ГЕНЕТИКА НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГЕМОХРОМАТОЗ

ГЕНЕТИКА
НАСЛЕДСТВЕННЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ
ГЕМОХРОМАТОЗ
ГЕМОХРОМАТОЗ
НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМОРФИЗМОВ,
АССОЦИИРОВАННЫХ С РИСКОМ РАЗВИТИЯ ГЕМОХРОМАТОЗА,
МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
(ГЕНЕТИКА НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. ГЕМОХРОМАТОЗ)
Наследственный гемохроматоз – врожденное заболевание, характеризующееся нарушением
обмена железа в организме человека, приводящим к избыточному накоплению железа в тканях.
Увеличенное всасывание железа происходит в течение всей жизни больного. У мужчин заболевание встречается в 5–10 раз чаще, чем у женщин; у женщин заболевание чаще всего развивается в постменопаузе, поскольку во время менструальных кровотечений происходит регулярное
выведение избыточного железа из организма. Манифестация заболевания, сопровождающаяся
характерными клиническими симптомами, выявляется обычно в возрасте 40–60 лет, но латентная
(прецирротическая) стадия болезни может быть диагностирована значительно раньше. В начальной стадии заболевания, как правило, отсутствуют характерные клинические симптомы, и диагностическими критериями в этом случае служат лабораторные показатели обмена железа (определение уровня ферритина в сыворотке и др.).
Раннее проведение диагностики гемохроматоза имеет огромное значение, поскольку вовремя
начатое несложное лечение (например лечебное кровопускание) способно предотвратить развитие или дальнейшее прогрессирование заболевания.
Если не обнаружить заболевание на ранней стадии, то дальнейшее накопление избытка железа приводит к развернутой стадии болезни с циррозом печени, специфическим изменением цвета
кожи («бронзовая кожа») и полиорганной недостаточностью. Сахарный диабет развивается примерно у 65 % больных, артропатия – у 25–50 % больных, патология сердца (в том числе застойная
сердечная недостаточность) – у 15 % больных. Почти у 30 % больных развивается рак печени, и в
настоящее время это является наиболее частой причиной смерти больных гемохроматозом.
Выявление генетических маркеров к развитию гемохроматоза в латентной (прецирротической)
стадии позволяет своевременно начать лечение и избежать большинства проявлений болезни.
Ожидаемая продолжительность жизни у больных, лечение которых начато еще при латентной стадии, практически не отличается от таковой в здоровой популяции.
Уже в середине прошлого века стало известно, что первичный гемохроматоз – это наследственное заболевание. Более 85 % случаев заболеваний связаны с мутациями в гене HFE (их называют
классическими наследственными гемохроматозами, или гемохроматозами первого типа). Тем не менее, в настоящее время выделяют четыре типа наследственного гемохроматоза, три из которых наследуются по аутосомно-рецессивному типу и только четвертый тип – по аутосомно-доминантному.
Ген, отвечающий за классический наследственный гемохроматоз (HFE), передается по аутосомно-рецессивному типу, локус HFE расположен на участке p21.3 хромосомы 6. К настоящему
моменту выявлено несколько связанных с риском развития гемохроматоза мутаций в гене HFE,
наиболее значимые из которых – HFE: 845 G>A, HFE: 187 C>G и HFE: 193 A>T.
Чаще всего гемохроматоз бывает ассоциирован с гомозиготной миссенс-мутацией в гене HFE,
приводящей к замене HFE: 845 G>A в кодируемом этим геном трансмембранном белке HLA-I. Около 0,5 % представителей североевропейской популяции являются гомозиготными по мутации HFE:
845 G>A . Среди всех больных первичным гемохроматозом около 85 % случаев заболеваний (по
другим данным – до 92 % случаев) связаны с гомозиготным состоянием мутации HFE: 845 G>A; при
этом практически все пациенты также являются гомозиготными носителями мутации HFE: 187 C>G.
2
При изолированном гетерозиготном носительстве HFE: 845 G>A обмен железа, как правило,
нарушается незначительно. Тем не менее, одновременное наличие мутаций HFE: 187 C>G и HFE:
193 A>T коррелирует с появлением у больных клинически выраженных симптомов.
Приблизительно 1 % людей в европейских популяциях является носителем гетерозиготы по гену
HFE. Около 0,5 % представителей североевропейской популяции являются гомозиготными по мутации HFE: 845 G>A. При этом практически все пациенты также являются гомозиготными носителями мутации HFE: 187 C>G.
