оСобенноСти редоКС-завиСимой модифиКации белКов в

ЛАБОРАТОРНЫЕ И экспериментальные исследования
УДК: 612.015:616–006.6
Особенности редокс-зависимой модификации
белков в эритроцитах больных немелкоклеточным
раком легкого в зависимости от стадии
заболевания
Р.Н. Белоногов1, Н.М. Титова2, Ю.А. Дыхно1, А.А. Савченко1,3
Красноярский государственный медицинский университет1
Сибирский федеральный университет, г. Красноярск2
НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, г. Красноярск3
660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1З, e-mail: ro-x@yandex.ru1
С целью определения уровня показателей окислительной модификации белков в эритроцитах больных немелкоклеточным раком легкого на различных стадиях заболевания обследовано 108 человек. В эритроцитах больных оценивалось
содержание карбонильных производных белков, среднемолекулярных пептидов, SH-групп белков. Наиболее выраженное
возрастание интенсивности процессов редокс-зависимой модификации белков в эритроцитах происходит у больных раком
легкого II и IV стадий. Окислительная модификация белков в составе эритроцитов играет роль в нарушении их функций,
что может приводить к различным гематологическим нарушениям, выраженность которых изменяется в зависимости от
стадии заболевания.
Ключевые слова: рак легкого, окислительный стресс, окислительная модификация белков.
characteristics of redox-depended modification of proteins in erythrocytes of patients
with non-small cell lung cancer in relation with stage of the disease
R.N. Belonogov1, N.M. Titova2, Yu.A. Dykhno1, A.A. Savchenko1,3
Krasnoyarsk state medical university1, Siberian federal university, Krasnoyarsk2
Institute of medical problems of North, Krasnoyarsk, Russia3
13, Partizan Zheleznyak Street, 660022-Krasnoyarsk, e-mail: ro-x@yandex.ru1
The aim of the study was to investigate level of markers of oxidative modification of proteins in erythrocytes of patients with
non-smallcell lung cancer. 108 patients with lung carcinoma were chosen for study. We measured proteins carbonyl derivatives,
middle molecular peptides, SH-groups of proteins. The most increase of redox-depended modification of proteins is happened on
II and IV stage of the desease. Oxidative modification of proteins in erythrocytes plays role in disregulation of their function and
leads to different hematological disorders which intensity changes in relation with stage of lung cancer.
Key words: lung cancer, oxidative stress, oxidative modification of proteins.
В патогенезе рака легкого существенную
роль играет системное действие опухоли на
организм. Опухоль постоянно испытывает на
себе влияние нормальных клеток, элементов
внеклеточного матрикса и иммунной системы.
Сами раковые клетки продуцируют различные
метаболиты, токсические вещества, онкобелки,
факторы роста, гормоны, воздействующие на
весь организм. Все это приводит к формированию характерных изменений в пораженном
органе и в системном кровотоке, выраженность
СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2010. №6 (42)
которых соотносится с основными параметрами
опухолевого роста: размером опухоли, поражением лимфатических узлов, наличием или
отсутствием метастазов [10–12]. Развитие злокачественных новообразований легких довольно
часто сопровождается гематологическими реакциями, которые являются результатом действия
опухоли на организм. Однако патогенез большей
части системных реакций так и остается неясным [7]. Развитие окислительного стресса
играет немаловажную роль в происхождении
Особенности редокс-зависимой модификации белков в эритроцитах ...
Содержание карбонильных производных белков в эритроцитах
в зависимости от стадии рака легкого, у.е./г Hb (Ме (С25;С75))
Показатель
Контроль
(n=35)
Альдегидные формы карбонильных
производных белков
2,65
(1,69; 4,39)
Кетонные формы карбонильных производных белков
1,84
(1,39; 2,95)
II стадия
(n=14)
5,78
(2,22; 8,55)
p1<0,05
8,84
(5,62; 11,23)
p1<0,05
III стадия
(n=26)
5,43
(2,03; 6,31)
p1<0,05
2,53
(1,50; 3,56)
p2<0,05
33
Таблица 1
IV стадия
(n=20)
2,73
(2,01; 9,13)
5,47
(2,93; 7,99)
p1,3<0,05
Примечание: p1 – статистически значимые различия с показателями контрольной группы; р2 – статистически значимые различия с показателями больных РЛ II стадии; р3 – статистически значимые различия с показателями больных РЛ III стадии.
многих из них [9, 12]. В свою очередь, данные
нарушения приводят к выраженному усилению
окислительных процессов в эритроцитах. Белки
эритроцитов, подвергшиеся окислительной деструкции, имеют длительный период распада,
что делает их перспективным маркером интенсивности свободно-радикального окисления
[4, 5, 7].
Целью работы явилось определение показателей редокс-зависимой модификации белков в
эритроцитах больных немелкоклеточным раком
легкого в зависимости от стадии заболевания
Материал и методы
На базе Красноярского краевого онкологического диспансера обследовано 108 больных
мужского пола с немелкоклеточным раком
легкого в возрасте 35–70 лет (средний возраст – 53,4 ± 2,4 года). У 30 больных раком легкого диагностирована II стадия, у 44 – III стадия,
у 34 – IV стадия заболевания. Окончательный
диагноз устанавливался после оперативного
вмешательства и гистологического исследования образцов опухоли врачами онкологического
диспансера. В качестве контрольной группы
были обследованы 35 здоровых доноров аналогичного возраста.
Кровь забиралась из локтевой вены в гепаринизированные пробирки, утром, натощак, на
следующий день после поступления больного
в стационар. Эритроциты отделялась центрифугированием, после чего в них проводилось
определение показателей редокс-зависимой модификации белков (карбонильные производные,
молекулы средней массы, тиоловые группы).
Об уровне карбонильных производных белков (КПБ) судили по реакции взаимодействия
окисленных аминокислотных остатков белков
с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием
2,4-динитрофенилгидразонов [13]. Оптическую
плотность образовавшихся производных динитрофенилгидразонов регистрировали спектрофотометрически при различных длинах волн:
356 нм – алифатические кетодинитрофенилгидразоны нейтрального характера; 370 нм – алифатические альдегиддинитрофенилгидразоны
нейтрального характера [4]. О содержании молекул средней массы (МСМ) судили на основании
прямой спектрометрии депротеинизированного
супернатанта, полученного после осаждения
белков раствором трихлоруксусной кислоты
при длине волны 254 нм [3]. Метод определения количества свободных тиоловых групп в
белках основан на взаимодействии SH-групп
с 5,5’-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой.
Интенсивность окраски регистрировали
спектрофотометрически при длине волны
412 нм. Для определения быстрореагирующих
SH-групп оптическую плотность пробы измеряли через две минуты после начала реакции. Для
определения медленно реагирующих SH-групп
измерение оптической плотности производили
через каждые 5 мин до тех пор, пока ее значение
не станет постоянным. Для выявления замаскированных SH-групп готовили пробу, в состав
которой также входил 8 М раствор мочевины [2].
Содержание гемоглобина в эритроцитах определяли цианметгемоглобиновым методом [6].
Для всех данных определяли медиану (Ме)
и интерквартальный разброс в виде подсчета
СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2010. №6 (42)
Р.Н. Белоногов, Н.М. Титова, Ю.А. Дыхно И др.
34
Содержание тиоловых групп белков в эритроцитах
в зависимости от стадии рака легкого, мкмоль/мг Hb (Ме (С25; С75))
Таблица 2
Показатель
Контроль
(n=35)
II стадия
(n=30)
III стадия
(n=44)
IV стадия
(n=34)
Быстрореагирующие
тиоловые группы
16,79
(11,78; 21,23)
20,31*
(16,70; 25,58)
19,77
(16,52; 27,46)
22,31
(12,50; 26,90)
Медленно реагирующие
тиоловые группы
7,08
(3,85; 9,91)
6,46
(4,57; 12,73)
6,19
(4,91; 11,79)
8,19
(5,98; 12,18)
Замаскированные тиоловые
группы
12,82
(10,14; 17,28)
14,58*
(12,92; 23,28)
16,17
(11,30; 18,95)
15,83
(13,54; 17,54)
Примечание: * – статистически значимые различия с показателями контрольной группы (p1<0,05)
25- (С25) и 75-процентилей (С75). Достоверность
различий между группами оценивалась при
помощи непараметрического критерия Манна–
Уитни. Статистический анализ осуществлялся
с помощью пакетов прикладных программ
Statistica версия 7,0 (StatSoft Inc., 2004).
Результаты и обсуждение
Динамика изменения уровня карбонильных
производных белков в эритроцитах приведена в табл. 1. У больных раком легкого (РЛ) II
стадии в эритроцитах происходит увеличение
содержания альдегидных форм КПБ на 119 %,
III стадии – их уровень снижается до 105 %,
а на IV стадии падает до уровня контрольной
группы. Уровень кетонных форм КПБ при РЛ II
стадии значительно возрастает, при III стадии
резко снижается, при РЛ IV стадии – снова существенно возрастает. У больных РЛ II стадии
он увеличивается на 380 %, III стадии – на 37 %,
IV стадии – на 197 %. Уровень молекул средней
массы в эритроцитах при II стадии увеличивается на 24 %, при III – на 22 % и при IV
стадии – на 16 % (рис. 1).
Содержание быстрореагирующих SH-групп
в эритроцитах при РЛ II стадии возрастает
на 21 %, при III стадии – на 18 %, при IV
стадии – на 33 % в сравнении с эритроцитами
людей контрольной группы. Содержание медленно реагирующих тиоловых групп белков в
эритроцитах при РЛ II и III стадии снижается
по сравнению с контролем на 9 % и 13 % соответственно. При РЛ IV стадии содержание
SH-групп возрастает на 16 %. Содержание замаскированных тиоловых групп в плазме в сравнеСИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2010. №6 (42)
нии с контролем повышается на 14, 26, 23 % при
II, III IV стадиях рака легкого соответственно
(табл. 2). Уровень суммарных тиоловых групп
существенно возрастает при РЛ II и IV стадий,
при III стадии заболевания значимых отличий
от контроля не наблюдается (рис. 2).
