НЕРАСТВОРИМЫЕ КОМПЛЕКСЫ БЕЛКОВ МОЛОЧНОЙ

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН
2008, том 51, №8
ФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
УДК 541.127:661.183.123.2
З.К.Мухидинов, А.Ш.Штанчаев, А.С.Насриддинов, Д.Т.Бобокалонов, Х.И.Тешаев,
академик АН Республики Таджикистан Д.Х.Халиков
НЕРАСТВОРИМЫЕ КОМПЛЕКСЫ БЕЛКОВ МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКИ
С РАЗЛИЧНЫМИ ПЕКТИНАМИ
Взаимодействия между протеинами и полисахаридами могут привести к образованию
комплексов или коацерватов, которые применяются во многих областях, включая микрокапсулирование и иммобилизацию энзимов. Однако до сих пор функциональная роль протеиново-полисахаридных взаимодействий не полностью раскрыта. Протеины и полисахариды играют ключевую роль в формировании структуры и стабилизации пищевой системы. Протеины используют в качестве эмульгаторов, а полисахариды в качестве стабилизаторов. По данным Диккинсона (Dickinson) [1], устойчивость и текстура смесей биополимеров зависит не
только от их функциональных свойств, а также от природы и силы взаимодействия протеина
и полисахарида. В зависимости от силы взаимодействия комплексы могут быть растворимыми или в состоянии агрегированного фазового равновесия. Взаимное притяжение может возникать за счет электростатического, гидрофобного взаимодействия или водородных связей,
которые в свою очередь приводят к комплексообразованию протеинов и полисахаридов. Результирующее влияние на комплексы оказывают энтропийные факторы – природа, структура
и молекулярный вес биополимеров. Другие факторы имеют энтальпийный характер, их величина зависит от соотношения протеин/полисахарид, от природы и плотности зарядов биополимеров. Показатель рН и ионная сила также существенно влияют на электростатическое
взаимодействие [2]. В исследованиях [3] отмечается, что комплексы β-Lg с пектином обладают медленной кинетикой связывания, что подтверждает существование двух стадий комплексообразования, переходя от молекулярного в агрегированное состояние. Первая стадия
соответствует образованию растворимых комплексов – интраполимеров между молекулами.
Вторая включает агрегирование этих интраполимерных комплексов с образованием нерастворимых комплексов - межполимеров (теория Тайнака) [3]. Проведенные исследования носят разрозненный характер и не охватывают особенности комплексообразования белков молочной сыворотки, а именно лактоглобулинов с различными пектинами.
В связи с этим в данной работе изучено образование нерастворимых комплексов пектинов, выделенных из разного растительного сырья (яблочные выжимки, корзинки подсолнечника, кожура и мякоть цитрусовых) с белками молочной сыворотки при рН ниже изоэлектрической точки (рН 3.5), методами турбидиметрии, потенциометрии и кондуктометрии.
Готовили 0.25% водный раствор цитрусового пектина (ст. этерификации 38%) и
0.25% раствор белков молочной сыворотки, представляющего собой концентрат лактоглобу607
Доклады Академии наук Республики Таджикистан
2008, том 51, №8
линов, полученного методом мембранной фильтрации, в ацетатном буфере (рН 3.50). Определенное количество 0.25% раствора белков молочной сыворотки помещали в стакан, добавляли при помешивании по 1 мл к 0.25% раствора пектина. Содержимое стакана выливали в
ампулу, которую помещали в измерительную ячейку турбидиметра 2100AN IS (фирма
HACH, USA) и измеряли мутность Т в НТУ при λ 455 нм. Параллельно определяли рН на
приборе (WTW GmbH Laboratory рН meter, inoLab pH Level 1, Germany) и удельную электропроводность растворов на приборе (WTW GmbH Laboratory conductivity meter inoLab
conductmeter Level 1, Germany). Обработка полученных данных проводилась по методике [4].
