стать - МГГУ им. М.А.Шолохова

1
Оригинальные исследования
Белок-нуклеиновая идентификация:
новый метод классификации белков, основанный
на белок-нуклеиновом взаимодействии
А.С. Крылов 1, Р.И. Жданов 2, 3
1
НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва, Россия
2
Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
3
Московский государственный гуманитарный университет им. М.А. Шолохова, Москва, Россия
Nucleic acid-protein identification: novel protein classification based
on nucleic acid-protein interaction
A.S. Krylov 1, R.I. Zhdanov 2, 3
1
Institute of General Pathology and Pathophysiology of the RAMS, Moscow, Russia
2
Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
3
M.A. Sholokhov Moscow State University for the Humanities, Moscow, Russia
Для классификации белков используется несколько
универсальных свойств белковых молекул. Некоторые
белки способны специфически связываться с ДНК и РНК.
В данной работе предлагается простой метод для сравнения белков, связывающихся с нуклеиновыми кислотами, который мы назвали «nucleic acid-protein fingerprint».
Метод базируется на использовании коротких олигонуклеотидов, иммобилизованных в ячейках гидрогеля, для гибридизации их с белками. На первой стадии был определен
самый короткий олигонуклеотид, способный специфически связываться с ДНК. Эксперименты с с образцами от
2 до 12 оснований показали, что тетрамеры, состоящие
из двух универсальных оснований – 5-нитроидол и только
2 обычных основания способны к узнаванию белков. Таким
образом, был создан простейшей универсального биочип
для связывания белков, состоящий из 16 значимых динуклеотидов. Физическая длина этих нуклеотидов равна
4, где 2 звена 5-нитроиндол а два звена – обычные основания ДНК Мы изготовили такой биочип и исследовали
связывание с ним белков, меченых красителем Texas Red.
Паттерны гибридизации двух белков RNase A и Binase показал заметную специфичность и различия между ними.
Биочип такой же конструкции, который содержит три или
четыре значимых основания должен иметь еще большую
специфичность. Таким образом, нами был предложен и
экспериментально подтвержден совершенно новый и универсальный принцип классификации белков.
Ключевые слова: классификация белков, белковонуклеиновое узнавание, олигонуклеотиды, биочип.
Several basic properties of proteins are used for their
classification. Some proteins can bind DNA and RNA in a
specific way. We propose a simple method for classification
of nucleic acids binding proteins which we call «nucleic acidprotein fingerprint». The method is based on usage of short
oligonucleotides, immobilized in hydrogel for hybridization with
proteins. First, we have found the shortest oligonucleotide
capable for specific binding with nucleic acids. Experiments
with samples from 2 to 12 bases length have shown that
tetramers with 2 chains of 5-nitroindole (universal base) and
2 chains of normal bases can recognize proteins. Thus, we
have made a smallest universal protein recognizing biochip
containing 16 dinucleotides. Physical length of them is 4
chains, two chains are from 5-nitroindole and two chains
are normal DNA bases. We manufactured that biochip and
investigated binding of dye labeled proteins with them. The
hybridization patterns of two proteins RNase A and Binase
have shown remarkable difference specificity and difference
between proteins. Biochip of this type with three of four
remarkable proteins will have much more specificity. Thus,
we proposed and experimentally confirmed a new type of
proteins classification.
В современной биохимии белков для их универсальной классификации используют величину молекулярной массы (ММ) и изоэлектрическую точку
(PI) [1]. Ферменты также сравнивают по величинам
константы Михаэлиса Km и константы скорости распада энзим-субстратного комплекса kcat [2]. Многие
белки также изучают по их способности связываться
с олигонуклеотидами (ОН) различной длины и первичной структуры (сиквенса) [3]. Целый класс белков, которые специфически связываются с нуклеиновыми кислотами, не имеет общей модели описания
этого процесса и общей линейки для измерения специфичности связывания. Явление нуклеино-белкового
узнавания изучается различными методами, такими
как биочипы, рентгеноструктурный анализ, замедление в геле, плазмонный резонанс [4–9]. Единого
описания данного процесса до сих пор не существует.
