С.Н. Щербо - Методы генодиагностики и их использование в
реклама
Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Кафедра клинической лабораторной диагностики ФДПО Щербо Сергей Николаевич МЕТОДЫ ГЕНОДИАГНОСТИКИ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ МЕТОДЫ ГЕНОДИАГНОСТИКИ • ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ нуклеиновых кислот • АМПЛИФИКАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ (ПЦР) • СЕКВЕНИРОВАНИЕ нуклеиновых кислот ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Лабораторные методы, основанные на гибридизационном анализе нуклеиновых кислот. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH); Метод усиления гибридизационного сигнала на основе разветвленной ДНК; ДНК/РНК гибридизационный захват; Фундаментальный принцип молекулярной биологии: существование КОМПЛЕМЕНТАРНЫХ взаимодействий между молекулами НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ создают основу для разработки ГИБРИДИЗАЦИОННЫХ и ПЦРтехнологий для молекулярного анализа геномов. Наиболее частые анеуплоидии • Трисомия 21 – синдром Дауна • Трисомия 18 - синдром Эдвардса • Трисомия 13 – синдром Патау • >97% всех хромосомных аномалий плода FISH – синдром Эдвардса хромосома 13 хромосома 18 хромосома 21 хромосома Х хромосома У Метод гибридизации с использованием разветвленных зондов (bDNA) представляет собой пример амплификационных технологий, позволяющих усиливать в ходе определения сигнал. В результате многоступенчатого процесса гибридизации, происходит присоединение многочисленных зондов, коньюгированных с молекулами фермента, окисляющего специальный субстрат и запускающий таким образом хемилюминесценцию. VERSANT bDNA TECHNOLOGY Bayer HelthCare ДНК/РНК гибридный захват ВПЧ Digene-тест Технология осуществляется в пять этапов и заключается в уникальном способе связывания вирусной ДНК с РНК-зондом, захвате полученного гибрида моноклональными антителами и хемилюминесцентной детекции образуемых комплексов (метод гибридного захвата) Прогностическая ценность теста: 99% Чувствительность теста: свыше 95% Специфичность теста эквивалентна цитологическому исследованию Исследование автоматизировано, время 2,5 ч. Образцы клеток эпителия, биопсийного материала Проведение ВПЧ Digene-теста МИКРОБИОЧИПЫ (MICROARRAY) Микробиочипы представляют собой миниатюрные устройства для анализа специфических взаимодействий биологических макромолекул (олигонуклеотиды, фрагменты геномной ДНК, РНК, белки, рецепторы, лиганды и другие). Принцип миниатюризации, реализованный в биочипах, приводит к снижению себестоимости и повышению производительности выполнения анализа (несколько десятков и сотен тысяч параметров одновременно) и очень высокой автоматизации исследований. ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МИКРОБИОЧИПОВ ВЫЯВЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ И ИХ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВЫХ ФОРМ ПОЛИМОРФИЗМ ПО ЕДЕНИЧНЫМ НУКЛЕОТИДАМ (ОНКОЛОГИЧЕСКИЕ, ССЗ И ДР.) ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, ПРОФИЛЯ микроРНК ИЗУЧЕНИЕ ВОСПРИИМЧИВОСТИ К ЛС Фотолитография олигомеров на твердую подложку ПРИМЕНЕНИЕ БИОЧИПОВ Affymetrix Важно, что биочипы могут быть использованы неоднократно (за исключением ДНК-чипов на гелевых подложках). Компания предлагает на продажу 6 чипов для анализа экспресии генов (Hu6800 Set, Mu19K Set, Mu11K Set, Mu650 Set, Ye6100 Set, Test 1), один чип для анализа единичного нуклеотидного полиморфизма (HuSNP2K Assay) и 3 чипа для анализа мутаций и полиморфизма (HIV PRT Plus Assay, p53 Assay, CYP450 Assay). ЭКСПРЕССИОННЫЕ МИКРОБИОЧИПЫ ЭКСПРЕССИОННЫЕ БИОЧИПЫ Ученые Стэндфордского университета (США) исследовали экспрессию генов тканей почек у 74 человек в возрасте от 27 до 92 лет и соотносили с процессами изменения функций почек в процессе старения организма. Использовали около 33 тыс. нуклеотидных последовательностей. Выяснилось, что 985 генов в почечных тканях изменяют свою активность на протяжении жизни. Из них с