0.25% водный раствор пектина имел следующие характеристики: мутность 38.5 НТУ (единица мутности), рН 3.60, χ-193.5 µS/см. У 0.25% раствора белков молочной сыворотки в ацетатном буфере: Т0 63.3 НТУ, pH 3.77, χ 3.73 mS/см. Данные турбидиметрического, потенциометрического и кондуктометрического титрований приведены в табл. 1, где Vo 30 мл –
объем 0.25% раствора сывороточного белков, γ – объемная доля 0.25 % цитрусового пектина,
Т1 – мутность, обусловленная комплексом, Т2 – мутность с поправкой на разбавление раствором пектина.
Из табл. 1 следует, что в выбранном интервале рН происходит образование нерастворимого пектин-белкового комплекса, заряд которого уменьшается по данным удельной электропроводности.
Таблица 1
Результаты турбидиметрического, потенциометрического и кондуктометрического титрований 0.25% раствора сывороточных белков 0.25% раствором цитрусового пектина
V,
мл
γ=
V/(V+V0)
1-γ
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
0.03
0.06
0.09
0.12
0.14
0.17
0.19
0.21
0.23
0.25
0.27
0.29
0.30
0.32
0.33
0.97
0.94
0.91
0.88
0.86
0.83
0.81
0.79
0.77
0.75
0.73
0.71
0.70
0.68
0.67
Δγ
рН
æ,
mS/сm
Т
T1=
T-T0
T2=
T1/(1- γ)
0.030
0.028
0.027
0.025
0.024
0.023
0.021
0.020
0.019
0.018
0.017
0.017
0.016
0.015
3.66
3.69
3.69
3.69
3.69
3.69
3.69
3.69
3.69
3.69
3.69
3.69
3.69
3.69
3.69
3.65
3.56
3.49
3.41
3.33
3.25
3.17
3.11
3.03
2.97
2.91
2.86
2.8
2.75
2.69
147
240
324
395
401
525
575
626
649
671
671
661
650
641
635
83.7
176.7
260.7
331.7
337.7
461.7
511.7
562.7
585.7
607.7
607.7
597.7
586.7
577.7
571.7
86.5
188.5
286.8
375.9
394.0
554.0
631.1
712.8
761.4
810.3
830.5
836.8
840.9
847.3
857.6
608
Δ T2
ΔT2/Δγ
102.0
98.3
89.2
18.1
160.1
77.1
81.7
48.7
48.9
20.3
6.3
4.2
6.4
10.3
3372.5
3459.8
3334.5
716.2
6722.4
3421.3
3827.0
2403.6
2540.5
1107.4
359.1
250.2
400.9
676.9
Физическая химия
З.К.Мухидинов, А.Ш.Штанчаев, А.С.Насриддинов и др.
8000
7000
6000
700
600
500
400
300
5000
4000
3000
ΔT2/Δ γ
T2
1000
900
800
2000
200
100
0
1000
0
0.03 0.09 0.14 0.19 0.23 0.27
Y
Интегральная кривая
0.3
0.33
Дифференциальная кривая
Рис.1. Интегральная и дифференциальная кривые турбидиметрического титрования 0.25% раствора
белка молочной сыворотки 0.25% раствором пектина
На рис. 1 представлены интегральная и дифференциальная кривые турбидиметрического титрования в зависимости от объемной доли раствора пектина. Как видно из рис. 1, из
интегральной кривой мутность пектин-белкового комплекса с ростом объемной доли раствора пектина увеличивается и достигает предела. Дифференциальная кривая показывает, что
скорость образования комплекса вначале увеличивается, затем падает. В точке максимума
соотношение белок/пектин соответствует мольному соотношение 44:1, то есть на 1 моль
пектина приходится 44 моля лактоглобулинов.
Было изучено методом турбидиметрии обратное титрование 0.25% раствора цитрусового пектина 0.25% раствором белков молочной сыворотки. Для этого растворяли в дистиллированной воде белок молочной сыворотки, центрифугировали при 5000 об/мин в течение
30 мин. После этого раствор доводили до концентрации 0.25%.
Цитрусовый пектин растворяли в 1/15 М ацетатного буфера (рН 3.50), центрифугировали при вышеуказанных условиях. Концентрация пектина составила 0.25%. Прибавляя определенное количество 0.25% раствора белков молочной сыворотки к 0.25% раствору цитрусового пектина в ацетатном буфере, измеряли мутность на турбидиметре.
