На правах рукописи ВАСИЛЬЕВА Ольга Юрьевна ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, СТАНДАРТИЗАЦИЯ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА НОВОГО БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА ШУНЛИТ 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2010 Работа выполнена в лаборатории спектральных исследований и анализа ИОНХ РАН и на кафедре аналитической химии химического факультета МГУ. Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор А.С. Берлянд Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Ю.Я. Харитонов доктор химических наук, профессор Ю.А. Ершов Ведущая организация: Институт фармакологии РАМН Защита диссертации состоится “24“ сентября 2010 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д.212.203.13 при ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, Москва, ул. МиклухоМаклая, д.8 С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. МиклухоМаклая, д.6 Автореферат разослан «12» августа 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор 2 Е.В. Лукашева ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность темы. Исследования последних лет показали хороший лечебный эффект при применении в медицинской практике методов сорбционной терапии у больных с различными заболеваниями, при которых традиционные методы лечения малоэффективны. Метод сорбционной детоксикации занял свое место среди прочих методов лечения. Если недавно понятие “сорбент“ ассоциировалось лишь с активированным углем, то за сравнительно короткий срок фармацевтический рынок России пополнился такими отечественными энтеросорбентами, как Полифепан, Полисорб и др. Прочные позиции на рынке имеет импортный препарат Смекта. Этим препаратам посвящено много публикаций, главным образом, с результатами клинических исследований. Вместе с тем, данные о физико-химических свойствах сорбентов, в частности, об их сорбционной активности, немногочисленны и не подлежат сравнению по причине разных условий проведения эксперимента. Несмотря на наличие широкого диапазона энтеросорбентов на фармацевтическом рынке России, проблема создания более экономичных энтерособентов отчественного производства по-прежнему актуальна, и одним из перспективных направлений являются энтерособенты минерального происхождения. Более 20 лет для очистки питьевой и сточной воды успешно применяются сорбенты на основе природных шунгитов, месторождения которых находятся в Карелии и Казахстане. Однако в качестве энтеросорбентов шунгиты до настоящего времени не использовались, поэтому разработка нового лекарственного препарата на основе природного шунгита является актуальной задачей, позволяющей расширить ассортимент отечественных лекарственных препаратов природного происхождения. Целью настоящей работы является изучение физико-химических характеристик нового биологически активного микста минералов шунлит на 3 основе природного шунгита с целью обоснования методов контроля и показателей качества, нормируемых при стандартизации. Задачи исследования: - установить минеральный состав шунгита Зажогинского месторождения (условное название микста минералов – шунлит); - изучить физико-химические свойства шунлита; - разработать способы и методики качественного и количественного анализа шунлита; - исследовать сорбционные свойства шунлита по отношению к некоторым токсичным органическим соединениям и ионам токсичных металлов; - исследовать стабильность шунлита при хранении; - разработать проект фармакопейной статьи предприятия на шунлит; - изучить антиоксидантную активность шунлита. Научная новизна. Установлен минеральный состав шунлита. Разработаны способы и методики фармацевтического и физико-химического анализа оценки качества нового биологически активного вещества шунлит. Разработаны методики количественного определения SiO2, Al2O3 и железа в шунлите методами спектрофотометрии и комплексонометрии. Впервые определено содержание токсичных металлов в шунлите методом атомно-абсорбционной спектроскопии. Впервые изучена сорбционная способность шунлита по отношению к органическим веществам: фенолу, метиленовой сини, цианокобаламину, бычьему альбумину и ионам тяжелых металлов: меди, ртути, свинца и цинка. Впервые установлена антиоксидантная активность