Основной целью данной работы является как раз
создание универсального и простого экспериментального метода для сравнения ДНК связывающих белков
по их специфичности. Данный метод основан на экс-
периментах по изучению связывания коротких иммобилизованных ОН с белками. Первоначальная задача
наших экспериментов состояла в нахождении самых
коротких OН, которые еще могут специфически связываться с белками. Современные экспериментальные методы основаны на исследовании связывании с
белками OН от 10 до 50 нуклеотидов длиной, а часто
и еще больше [6]. Поэтому сначала надо было найти левый край этой шкалы, то есть самый короткий
специфический OН. Мы нашли такой самый короткий
узнаваемый белками OН и предложили для него уникальный сиквенс. Данная работа описывает гибридизацию белков на ДНК чипах, состоящих из коротких OН.
Описанный метод может стать универсальным способом классификации ДНК/РНК связывающих белков.
Key words: protein classification, nucleic acid – protein
recognition, oligonucleotides, microarray.
Материал и методы
Реактивы
Все OН были синтезированы с помощью синтезатора Applied Biosystems 394 с использованием стандартных методов фосфоамидитной химии и 3’-C(7)
е-mail: zrenad@gmail.com
гены & клетки Том IX, № 3, 2014
2
Оригинальные исследования
аминолинкера фирмы CPG (Glen Research, США).
Олигонуклеотиды, иммобилизованные на биочипе,
имели следующую структуру: 5’-NNNN-3’C(7)-NH2,
где NNNN – это OН длиной от 2 до 12 оснований,
содержащие четыре значимых основания (A, T, G, C)
и универсальное основание Ni, C(7)-NH2 – аминолинкер, который использовался для иммобилизации
OН внутри полиакриламидного геля. Краситель Texas
Red sulphonyl chloride dye (TR) был произведен фирмой «Molecular Probes» (Eugene, США).
Биочип был создан в два этапа. Вначале, сетка из
21 или 16 ячеек из 5% полиакриламидного геля изготавливалась на стекле методом фотополимеризации [10]. Размер каждой ячейки 100×100×20 мкм,
промежутки между ячейками – 200 мкм. Благодаря
специальной обработке, гель содержал альдегидные
группы. Затем капли водного раствора OН объемом
1 нл наносились в ячейки геля и OН присоединялся
к гелю через Шиффово основание между аминолинкером и альдегидной группой геля [11]. Таким образом, формировался биочип, содержащий OН, иммобилизованные в гелевых ячейках. Фермент биназа
из Bacillus intermedius чистоты analytical grade была
предоставлен доктором В.А. Мицкевич [12]. В работе использована рибонуклеаза A (RNase A) (Sigma,
США).
Все измерения флуоресценции были выполнены
с помощью флуоресцентного микроскопа (ЛОМО,
Россия), оборудованного высокочувствительной ПЗС
камерой (Princeton Instruments, США). Сигналы от
телекамеры поступали на компьютер и обрабатывались специальной программой. Это программное
обеспечение было написано для обработки результатов эксперимента с помощью программы LabVIEW
(National Instruments, США). Набор ОН был синтезирован для определения минимального размера JN,
необходимого для специфического и стабильного
связывания белков. Этот ряд состоял из следующих
семи OН:
1) 5’-G-A-3’-NH2 (длина 2);
2) 5’-G-A-G-3’-NH2 (длина 3);
3) 5’-G-A-G-A-3’-NH2 (длина 4);
4) 5’-G-A-G-A-G-A-3’-NH2 (длина 6);
5) 5’-G-A-G-A-G-A-G-A-3’-NH2 (длина 8);
6) 5’-G-A-G-A-G-A-G-A-G-A-3’-NH2 (длина 10);
7) 5’-G-A-G-A-G-A-G-A-G-A-G-A-3’NH2 (длина 12).
Все эти ОН были иммобилизованы в ячейках гелевого биочипа. Каждый OН был иммобилизован
в отдельной ячейке, по три ячейки на один OН, то
есть каждый OН был повторен трижды. Для экспе-
Рис. 1. Результаты гибридизации биназы
с олигонуклеотидами различной длины:
от 2 (правая колонка) до 12 (левая).
Интенсивность сигнала увеличивается от синего
к красному и далее к белому
гены & клетки Том IX, № 3, 2014
риментов по гибридизации использовался фермент
биназа, который специфически связывается с ДНК и
РНК. Фермент был мечен красителем TR при низких
отношениях краситель/белок. Биочип с иммобилизованными на нем OН был гибридизован с TR меченым
белком биназа.