Данные турбидиметрического титрования 0.25% раствора цитрусового пектина 0.25%
раствором белков молочной сыворотки приведены в табл. 2, где V o – начальный объем 0.25%
раствора цитрусового пектина, равный 25 мл, То – мутность 0.25% раствора цитрусового пектина, равная 41 НТУ, мутность 0.25% раствора белков молочной сыворотки 38.3 НТУ, γ –
объемная доля 0.25% раствора белков молочной сыворотки.
609
Доклады Академии наук Республики Таджикистан
2008, том 51, №8
Таблица 2
Результаты турбидиметрического титрования 0.25% раствора цитрусового пектина
0.25% раствором белков молочной сыворотки
1- γ
Δγ
Т
T1=T-T0
T2= T1/(1- γ)
Δ T2
Δ T2/Δ γ
0.03
0.06
0.09
0.12
0.14
0.17
0.19
0.21
0.23
0.25
0.29
0.32
0.35
0.38
0.40
0.42
0.44
0.46
0.48
0.50
0.52
0.53
0.55
0.56
0.571
0.97
0.94
0.91
0.88
0.86
0.83
0.81
0.79
0.77
0.75
0.71
0.68
0.65
0.63
0.60
0.58
0.56
0.54
0.52
0.50
0.48
0.47
0.45
0.44
0.429
0.030
0.028
0.027
0.025
0.024
0.023
0.021
0.020
0.019
0.036
0.032
0.030
0.027
0.025
0.023
0.021
0.020
0.018
0.017
0.016
0.015
0.014
0.013
0.013
84
119
142
162
183
204
217
240
261
282
315
346
375
400
424
462
470
500
525
552
581
613
638
659
697
43.0
78.2
100.8
120.8
141.5
162.5
176.0
199.4
219.5
240.7
273.8
304.7
334.0
359.3
382.5
420.5
429.3
458.8
484.0
511.0
539.8
572.0
597.1
618.0
633.2
44.4
83.4
110.9
136.9
165.1
195.0
217.1
252.6
285.4
320.9
383.3
446.9
512.1
574.9
637.5
728.9
772.7
856.4
935.7
1022.0
1115.6
1220.3
1313.6
1400.8
1477.5
39.0
27.5
26.0
28.2
29.9
22.1
35.5
32.8
35.6
62.4
63.6
65.2
62.7
62.6
91.4
43.9
83.7
79.3
86.3
93.6
104.7
93.4
87.2
76.7
1288.9
966.8
973.4
1117.7
1256.5
979.8
1664.1
1619.2
1850.3
1746.8
1958.1
2200.8
2309.1
2504.8
3959.2
2053.3
4217.8
4293.1
5003.5
5802.4
6922.8
6572.1
6521.1
6082.2
1600
8000
1400
7000
1200
6000
1000
5000
800
4000
600
3000
400
2000
200
1000
0
ДT2/Д г
γ=V/(V+V0)
Т2 (НТУ)
V,
мл
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
0
0.03 0.12 0.19 0.25 0.35 0.42 0.48 0.53 0.571
Y
Интегральная кривая
Дифференциальная кривая
Рис.2. Интегральная и дифференциальная кривые турбидиметрического титрования 0.25% раствора
пектина 0.25% раствором белка молочной сыворотки.
610
Физическая химия
З.К.Мухидинов, А.Ш.Штанчаев, А.С.Насриддинов и др.
На рис.2 приведены интегральная и дифференциальная кривые турбидиметрического
титрования в зависимости от объемной доли раствора белков молочной сыворотки.
Хорошо видно, что по данным интегральной кривой мутность пектин-белкового комплекса по мере увеличения объемной доли раствора белков все время растет, не образуя предела, и превышает максимальное значение мутности в рис. 1. Дифференциальная кривая показывает, что скорость образования комплекса все время увеличивается.