шунлита. Практическая значимость работы. Результаты исследований положены в основу проекта ФСП “Шунлит – порошок для приготовления суспензии для приема внутрь“. Разработанные методики внедрены в лаборатории спектральных методов анализа ИОНХ РАН, в ООО НПО 4 “Интерлит“ и на кафедре фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета РУДН. Апробация диссертации. Результаты работы представлены на научнопрактической конференции “Новая технологическая платформа биомедицинских исследований“ (ЮФУ РАН г. Ростов на Дону, 2006г.), II международном семинаре “Охрана окружающей среды в городе“ (Москва, 2006г.), IX международном конгрессе “Здоровье и образование в XXI веке” (Москва, РУДН, 2008г.), I всероссийской конференции “Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции“ (Москва 2009 г.), XVII российском национальном конгрессе “Человек и лекарство“ (Москва, 2010 г.) Публикации. По материалам диссертации имеется 11 публикаций, 5 из которых - в центральных журналах, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 138 страницах и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав с результатами исследований и их обсуждением, выводов и двух приложений. Обзор литературы включает в себя 170 ссылок, в т.ч. 60 на английском языке. Диссертация содержит 21 рисунок и 24 таблицы. Положения, выдвигаемые на защиту. - результаты установления минерального состава шунлита - методики и результаты определения содержания токсичных металлов в шунлите - методика количественного определения SiO2, Al2O3 и Fe в шунлите - результаты фармацевтического анализа шунлита - проект ФСП на “Шунлит – порошок для приготовления суспензии для приема внутрь“ - результаты изучения сорбционной способности шунлита - результаты изучения антиоксидантной активности шунлита. 5 СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Материалы и методы. Объект исследования – сорбент шунлит - был получен размолом шунгита разновидности III Зажогинского месторождения на шаровой мельнице. Шунгит был предварительно подвергнут очистке от посторонних включений. Полученный порошок был просеян на сите до частиц размером не более 0,31мм. Элементный анализ шунлита проводили методом лазерной массспектроскопии на приборе ЭМАЛ-2. Рентгенофазовый анализ шунлита проводили токсичных на порошковом элементов абсорбционного абсорбционный анализа. в дифрактометре шунлите В работе спектрофотометр ДРОН-2. проводили были фирмы Определение методом атомно- использованы: атомно- Perkin-Elmer (модель 303, пламенный вариант,) и атомно-абсорбционный спектрофотометр фирмы Perkin-Elmer (модель 2100, с электротермической атомизацией в графитовой печи HGA-700). Все реактивы фармацевтического и индикаторы, анализа использованные шунлита, описаны для химико- в соответствующих разделах Государственной фармакопеи XI издания, выпуск 2. Оптическую плотность растворов метиленовой сини измеряли на спектрофотометре Adilent-8453. ИК спектр шунлита в таблетке с KBr снимали на ИКспектрометре ФСН-1201. Для изучения сорбционных свойств шунлита были использованы: дистиллированная вода, полученная двойной перегонкой водопроводной воды; боратный буферный раствор, аммиачный буферный раствор, раствор ацетата натрия, растворы пикрамина –ε и ПАР (мононатриевой соли 4(2пиридил-азо)резорцина), стандартный раствор ртути (ЭАА “Экоаналитика“, ион ртути (II), ГСО № 7343-96, 1,0 мг/см3, партия 4-07), стандартный раствор цинка (ЭАА “Экоаналитика“, ион цинка, ГСО № 7770-2000, 1,0 мг/см3, партия 5-07), стандартный раствор свинца (ЭАА “Экоаналитика“, ион 6 свинца, ГСО № 7778-2000, 1,0 мг/см3, партия 8-07), стандартный раствор меди, (ГСО №7764-2000, ЭАА ‘Экоаналитика”, ион меди, ГСО №7764-2000, 1,0 мг/см3, партия 6-07), фульвокислоты почвенные (чернозем типичный курский), выделенные в 2004 г, стандартный 0,1 М раствор HCl, приготовленный из фиксанала; стандартный раствор фенола (1 мг/мл, ЭАА “Экоаналитика”, ГСО №7346-96, партия метиленовый 4-07); синий (тригидрат хлорида тетраметилентионина); цианокобаламин (витамин В12); бычий сывороточный альбумин (Fraction V, MW 66338, MP Biomedicals LLC). Измерение оптической плотности исследуемых растворов проводили на фотоколориметре КФК-2 и спектрофотометре СФ-46, а атомноабсорбционный анализ - на