Новые технологии секвенирования ДНК В. Зубов Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Медико-генетический научный центр РАМН
г. Москва
11.06.2009 г.
Новые технологии секвенирования ДНК
В. Зубов
Институт теоретической и
экспериментальной биофизики РАН
Пущино
День Генома
Dr. James Watson, co-discoverer of the DNA helix
and father of the Human Genome Project, became
the first human to receive the data encompassing
his personal genome sequence at Baylor College of
Medicine in Houston in May
31, 2007.
James Watson (left) receives a digital copy of
his genome sequence from Jonathan Rothberg
in May 2007.
День ДНК
Финансирование разработок
Бюджетное фининсирование:
I пятилетка – 100 000$ и 1000$ за геном
2004 г. – 39 млн.$
2005 г. – 31 млн.$
2006 г. – 13 млн.$
2007 г. – 16 млн.$
2008 г. – 20 млн.$
II пятилетка – 1000$ за геном
2009 – 2013 г.г.
“Внебюджетное” финансирование:
> 100 млн.$ -
Характеристики геномных секвенаторов
(2009 г.)
Секвенатор
млрд. /
сутки
FLX Titanium
1,0…1,4
~ 0,4
~ 0,5
400…500
Genome Analyzer IIx 1,5…1,9
~ 6,5*
9,5…12*
2х50/2х75
12…14*
20…30*
2х50
SOLiD 3
* В режиме 2х50
1,5…2,3
Раб. цикл
мрлд./
(суток)
раб. цикл
Длина чтения
(п.о.)
Next Generation Sequencing
(NGS)
1. Pyrosequencing
2. Cluster-SBS
3. SOLiD
Jonathan Rothberg – основатель компании
454 Life Sciences
Dr. Rothberg was born in 1963
in New Haven, M.S., M.Phil, and
Ph.D. in biology from Yale University.
Dr. Rothberg is the founder of 454 Life Sciences,
Clarifi Corporation, CuraGen Corporation, The
Rothberg Institute for Childhood Diseases, and the
co-founder and Chairman of RainDance Technologies.
Пиросеквенирование
(основные этапы)
• 1985 год – шведские учёные Pål Nyren и Arne Lundin разработали
чувствительный люминометрический метод определения пирофосфата;
• 1987 год – P. Nyren разработал метод анализа ДНК-полимеразной
активности, основанный на определении пирофосфата;
• 1988 год – Edward Hyman предложил использовать этот метод для
секвенирования ДНК;
• 1990 год – им же получен патент на пирофосфатный метод секвенирования
нуклеиновых кислот;
• 1997 год – создана компания “Pyrosequencing” (до 2008 г. - “Biotage AB”);
• 2000 год – в США учреждена компания “454 Life Sciences”;
• 2004 год – компания “454 Life Sciences” получает от NIH гранты на
совершенствование своего метода геномного секвенирования (2,4 млн.$) и на
разработку ультрамикрометода секвенирования геномов (5 млн.$);
• 2005 год – появление коммерчески доступных пиросеквенаторов GS 20;.
• 2007 год – выпуск модели GS FLX;
• 2009 год – GS FLX Titanium.
Основы пиросеквенирования
Технология пиросеквенирования
GS FLX Titanium
http://www.pssclabs.com/roche/pdf/FLX_Titanium_Cluster21.pdf
Количество циклов увеличено в 2 раза (у GS 20 и FLX – 100)
Длина чтения - >400 п.о. (GS 20 - >100 п.о., FLX - >200 п.о.)
Производительность - ~ 0,5 млрд. п.о. (за 10 часов).
Распределение длины FLX-сиквенсов
(Titanium)
Run completed with
improved Genome
Sequencer FLX Titanium
series chemistry
demonstrating a modal
read length of 766 base
pairs.
http://www.454.com/products-solutions/future-of-454-sequencing.asp
Парноконцевые библиотеки ДНК
http://www.454.com/downloads/DeNovoComplexGenomes_Flyer.pdf
23 Apr 2009
Области применения
•Metagenomic Analysis
•RNA Virus Sequencing
•Small RNA Analysis
•Comprehensive Analysis of MicroRNAs
•Transcriptome sequencing
•Expression tags
•ChIP-seq/Methylation/Epigenetics
•Amplicon Sequencing
•Mitochondria/Viruses/Plastids/Plasmids
•Ancient DNA
•Prokaryote Whole Genome
Eukaryote Whole Genome ?
Флуоресцентные геномные секвенаторы
Genome Analyzer IIx
SOLiD™ 3 System
Подготовка библиотеки фрагментов
http://seq.molbiol.ru/sch_lib_fr.html
Получение мономолекулярных клонов
(кластеров) ДНК
Форматы проточных ячеек
2х8
2х1 2х4 2х8
Геномные секвенаторы –
флуоресцентные микроскопы
Темнопольный
Эпифлуоресцентный
SBS / SBL
(sequencing by synthesis / sequencing by ligation)
Полимеразный синтез ДНК
Лигазный синтез ДНК
A new class of cleavable fluorescent nucleotides: synthesis and optimization
as reversible terminators for DNA sequencing by synthesis /
Turcatti G., Romieu A., Fedurco M., Tairi A.-P. // Nucleic Acids Research,
2008, Vol. 36, No. 4 e25.
5’
3’
3’
5’
Производительность геномных секвенаторов
Genome Analyzer IIx
SOLiD™ 3 System
Динамика роста производительности
cеквенаторов SOLiD
http://www3.appliedbiosystems.com/AB_Home/applicationstechnologies/SOLiDSystemSequencing/overviewofsolidsystem/index.htm
Прогноз роста производительности
cеквенаторов GA IIx
Вспомогательные технологии
•
Парноконцевое секвенирование ДНК
•
Избирательное секвенирование ДНК
•
Индексация секвенируемых препаратов ДНК
Mate-Paired & Paired End Reads
Гибридизационная селекция ДНК
Индексация нуклеотидных последовательностей
(Sample Indexing)
GS FLX Standard Multiplex Identifiers (MID)
Набор содержит 6 адапторов
Ближайшие конкуренты
SMRT sequencing
(Single-Molecule, Real-Time sequencing)
Технология “Long Fragment Read” (LFR)
Мультиадапторные библиотеки ДНК
Начало секвенирования геномов – 2 кв. 2009 года
План на 2009 г. – 1000 геномов (по 5 000$)
План на 2010 г. – 20 000 геномов
Планы на пятилетку:
• открытие 10 геномных центров
• оцифровка 1 миллиона геномов
True Single Molecule Sequencing
(tSMS)
• Two glass flow cells
• Each flow cell is divided into 25 channels
• 50 individual samples per run
• Proprietary surface chemistry
• ~25 bases in length
• Multi-pass sequencing
HeliScope™
Polonator G.007
Прочие конкуренты
Ultra-Fast Real Time sequencer
Single Molecule Sequencing
GeneEngine™ technology
VisiGen® sequencing system
GE Global Research
Nanopore Sequencing
http://genomics.ucsd.edu/yingja/
The Beijing Genomics Institute (BGI)
http://www.genomics.org.cn/en/platform_detail.php?id=150
Благодарю за
внимание
ВОПРОСЫ
?
День ДНК
Замечания и предложения по поводу организации проведения
Международного Дня ДНК в России принимаются на форуме
molbiol.ru в разделе «Молекулярная и клетоная биология»
в опросе «Международный День ДНК»:
http://molbiol.ru/forums/index.php?s=cfb937cb0801b2a5ee613ad341aa45cc&showtopic=345887