Такое поведение зависимости мутности пектин-белкового комплекса от объемной доли раствора белков в рис.2 делает необходимым изучить характер этой зависимости при
взаимодействии любых соотношений растворов белков молочной сыворотки и пектина. Для
решения данной задачи нами приготовлены водный раствор белков молочной сыворотки и
растворы пектинов, выделенных из корзинок подсолнечника, выжимок яблок, кожуры и мякоти цитрусовых.
Водный раствор белков молочной сыворотки после центрифугирования при 5000
об/мин в течение 30 мин доводили до концентрации 0.1%. В данной работе использовали
подсолнечный пектин, полученный из корзинок подсолнечника при температуре гидролиза
850С в течение 60 мин при рН 1.2, имевший код – ПП 85-60-1.2 (содержание галактуроновой
кислоты 65%, степень этерификация (СЭ) 47.17%, молекулярный вес Mw 95000, яблочный
пектин – ЯП 85-60-1.2, полученный из выжимок красных яблок, выращенных в Муминабадском районе (содержание галактуроновой кислоты 68%, СЭ 52%, Mw 134000) и цитрусовый
пектин (ЦП120-10-2.0-0.05, полученный из апельсиновых выжимок и очищенный через мембрану с размером пор 0.05мкм (содержание галактуроновой кислоты 74%, СЭ 82.76%, Mw
226000). Пектины (подсолнечный, яблочный и цитрусовый) растворяли в 1/15 М ацетатного
буфера (рН 3.50), центрифугировали при 5000 об/мин в течение 30 мин. Концентрация пектинов во всех случаях после центрифугирования составляла 0.1%.
Было проведено изучение комплексообразования при взаимодействии 0.1% раствора
пектина с 0.1% раствором белков молочной сыворотки. Поскольку мутность пектин – белковых комплексов с ростом объемной доли раствора белков согласно рис. 2 все время увеличивается, не давая предела в отличие от рис. 1, их готовили, добавляя раствор белков молочной
сыворотки в раствор пектина. Помещали 0.1% раствор пектина в ацетатном буфере (рН 3.50)
в стаканчик, приливали при помешивании 0.1% белков молочной сыворотки.
Соотношение растворов бралось таким образом, чтобы общая концентрация полимеров была равна 0.1%. Cодержимое стаканчика выливали в ампулу, которую помещали в турбидиметр и измеряли мутность в НТУ. Параллельно проводилось определение рН и χ.
В табл. 3 приведены результаты изучения комплексообразования при взаимодействии
0.1% растворов пектинов с 0.1% раствором белков молочной сыворотки методами турбидиметрии, потенциометрии и кондуктометрии.
611
Доклады Академии наук Республики Таджикистан
2008, том 51, №8
Как видно из табл. 3, в узком интервале рН происходит образование нерастворимых
пектин-белковых комплексов, заряд которых уменьшается по данным удельной электропроводности.
Таблица 3
Характеристики растворов подсолнечного (1), яблочного (2) и цитрусового пектинов (3),
белков молочной сыворотки и комплексов на их основе
γ*
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
Т (НТУ)
2
16.5
27
60.6
165
222
243.7
441.2
857.6
467.3
52
14.5
1
54.4
72.7
87.8
98.9
113.2
147.8
167.8
197.7
310.1
470.9
14.5
рН
3
34.1
74.2
97.8
114.7
131.7
167.5
166.1
111
84.5
48.0
14.5
3.6
3.6
3.6
3.6
3.6
3.6
3.6
3.6
3.6
3.7
4.5
1
3.15
2.91
2.79
2.49
2.19
1.90
1.53
1.23
0.90
0.57
0.15
χ, mS/cm
2
3.25
3.02
2.70
2.49
2.17
1.8
1.54
1.24
0.85
0.57
0.15
3
3.19
3.13
2.78
2.44
2.13
1.88
1.54
1.24
0.90
0.57
0.15
*γ =V/(V+V0) – объемная доля раствора белков.
1000
900
800
T (NTU)
700
600
500
400
300
200
100
0
0
2
4
6
8
10
12
Y
подсолнечный
яблочный
цитрусовый
Рис.3. Зависимость мутности комплексов на основе белка молочной сыворотки
с различными пектинами от γ.