атомно-абсорбционном спектрометре “Квант”. Для центрифугирования была использована центрифуга лабораторная медицинская ОПН-8. Значения рН растворов измеряли при помощи потенциометра рН-121. Сорбционные свойства всех изученных веществ были исследованы в статическом режиме. Для исследования антиоксидантных свойств шунлита были использованы водные и водно-спиртовые (на 20% этиловом спирте) настои шунлита, а также растворы, содержащие взвесь шунлита. В работе использовали коммерческие супероксиддисмутазы препараты ферментов: каталазы глутатионпероксидазы (СОД), (КАТ), (ГП), глутатионредуктазы (ГР), пируваткиназы (ПК), лактатдегидрогеназы (ЛД), субстраты: глутатион окисленный и глутатион восстановленный, фосфоенолпируват, аденозиндифосфат, гидроксибутил, феназинметасульфат, нитросиний тетразолий; коферменты β-никотинамидадениндинуклеотид фосфат восстановленный (β-НАДФН), -никотинамидадениндинуклеотид восстановленный (β--НАДН) (все препараты ферментов и субстраты фирмы Sigma), реактивы: пирофосфат натрия, трис(гидроксиметил)аминометан, аммоний молибденовокислый дигидрофосфат калия (NH4)6Mo7O24·4H2O, пероксид KH2PO4, 7 гидроксид водорода. натрия, Скорость ферментативных реакций определяли при помощи спектрофотометра Shimadzu MPS-2000 с непрерывной автоматической регистрацией. 2. Исследование минерального состава шунлита Элементный анализ шунлита проводили методом лазерной массспектроскопии. Было установлено, что основное содержание в шунлите составляют С, O и Si (10-40 масс.%), а также Al и K (1-10 масс.%). В состав шунлита в незначительных количествах входят: Ca, Fe, Ti (0,1-1 масс.%), Ba, Cl, P, S, Rb (0,01-1 масс.%), As, B, Ce, Co, Cr, Cu, La, Mn, Nb, Ni, Sr, Y, Zn, Zr (0,001-0,01 масс.%), а содержание Cd, Hg, Pb находится ниже предела обнаружения (<0,0001 масс.%). Элементный состав шунлита в пересчете на оксиды представлен в таблице 1. Таблица 1.Элементный состав шунлита в пересчете на оксиды. оксид B2O3 Fe2O3 Na2O MgO Al2O3 SiO2 содержание, масс.% 0,026 0,91 0,24 0,53 оксид P2O5 K2O CaO TiO2 Cr2O3 MnO содержание, масс.% 0,083 2,21 0,31 0,92 Полученные минерального результаты состава были шунлита использованы методом 57,32 0,0182 0,011 для установления рентгенофазового Дифрактограмма шунлита представлена на рис.1. Рис. 1. Дифрактограмма шунлита. 8 4,42 анализа. Расшифровка дифрактограммы, проведенная с использованием банка рентгенодифракционных стандартов ICPDS и баз данных по минералогии, показала, что шунлит представляет собой минеральный микст, состоящий из кварца (SiO2), кианита (Al2SiO5), микроклина (K,Na)[AlSi3O8], графита и шамозита (Fe,Al,Mg)6(Si,Al)4O10(OH)8. 3. Химико-фармацевтический анализ шунлита. Методом атомно-абсорбционного анализа было исследовано 5 серий образцов шунлита. Было установлено, что содержание токсичных элементов Cu, Zn, Pb, As в шунлите незначительно, а содержание Cd и Hg находится ниже предела обнаружения метода (<0,00001%) (табл. 2). Статистическая обработка результатов анализа показывает, что разработанные методики обладают удовлетворительной точностью и воспроизводимостью. Таблица 2. Результаты атомно-абсорбционного определения токсичных элементов в шунлите. элемент Cu Zn Pb As Cd Hg содержание, масс.% 0,0030 0,0089 0,0002 0,0012 <0,00001 <0,00001 εср, % 4,75 2,24 Схема химико-фармацевтического 6,20 7,71 анализа ----- шунлита ----- (рис.2, 3) была разработана на основании ОСТ «Стандарты лекарственных средств. Основные положения». Анализ проводили на 5 сериях образцов шунлита. Рис.2. Схема химико-фармацевтического анализа шунлита. 9 По внешнему виду образцы шунлита представляли собой порошок черного цвета, без запаха. В свежеприготовленных образцах препарата содержание частиц с диаметром менее 0,31 мм составляло от 98,2 до 99,4%. Образцы, состаренные в течение двух лет в обычных условиях, этот показатель практически не изменили. Изучение растворимости показало, что шунлит практически не растворим в воде, ацетоне и 95% водном растворе этилового спирта. Для идентификации подлинности было предложено использовать ИКспектр шунлита в таблетке с KBr. Кроме того, для подтверждения подлинности препарата предлагается использовать окраску и электронный спектр поглощения раствора синего кремниймолибденового