Соглашение 14.607.21.0063

Соглашение 14.607.21.0063
<Номер постера>
Федеральная целевая программа
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического
комплекса России на 2014—2020 годы»
Науки о жизни
Тема: Создание адресных бифункциональных агентов на основе цитотоксического белка лактаптина и опухоль-адресованных пептидов
для направленной элиминации раковых клеток
Соглашение 14.607.21.0063
на период 2014 - 2016 гг.
Руководитель проекта: Зам. Директора ИХБФМ СО РАН В.А. Рихтер
Получатель субсидии: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины
Сибирского отделения Российской академии наук
Цели и задачи проекта
Цель проекта: Разработка и получение бифункциональных агентов белковой природы для направленной элиминации раковых клеток - рекомбинантных слитых белков, состоящих из апоптоз-индуцирующего белка
лактаптина и опухоль-адресованных пептидов, обеспечивающих доставку лактаптина к опухоли.
Задачи проекта:
1. Разработать технологический процесс получения рекомбинантных слитых белков «адресный пептид-лактаптин», обладающих цитотоксической и противоопухолевой активностью и состоящих из апоптоз-индуцирующего
белка лактаптина и опухоль-адресованных пептидов, отобранных из комбинаторной пептидной библиотеки и обеспечивающих доставку противоопухолевого средства в опухоль.
2. Провести испытания цитотоксической активности слитых белков «адресный пептид-лактаптин» на культурах раковых и нормальных клеток мыши и человека in vitro.
3. Провести испытания адресных свойств полученных слитых белков «адресный пептид-лактаптин» на лабораторных животных c трансплантированными опухолями.
4. Провести испытания противоопухолевой активности полученных слитых белков «адресный пептид-лактаптин» на моделях алло- и ксенотрансплантатов in vivo.
5. Провести испытания острой токсичности слитых белков «адресный пептид-лактаптин» с наибольшим терапевтическим потенциалом на лабораторных животных согласно «Руководству по проведению доклинических
исследований лекарственных средств».
В настоящем проекте для усиления противоопухолевого эффекта лактаптина впервые использованы опухоль-адресованные пептиды, отобранные с помощью пептидной фаговой библиотеки и обеспечивающие
доставку противоопухолевого средства в опухоль, что позволит снизить дозу лактаптина, необходимую для получения терапевтического эффекта и увеличить эффективность противоопухолевой терапии.
Ожидаемые результаты проекта
Разработанные методики:
1. Методика отбора опухоль-адресованных пептидов из фаговой пептидной библиотеки методом аффинной селекции.
2. Методика получения генетических конструкций со встроенными генами лактаптина и опухоль-адресованных пептидов, обеспечивающих продукцию рекомбинантных слитых белков клетками штаммов-продуцентов E.
coli.
3. Методика выделения и очистки рекомбинантных слитых белков.
4. Методика оценки количественных параметров, характеризующих специфическую активность рекомбинантных слитых белков.
Экспериментальные результаты:
1. Опухоль-адресованные пепдиды, отобранные из пептидной фаговой библиотеки на культурах раковых клеток и опухолевых моделях
2. Генетические конструкции со встроенными генами лактаптина и опухоль-адресованных пептидов, обеспечивающие продукцию рекомбинантных слитых белков клетками штаммов-продуцентов E. coli.
3. Штаммы-продуценты E. coli, обеспечивающие наработку рекомбинантных слитых белков.
4. Экспериментальные образцы рекомбинантных слитых белков.
Разработанные документы:
1. Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ.
2. Отчеты о патентных исследованиях и о дополнительных патентных исследованиях.
3. Лабораторный технологический регламент наработки и очистки рекомбинантных слитых белков с наибольшим терапевтическим потенциалом.
4. Программа и методики испытаний экспериментальных образцов рекомбинантных слитых белков с наибольшим терапевтическим потенциалом.
5. Протоколы исследований и испытаний экспериментальных образцов рекомбинантных слитых белков
6. Технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера - организации реального сектора
экономики.
7. Проект технического задания на проведение ОТР по теме: «Создание опытно-промышленной технологии получения противоопухолевой субстанции на основе рекомбинантных слитых белков «адресный пептидлактаптин».
Перспективы практического использования
Результаты проекта будут востребованы исследовательскими организациями, биотехнологическими компаниями, разрабатывающими новые противоопухолевые препараты, фармацевтическими компаниями, которые
занимаются производством противоопухолевых терапевтических средств, и организациями практического здравоохранения для терапии злокачественных новообразований и улучшения качества жизни онкологических
больных.
Создание новых противоопухолевых лекарственных средств, обладающих направленным воздействием на опухолевые клетки и не оказывающих токсического действия на здоровые клетки организма, является в
настоящее время приоритетным направлением фундаментальных и прикладных исследований во всем мире. Результаты проекта - малотоксичные и высокоспецифичные адресные бифункциональные противоопухолевые
агенты, будут востребованы международным научным сообществом, в том числе при представлении на международных конференциях, и могут являться основой для международных фундаментальных исследований и
прикладных проектов.
Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г.
1. Проведен отбор опухоль-адресованных пептидов в системе in vitro на культурах раковых клеток человека (аденокарцинома молочной железы MCF-7 и MDA-MB-231 и аденокарцинома легких А549 и в системе in vivo в
модели ксенографтов на мышах линии SCID с трансплантированной опухолью человека MDA-MB-231. Проведен сравнительный анализ специфичности отобранных пептидов, экспонированных бактериофагами, in vitro
и in vivo.
