанола.
При этом исследователи сталкиваются с рядом трудностей. Так,
например, клеточная стенка, плазматическая или внутриклеточная
мембрана могут препятствовать проникновению субстрата к
соответствующему ферменту, а также диффузии продукта из
клетки. Кроме того, возникает необходимость поддержания
целостности клетки и удержания клеток в той фазе роста, в которой
синтезируются требуемые ферменты.
Наконец, из-за большого
числа присутствующих в
клетке ферментов (что в
ряде случаев
рассматривается как
достоинство) возможно
протекание нежелательных
побочных реакций.
Для иммобилизации могут быть использованы клетки в
различном состоянии: живые и поврежденные в той
или иной степени. Одностадийные реакции могут
осуществлять и живые, и поврежденные клетки.
Полиферментные реакции проводят с применением
живых клеток, которые могут длительное время
регенерировать АТФ и коферменты (НАДФ, НАД).
Различают два направления в исследованиях по
иммобилизованным микроорганизмам:
 создание катализаторов процессов биотрансформации
различных органических соединений;
 создание катализаторов для реализации процессов
биосинтеза различных органических соединений, в том
числе первичных и вторичных метаболитов.
В зависимости от типа клеток и решаемых задач
различают следующие виды иммобилизации:
 на поверхности носителя;
 в массе носителя;
 в полимерном геле;
 в полимерных пленках;
 с использованием мембранных технологий;
 с помощью плоских мембран;
 с использованием пористых и полых волокон;
 с применением микрокапсулирования.
Иммобилизация клеток путем включения в
различные гели, мембраны, волокна основана на
химических и физических взаимодействиях.
Химический метод основан на образовании
ковалентных
связей
с
активированным
носителем, на поперечной сшивке клеток за счет
активных групп в клеточной оболочке с
бифункциональными
реагентами
(например,
глутаровым альдегидом). К физическим методам
относятся адсорбция и агрегация.
Химические методы используются реже по
сравнению с другими методами и малопригодны
для иммобилизации живых клеток. Гораздо
большее распространение получило включение
клеток в состав гелей, мембран и волокон. При
таком способе иммобилизации клетки могут
сохранять жизнеспособность и в присутствии
питательной
среды
размножаться
в
приповерхностных слоях гелей.
Наибольшее количество исследований по иммобилизации клеток
микроорганизмов проведено японскими исследователями. Особые
успехи были достигнуты ими в области синтеза аминокислот,
органических
кислот
и
антибиотиков.
В
Московском
государственном университете был разработан метод получения
аспарагиновой кислоты, который по эффективности не уступает
японским.
Клетки
E.coli,
включенные
в
армированный
полиакриламидный гель, были с успехом использованы для
получения
аспарагиновой
кислоты,
период
полужизни
катализатора – 110 суток.
Иммобилизовать
можно не только
клетки
микроорганизмов, но
и клетки
растительных и
животных тканей,
используя их для
синтеза
физиологически
активных соединений.
Характеристика иммобилизованных
биокатализаторов
По
принципу
действия
все
искусственные
твердофазные
биокатализаторы
на
основе
микробных клеток разделяются на 4 типа:
1. Одноферментные системы без кофакторов.
2. Олигоферментные системы регенерацией разных
кофакторов (обычно НАД и НАДН).
3. Мультиферментные системы с регенерацией
нескольких кофакторов.
4. Мультиферментные системы, катализирующие
сложные сиснтетические процессы,
непосредственно связанные с основным
метаболизмом клетки.
Методы иммобилизации клеток делят на 4 категории:
1. Иммобилизация клеток или субклеточных органелл в инертном
субстрате. Например, клетки Catharanthus roseus, Digitalis lanata в
альгинатных, агарозных шариках, в желатине и т.д. Метод
предполагает обволакивание клеток одной из различных
цементирующих сред – альгинат, агар, коллаген, полиакриламид.
2. Адсорбция клеток на инертном субстрате. Клетки прилипают к
заряженным шарикам из альгината, полистирола, полиакриламида.
Метод применялся в экспериментах с животными клетками, а также
клетками Saccharomyces uvarum, S. cerevisiae, E. coli.
S. cerevisiae
3. Адсорбция клеток на инертном субстрате с помощью биологических
макромолекул (таких, как лектин). Применяется редко, есть сведения
об экспериментах с различными линиями клеток человека,
эритроцитами крови барана, адсорбированными на покрытой белком
агарозе.
4. Ковалентное связывание с другим инертным носителем типа КМЦ.
Очень редко применяется, известна удачная иммобилизация для
Micrococcus luteus. В основном проводились эксперименты по
иммобилизации клеток животных и микроорганизмов.