комплекса, приготовленного для количественного определения кремния. Спектр был снят в области от 350 до 900 нм в кювете толщиной 10 мм относительно раствора, полученного в контрольном опыте, с максимумом при 817нм и минимумом при 418 нм. Для обнаружения ионов алюминия и железа были использованы цветные реакции этих ионов с ализарином красным №0 (1,2- диоксиантрахиноном) и ферроцианидом калия соответственно. Реакцию выполняли методом бумажной хроматографии с раствором, полученным при выполнении испытаний по разделу “Вещества, растворимые в кислоте хлористоводородной“. В результате на полоске бумаги при погружении ее в 3% раствор уксусной кислоты в месте нанесения раствора появилось отчетливое пятно синего цвета (железо окисное) с кольцевым ореолом фиолетово-красного цвета (алюминий). Высушивание свежеприготовленных образцов проводили при 1200С, что привело к уменьшению их массы на 0,6 - 1,8%. В процессе хранения образцов в течение двух лет потери в массе практически не изменились. Потери в массе при прокаливании определяли в условиях медленного нагревания образцов до 10000C с последующим выдерживанием при этой температуре в течение 30 минут. Потери в массе составили от 29 до 33,8%. 10 Для изучения адсорбционной способности шунлита в качестве исходного раствора был использован 0,15% водный раствор метиленового синего. Концентрацию раствора после установления адсорбционного равновесия определяли спектрофотометрически, при длине волны 664 нм. Расчеты проводили с использованием РСО метиленового синего. Величина адсорбционной способности шунлита составила от 0,010 до 0,013 г метиленового синего на 1 г препарата. Испытания шунлита на микробиологическую чистоту проводили в соответствии с ОФС (ГФ XI, вып.2, С.187) и изменением №3. Все серии препарата удовлетворяли требованиям категории 3.2. Для проведения количественного анализа из образцов шунлита были приготовлены водная и кислотная вытяжки и раствор плава (рис.3). Водная вытяжка была получена выдерживанием 6 г шунлита в течение 30 мин в 75 мл дистиллированной воды. Для приготовления кислотной вытяжки 5 г шунлита выдерживали в 100 мл 0,1М раствора HCl. Для количественного определения кремния, алюминия и железа шунлит был переведен Рис.3. Схема количественного анализа шунлита. 11 в растворимую форму. Навеску шунлита сплавляли со смесью карбоната натрия, тетрабората натрия и нитрата калия при 9000С, полученный плав растворяли в соляной кислоте. В ходе анализа водной вытяжки были получены следующие результаты: содержание растворимых в воде веществ - < 0,5% в пересчете на сухой препарат, рН водной вытяжки – 7-8, щелочность – 0,075-0,090 % в пересчете на Na2O в сухом препарате и содержание хлоридов - < 0,05 % в пересчете на сухой препарат. В кислотной вытяжке содержание (в пересчете на сухой препарат) растворимых в HCl веществ составило 1,1-1,6%, тяжелых металлов - < 0,002%, сульфатов - < 0,1%, мышьяка - < 0,001%. В растворе плава шунлита было проведено количественное определение кремния, железа и алюминия. Содержание кремния в шунлите проводили по методике, основанной на реакции образования желтого кремниймолибденового комплекса, его последующего восстановления измерении оптической плотности полученного и синего кремниймолибденового комплекса при длине волны 817 нм. При расчетах содержания кремния использовали значение удельного показателя поглощения раствора синего кремниймолибденового комплекса. В 5 сериях образцов шунлита содержание кремния в пересчете на SiO2 составило от 56,6 до 62,2%. Определение содержания железа проводили с помощью комплексонометрического титрования трилоном Б, образующим с Fe3+ комплексное соединение. В качестве металлоиндикатора использовали сульфосалициловую кислоту. В состав шунлита входит как трехвалентное железо, так и двухвалентное, однако исследования растворов плава показали, что в продукте плавления препарата все железо находится в форме Fe3+. Таким образом, предложенный метод является методом определения общего железа в препарате. Суммарное содержание железа в образцах шунлита составило от 0,54 до 0,83%. 