В крупномасштабных популяционных исследованиях было выявлено, что даже у гомозигот HFE:
845 G>A гемохроматоз развивается менее чем в 1 % случаев. В связи с этим определение генетических полиморфизмов в качестве массового скринингового теста на гемохроматоз нецелесообразно. Однако его назначение людям из группы риска (см. ниже) в случае положительного результата
служит основанием для проведения регулярных профилактических обследований с целью своевременного обнаружения признаков увеличения железа в крови и назначения необходимого лечения.
Показания к генетическому анализу:
v наличие клинических симптомов (необъяснимая гепатомегалия, идиопатическая кардиомиопатия, необычная пигментация кожи, утрата либидо, диабет, артрит), особенно у пациентов
в возрасте до 35 лет;
v наличие близких родственников – больных гемохроматозом;
v проведенное генетическое тестирование у родственников, показавшее наличие мутаций в
гене HFE, особенно у родственников I степени родства (родителей, детей, брата или сестры).
Технология анализа генетических полиморфизмов (single nucleotide polymorphisms – SNPs)
В случае возникновения замены в нуклеотидной последовательности ДНК возможно обнаружение трех вариантов генотипа: гомозиготы с исходной последовательностью нуклеотидов, гетерозиготы и гомозиготы с заменой в последовательности нуклеотидов.
Технология ПЦР с анализом кривых плавления дает возможность идентифицировать фрагменты ДНК путем детекции изменений в уровне флуоресценции комплекса фрагмент–проба (меченный флуорофором олигонуклеотидный зонд) на этапе его денатурации и последующего построения графика кривой плавления.
Технология включает следующие этапы:
v амплификация искомой последовательности ДНК;
v гибридизация ампликонов с олигонуклеотидами (пробами), меченными флуорофорами;
v образование комплементарных и частично комплементарных дуплексов;
v плавление (денатурация) дуплексов;
v детекция флуоресценции с последующим построением и анализом кривых плавления.
Для определения нуклеотидной последовательности, образовавшейся в процессе амплификации, используют метод примыкающих проб (kissing probes или резонансный перенос энергии).
В его основе лежит использование двух типов олигонуклеотидов (проб), гибридизующихся на
матрицу при низкой температуре в непосредственной близости друг от друга. Один из олигонуклеотидов метят флуоресцентным донором, другой – акцептором (гасителем). Идентификация нуклеотидной последовательности образца осуществляется в процессе плавления дуплексов (результат
гибридизации фрагментов ДНК и олигонуклеотидных зондов), которое происходит при последовательном увеличении температуры реакционной смеси.
Преимуществом данного подхода является использование специфических флуорофоров, снижающих риск детектирования неспецифических продуктов амплификации, как при использовании
интеркалирующих красителей.
3
Компания «ДНК-Технология» предлагает уникальную технологию выявления и идентификации SNP методом ПЦР с анализом кривых плавления.
Преимуществами данной технологии являются:
v Использование Taq-полимеразы, блокированной специфическими антителами, на этапе
амплификации искомого участка ДНК с праймерами, общими для обоих вариантов последовательности:
▪ реализация «горячего старта» без применения парафина;
▪ предотвращение неспецифического отжига праймеров;
▪ повышение чувствительности комплектов реагентов.
v Для повышения надежности типирования компания «ДНК-Технология» использует модификацию метода примыкающих проб:
▪ сиквенс-специфичные типирующие олигонуклеотиды;
▪ одновременная гибридизация с двумя альтернативными типирующими зондами, меченными различными флуорофорами, что позволяет определять оба варианта искомой последовательности в одной пробирке, в отличие от систем с интеркалирующими красителями,
где для определения одного SNP необходимо использовать две пробирки для разделения
аллельных вариантов.
v Автоматическое генотипирование и интерпретация результатов в режиме реального
времени с использованием специализированного программного обеспечения.
v Возможность визуальной интерпретации результатов за счет определения разницы температур плавления не менее 4–5 °С для аллельных вариантов одного гена.
Компания «ДНК-Технология» разработала набор реагентов для определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с риском развития гемохроматоза, методом ПЦР в
режиме реального времени (Генетика наследственных заболеваний. Гемохроматоз).
Технические характеристики и состав набора реагентов
Количество тестов в наборе
48 тестов
Формат реагентов
Нераскапанный
Taq-АТ-полимераза
1 пробирка (72 мкл)
ПЦР-буфер
1 флакон (1,44 мл)
Масло минеральное
1 флакон (2,88 мл)
Определяемые полиморфизмы
Материал для анализа
Срок годности
Температура хранения
1 пробирка HFE: 187 C>G (H63D) – 960 мкл
1 пробирка HFE: 193 A>T (S65C) – 960 мкл
1 пробирка HFE: 845 G>A (C282Y) – 960 мкл
Цельная кровь
6 месяцев
+2... +8 °С
-20 °С (для Taq-АТ-полимеразы)
Технология:
▪ ПЦР-плавление;
▪ использование других технологических платформ не допускается.