возрастом 742 гена увеличивают экспрессию, а 243 уменьшают. Некоторые люди имели несоответствующих возрасту активность генов. У одних почечная ткань была слишком стара для молодого возраста, у других еще молода для старости. Биочипы на основе микрофлюидомных технологий ВОЗМОЖНЫЕ ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ BioMark ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ОТДЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ ОНП АНАЛИЗ CNV АНАЛИЗ ДНК СИКВЕНС ОТКРЫТАЯ СИСТЕМА: TaqMan, Roche UPL, интеркалирующие красители Digital Array™ IFCs 1 12765 48770 КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ МИКРОБИОЧИПОВ Выделяют три основных области применения микробиочипов: лабораторная диагностика, классификация и прогноз течения заболеваний, анализ механизмов биологических процессов и патогенез заболеваний. ПРОГНОЗ ТЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ Affymetrix Излечимые виды лейкозов дают одни узоры (паттерны), неизлечимые дают совсем другие паттерны. На рисунке можно видеть, как окрашенная ДНК от разных больных образует различные паттерны на биочипе. Болезнь одна и таже, паттерны — разные. По виду паттернов можно с большой вероятностью предсказать течение болезни на самой ранней ее стадии. В данном случае при паттерне типа 1 верятность метастаз равна нулю, при паттерне типа 2 — уже 29%, при паттернах типа 3 и 4 соответственно 75% и 77%. ПОДБОР И МОНИТОРИНГ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ AmpliChip CYP450 Микробиочипы активно используются в фармакологии: опубликован протокол применения биочипов GenenChip для фармакологических исследований. Важнейшей системой метаболизма лекарств является система цитохрома Р-450. Биочип AmpliChip CYP450 содержит более 15000 различных олигонуклеотидпых зондов, чтобы анализировать как смысловые, так и антисмысловые последовательности образца амплифицированой целевой ДНК. Практически все известные полиморфизмы и аллели CYP2D6, и два наиболее часто встречающихся для CYP2C19, могут быть обнаружены одновременно. Биочипы как инструмент в широкомасштабных генетические исследованиях и технологии генотипирования. БИОЧИПЫ И GWAS Использование биочипов в постгеномный период развития медицины связано с участием ведущих фирм производителей в крупных международных проектах исследований полногеномных ассоциации (GWAS). Основным вопросом становиться определение изменений в геноме, которые связанны с фенотипом или характерны для определенного заболевания. The Genome-Wide Human SNP Array 6.0 • 1,8 млн маркеров: 906 600 ОНП и 946 000 зондов для детекции вариаций числа копий (CNV) • Более 500 различных образцов, включая 270 HapMap • Генотипирование человека и мыши • > 40 млн. генотипов/день при использовании системы GCS3000 ТЕХНОЛОГИИ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ СЕКВЕНИРОВАНИЕ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ NEXT-GENERATION SIQUENCING (NGS) В 2005 ГОДУ ВОЗНИКЛИ ПЕРВЫЕ ПЛАТФОРМЫ ДЛЯ ПАРАЛЛЕЛЬНОГО ДНК СЕКВЕНИРОВАНИЯ, ОТКРЫВ ЭРУ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ; СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПУТЕМ СИНТЕЗА С ОБРАТИМОЙ ТЕРМИНАЦИЕЙ (ILLUMINA) ПИРОСЕКВЕНИРОВАНИЕ (ROCHE) СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПУТЕМ ЛИГИРОВАНИЯ (SOLID) ПОЛУПРОВОДНИКОВОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ (ION TORRENT) СЕКВЕНИРОВАНИЕ ОДНОЙ МОЛЕКУЛЫ (HELICOS GENETIC ANALYSIS SYSTEM) НАНОСЕКВЕНИРОВАНИЕ (COMPLET GENOMICS) В НАСТОЯЩЕЕ ВРЕМЯ НА РЫНКЕ ЛИДИРУЕТ КОМПАНИЯ ILLUMINA, КОТОРАЯ ЗА ДВА-ТРИ ГОДА СОБИРАЕТСЯ ДОВЕСТИ СТОИМОСТЬ ПОЛНОГЕНОМНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ ОДНОГО ГЕНОМА С 30х ПОКРЫТИЕМ (КРАТНОСТЬ ПРОЧТЕНИЯ) ДО СУММЫ МЕНЬШЕ 1000 ДОЛЛАРОВ США. SOLiD™ System Инновации SOLiDTM Цена сиквенса генома человека $M Throughput (GB) +SOLiD 4 & 4hq System 100,000.00 upgrade 300 ~$3,000,000,000 10,000.00 120 SOLiD 3 System 100 80 ~13 years SOLiD System SOLiD Platform 1,000.00 SOLiD 2 System 100.00 10.00 60 