ÑÅËÜÑÊÎÕÎÇßÉÑÒÂÅÍÍÀß ÁÈÎËÎÃÈß, 2012, ¹ 3 ÄÍÊ-òåõíîëîãèè, òðàíñãåíåç, ìîëåêóëÿðíîå ìàðêèðîâàíèå ÓÄÊ 633.111.1:(573.6.086.83+577.21) ÀÍÀËÈÇ ÂÅÐÒÈÊÀËÜÍÎÃÎ ÏÅÐÅÍÎÑÀ ÃÅÍΠÎÒ ÒÐÀÍÑÃÅÍÍÛÕ Ê ÍÅÒÐÀÍÑÃÅÍÍÛÌ ÐÀCÒÅÍÈßÌ ÏØÅÍÈÖÛ (Triticum aestivum L.)∗ Ä.Í. ÌÈÐÎØÍÈ×ÅÍÊÎ1, Ì.Â. ÔÈËÈÏÏÎÂ1, Ñ.Â. ÄÎËÃÎÂ1, 2 Ïðè êóëüòèâèðîâàíèè òðàíñãåííîé ïøåíèöû ñóùåñòâóåò âîçìîæíîñòü âåðòèêàëüíîãî ïåðåíîñà ãåíîâ îò ãåííî-ìîäèôèöèðîâàííûõ ê îáû÷íûì ñîðòàì âñëåäñòâèå ïåðåíîñà ïûëüöû, ïåðåîïûëåíèÿ è îáðàçîâàíèÿ ñåìÿí, ãèáðèäíûõ ïî òðàíñãåíàì. Èñïîëüçîâàâ â êà÷åñòâå äîíîðîâ ïûëüöû òðàíñãåííóþ ãîìîçèãîòíóþ ëèíèþ ÿðîâîé ïøåíèöû ñîðòà Àíäðîñ, êîòîðàÿ ñîäåðæèò ãåòåðîëîãè÷íûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ãåíà bar, ïðèäàþùåãî óñòîé÷èâîñòü ê ãåðáèöèäàì íà îñíîâå ôîñôèíîòðèöèíà, è ãåíà çåëåíîãî ôëóîðåñöåíòíîãî áåëêà gfp, ìû ïðîäåìîíñòðèðîâàëè âåðòèêàëüíûé ïåðåíîñ òðàíñãåíîâ ó ïøåíèöû â åñòåñòâåííûõ óñëîâèÿõ ïðè óäàëåíèè íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé òîãî æå ñîðòà îò ãåííî-ìîäèôèöèðîâàííûõ íà ðàññòîÿíèå 1, 2 è 3 ì.  ðåçóëüòàòå 2-ëåòíèõ èññëåäîâàíèé ïîêàçàíà çàâèñèìîñòü ÷àñòîòû ïåðåíîñà òðàíñãåíîâ îò íàïðàâëåíèÿ ãîñïîäñòâóþùèõ âåòðîâ è óäàëåíèÿ íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé îòíîñèòåëüíî òðàíñãåííûõ. ×àñòîòà âåðòèêàëüíîãî äðåéôà òðàíñãåíîâ â ñåìåíàõ íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé íà ïîëåâûõ ó÷àñòêàõ âàðüèðîâàëà îò 0,000 äî 0,797 %. Òðàíñãåííûé ñòàòóñ ãèáðèäíûõ ñåìÿí áûë ïîäòâåðæäåí óñòîé÷èâîñòüþ ê ïðèìåíåííîìó ãåðáèöèäó, ôëóîðåñöåíöèåé òêàíåé, íàëè÷èåì ïîñëåäîâàòåëüíîñòè òðàíñãåíîâ â ãåíîìå ðàñòåíèé (äàííûå ÏÖÐ è ÏÖÐ ñ îáðàòíîé òðàíñêðèïöèåé), à òàêæå õàðàêòåðíûì íàñëåäîâàíèåì òðàíñãåíîâ â ñëåäóþùåì ñåìåííîì ïîêîëåíèè. Ïîäîáíûå ýêñïåðèìåíòû ïðîâåäåíû â Ðîññèè âïåðâûå. Êëþ÷åâûå ñëîâà: òðàíñãåííàÿ ïøåíèöà, âåðòèêàëüíûé ïåðåíîñ ãåíîâ, íàñëåäîâàíèå òðàíñãåíîâ, óñòîé÷èâîñòü ê ãåðáèöèäó, ôëóîðåñöåíöèÿ òêàíåé. Keywords: transgenic wheat, crop-to-crop gene flow, transgene segregation, herbicide resistance, GFP fluorescence. Çà ïîñëåäíåå äåñÿòèëåòèå âûïîëíåíî áîëüøîå ÷èñëî èññëåäîâàíèé, ïîñâÿùåííûõ ýêñïðåññèè ðàçëè÷íûõ ãåòåðîëîãè÷íûõ ãåíîâ â êóëüòóðíûõ ñîðòàõ ó òâåðäîé è ìÿãêîé ïøåíèöû. Õîòÿ ãåííî-ìîäèôèöèðîâàííàÿ (ÃÌ) ïøåíèöà ïîêà íå