Технологии оцифровки генетической информации В. Зубов Институт теоретической и

реклама
22.09.2011
Технологии оцифровки
генетической информации
«Новые поколения методов высокопроизводительного
секвенирования нуклеиновых кислот»
В. Зубов
Институт теоретической и
экспериментальной биофизики РАН
Пущино
Сокращения
NGS - Next Generation Sequencing
SBS - Sequencing By Synthesis
SOLiD - Sequencing By Oligonucleotide Ligation and Detection
PGM - Personal Genome Machine
NNGS - Next-Next Generation Sequencing
Единицы измерения
Mb - Megabase (миллион пар оснований)
Gb - Gigabase (миллиард п.о.)
Tb - Terabase (триллион п.о.)
Основные задачи NGS
Медицинская генетика
Фармакогенетика
Этногенетика
Эпигенетика
Диагностика
Трансплантология
Криминалистика
Биобезопасность
Селекционная работа
Теория эволюции
Происхождение человека
Происхождение жизни
Основные этапы развития NGS
Дореволюционный период
•
•
•
•
завершение проекта «Геном человека» (3 млрд.$);
резолюция Конгресса США о Национальном Дне ДНК (25.04.2003);
снижение стоимости секвенирования генома человека до 200 млн.$;
исчерпание потенциала Сенгеровской технологии секвенирования.
Революция 2005 года – появление NGS
I пятилетка (2005…2009 годы)
•
•
•
•
•
2005 г. - появление первого секвенатора нового поколения;
2006 г. - геном за 20 млн.$ (GS 20, 10…20 млн.п.о. за цикл);
2007 г. - геном за 1 млн.$ (GS FLX, ~ 100 млн.п.о. за цикл);
2008 г. - GA II (Illumina, ~ 3 млрд.п.о.) и SOLiD 2.0 (ABI, ~ 6 млрд.п.о);
2009 г. - цена генома опустилась ниже 100 тыс.$.
II пятилетка (2010…2014 годы)
2010 г. - HiSeq 2000 (Illumina, 200 млрд.п.о. за цикл);
- геном за 10 тыс.$;
- 5500xl (Life Tech., 180 млрд.п.о. за цикл).
2011 г. - геном за 5 тыс.$;
- PGM (Ion Torrent, 200 млн. п.о. за цикл).
Общие принципы NGS
Пробоподготовка основана на получении клонов ДНК
Клоны размещаются на стенке проточной ячейки
Через ячейку пропускаются растворы реагентов
Реагенты участвуют в синтезе ДНК
Информация считывается ПЗС- или КМОП-сенсорами
Ячейка промывается
Основные технологии NGS
Фирмы
Технология
секвенирования
Производительность
(2011 г.)
Продолжительность
рабочего цикла
Биолюминесцентная
~ 1 Gb
≤ 23 ч
Флуоресцентная
ДНК-полимеразная
200…500 Gb
5…10 дней
Флуоресцентная
ДНК-лигазная
200 Gb
5…10 дней
Полупроводниковая
200 Mb
2…4 ч
Краткая история пиросеквенирования
Шведский период
• 1985 год – шведские учёные Pål Nyren и Arne Lundin разработали чувствительный
люминометрический метод определения пирофосфата;
• 1987 год – P. Nyren разработал пирофосфатный метод анализа ДНК-полимеразной
активности;
• 1988 год – E. Hyman предложил использовать этот метод для секвенирования ДНК;
• 1990 год – получен патент на пирофосфатный метод секвенирования ДНК;
• 1997 год – создана компания «Pyrosequencing» (до 2008 г. - “Biotage AB”).
Американский период
• 2000 год – в США учреждена компания «454 Life Sciences»;
• 2004 год – «454 Life Sciences» получает от NIH гранты на совершенствование
метода геномного секвенирования (2,4 млн.$) и на разработку ультрамикрометода
секвенирования геномов (5 млн.$);
•
•
•
•
•
2005 год – появление коммерчески доступных пиросеквенаторов GS 20;
2007 год – выпуск модели GS FLX;
2009 год – GS FLX Titanium;
2010 год – GS Junior;
2011 год – FLX+.
Технология пиросеквенирования
Проточные ячейки пиросеквенаторов
Пиросеквенаторы FLX и Junior
Флуоресцентные технологии
(пробоподготовка)
http://seq.molbiol.ru/sch_lib_fr.html
Получение клонов ДНК
SBS / SBL
(sequencing by synthesis / sequencing by ligation)
N
3
Cy3
Cy3 - XXXX -
S ~ P - NNNNN - OH
P - NNNNN- P
US Pat.№ 7795424
~ S - XXXX -
Cy3
N
3
TCEP
tris(2-carboxy-ethyl)phosphine
AgNO3
Phosphatase
5’
3’
3’
5’
Форматы проточных ячеек
2х8
2х1 2х4 2х8
Динамика роста производительности
флуоресцентных секвенаторов
GA IIx
SOLiD
Jeremy Preston, PhD (Illumina, Marketing Manager, июль 2009 г.) - http://www.solexa.com/seminars/archive/presentations/200907_JPreston.pdf
http://www3.appliedbiosystems.com/AB_Home/applicationstechnologies/SOLiDSystemSequencing/overviewofsolidsystem/index.htm
Флуоресцентные секвенаторы
HiSeq 1000
HiSeq 2000
5500
5500xl
Max-Seq
Технология Complete Genomics
In Sequense. September 20, 2011. By Monica Heger
… Currently, Complete Genomics is operating 24 machines in its Mountain View, Calif., which
can each produce one genome per day. …
Война клонов
Технология
Диаметр
клонов
Количество
молекул ДНК
10…30 мкм
1…10 млн.