Анализ специфичности клонов №15 и контрольного бактериофага
(№0) к раковым клеткам человека
линий MDA-MB-231 и MCF-7 и к
первичной
культуре
нетрансформированных
клеток
молочной железы человека BN-2
Относительная
связываемость
экспонированных пептидов in vivo
(модель ксенографтов MDA-MB231);
2. Получены генетические конструкции, обеспечивающие продукцию рекомбинантных слитых белков, клетками штаммов-продуцентов и рекомбинантные штаммы E.coli – продуценты слитых белков.
Генетические конструкции на основе отобранных
пептидов:
1. pET-15b_T1_RL (GLHTSATNLYLH)
2. pET-15b_T2_RL (SGVYKVAYDWQH)
3. pET-15b_T3_RL (YTYDPWLIFPAN)
Генетические конструкции на основе RGD-пептида:
5. pET-15b_RL_RGD_H (A)
6. pET-15b_RL_H_RGD (Б)
4. pET-15b_T4_RL (FIPFDPMSMRWE)
3. Проведены дополнительные патентные исследования. Подана заявка на патент № 2015132522 (приоритет от 04.08.2015) «Опухоль-специфический пептид для адресной химиотерапии опухолей молочной железы
человека».
4. Проведена отработка методов выделения и очистки рекомбинантных слитых белков, включающая следующие стадии: аффинная хроматография на IMAC Sepharose 6 Fast Flow; гель-фильтрация на DEAE Sephadex A-25;
катионообменная хроматография (1) на SP Sepharose Fast Flow; катионообменная хроматография (2) на SP Sepharose Fast Flow; анионообменная хроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow.
5. Проведена отработка методов контроля качества рекомбинантных слитых белков. Методы контроля: секвенирование ДНК генетических конструкций со встроенными генами опухоль-адресованного пептида и
лактаптина для подтверждения правильности нуклеотидных последовательностей, кодирующих рекомбинантные белки; электрофорез в ПААГ для оценки чистоты рекомбинантных белков; Вестерн-блот анализ слитых
белков с антителами к лактаптину для подтверждения подлинности полученных белков; высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) для анализа чистоты слитых белков; MALDI TOF масс-спектрометрия для
подтверждения первичной структуры слитых белков; ЛАЛ-тест для оценки содержания бактериальных эндотоксинов в экспериментальных образцах рекомбинантных белков.
6. Разработана методика получения рекомбинантных слитых белков, включающая наработку биомассы клеток-продуцентов слитых белков, выделение целевых рекомбинантных белков из биомассы клеток-продуцентов,
очистку целевых белков и анализ качества полученных экспериментальных образцов рекомбинантных слитых белков.
7. Проведена наработка пяти экспериментальных образцов рекомбинантных слитых белков T1-RL, T2-RL, T3-RL, RL_RGD_H и RL_H_RGD, содержащих опухоль-адресованный пептид и апоптоз-индуцирующий белок
лактаптин. Качество полученных экспериментальных образцов рекомбинантных слитых белков подтверждены современными методами генетического и биохимического анализа.
8. Разработана Программа и методики испытаний экспериментальных образцов рекомбинантных слитых белков, включающие разработку спецификации на экспериментальные образцы с обоснованием используемых при
испытаниях методов контроля и определением нормативных показателей качества испытуемых препаратов.
9. Разработана методика оценки количественных параметров, характеризующих специфическую активность рекомбинантных слитых белков, включающая оценку цитотоксической активности слитых белков на культурах
раковых клеток мыши и человека; оценку адресности слитых белков путем определения тропности к опухоли; оценку противоопухолевой активности слитых белков путем определения индекса торможения роста опухоли
in vivo на моделях алло- (гепатома, аденокарцинома легких) и ксенотрансплантантов (рак молочной железы); оценку аномальной токсичности слитых белков при внутривенном введении белым беспородным мышам.
Информация о проекте размещена на официальном сайте ИХБФМ СО РАН в сети интернет по адресу http://www.niboch.nsc.ru/doku.php/ru/science/grants/gk/2014_14.607.21.0063.
В 2015 г. за счет средств индустриального партнера ООО "ИРВИН 2" была проведена закупка материалов и оборудования для ферментации и для очистки и анализа качества рекомбинантных слитых белков.
Партнеры проекта
Индустриальный партнёр: Общество с ограниченной ответственностью «ИРВИН 2» (ООО «ИРВИН 2») - российская высокотехнологичная компания отрасли здравоохранения. Обеспечивает 100% внебюджетного
финансирования работ по проекту.
Основные направления деятельности: Поставка лекарственных средств, производство и поставка диагностического оборудования и комплексов лабораторной диагностики, научно-исследовательская деятельность в
области создания адресных систем доставки лекарственных средств, разработка инновационных лекарственных средств.
Соисполнитель: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук« (ИЦиГ СО
РАН). На базе ИЦиГ СО РАН действует ЦКП «SPF-виварий».
В рамках выполнения проекта на базе ЦКП «SPF-виварий» будут проводиться работы по исследованию адресности, противоопухолевой активности и острой токсичности разработанных слитых белков «адресный
пептид-лактаптин».
Соглашение 14.607.21.0063
<Номер постера>