12 Содержание алюминия определяли методом обратного титрования раствора, полученного при определении железа. К раствору добавляли избыток трилона Б и проводили титрование нитратом свинца в присутствии индикаторной смеси метиленового оранжевого и гексаметилентетрамина. Содержание алюминия в образцах шунлита составило от 3,6 до 4,9%. Все разработанные методики количественного определения были проверены на модельных смесях, имитирующих состав раствора плава шунлита. Результаты анализа и статистической обработки результатов сведены в табл. 3. Проверку проводили на 5 сериях образцов. Таблица 3. Результаты анализа модельных растворов, имитирующих состав испытуемых растворов, и метрологические характеристики методов определения (f=3, P=95%). tвыч взято на анализ (µ), г Х(%) S ∆X (%) ε SiO2 0,0825-0,1001 100,17 1,26 4,02 4,01 0,27 Fe 0,00151-0,00157 99,95 1,91 6,06 6,06 0,00 Al2O3 0,00464-0,00968 99,78 0,48 1,54 1,54 0,29 Была исследована стабильность шунлита при хранении. Было установлено, что шунлит может храниться в течение 2 лет при температуре, не превышающей 300С, без изменения свойств. На основании спецификация проведенных шунлита исследований (табл.4), включающая была в себя составлена наименование показателей качества препарата, методы их контроля и нормы этих показателей. Таблица 4. Спецификация порошка шунлита для приготовления суспензии для приема внутрь. Наименование показателя Метод контроля Описание Визуальный Растворимость Визуальный вып.1, С.175) (ГФ XI, 13 Норма Порошок черного цвета, без запаха Практически не растворим в воде, спирте 95%, ацетоне ИК-спектрофотометрия Спектрофотометрия Подлинность Бумажная хроматография продуктов взаимодействия препарата с калия ферроцианидом и ализарином Прокаливание препарата при 10000С Измельченность Потеря в массе при высушивании Потеря в массе при прокаливании Растворимые в воде вещества рН водной вытяжки Щелочность Хлориды Вещества, растворимые в кислоте хлористоводородной Тяжелые металлы Сульфаты Мышьяк Микробиологическая чистота Адсорбционная способность ГФ XI, вып.2, С.17 ГФ XI, вып.1, С.176 ИК-спектр препарата, снятый в таблетке с калия бромидом, должен иметь совпадение по положению основных полос поглощения со спектром на прилагаемом рисунке Электронный спектр поглощения раствора, приготовленного для количественного определения кремния, должен иметь максимум при 817±2 нм На бумаге должно появиться отчетливое пятно синего цвета (железо окисное) с кольцевым ореолом фиолетово-красного цвета (алюминий). Превращение в порошок серого или светло-серого цвета с коричневым оттенком Остаток на сите 0,310 мм не должен превышать 2% Не более 2% Весовой От 28 до 34% Весовой Не более 0,5% Потенциометрический (ГФ XI, вып.1, С.113) От 7 до 8 Ацидиметрическое титрование ГФ XI, вып.1, С.165 Весовой Щелочность должна быть не более 0,1% в пересчете на содержание натрия оксида в сухом препарате Не более 0,05% Не более 2% ГФ XI, вып.1, С.165 ГФ XI, вып.1, С.165 ГФ XI, вып.1, С.165 ГФ XI, вып.2, С.187 и Изменение №2 и №3 Спектрофотометрия 14 Не более 0,002% Не более 0,1% Не более 0,001% Категория 3.2 Не менее 0,010 г метиленового синего на 1 г препарата Количественное определение Спектрофотометрия От 55 до 65% Комплексонометрия Не более 1% Комплексонометрия От 3 до 6% Согласно ФСП Согласно МУ 9467-015-05749470-98 2 года Кремний Железо Алюминий Упаковка Маркировка Срок годности На основании проведенных исследований был разработан проект ФСП на шунлит, порошок для приготовления суспензии для приема внутрь, применяемый в качестве лекарственного средства. 4. Исследование сорбционных свойств шунлита. Сорбционные свойства шунлита изучали в статическом режиме. В качестве сорбатов были выбраны ионы токсичных металлов: свинца, цинка, ртути и меди. В работе использовали навески сорбента массой 0,02-0,1 г, и растворы сорбатов объемом 10 мл. Исследования проводились при значениях рН, близких к кислотности желудка и двенадцатиперстной кишки – 2 и 6,5 соответственно. Время установления сорбционного равновесия составило 40 минут для цинка, ртути и свинца и 30 минут для меди. При рН 2 ионы всех исследуемых металлов не сорбировались на шунлите, а при рН 6,5 сорбция наблюдалась. Данные для построения изотерм сорбции металлов (рис. 4-8) получены при рН 6,5. 