Moore’s Law 1.00 40 20GB 20 3GB 0.10 6GB <2 weeks ~$5,000 0.01 0.001 0 2007 2008 2009 2010 1990 2001 2007 2009 2012 СЕКВЕНИРОВАНИЕ 2014 ГОД К 2011-2014 гг. сложилась более ровная ситуация и целью является достижение цены секвенирования полного генома за 1000 долларов США. Фирма Life Technology представила в 2012 г. секвенатор Ion Proton, который должен был к концу года выйти на уровень 1000 долларов США за геном. Однако в настоящее время стоимость при анализе значительного количества образцов колеблется между 5000 и 4000 долларов США. Аналогичная попытка предпринята в 2014 г. фирмой Illumina при презентации секвенатора HiSeqX. В настоящее время происходит замена существующих технологий на более производительные: так Roche поглотила ряд перспективных молодых компаний и активно сотрудничает с Pacific Biosciences. ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ (NGS) В МЕДИЦИНЕ ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ NGS В МЕДИЦИНЕ ТРУДНОСТИ: СОЗДАНИЕ ПРОСТЫХ ТЕХНОЛОГИЙ, ДОСТУПНЫХ ДЛЯ ЛАБОРАТОРИЙ. ПОЛУЧЕНИЕ РАЗРЕШЕНИЙ НА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕННЕТИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ И ОБОРУДОВАНИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ. В 2012-2014 гг. в США появились первые рутинные диагностические технологии, основанные на технологиях высокопроизводительного секвенирования, а секвeнатор MiSeqDx получил одобрение FDA по применению в медицинской практике. НАПРАВЛЕНИЯ: РАЗЛИЧНЫЕ ВАРИАНТЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТЕСТИРОВАНИЯ (ГТ): ДИАГНОСТИЧСКИМ ИЛИ ПРОГНОСТИЧЕСКИМ. ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОБИОЦЕНОЗА ЧЕЛОВЕКА. В настоящее время в ПМ можно выделить несколько направлений ГТ: преимплантационное, пренатальное, неонатальное, педиатрическое и терапевтическое для взрослого населения. Обычно ГТ применяют в случаях наличия клинических симптомов или родственников, страдающих генетическим заболеванием. Технологически ГТ осуществляется двумя методами, во-первых, таргетной диагностикой при наличии конкретных генетических полиморфизмов, и, во-вторых, полногеномного секвенирования. В первом случае исследуют конкретные генетические полиморфизмы: ОНП, CNV, вставки, делеции, дупликации и т.д. целевых генов или хромосомного региона. ТАРГЕТНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ – ОГРАНИЧЕННОЕ ИНТЕРЕСУЮЩИМИ ИССЛЕДОВАТЕЛЕЙ УЧАСТКАМИ ГЕНОМА, КОТОРЫЕ МОЖНО ПРОЧИТАТЬ С БОЛЕЕ ВЫСОКИМ ПОКРЫТИЕМ. ПОЛНОГЕНОМНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Полногеномные исследования применяют при заболеваниях с не совсем четкой клинической картиной, МФЗ, связанными с мутациями в нескольких генах, а также при проведении скрининговых исследований для выявления редких и не очевидных фенотипов. Риск развития МФЗ у данного конкретного человека зависит от ряда факторов: семейной наследственности, стиля жизни, физических нагрузок и разработаны математические модели, которые учитывают вклад указанных рисков. Геном в настоящее время рассматривается в качестве открытой системы и создание полногеномного профиля пациентов даст возможность разделить их на группы риска и выявить новые диагностические генетические маркеры, а также использовать для предсказания ответа на различные ЛС. Информация, полученная в результате ГТ может быть использована для оценки персонального ответа на ЛС, выбора лекарственного препарата и дозы. Направления разработок Частые мультифакториальные заболевания и синдромы (ИБС, нарушения свертываемости крови, остеопороз и т.