Экспериментальные модели - Сибирский федеральный

Экспериментальное моделирование
функционирования ферментов в
клетке: новые подходы
Валентина А. Кратасюк, д.б.н., проф.
Елена Н. Есимбекова, к.б.н.
Елена В. Немцева, к.ф.-м.н.
Ирина Е. Суковатая, к.б.н.
Проблема
•
2
Интенсивное
исследование:
• молекулярной
организации
клетки,
• механизмов
переноса энергии
в метаболической
системе
• происхождение
клетки и т.д.
2
Проблема
• Большинство гипотез о метаболических
механизмах функционирования делается
на основе исследований in vitro
OR
3
Ферментативные реакции in vivo и in vitro
Цитоплазма
(soft gel)

Буферный
раствор
Цитоплазма E. Coli
(модель)
(более 50 типов макромолекул
(McGuffee, S. R. and A. H. Elcock ,2010,
Diffusion, crowding & protein stability in a
dynamic molecular model of the bacterial
cytoplasm. PLoS Computational Biology 6
(3)
4
Проблема
•
Клетка: вместилище неравномерно распределенных
ферментов и субстратов
• Компартменты: разделение метаболических процессов
по отдельным отсекам
Проблема
•
Например, метаболические пути
функционируют более эффективно, если
субстраты для ферментативных реакций
оказываются в соответствующем месте в
нужное время.
Супрамолекулярные комплексы
•
Структура
пируватдегирогеназного
ферментативного
комплекса
• Получено немало
доказательств того, что
многие ферменты в
клетках работают в виде
структурно и
кинетически единых
комплексов.
Проблема
•
В комплексах проходит цепь последовательных процессов,
когда продукт первого фермента является субстратом для
второго фермента и т.д.
• ПОЭТОМУ: важнее исследовать функционирование не
отдельно взятого фермента, а цепей сопряженных
ферментативных реакций.
Проблема
•
Исследование кинетики
реакций высокоочищенные
ферментов в разбавленных
растворах (уравнение
Михаэлиса-Ментен)
• «Однако большинство
внутриклеточных ферментов
никогда не функционирует в
условиях, отвечающих
уравнению МихаэлисаМентен, и обычно находится
не в разбавленном растворе, а
в сложной неоднородной
среде» (М. Тривен
Иммобилизованные
ферменты. М.: Мир. 1983).
Существующие подходы не решают
проблемы
• Прямые эксперименты в клетке затруднены:
– сложная цепь метаболических процессов
– клеточная оболочка препятствует прямому воздействию на клетку.
• Исследование выделенных фермент-субстратных систем для
интерпретации процессов, происходящих внутри клетки, часто приводит
к артефактам:
– в системах in vitro нарушаются связи, имеющиеся у ферментов в
клетке
– вязкость среды и микроокружение ферментов в клетке значительно
отличаются от таковых в пробирке.
•
10
ЦЕЛЬ: Создание экспериментальных моделей
структурно и кинетически единых
ферментативных комплексов, находящихся в
соответствующем микроокружении
• NADH: FMN-оксидоредуктаза – люцифераза
реконструирована в вязких растворах сахарозы и
глицерина и при иммобилизации в гели крахмала и
желатина
ОБЪЕКТ: сопряженные с люциферазой
полиферментные цепочки
H+
NAD(P)*
FMNH2
Oxidoreductase
NAD(P)H
FMN
O2
RCHO
Luciferase
RCOOH
H2O
• ПРЕИМУЩЕСТВА ОБЪЕКТА:
• ВИЗУАЛИЗАЦИЯ: светоизлучение - удобный параметр
регистрации активности ферментов в
полиферментных цепях
• КОНСТРУИРОВАНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ
ЦЕПОЧЕК С ЛЮЦИФЕРАЗОЙ: 6 ферментов и более
О люциферазе
• Структурно-функциональная
организация люминесцентной
системы светящихся бактерий
неизвестна.
• Есть ли связь люциферазы с
мембранными структурами клетки?
• Роль люциферазы в метаболизме
светящихся бактерий? Какие
ферменты связаны с люциферазой
in vivo?
• Природные субстраты
люциферазы? Альдегидный
фактор?
• Биологический смысл свечения?