0,010 0,018 0,008 Г, ммоль/г 0,016 Г, ммоль/г 0,014 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,006 0,002 0,004 0,002 0,000 0,00 0,000 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,5 С, ммоль/л С, ммоль/л Рис.4. Изотерма сорбции цинка на шунлите. Рис.5.Изотерма сорбции свинца на шунлите. 15 Сорбция всех изученных катионов удовлетворительно описывается уравнением Фрейндлиха. Параметры сорбции сведены в табл.5. 0.10 0.07 0.08 0.06 X/m, ммоль/г X/m, ммоль/г 0.05 0.04 0.03 0.06 0.04 0.02 0.02 0.00 0.01 0.00 0.00 0 1 2 3 4 0.05 0.10 5 0.15 0.20 С, ммоль/л С, ммоль/л Рис.6. Изотерма сорбции меди на шунлите Рис.7. Изотерма сорбции меди на шунлите в присутствии фульвокислоты Табл.5. Параметры сорбции ионов металлов на шунлите 0.025 X/m, ммоль/г 0.020 K 0.015 n D ( см3/г) Zn2+ Pb2+ Cu2+ Cu2+ (фульвокислота) Hg2+ 0.005 0.000 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 С, ммоль/л Рис.8. Изотерма сорбции ртути на шунлите. max 0,019 0,012 0,340 3,41 4,85 2,99 90 360 80 (ммоль/г) 1,4х10-2 7х10-3 3,3х10-2 0,191 2,03 890 7,8х10-2 0,0191 3,59 220 1,6х10-2 0.010 Значения коэффициентов распределения D на начальных участках изотерм возрастают в ряду Cu2+ ≈ Zn2+ < Hg2+ < Pb2+, что практически совпадает с рядом удерживания этих ионов на катионообменниках. Было установлено, что присутствие фульвокислоты увеличивает коэффициент распределения меди в 10 раз. В качестве органических сорбатов были использованы соединения, имитирующие различные факторы интоксикации: фенол, метиленовый синий, цианокобаламин и бычий альбумин. Данные для изотерм сорбции получены при рН 2 и 6,5. 16 Время установления сорбционного равновесия составило 10 мин для фенола, 5 мин для метиленового синего, 2 мин для цианокобаламина и 24 ч для бычьего альбумина. Сорбция всех изученных соединений удовлетворительно описывается уравнением Фрейндлиха (рис. 9-12, табл.6). 0.07 0.08 0.06 0.06 X/m, ммоль/г 0.04 0.02 0.04 0.03 0.02 0.00 0.01 0 1 2 3 4 0.00 0.00 5 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 С (ммоль/л) С, ммоль/л Рис.10. Изотерма сорбции метиленового синего в кислой (--∆--) и нейтральной (__●__) среде. Рис.9. Изотерма сорбции фенола в кислой (--∆--) и нейтральной (__●__) среде. 0.010 6e-4 0.008 5e-4 4e-4 0.006 X/m, ммоль/г X/m, ммоль/г X/m, ммоль/г 0.05 0.004 3e-4 2e-4 1e-4 0.002 0 0.000 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 С, ммоль/л 0.0000 0.0005 0.0010 0.0015 0.0020 С, ммоль/л Рис.12. Изотерма сорбции бычьего альбумина в кислой (-∆-) и нейтральной (__●__) среде. Рис.11. Изотерма сорбции цианокобаламина в кислой (--∆--) и нейтральной (__●__) среде. 17 Табл.6. Параметры сорбции органических соединений на шунлите. рН 2 K фенол n 0,027 1,82 D см3/г X/mmax ммоль/г 80 0,053 0,029 2,04 200 0,053 0,051 0,064 6,08 1620 0,046 0,008 0,015 3,36 920 0,008 4,2х10-4 0,005 2,56 110 4х10-4 метиленовый 0,087 4,33 1660 синий цианокобаламин 0,003 1,49 520 бычий альбумин 0,035 1,48 рН 6,5 40 K n D X/mmax 3 ммоль/г см /г Значения коэффициентов распределения убывают в ряду: метиленовый синий> цианокобаламин > фенол > бычий альбумин, что согласуется со структурой этих соединений и, вероятно, определяется характером π-π взаимодействий сорбата и матрицей сорбента. 5. Исследование биологической активности шунлита. Исследование биологической активности шунлита проводили in vitro с помощью следующих молекулярных тест-систем: супероксиддисмутазной (СОД), каталазной глутатионпероксидазной (КАТ), (ГП), глутатионредуктазной (ГР), и пируваткиназной (ПК). Эти тест-системы, содержание ферменты антиоксидантной защиты, широко используют для выявления веществ, обладающих антиоксидантной, адаптогенной, противовирусной или противомикробной активностью. Расчеты скорости ферментативных реакций проводили на основании 3 измерений. Относительная ошибка определения не превышала 5%. Было установлено, что вытяжки из водных и водно-спиртовых растворов шунлита во всем изученном диапазоне концентраций не оказывают влияния на скорость каталазной реакции (рис.13). Активность каталазы также изучали в водных растворах, содержащих частицы шунлита. Исследования проводили в фосфатном буфере с рН 8,0, соответствующим концентрации максимальной шунлита в активности пробе, равной фермента 1 мкг/мл, (рис.14). происходила незначительная активация каталазы, что может свидетельствовать об 18 При Рис.13. Влияние