Результаты и обсуждение
Результаты гибридизации представлены на рисунке 1. интенсивность сигнала значительно нарастала при росте длины OН от 2 до 6. Цифровая зависимость сигнала от длины приведена на рисунке 2.
Видно, что при росте длин OН от 4 до 7 наблюдается
плато, а дальнейший рост описывается физическим
увеличением длины OН. Полученный результат открыл возможность создания биочипов для белковой гибридизации с очень малой длиной OН – всего
четыре нуклеотида. Следующий этап работы состоял
в конструировании максимально простого чипа, состоящего из тетрамеров. Его дизайн основан на том,
чтобы ввести в состав тетрамеров один или два универсальных звена 5’-нитроиндол. 5-Nitroindole (Ni) –
это гидрофобное ароматическое соединение, которое
используется в OН в качестве основания, неотличимого ни от одного из четырех натуральных оснований
при формировании двойной спирали ДНК.
Основная идея экспериментов состояла в том,
чтобы OН имел физическую длину в 4 нуклеотида,
при этом только два нуклеотида узнавались белками. Для решения этой задачи мы синтезировали ряд
OН следующего состава:
1) 5’-G-A-3’-NH2
2) 5’-G-A-Ni-3’-NH2
3) 5’-G-A-Ni-Ni-3’-NH2
4) 5’Ni-G-A-Ni-3’-NH2
Все эти OН были иммобилизованы в ячейках биочипа. На рисунке 3 показаны результаты гибридизации этого гелевого чипа с биназой. Именно OН, состоящий из четырех звеньев, имел очень сильный
сигнал и, при этом два концевых нуклеотида должны
быть значимыми, а два других нуклеотида могут быть
Ni (5-нитроиндол). Таким образом, самый короткий
узнаваемый OН должен иметь следующую первичную
структуру Ni-Ni-B-B, где B – одно из четырех значимых оснований. Такой OН имеет физическую длину в
4 основания и при этом только два из них узнаются
белками. Именно такой дизайн легко реализовать
на практике. Мы синтезировали полный набор из 16
OН, несущих на 5’-конце все возможные значимые
Рис. 2. Изменение сигнала гибридизации
в зависимости от длины олигонуклеотида
3
Оригинальные исследования
динуклеотиды и структуру NiNi-NH2 на 3’-конце.
Типичная структура одного из эти тетрамеров:
5’-G-T-Ni-Ni-3’-NH2. Весь набор из 16 OН был иммобилизован в гелевых ячейках биочипа. Раскладка
OН по ячейкам представлена в таблице. Эксперимент
состоял в гибридизации двух флуоресцентно меченых
белков биназы и РНКазы А с этим биочипом. Было
выявлено, что даже визуальный паттерн отличался
индивидуальностью – все 16 динуклеотидов имели
существенно разные сигналы (рис. 4).
Полученный рисунок иллюстрирует так называемый фингепринт белок-нуклеинового взаимодействия – «fingerprint of protein – DNA interaction».
Полученные данные позволяют оценить специфичность связывания белков с ДНК и РНК. Белки биназа
и РНКаза А имели существенно отличающиеся паттерны гибридизации с чипом, что позволяет легко
отличать даже сходные белки друг от друга (рис. 5).
Например, как биназа, так и РНКаза А имели сильный сигнал гибридизации для динуклеотидов GG, GA,
GC и GT, однако динуклеотиды, имеющие основание
A во второй позиции, сильно различались по своему
сигналу. В случае биназы сигналы от GA, AA, CA и
TA были равны 1200, 170, 205 и 250, а в случае
RNase A – 730, 80, 509 и 470. Различия весьма существенны и могут наблюдаться даже на визуальном
уровне (см. рис. 3).
А
1
2
3
4
Рис. 3. Изменение сигнала гибридизации биназы
в зависимости от длины олигонуклеотида и
позиции 5-нитроиндола (NI) в цепи:
1 – 5’-G-A-3’-NH2; 2 – 5’-G-A-Ni-3’-NH2;
3 – 5’-G-A-Ni-Ni-3’-NH2; 4 – 5’Ni-G-A-Ni-3’-NH2
Последовательности олигонуклеотидов
на биочипе
GG
GA
GC
GT
AG
AA
AC
AT
CG
CA
CC
CT
TG
TA
TC
TT
Рис. 4. Результаты гибридизации биназы
на минимальном двумерном олигонуклеотидном
биочипе
Б
Рис. 5. Результаты гибридизации биназы (А)
и RNase A (Б) на двумерном олигонуклеотидном
биочипе после цифровой обработки.