Модели клетки светящихся бактерий
Wall
Polar agents,
solvents,
alcohols
Heavy metals,
Phenols
Membrane
Inhibitors
Ag chlorine
Cytoplasmic
membrane
Heavy metals
(cadmium),
Phenolics
(Dichlorophenol)
R
FMN + NADH + H+
FMNH2 + NAD+
L
FMNH2 + R1COH + O2
FMN + R1COOH + H2O +
h
490 nm
Protonmotive
force
Cytoplasmic
constituents
Membrane
ATPase
ИМИТАЦИЯ ВЯЗКОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ В МАТРИКСЕ КЛЕТКИ:
• Совместная иммобилизация в гели крахмала и желатина всех необходимых для свечения
компонентов (ферментов и субстратов)
• Погружение в вязкие растворы сахарозы и глицерина.
• Имитация связи с мембранными структурами – гель + биополимеры
14
Экспериментальные модели
• проявляют
биолюминесцентную
активность
• имитируют вязкое
микроокружение
ферментов в клетке
• имитируют связь
ферментов в
метаболической
цепочке
15
Подбор микроокружения:
Активность биолюминесцентной реакции в зависимости
от вязкости среды
I/I
1,20
3,00
I/I
1,0
2,5
0,8
2,0
sucrose
0,6
gelatin
1,5
0,4
1,0
0,2
glycerol
0,0
0
10
20
30
40
50
Sucrose or glycerol concentration, %
0,5
0,0
0
2
4
Gelatin concentration, %
6
• glycerol
T=350C
sucrose
120
180
160
100
I,%
120
контроль
0,91М
1,09М
2,72М
5,43М
100
80
60
Интенсивность свечения, %
Интенсивность свечения, %
140
80
контроль
0,52 М
60
1,01 М
2,03 М
4,06 М
40
40
20
20
0
0
температура 35
температура 35
0,002
kd, c-1
0,0007
0,0018
0,0006
0,0016
0,0005
0,0012
контроль
0,91М
1,09М
2,72М
5,43М
0,001
0,0008
0,0006
Константа спада, с-1
Константа спада, с-1
0,0014
контроль
0,52 М
1,01 М
2,03 М
4,06 М
0,0004
0,0003
0,0002
0,0004
0,0001
0,0002
0
0
35
35
Температура
Температура
17
• Влияние сахарозы (1) и глицерина (2) на выход
квантов (Q,%) в реакции, катализируемой R+L
Q, %
300
250
1
200
150
2
100
50
0
0
2
4
6
8
Viscosity, mPas
18
• glycerol
T=350C
200000000
Q,%
sucrose
4000000000
180000000
3500000000
160000000
3000000000
120000000
контроль
0,91М
1,09М
2,72М
5,43М
100000000
80000000
Квантовый выход
Квантовый выход
140000000
2500000000
контроль
0,52 М
1,01 М
2,03 М
4,06 М
2000000000
1500000000
60000000
1000000000
40000000
500000000
20000000
0
0
35
35
Температура
Температура
19
Иммобилизация в гель
крахмала
Состав:
L+R, L+R+FMN,
L+R+FMN+NADH
L+R+FMN+aldehyde
L+R+aldehyde+NADH
L+R+FMN+aldehyde+NADH
• Характеристики:
•
•
•
выход активности - 40-100 %
сроки хранения –более 5 лет
дозирован на 1 измерение
20
Максимальный выход активности
120
L+R immobilized into starch gel
Recovery of activity, %
100
80
60
L+R+C14+NADH immobilized into
starch gel
L+R immobilized into gelatin gel
L+R+C14+NADH immobilized into
gelatin gel
40
20
0
21
Увеличение эффективности взаимодействия
Л и Р в вязких средах
•интенсивность свечения (I)
•константа затухания
свечения (kd)
• время максимума свечения
(tmax)
• выход квантов
• время затухания свечения (P)
•pH-оптимум
•термостабильность
•энергия активации
•константа
термоинактивации,
•Константы Михаэлиса
Sucrose
Glycerol
Starch
gel
Gelatin
gel
22
Увеличение стабильности ферментов:
температура
I/Iмакс
1,2
1
5
0,8
4
0,6
3
0,4
2
0,2
1
0
0
10
20
30
40
50
60
70
T, C
0
• 1 – раст L+R
2 - L+R (желатин) 3 - L+R+С14+НАДН (желатин)
• 4 - L+R+С14+НАДН (крахмал)
5 - L+R (крахмал)
pH -оптимум
I/Imax
1,2
1
soluble L+R
0,8
L+R immobilized into gelatin gel
0,6
L+R+C14+NADH immobilized into
gelatin gel
L+R immobilized into starch gel
0,4
L+R+C14+NADH immobilized into
starch gel
0,2
рН
0
5,8
6
6,2
6,4
6,6
6,8
7
7,2
7,4
7,6 7,8
8
24
Механизмы влияния вязких сред
Конформационные изменения
компонентов?