1…2 мкм
1…2 тыс.
1…2 мкм
2…3 тыс.
2 мкм
2…3 тыс.
0,2…0,3 мкм
200…600
Полупроводниковая технология
(“тёмная сторона” секвенирования)
Personal Genome Machine
(первая встреча)
Дина Надыршина и Ирина Гилязова у выставочного стенда компании Ion Torrent
(14.06.2010, Швеция, European Human Genetics Conference)
Основные этапы технологии
An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing /
J.M. Rothberg et al. // Nature. – 2011. – Vol.475. – P.348–352.
Принципиальная схема
полупроводникового секвенатора
An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing /
J.M. Rothberg et al. // Nature. – 2011. – Vol.475. – P.348–352.
Сенсорные чипы и проточные ячейки
An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing /
J.M. Rothberg et al. // Nature. – 2011. – Vol.475. – P.348–352.
Структура pH-сенсорных чипов
Ion 314
Ion 318
Ion 316
Ion 320 ?
Внешний вид и общее устройство PGM
An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing /
J.M. Rothberg et al. // Nature. – 2011. – Vol.475. – P.348–352.
Экспансия PGM
PGM в Индии
PGM в Чили
Jonathan M. Rothberg
(вождь NGS)
http://www.profimedia.si/picture/personalized-medicine-jonathan-m-rothberg/0089893207/
NNGS
(наносеквенирование)
“НАНО” без “НО” не бывает
PacBio RS
In Sequense. September 20, 2011. By Monica Heger
Pacific Biosciences said today that it has had to cut approximately 130 employees, or 28
percent of its workforce, in response to "uncertainties associated with the economic
environment" and a slower-than-projected adoption rate of its PacBio RS. …
Основные модели секвенаторов
2005
GS 20
2006
2007
2008
GS FLX
GA 1G
2009
2010
Titanium
GS Junior
GA II……x………e HiSeq 2000
SOLiD 2.0
SOLiD 3
2011
FLX+
HiSeq 1000
SOLiD 4
5500xl
5500
PGM
PacBio RS
MaxSeq
Цены
(тыс. $, май 2011 г.)
FLX / Junior
500 / 108
+ 30 / 16
HiSeq 2000 / 1000
690 / 560
+ 55 / 55
5500xl / 5500
595 / 349
+ 54 / 54
PGM
49,5
+ 18
http://www.molecularecologist.com/next-gen-table-3a/
Скачки с препятствиями
$600,000
$500,000
$400,000
$300,000
$200,000
$0
$100,000
PGM
5500
5500xl
HiSeq 2000
HiSeq 1000
GA IIx
Junior
FLX
Max-Seq
RS
MiSeq ?
Эволюция технологий NGS
2005 г.
– рождение пиросеквенирования
2007…2010 г.г. - развитие флуоресцентных технологий
2011 г.
- начало эволюции полупроводниковых технологий
2012 г.
- вымирание пиросеквенирования
2013…2014 г.г. - появление секвенаторов эконом-класса
Типы секвенаторов
Обычный геномный секвенатор
Секвенатор эконом-класса
Схема полупроводникового секвенатора
с замкнутой системой подачи реагентов
2
1
1. Ёмкости с промывочным раствором.
2. Ёмкости с реагентными растворами.
3. Перистальтический насос.
4. Шаговые моторы.
5. Датчики кондуктометра.
6. Многоходовые краны.
7. Проточная ячейка.
8. Сенсорный чип.
9. Контроллер чипа.
10. Контроллер шаговых моторов.
11. Плата кондуктометра.
12. Управляющий компьютер.
1
4
3
5
5
7
4
4
6
6
5
5
8
12
9
10
11
Раздел сфер влияния
Флуоресцентное секвенирование
Полупроводниковое секвенирование
Практика
Наука
Ре секвенирование геномов
Медицинская генетика
Фармакогенетика
Этногенетика
Эпигенетика
Диагностика
Трансплантология
Криминалистика
Биобезопасность
Селекционная работа
Секвенирование геномов de novo
Теория эволюции
Происхождение человека
Происхождение жизни
NNGS
Экспрессная генодигностика инфекционных болезней (?)
Благодарю за внимание
Скачать