д.) Молекулярная онкология – герминальные мутации (BRCA1, BRCA2), соматические мутации (KRAS, BRAF), транспорт лекарств, васкуляризация опухоли Фармакогенетика (цитохромы, NAT2, TPMT, EPHX1) Профессиональные заболевания: аллергодерматозы, бронхолегочная патология (цитохромы, MMP1) Генетическая предрасположенность к инфекционным заболеваниям (интерлейкины, TOLL-рецепторы, белки системы комплемента) – планируем ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ NGS ПРЕИМПЛАТАЦИОННОЕ – если у будущих родителей высок риск передачи наследственного заболевания ребенку, врач (обычно в рамках экстракорпорального оплодотворения – ЭКО) может быть назначена преимплантационную генетическую диагностику эмбриона. ПРЕНАТАЛЬНОЕ – выявление риска развития определенного заболевания НЕОНАТАЛЬНОЕ – новорожденный ребенок может быть подвержен генетическому исследованию ДЕТСКОЕ, ПЕДИАТРИЧЕСКОЕ – ребенок с отставанием в развитии может быть подвергнут генетическому исследованию в целях постановки диагноза ВЗРОСЛОЕ, ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ – пациент, имеющий в истории семьи родственников, страдающих определенным заболеванием, хочет выяснить имеет ли он генетическую предрасположенность к развитию данного вида заболевания (онкология, ССЗ, эндокринология и др.) РЕЗУЛЬТАТ: применение оптимальных методов диагностики и лечения. Например, в результате колоноскопии и удалении полипов во избежание развития наследственного неполипозного рака толстой кишки или превентивной мастэктомии для снижения риска развития РМЖ. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ СКРИНИНГ БУДУЩИХ РОДИТЕЛЕЙ Генетический скрининг будущих родителей рекомендуют, как лицам входящим в группу риска, так и внешне здоровым. Выделяют два фактора: близкородственные браки (10%) и одинаковая этническая принадлежность. Ряд стран Ближнего Востока и Средиземноморья реализуют программу по выявлению носителей талассемии ( в Иране , где ГТ является частью обязательного добрачного исследования рождаемость младенцев с этим заболеванием снизилась на 70%). Согласно статистике, каждый второй человек является носителем одного или нескольких наследственных заболеваний. Использование в ГТ циркулирующей в кровотоке матери внеклеточной ДНК плода (celf-free fenal DNA, cffDNA) Весьма перспективной технологией пренатального ГТ является использование циркулирующей в кровотоке матери внеклеточной ДНК плода, начиная уже с пятой недели беременности. По числу прочтений, которые относятся к исследуемой хромосоме относительно референсной, можно определить случаи анеуплодии, выявить пол будущего ребенка, хромосомные перестройки. Указанный метод в 2012 г. одобрен как дополнение к существующим протоколам в США, но назначается либо при высоком риске наследственных заболеваний, или по желанию. Схема отображает все этапы теста Panorama Анализ внеклеточной ДНК плода Концентрация внеклеточной ДНК плода составляет 37% от всей свободной циркулирующей (внеклеточной) ДНК и достигает 25-30% к средине второго триместра. Самый многообещающий метод – секвенирование всей внеклеточной ДНК плазмы матери с использованием технологии NGS. По числу прочтений, относящихся к интересующей хромосоме относительно референтной хромосомы можно определить случаи анеуплодии. Возможно определение пола ребенка, выявить небольшие хромосомные перестройки и т.д. Если проводится высокопроизводительное секвенирования всей внеклеточной ДНК и матери и плода, то это дает возможность диагносцировать любое наследственное заболевание. Генеральный директор компании Illumina, Джей Флэтли, заявил, что полное считывание ДНК для каждого новорожденного будет технически возможным и доступным менее чем за пять лет, что обещает революцию в здравоохранении и к 2019 году оно будет обычным делом. Проведение полногеномного генетического тестирования всех новорожденных в Великобритании позволит, по мнению специалистов выявить у 17% обследованных наследственные заболевания на самой ранней стадии. СЛОЖНЫЙ ГЕНОМНЫЙ ЛАНДШАФТ ОПУХОЛИ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ NGS ПОКАЗАЛО ЧТО ОПУХОЛЬ ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ СОВОКУПНОСТЬ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ С РАЗЛИЧНЫМИ ПРОФИЛЯМИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ. МОДЕЛЬ «ВЕТВЯЩЕЙСЯ ЭВОЛЮЦИИ»: ОПУХОЛЬ ИНИЦИИРОВАНА КЛЕТКАМИ, НЕСУЩИМИ ПЕРВИЧНУЮ МУТАЦИЮ, ЧЕРЕЗ НЕКОТОРОЕ ВРЕМЯ ДАЕТ НАЧАЛО ЦЕЛОМУ РЯДУ КЛОНАЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ (ЛОМАЕТСЯ СИСТЕМА ЗАЩИТЫ ДНК) ТЕХНОЛОГИИ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ЕДЕНИЧНЫХ КЛЕТОК ПОЗВОЛЯЮТ ВЫЯВЛЯТЬ РАЗНООБРАЗИЕ ИХ ГЕНОМНЫХ НАРУШЕНИЙ И ИЗМЕНЕНИЙ ТРАНСКРИПТОМОВ. ГТ онкологических заболеваний С появлением ГТ онкологические заболевания рассматриваются как генетические, поэтому в диагностическом и терапевтическом плане весьма актуальным является использование рассматриваемых технологий секвенирования. К настоящему времени известно большое число онкогенов (более 400) и супрессоров опухолей. Сложность анализа генома при раке заключается в том, что 80-90% мутаций не наследственного характера, однако достаточно мутации в одной копии гена для того, чтобы клетка стала раковой. Такие доминантные онкогены обуславливают до 90% всех раковых заболеваний. Остальная часть приходится на мутации в генах-супрессорах, однако в этом случае мутировать должны обе копии гена-супрессора и такие мутации могут передаваться по наследству. Онкогены и гены супрессоры Онкогены контролируют в нормальной клетке клеточный цикл и апоптоз и связаны с факторами роста и апоптоза, трансдукторами и транскрипционными факторами и мутации способствуют раковому перерождению. С другой стороны гены супрессоры опухолей ответственны за блокировку неконтролируемого клеточного роста и деления, запускают апоптоз или защищают геном от повреждений. Указанные гены-супрессоры в результате либо мутаций, либо эпигенетических изменений (например, метилирование) могут терять свои функции. ГТ онкологических заболеваний По оценкам для злокачественной трансформации клетки в зависимости от типа рака необходимо от 3 до 12 мутаций. Некоторые мутации (TP53, KRAS и ряд других) выявляются в ряде опухолей, а некоторые тканеспецифичны (RB1). Технология высокопроизводительного секвенирования позволяет проанализировать все мутации генома опухолевой клетки в одном секвенировании экзома. Хотя опухоли часто генетически гетерогенны благодаря многократному прочтению генома даже редкие варианты могут быть идентифицированы. Отметим некоторые особенности и ограничения при анализе раковых геномов: ограниченное количество ДНК в биоптате, некротизация опухолей и примеси нормальных клеток, различные клоны опухоли, а также необходимость одновременного секвенирования генома пациента, опухоли и референсного. Проекты в онкологии НОРВЕГИЯ: ЦЕЛЬ ПРОЕКТА СЕКВЕНИРОВАНИЕ НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ ТКАНЕЙ КАЖДОГО ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ПАЦИЕНТА В СТРАНЕ. ПОЛУЧИЛ ПОДДЕРЖКУ ПРАВИТЕЛЬСТВА. НАЧАЛО: 2000 ПАЦИЕНТОВ ВОСЕМЬ ТИПОВ РАКОВ. ПРОЕКТ ЕС IT-FUTURE OF MEDICINE ОБЪЕДИНЕНИЕ ГЕНОМИКИ ТРАНСКРИПТОМИКИ, ПРОТЕОМИКИ, МЕТАБОЛОМИКИ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ОБЩИХ ПРЕДСКАЩАТЕЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ ВСЕХ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ПАЦИЕНТОВ В ЕВРОПЕ ПЕРСПЕКТИВЫ ГС В настоящее время ГС применяется в диагностике наследственных, онкологических и некоторых МФЗ, однако весьма перспективно применение данных технологий в оценке микробиомного биоценоза человека. С точки зрения организации проведения исследований весьма перспективно создание крупных сервисных центров по секвенированию и накопления и обработки данных. По данным данным GenBank на протяжении последних 30 лет объемы данных о НП растут экспоненциально, обработка которых значительно отстает из-за недостатка биологических знаний и биоинформационных алгоритмов. ПЕРСПЕКТИВЫ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ Наблюдается тенденция к отказу владения оборудованием в отдельных лабораторий к использованию услуг в специализированных сервисных центрах. Уже сегодня центры секвенирования по всему миру владеют более 50% секвенаторов и производят до 80% всех генных данных. Можно предполагать, что в течение ближайших 3-5 лет возникнут более производительные технологии секвенирования и будет взята отметка в 1000$, затем 100 $. Благодарю за внимание