Micrococcus luteus
Конструкции реакторов
За исключением некоторых специальных случаев, чаще всего гель, в
который включают клетки, состоит из сферических частиц, а не из волокна,
мембран или блоков. Одностадийные биопревращения с использованием
иммобилизованных ферментов или мертвых клеток осуществляют обычно в
прот очных реакт орах с перемешиванием, в реакт орах с псевдоожиженным
слоем или в реакт орах с полыми волокнами. Каждая из этих систем имеет
определенные ограничения в отношении величин перепадов давления и
неравномерного распределения катализатора.
Физиолого-биохимические особенности
иммобилизованных биокатализаторов, их
практическое использование
Выбор способа иммобилизации микробных клеток
определяется как физиолого-биохимическими особенностями
иммобилизованных биокатализаторов, так и стоящими перед
исследователем или производственником задачами и
осуществляется:
1. По принципу действия иммобилизованных клеточных
систем (так наибольший прогресс отмечается в использовании
иммобилизованных клеток как катализаторов
биотрансформации).
2. По масштабам биотехнологического процесса (для
проведения процессов «большой» биотехнологии, т.е.
крупнотоннажного производства таких продуктов, как
аминокислоты, органические кислоты, спирты и т.д.).
3. По специфике биотехнологического процесса (для очистки
сточных вод в биофильтрах – только адсорбционный метод).
Биокаталитическая активность целых иммобилизованных клеток в
настоящее время может быть использована в различных отраслях науки и
техники:
 при биосинтезе и трансформации таких соединений, как аминокислоты,
органические кислоты, антибиотики, стероиды углеводы, углеводороды,
нуклеотиды и нуклеозиды;
 в пивоварении и виноделии;
 при очистке сточных и природных вод;
 при извлечении металлов из сточных вод;
 в биогеотехнологии;
 при ассимиляции солнечной энергии;
 при изготовлении водородных солнечных элементов;
 в азотфиксации;
 в аналитических целях при изготовлении биоселективных электродов.
Биомедицинское применение искусственных
препаратов, содержащих иммобилизованные
ферменты, белки, клетки и другие биологически
активные материалы
Применение ферментов и других физиологически активных
веществ (ФАВ) белковой природы в терапии имеет давние
традиции. Современная медицина все шире использует
высокоочищенные препараты ФАВ белковой природы в самых
различных отраслях клинической медицины в качестве
перспективных средств медикаментозного лечения вследствие
их исключительно высокой активности и специфичности.
В настоящее время принято выделять два принципиальных
получению иммобилизованных терапевтических ферментов.
подхода
к
1. При различных системных поражениях, когда присутствие терапевтического
фермента необходимо в разных органах и тканях, целесообразно
использовать тем или иным способом стабилизированные водорастворимые
препараты иммобилизованных ферментов, обладающие повышенной
ст абильност ью в физиологических условиях и замедленным выведением
из организма. Сюда же будут относиться и различные ферментсодержащие
искусственные клетки типа микрокапсул, теней эритроцитов или липосом.
2. С другой стороны, для терапии локальных поражений, когда присутствие
фермента требуется лишь в месте поражения, целесообразно создание
биосовместимых ферментсодержащих полимерных частиц, которые могут
быть локализованы в определенном мест е и ост ават ься т ам заданное
время, непрерывно выделяя в окружающую среду терапевтический фермент,
предпочтительно дополнительно стабилизированный. Самостоятельный
случай – использование иммобилизованных ферментов в аппаратах для
экстракорпоральной перфузии типа искусственной почки, в перевязочных и
дренирующих материалах для ускорения заживления ран и ожогов и для
модификации внутренней поверхности протезов кровеносных сосудов с
целью понижения тромбообразования.
Перспективный метод применения ферментов для лечения — это
создание различного типа искусственных клеток. Исторически
первым подходом к этой проблеме было микрокапсулирование
ферментов, т.е. их включение в полимерные микрокапсулы,
обеспечивающие надежное удержание и защиту фермента и
свободное
проникновение
относительно
низкомолекулярных
субстратов и продуктов ферментативной реакции.
Еще одним методом создания искусственных клеток является
включение ферментов в липосомы –
искусственные
фосфолипидные микропузырьки. Ферменты, включенные в
липосомы,
также
предохранены
от
инактивирующего
воздействия внешней среды, а сами липосомы, состоящие из
природных соединений, полностью утилизуются в организме. В
отличие от микрокапсул, однако, липосомы обладают
уникальной способностью доставлять включенный в них
препарат внутрь клеток, с которыми они взаимодействуют по
механизму слияния или эндоцитоза.
Основными
преимуществами
реакторов
на
основе
иммобилизованных ферментов являются следующие:
 возможность избежать непосредственного контакта организма с
чужеродным белком и таким образом уменьшить нежелательные
реакции на этот белок;
 возможность многократного использования реактора;
 возможность проведения долговременного лечения.
К недостаткам таких реакторов следует отнести не до конца
решенные проблемы тромбообразования.
Спасибо за внимание!