водных и водно-спиртовых настоев шунлита на скорость каталазной реакции. антиоксидантном действии шунлита. При воздействии на каталазу более высоких концентраций шунлита (100-1000 мкг/мл) происходит ее ингибирование, что коррелирует с наличием антибактериальных свойств у шунлита. Учитывая, что шунлит может быть использован как энтеросорбент, представлялось целесообразным изучить его влияние на активность каталазы в кислой среде. С этой целью использовали K,Na-фосфатный буфер с рН3,4. Каталаза в зависимости от концентрации шунлита в условиях кислой среды (при рН = 3,4) проявляет два взаимопротивоположных эффекта, в присутствии относительно небольших концентраций шунлита (1 - 10 мкг/ мл) в кислой среде происходит ее ингибирование (рис.15), в то время как Рис.14. Влияние шунлита на активность каталазы при рН 8 Рис.15. Влияние шунлита на активность каталазы при рН 3,4 19 увеличение концентрации шунлита от 50 до 500 мкг/мл активирует каталазу в сотни и тысячи раз по сравнению с исходным контролем, не достигая, однако, значений, характерных для активности каталазы при оптимальном рН. Снижение рН буфера до 3,4, т.е. уход от рН-оптимума, характерного для каталазы, приводит к снижению активности каталазы в 60 раз, что, вероятно, связано с частичной денатурацией фермента. Установлено, что шунлит вызывает активацию супероксиддисмутазы во всем изученном интервале концентраций, причем максимальная активность фермента наблюдалась при концентрациях шунлита 1-100 мкг/мл (рис.16). Активирующее действие шунлита наблюдалось и в случае глутатионпероксидазной (рис.17) и глутатионредуктазной (рис.18) тестсистем. Скорость ГП-реакции при концентрации шунлита, равной 250 мкг/мл возрастала в 5 раз по сравнению с контролем, а скорость ГР-реакции Рис. 16. Влияние шунлита на активность Рис.17. Влияние шунлита на супероксиддисмутазы. активность глутатионпероксидазы возрастала в полтора раза при концентрации шунлита 100 мкг/мл. Было установлено, что все изученные концентрации шунлита ингибируют пируваткиназу (рис.19), что свидетельствует о наличии у шунлита антибактериальных свойств. 20 Рис.18. Влияние шунлита на активность глутатионредуктазы. Рис.19. Влияние шунлита на активность пируваткиназы. Изучение биологической активности шунлита in vitro показало, что он обладает несколькими ее видами. Активация ферментов антиоксидантной защиты (КАТ, СОД, ГП и ГР), свидетельствует о наличии антиоксидантной активности, а ингибирование ПК во всем исследованном интервале концентраций и ингибирование КАТ в некоторых интервалах концентраций - о наличии у шунлита бактерицидной активности. ВЫВОДЫ 1. На основании данных элементного и ренгтенофазового анализа с использованием банка рентгенодифракционных стандартов ICPDS и электронных баз данных по минералогии установлен минеральный состав шунлита. Минеральный микст шунлит состоит из кварца, кианита, микроклина, графита и шамозита. 2. Методом атомно-абсорбционной спектроскопии установлено, что содержание токсичных металлов в шунлите незначительно и составляет 0,0032 масс.% для Cu, 0,0088 масс.% для Zn, 0,0002 масс.% для Pb и 0,0014 масс.% для As, а содержание Cd и Hg не превышает 0,00001 масс.%. 3. Разработаны методики качественного и количественного анализа шунлита, определения содержания в нем примесей, отличающиеся хорошей специфичностью и воспроизводимостью. 21 4. Предложены показатели и установлены их нормы для оценки качества порошка шунлита при его стандартизации. Разработан проект ФСП на порошок шунлита для приготовления суспензии для приема внутрь. 5. Установлено, что порошок шунлита обладает высокой сорбционной способностью по отношению к ряду токсичных органических веществ и ионам тяжелых металлов в условиях in vitro. 6. С помощью молекулярных тест-ферментных систем установлено, что шунлит обладает выраженной антиоксидантной и бактерицидной активностью. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Васильева О.Ю., Прокопов А.А., Берлянд А.С., Дубинская В.А. Изучение действия природных шунгитов на ферментные тест-системы in vitro. Сборник “Естествознание и гуманизм”. Сибирский Государственный медицинский университет. Томск.2005. - Т.2.- №3. С.63. 2. Васильева О.Ю., Берлянд А.