Окислительный стресс при раке легкого оказывает повреждающее воздействие на белки, что
выражается в их фрагментации и образовании
белковых агрегатов, о чем может свидетельствовать уровень альдегидных и кетонных форм
карбонильных производных белков соответственно [4]. Отражением степени фрагментации
белковых молекул, происходящей либо в результате непосредственного действия активных
форм кислорода, либо в результате повышения
их чувствительности к протеолизу в условиях
окислительного стресса, может служить также
содержание молекул средней массы [5]. Увеличение содержания МСМ может быть связано
как с их образованием в самих эритроцитах,
так и с адсорбцией на поверхности эритроцитов из плазмы. Кроме того, МСМ, образуясь в
результате действия свободных радикалов, сами
способны выполнять функцию антиоксидантов.
Повышение уровня сульфгидрильных групп белков может происходить в результате увеличения
активности тиол-зависимых защитных механизмов, в частности тиоредоксиновой системы, что
отмечается некоторыми исследователями при
раке легкого [11]. Поскольку тиоловые группы белков могут выполнять антиоксидантную
функцию, повышение их уровня, вероятно,
происходит с целью компенсации недостатка
низкомолекулярных антиоксидантов [1, 11].
Особенности редокс-зависимой модификации белков в эритроцитах ...
Рис. 1. Содержание молекул средней массы в эритроцитах
больных раком легкого в зависимости от стадии заболевания.
Примечания: 1 – контрольная группа; 2 – больные РЛ II стадии;
3 – больные РЛ III стадии; 4 – больные РЛ IV стадии
В эритроцитах содержится основное количество антиоксидантов крови. Активные
формы кислорода из плазмы могут легко проникать в эритроциты через анионные каналы
или диффундировать через мембрану. В связи
с этим эритроциты могут выступать в роли эффективных скевенджеров свободных радикалов
[15]. Воздействие активных форм кислорода на
эритроциты влияет на физиологический статус
клетки: регуляцию гликолиза, изменение формы
и объема эритроцитов, мембранный транспорт и
др. [8, 10, 14]. Усиление окислительных процессов в эритроцитах, в частности окислительная
модификация гемоглобина, может вести к снижению их способности к переносу кислорода,
что может приводить к развитию гипоксии.
Таким образом, окислительная модификация
белков эритроцитов, играет роль в нарушении
их функций, что может приводить к различным
гематологическим нарушениям, выраженность
которых изменяется в зависимости от стадии
заболевания.
35
Рис. 2. Содержание суммарных тиоловых групп белков в эритроцитах в зависимости от стадии рака легкого.
Примечания: 1 – контрольная группа; 2 – больные РЛ II стадии;
3 – больные РЛ III стадии; 4 – больные РЛ IV стадии
ЛИТЕРАТУРА
1. Афанасьева А.Н., Афанасьев С.Г., Ли А.А. и др. // Сибирский
онкологический журнал. 2007. № 4 (24). С. 12–18.
2. Веревкина И.В., Точилкин А.И., Попова Н.А. // Современные
методы в биохимии. М.: Медицина, 1977. С. 223–231.
3. Габриэлян Н.И., Дмитриев А.А., Савостьянова О.А. и др. //
Анестезиология и реаниматология. 1985. № 1. С. 36–38.
4. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А. и др. // Вопросы
медицинской химии. 1995. Т. 41, № 1. С. 24–26.
5. Дубинина Е.Е., Морозова М.Г., Леонова Н.В. и др. // Вопросы
медицинской химии. 2000. Т. 46, № 4. С. 398–409.
6. Меньшиков В.В. Справочник по клиническим лабораторным
методам исследования. М.: Медицина, 1987. 460 с.
7. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З. и др.
Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания.
Новосибирск: АРТА, 2008. 284 с.
8. Bordin L., Quartesan S., Zen F. et al. // Bioch. Bioph. Acta:
Biomembranes. 2006. Vol. 1758 (5). P. 611–619.
9. Esme H., Cemek M., Sezer M. et al. // Respirology. 2008.
Vol. 13 (1). P. 112–116.
10. Hernandes-Hernandes A., Rodrigues M.C., Lopes-Revuelta
A. et al. // Blood Cells Molecules and Diseases. 2006. Vol. 36 (3).
P. 355–363.
11. Kinnula V.L., Pääkkö P., Soini Y. // FEBS Letters. 2004.
Vol. 569 (1). P. 1–6.
12. Lee J.M., Yanagawa J., Peebles K.A. et al. // Crit. Rev. Oncol./
Hematol. 2008. Vol. 66 (3). P. 208–217.
13. Levine L.R., Williams J.A., Stadtman E.R. et al. // Methods in
enzymology. 1994. Vol. 233 (37). P. 346–357.
14. Miki Y., Tazawa T., Hirano K. et al. // Bioch. Bioph. Res.
Comm. 2007. Vol. 363 (1). P. 57–62.
15. Ozensoy O., Kockar F., Arslan O. et al. // Clin. Biochem. 2006.
Vol. 39 (8). P. 804–809.
Поступила 1.06.10
СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2010. №6 (42)