4
Реагенты для выделения ДНК:
▪ ПРОБА-РАПИД-ГЕНЕТИКА;
▪ ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА.
Минимальное количество ДНК для анализа:
1,0 нг на амплификационную пробирку.
Дополнительные реагенты:
реагенты для контроля качества ДНК (КВМ) – для детектирующего амплификатора ДТ-322.
Для проведения анализа необходимы следующие расходные материалы и оборудование:
▪ микропробирки (или микропробирки в стрипах) объемом 0,2 мл для ПЦР-анализа, адаптированные для работы с термоциклером в режиме реального времени;
▪ штатив и насадка на микроцентрифугу (вортекс) для стрипованного пластика.
Преимущества использования набора реагентов для определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с риском развития гемохроматоза, методом ПЦР в режиме реального времени:
▪ технологичность (стандартные методики ПЦР с детекцией результатов в режиме реального
времени);
▪ высокая скорость (для определения генотипа пациента требуется не более суток);
▪ автоматическая выдача результатов (для приборов серии ДТ);
▪ низкая стоимость анализа;
▪ высокая чувствительность (технология позволяет достоверно отличать аллельные состояния
гена друг от друга);
▪ одновременная детекция – в одной пробирке определяются два аллельных варианта гена;
▪ внутренний контроль (ВК) позволяет оценить количество ДНК в амплификационной пробирке и исключить ошибки генотипирования.
Оборудование, необходимое для проведения анализа
Набор реагентов предназначен для использования в лабораториях, оснащенных детектирующими амплификаторами для ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (приборы серии ДТ производства ООО «НПО ДНК-Технология»): ДТлайт, ДТпрайм и ДТ-96 (для
ДТ-322 функция контроля количества ДНК в каждой пробирке не поддерживается) (рис. 1).
Рис. 1. Приборы производства компании «ДНК-Технология»
5
Приборы серии ДТ оснащены специально разработанным русскоязычным программным обеспечением, поддерживающим автоматическую обработку данных и выдачу результатов исследования в удобной для интерпретации форме. Уникальные технические характеристики приборов
позволяют сократить время амплификации до 1 часа 20 минут, а общее время проведения анализа – до 2 часов 30 минут. Это значительно экономит время исследования и обеспечивает высокую
пропускную способность лаборатории.
Кроме того, программа позволяет выдавать результаты в удобной и наглядной форме для анализа полученных данных врачами-клиницистами.
№
1
2
3
Наименование исследования
HFE:_187_C>G
HFE:_193_A>T
HFE:_845_G>A
Результаты
C G
А А
G G
Cp
27,5
28,0
28,0
Дополнительные исследования:
▪ определение индекса насыщения трансферрина;
▪ определение уровня ферритина в сыворотке крови;
▪ десфераловая проба;
▪ определение коэффициента насыщения трансферрина железом – НТЖ (железо/общая железосвязывающая способность сыворотки крови – ОЖСС).
6
Внимание! Информация, содержащаяся в рекламном буклете, может не совпадать с актуальной версией спецификации на указанный продукт
7
Кодирует фактор взаимодействия с рецептором TfR
(рецептором трансферрина,
опосредующим поступление
железа в цитоплазму клетки с
последующим встраиванием
в молекулу гемоглобина или
связыванием с ферритином
или гемосидерином).
Регуляция экспрессии хепсидина, определяющего сорбцию железа в кишечнике и
его концентрацию в сыворотке крови
HFE – ген,
кодирующий белок
наследственного
гемохроматоза
rs1799945
rs1800730
rs1800562
193 А>Т
(S65C)
845 G>A
(C282Y)
Идентификатор*
187 C>G
(H63D)
Полиморфизм
A/A
G/A
G/G
T/T
A/T
A/A
Снижение функциональной активности
фермента
Без особенностей
Снижение функциональной активности
фермента
Без особенностей
Снижение функциональной активности
фермента.
Нарушение взаимодействия HFE
с рецептором TfR (негативной регуляции).
Нарушение регуляции экспрессии
хепсидина
С/G
G/G
Без особенностей
Ассоциации/эффекты
С/С
Возможные
генотипы
* Обозначение в базе данных dbSNP Национального центра биотехнологической информации США (National Center for Biotechnological Information, NCBI)
Функция гена
Ген
Генетические полиморфизмы, ассоциированные с риском развития гемохроматоза
Контакты офиса:
ООО «ДНК-Технология» Адрес: Москва, Варшавское шоссе, д. 125 Ж, корп. 6
Тел./факс: (495) 980-45-55 www.dna-technology.ru, mail@dna-technology.ru
Телефон горячей линии:
8 800 200-75-15 (звонок по России бесплатный)