С. Анализ примесных элементов в природных шунгитах методом атомно-абсорбционной спектроскопии. Сборник “Естествознание и гуманизм”. Сибирский Государственный медицинский университет. Томск. - 2005. - Т. 2. - №3. - С.63. 3. Васильева О.Ю., Берлянд А.С., Алиханян А.С., Прокопов А.А. Стандартизация природного биологически активного минерального сырья шунлит Материалы научно-практической конференции “Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)”. Ростов-на-Дону: ЮНЦ РАН -2006.- С.85 4. Васильева О.Ю., Гойзман М.С., Г.Б.Тихомирова, Берлянд А.С., А.С.Алиханян, А.В.Шевяков. Количественный анализ нового природного биологически активного вещества шунлит. Химикофармацевтический журнал. 2007. - Т.41. - №10. - С.46-50. 22 5. Васильева О.Ю., Гойзман М.С., Г.Б.Тихомирова, Берлянд А.С., А.С.Алиханян, нового А.В.Шевяков. природного Химико-фармацевтический биологически активного вещества анализ шунлит. Химико-фармацевтический журнал. 2008. - Т.42. - №5. - С. 33-36. 6. В.В. Ягов, И.В. Ягова, О.Ю. Васильева, А.В. Бородин, А.Н. Жучков, А.С. Берлянд. Изучение сорбции высокотоксичных ионов тяжелых металлов природными шунгитами. Химико-фармацевтический журнал. 2008. - Т.42. - №11. - С. 41-44. 7. Васильева О.Ю., Берлянд А.С. Изучение сорбции ионов некоторых металлов новым природным биологическим активным веществом Шунлит. Сборник научных трудов IX международного конгресса “Здоровье и образование в XXI веке“ “Влияние космической погоды на биологические системы в свете учения А.Л. Чижевского“. 2008.Москва.- РУДН.- С.487-488. 8. Васильева О.Ю., Тихомирова Т.И., Берлянд А.С. Сорбция некоторых токсичных металлов на новом биологически активном веществе шунлит. Химико-фармацевтический журнал, 2009. Т. 43. №5. С.44-47. 9. Васильева О.Ю., Тихомирова Т.И., Берлянд А.С. Сорбция некоторых органических соединений на новом биологически активном веществе шунлит. Химико-фармацевтический журнал, 2009. Т. 43. №6. С.40-43 10. Васильева О.Ю., Берлянд А.С., Плесская сорбционных свойств нового природного Н.А. Исследование энтеросорбента шунлита. Тезисы I всероссийской конференции “Современные методы химикоаналитического контроля фармацевтической продукции“. - Москва. 2009. - С.35-36. 11. Васильева О.Ю., Берлянд А.С., Плесская Н.А. Установление минерального состава нового биологически активного вещества шунлит методом рентгенофазового анализа. Тезисы докладов XVII российского национального конгресса “Человек и лекарство“. – Москва. – 2010. – С.511. 23 Васильева Ольга Юрьевна “Физико-химические свойства, стандартизация и контроль качества нового биологически активного вещества шунлит “ Шунлит – новое биологически активное вещество минерального происхождения. В работе проведен количественный и химико- фармацевтический анализ шунлита, исследованы его сорбционные свойства и антиоксидантная активность. На основании полученных результатов количественного анализа шунлита, разработаны методики отличающиеся хорошей воспроизводимостью, выбраны показатели качества шунлита, применяемые для его стандартизации и разработан проект статьи ФСП на порошок шунлит, используемый в качестве суспензии для приема внутрь. Установлено, что содержание токсичных элементов в шунлите незначительно, что шунлит проявляет высокую сорбционную способность по отношению к различным неорганическим и органическим токсичным соединениям и обладает антиоксидантной активностью. Все это свидетельствует о возможности применения шунлита в качестве энтеросорбента. Olga Y. Vasilyeva “Physico-chemical properties, standardization and quality control of the new biologically active substance shunlite.” Shunlite is a new biologically active substance of mineral origin. Its quantitative and chemicopharmaceutical analysis has been carried out, its sorption properties and antioxidant activity have been investigated. Quantitative analysis technique was developed and quality index for its standardization was selected. Pharmacopoeia item was developed for shunlite, powder used for preparation of pulp for ingestion. It was found that the content of toxic elements in shunlite is low and shunlite exhibits antioxidant activity and high sorption capacity for some inorganic and organic toxic substances. All this indicates that shunlite may be applied as an enterosorbent. 24
