Иммобилизованные ферменты

Иммобилизованные
ферменты
Лекция 5
План лекции:
1. Влияние иммобилизации на каталитическую
активность и конформацию фермента.
2. Влияние иммобилизации на стабильность
ферментов.
3. Эффекты диффузии реагентов в катализе
иммобилизованными ферментами.
4. Промышленные процессы на основе
иммобилизованных ферментов.
5. Ферментные электроды.
6. Применение иммобилизованных ферментов в
медицине.
Как изменяются каталитические
характеристики иммобилизованных
ферментов по сравнению с
нативными ферментами в растворе?
Особенности процессов на основе
иммобилизованных ферментов
Все эффекты, наблюдаемые при катализе
иммобилизованными ферментами можно
разделить на две группы:
к первой из них относятся эффекты, связанные с
влиянием иммобилизации на
состояние/конформацию фермента;
ко второй – эффекты, обусловленные
распределением реагентов в системе
Способы «ужесточения» структуры
фермента
1 - внутримолекулярная сшивка бифункциональными
реагентами
2 - многоточечное ковалентное либо нековалентное
присоединение к носителю;
3 – включение в «тесные» поры носителя
Влияние иммобилизации на стабильность
ферментов
Операционная стабильность – время
полуинактивации фермента
immobilized
enzymes
free (soluble)
enzymes
Влияние иммобилизации на стабильность
ферментов
Во многих случаях иммобилизованные ферменты
характеризуются более высокой стабильностью по
отношению к денатурирующим воздействиям
Для протекания ферментативной реакции необходимо:
во-первых, чтобы молекула субстрата
подошла к поверхности частицы
(если фермент иммобилизован на носителе),
во-вторых, продиффундировала внутри нее
(если фермент иммобилизован внутри носителя)
В зависимости от того, как соотносятся скорости диффузионных
стадий и непосредственно ферментативной реакции, может
наблюдаться одна из трех ситуаций:
1. Процесс контролируется внешней диффузией
(внешнедиффузионный режим)
2. Процесс контролируется внутренней диффузией
(внутридиффузионный режим)
3. Кинетически контролируемый процесс
(кинетический режим)
Примеры промышленных процессов на
основе иммобилизованных ферментов
1. Получение глюкозофруктозных сиропов
2. Получение L-аминокислот из их
рацемических смесей
3. Получение безлактозного молока
4. Получение 6-аминопенициллановой
кислоты (6-АПК)
Ферментные электроды
Ферментный электрод – это комбинация датчика
(ионселективный электрод) с иммобилизованным
ферментом, обеспечивающая высокоселективный и
высокочувствительный метод определения субстрата.
1962 г. - первые сообщения
об измерении концентрации
глюкозы в биологических
растворах и тканях с
помощью электрода, в
котором использовали
глюкозооксидазу,
иммобилизованную в геле на
поверхности
полярографического
кислородного электрода
Типичные ферментные электроды
и их параметры
Фермент
Датчик
Стабильность
Время
реакции
Чувствительность, М/л
Уреаза
Катионный
Газовый
(NH3)
3 недели
1 мес.
30–60 с
2–4 мин
10–2–5⋅10–5
до 5⋅10–4
Глюкоза
Глюкозооксидаза
рНэлектрод
Газовый
(О2)
1 неделя
3 недели
5–10 мин
2–5 мин
10–1–10–3
2⋅10–4
L-аминокислоты
Оксидаза
L-аминокислот
Pt(H2O2)
4–6 мес.
12 с
10–3–10–5
Спирты
Алкогольоксидаза
Pt(H2O2)
1 неделя
12 с
0.5–100 мг/ %
Пенициллин
Пенициллиназа
рНэлектрод
2 недели
0.5–2
мин
10–2–10–4
Мочевая
кислота
Уратоксидаза
Pt(H2O2)
4 мес.
30 с
10–2–10–4
Нитрат
Нитратредуктаза
NH4+
2–3 мин
–
10–2–10–4
Нитрит
Нитритредуктаза
Газовый
(NH3)
3–4 мес.
2–3 мин
5⋅10–2 –5⋅10–4
Сульфат
Акрилсульфатаза
Pt
1 мес.
1 мин
10–1–10–4
Определяемое
вещество
Мочевина
Направления использования
иммобилизованных ферментов в
медицине
1. Создание лекарственных препаратов
пролонгированного действия со сниженной
токсичностью и аллергентностью.
2. Решение проблемы направленного транспорта
лекарств в организме.