Методы флуоресцентной
спектроскопии
luciferase
FMN  Н2 + RCHO + O2  FMN + RCOOH + H2O + h
Спектр
поглощения
Спектр испускания
и возбуждения
флуоресценции
Анизотропия
флуоресценции
Время жизни
флуоресценции
Выводы:
1. Конформация ферментов не изменяется в исследованных вязких средах.
2. Влияние сред на скорость ферментативного процесса осуществляется,
главным образом, через изменение физико-химических характеристик
субстратов.
Изучение экспериментальных моделей
• сравнить поведения фрагментов метаболических цепей с
люциферазой в экспериментальной модели и в растворе
• позволяет понять закономерности функционирования
ферментов in vivo и взаимодействия с другими
химическими компонентами матрикса клетки
• определить ферменты, с которыми люцифераза связана в
метаболической цепи
• определить истинные субстраты люциферазы,
• понять влияние микроокружения внутриклеточного
матрикса на взаимодействие субстратов и ферментов
• разработать стабильный многокомпонентный реагент
для биолюминесцентного анализа
БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МОНИТОРИНГ
СТРЕССОВОГО СОСТОЯНИЯ РАСТЕНИЙ
В ЗАМКНУТЫХ СИСТЕМАХ
ЖИЗНЕОБЕСПЕЧЕНИЯ
Кратасюк В.А. , Есимбекова Е.Н., Ray A.
Bucklin, Melanie Correll
Сибирский федеральный университет
Институт биофизики СО РАН
University of Florida (USA)
Биолюминесцентный метод определения
пиридиновых нуклеотидов
НАД(Р)Н
Концентрация, М/мг.белка
• Разработан на примере
корнеплодов редиса с целью
оценки влияния стрессовых
условий в замкнутых системах
жизнеобеспечения на растения
60
50
40
30
20
10
0
1
Стрессовые условия:
•
низкая температура (+4°С, 3 7 дней),
•
низкое давление в
модельных климатических
камерах
НАД(Р)+
2
3
• Пиридиновые нуклеотиды
НАД(Р)Н, НАД(Р)+ маркеры стрессового
ответа
Перспективы
•
•
•
•
Усовершенствование моделей:
математическое моделирование
введение биополимера с
иммобилизованными ферментами,
увеличение длины метаболической цепи
усложнение структуры искусственной
клетки: введение органелл (рибосомы,
митохондрии и т.д.)
29
Перспективы
Разработанная методология может быть
применена к растительной клетке для изучения
внутриклеточных процессов
Переход клетки в состояние покоя, анабиоз
Химическая эволюция
Models for enzyme's functioning inside the luminous bacteria:
new approach
30
Благодарности
•
•
•
•
•
•
РФФИ № 07-04-01340-а «Гелевая модель функционирования ферментов в
клетке на примере ферментов светящихся бактерий», 2007-2009
Грант № 2.2.2.2/5309 Министерства образования и науки РФ, Федеральное
агентство по образованию, Аналитическая ведомственная целевая программа
«Развитие научного потенциала высшей школы», проект «Моделирование
процессов функционирования сопряженных ферментативных систем в
клетке на примере ферментов светящихся бактерий», 2009-2011.
Американский фонд поддержки гражданских исследований (CRDF), №
RUX0-002-KR-06/BP4M02 «Биолюминесцентные биосенсоры для
экологического мониторинга: стабилизация биологического модуля», 20092010
Грант ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной
России» на 2009-2013 годы», проект по теме: «Биолюминесцентный анализ
молекулярных процессов в клетках и их физико-химических моделях;
создание на их основе нового поколения биолюминесцентных сенсоров для
биологии и медицины»
Программа Президиума РАН и СО РАН «Молекулярная и клеточная
биология», грант № 10-7 (2003-2007)Б №10-10 (2008) «Молекулярные
механизмы образования эмиттера в биолюминесцентных реакциях
различных организмов», 2003-2010
Грант Президента Российской Федерации НШ-1211.2008.4. «Ведущая
научная школа», 2008-2010.