Последовательности динуклеотидов в последнем
ряду GG, GA, GC, GT
гены & клетки Том IX, № 3, 2014
4
Оригинальные исследования
Выводы
чипов с 3 или 4 значимыми основаниями. Чип на
основе тетрануклеотидов будет включать в себя 128
элементов и откроет еще большие возможности для
идентификации белков.
Описан совершенно новый подход к классификации белков, на основе их специфического связывания с ДНК, причем подход единый для всех белков
такого типа.
Гибридизация даже с небольшим динуклеотидным чипом формирует совершенно индивидуальный
паттерн для каждого белка. Этот подход был реализован на основе простейшей платформы из тетрануклеотидов, иммобилизованных в гелевом чипе.
Обнаружено, что даже тетрамерные олигонуклеотиды c двумя значимыми нуклеотидами способны связывать белки специфическим образом.
Даже простейший биочип из 16 элементов способен создавать образы ДНК и РНК связывающих
белков. Развитие метода возможно на основе био-
Авторы благодарят канд.хим.наук А.В. Чудинова
(ИМБ РАН, Москва) за помощь в синтезе олигонуклеотидов и канд. биол. наук М.Я. Ибрагимову
за помощь в работе. Работа выполнена за счет
средств субсидии, выделенной Казанскому университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности 2014 г. Работа
поддержана также грантами РФФИ и Академии
наук РТ № 12-03-97089-рповолжье. Р.И.Ж. –
реципиент Фонда им. А. фон Гумбольдта, грант
№ V–8121/RUS/1032332, Бонн, Германия.
Литература:
1. Nelson D.L., Cox M.M., editors. Leninger principles of
biochemistry, 6th edition. USA: W.H. Freeman; 2012.
2. Raleigh D.P. Guilt by association: the physical chemistry and
biology of protein aggregation. J. Phys. Chem. Letts. 2014; 5 (11):
2012-4.
3. Song K.-M., Lee S., Ban C. Aptamers and their biological
aplications. Sensors 2012; 12: 612-31.
4. Krylov A.S., Zasedateleva O.A., Prokopenko D.V. et al. Massive
parallel analysis of the binding specificity of histone-like protein HU to
single- and double-stranded DNA with generic oligodeoxyribonucleotide
microchips. Nucl. Acids. Res. 2001; 29: 2654-60.
5. Zasedateleva O.A., Krylov A.S., Prokopenko D.V. et al.
Specificity of mammalian Y-box binding protein p50 in interaction with
ss and ds DNA analyzed with generic oligonucleotide microchip. J. Mol.
Biol. 2002; 324(1): 73-87.
6. Bulyk M.L., Huang X., ChooY. et al. Exploring the DNA-binding
specificities to zincfingers with DNA microarray. PNAS USA 2001;
98: 7158-63.
7. Nakagawa S., Gisselbrecht S.S., Rogers J.M. et al. DNA-binding
specificity changes in the evolution of forkhead transcription factors.
Proc. Natl. Acad. Sci USA 2013; 110(30): 12349-54.
8. Garner M.M., Revzin A. A gel electrophoresis method for
quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application
to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory
system. Nucleic Acids Res. 1981; 9: 3047-60.
9. Jost J.P., Munch O., Andersson T. Study of protein-DNA
interactions by surface plasmonresonance (real time kinetics). Nucleic
Acids Res. 1991; 19: 2788-98.
10.Yersov G., Barsky V., Belgovskiy A. et al. DNA analysis and
diagnostics on oligonycleotide microchips. PNAS USA 1996; 93:
4913-18.
11. Timofeev E., Kochetkova S.V., Mirzabekov A.D. et al.
Regioselective immobilization of short oligonucleotides to acrylic
copolymer gels. Nucleic Acids Res. 1996; 24: 3142-8.
12. Korchuganov D.S, Shul'ga A.A., Ermoliuk Ia.S. et al. I87E
mutation prevents barstar dimerization. Rus. J. Bioorg. Chem. 2004;
30: 638-43.
Благодарности
Поступила: 23.09.2014
гены & клетки Том IX, № 3, 2014