На рис. 3 представлены кривые зависимости мутности комплексов на основе исследованных пектинов и белков молочной сыворотки в зависимости от γ. Видно, что с ростом объемной доли раствора белков мутность плавно увеличивается, достигая предела при неболь612
Физическая химия
З.К.Мухидинов, А.Ш.Штанчаев, А.С.Насриддинов и др.
ших значениях объемной доли белков (0.5) с цитрусовым пектином, а с яблочным пектином,
достигая предела при γ = 0.7 и в дальнейшем уменьшается. В случае с подсолнечным пектином возрастание выхода продолжается до больших значений объемной доли (0.9), затем падает. Такая закономерность хорошо согласуется со СЭ пектинов. Чем меньше СЭ, где имеется много свободных карбоксильных групп, тем больше требуется положительно заряженных
белковых молекул для образования нерастворимого комплекса.
Сравнивая кривые, приведенные на рис. 3, можно отметить, что наибольшая мутность
и, соответственно, выход наблюдается у комплекса на основе яблочного пектина. Вторым по
величине мутности (выходу) является комплекс на основе подсолнечного пектина. Это указывает на то, что при близких значениях СЭ яблочного и подсолнечного пектинов, мутность
комплекса больше на основе того пектина, у которого выше молекулярный вес. В данном
случае у яблочного пектина Mw выше, чем у подсолнечного пектина. Наименьшим значением мутности (выхода) обладает комплекс на основе цитрусового пектина. Низкие значения
мутности в последнем случае можно объяснить высокой степенью этерификации цитрусового пектина. Указанные выше различия в структуре подсолнечного, яблочного и цитрусового
пектинов оказывают влияние на особенности их взаимодействия с белком молочной сыворотки при образовании нерастворимых комплексов. Кроме того, необходимо отметить использование турбидиметрического метода как быстрого метода характеристики нерастворимых комплексов на основе пектина и различных белков [5].
Институт химии им. В.И.Никитина
Поступило 02.07.2008 г.
АН Республики Таджикистан
Л И Т Е РАТ У РА
1.
2.
3.
4.
5.
Dickinson E. - Food Polysaccharides and their Applications. New-York, 1995, p. 501-515.
Girard M, Turgeon S.L., Gauthier S. – J. Agric. Food Chem., 2003, v. 51, p. 4450-4554.
Tainaka K.I. – Biopolymers, 1980, v. 19, p. 1289-1298.
Практикум по высокомолекулярным соединениям. М.: Химия, 1985, 224 с.
Штанчаев А.Ш. и др. – ДАН РТ, 2007, т. 50, №9-10, с. 748-752.
З.К.Муњидинов, А.Ш.Штанчаев, А.С.Насриддинов, Д.Т.Бобокалонов, Х.И.Тешаев,
Љ.Х.Холиќов
КОМПЛЕКСЊОИ ЊАЛНАШАВАНДАИ ПЕКТИН ВА САФЕДАИ ЗАРДОБИ
ШИР
Комплексњои њалнашавандаи пектинњои аз себ, офтобпараст ва афлесун бо
лактоглобулинњои сафедаи зардоби шир омўхта шудааст. Бо усулњои турбидиметрї,
613
Доклады Академии наук Республики Таджикистан
2008, том 51, №8
потентсиометрї ва кондуктометрї механизми њосилшавии ин комплексњо нишон дода
шудааст.
Микдори
эфирнокї
ва
массаи
молекулаи
пектинњо
ба
механизми
комплексњосилшавї вобастагии зич дорад.
Z.K.Muhidinov, A.Sh.Shtanchaev, A.S.Nasriddinov, D.T.Bobokalonov, Kh.I.Teshaev,
D.Kh.Khalikov
STUDY OF COMPLEX FORMATION BETWEEN DIFFERENT PECTINS
AND WHEY LACTOGLOBULINS
This study describes the complex formation of different pectins obtained from apple pomace, sunflower head and citruses pectin at the low pH. The insoluble complexes formed were investigated using turbidimeric, potentiometric and conductometric methods. The nature of resulted
complexes manly depends on the pectin methyl etherification pattern and molecular weight.
614