âîçäåëûâàåòñÿ, âíåäðåíèå òðàíñãåííûõ ñîðòîâ â øèðîêóþ ïðàêòèêó ìèðîâîãî ñåëüñêîõîçÿéñòâåííîãî ïðîèçâîäñòâà â áëèæàéøèå ãîäû ïðåäñòàâëÿåòñÿ âïîëíå ðåàëüíûì, ïîñêîëüêó ñ 1996 ãîäà â ðàçíûõ ðåãèîíàõ ìèðà, âêëþ÷àÿ ðàçâèòûå åâðîïåéñêèå ñòðàíû, ÑØÀ, Êàíàäó, ßïîíèþ, Àâñòðàëèþ, à òàêæå Êèòàé, Ìåêñèêó è Ðîññèþ, ïðîâåäåíî áîëåå 500 ïîëåâûõ èñïûòàíèé òðàíñãåííûõ ôîðì ïøåíèöû.  ýòîé ñâÿçè âîïðîñû äðåéôà ãåíîâ ïðè âîçäåëûâàíèè ãåíåòè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííîé ïøåíèöû èìåþò íåìàëîâàæíîå çíà÷åíèå, òåì áîëåå ÷òî ïøåíèöà — ãëàâíàÿ ñåëüñêîõîçÿéñòâåííàÿ êóëüòóðà â Ðîññèè. Îäíîé èç ïðîáëåì ïðè âíåäðåíèè ÃÌ êóëüòóð â øèðîêóþ ñåëüñêîõîçÿéñòâåííóþ ïðàêòèêó ìîæåò áûòü äðåéô ãåíîâ èç ãåíîìà ÃÌ ðàñòåíèé â ãåíîì íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé (âåðòèêàëüíûé ïåðåíîñ). Ïðîÿâëåíèÿ ïîñëåäñòâèé âåðòèêàëüíîãî ïåðåíîñà ìîæíî îæèäàòü â ðåãèîíàõ ñ ïåðåêðûâàþùèìèñÿ çîíàìè ïðîèçðàñòàíèÿ è ñèíõðîíèçèðîâàííûìè ïåðèîäàìè öâåòåíèÿ ÃÌ êóëüòóð è òðàäèöèîííûõ ñîðòîâ, à òàêæå â ðåãèîíàõ ïðîèçðàñòàíèÿ áëèçêîðîäñòâåííûõ ñîðíûõ èëè äèêîðàñòóùèõ âèäîâ. Ïøåíèöà ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé îäíîëåòíåå ñàìîîïûëÿþùååñÿ ðàñòåíèå, ÷òî çíà÷èòåëüíî óìåíüøàåò ðèñê äðåéôà òðàíñãåíîâ ïîñðåäñòâîì ïåðåíîñà ïûëüöû. Ñðåäè çëàêîâûõ êóëüòóð ÷àñòîòà ïåðåîïûëåíèÿ ó ìÿãêîé ïøåíèöû ñàìàÿ íèçêàÿ è â çàâèñèìîñòè îò ñîðòà ñîñòàâëÿåò 0,5-10,0 % (1), ÷òî îáóñëîâëåíî åå áèîëîãè÷åñêèìè îñîáåííîñòÿìè. Ïî ñðàâíåíèþ ñ ïûëü∗ Çàâåðøàþùèå ýòàïû èññëåäîâàíèé âûïîëíåíû ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå Ìèíèñòåðñòâà îáðàçîâàíèÿ è íàóêè Ðîññèéñêîé Ôåäåðàöèè, ãðàíò ¹ 16.Ì04.12.0005. 37 öîé ó äðóãèõ çëàêîâ ó ïøåíèöû ïûëüöåâûå çåðíà äîñòàòî÷íî òÿæåëûå, à èõ êîëè÷åñòâî ìåíüøå (2), ïîýòîìó ïðèáëèçèòåëüíî 90 % ïûëüöû îñåäàåò â ðàäèóñå 3 ì (3, 4). Îäíàêî â îòäåëüíûõ ñëó÷àÿõ îíà ìîæåò ïåðåíîñèòüñÿ âåòðîì íà ðàññòîÿíèå äî 50-60 ì (2, 3). Ñ÷èòàåòñÿ, ÷òî æèçíåñïîñîáíîñòü ïûëüöû ó ïøåíèöû äîñòàòî÷íî íèçêàÿ è ñîõðàíÿåòñÿ â ñðåäíåì 20-30 ìèí (2, 5), õîòÿ ó ðàçíûõ ñîðòîâ îíà ìîæåò âàðüèðîâàòü îò íåñêîëüêèõ ìèíóò äî 2-3 ÷ (6). Åùå îäíà âàæíàÿ áèîëîãè÷åñêàÿ îñîáåííîñòü ïøåíèöû çàêëþ÷àåòñÿ â òîì, ÷òî ïðè öâåòåíèè êîëîñüåâ ÷àñòîòà ðàñêðûòèÿ ïûëüíèêîâ êîëåáëåòñÿ îò 61 äî 93 % â çàâèñèìîñòè îò ñîðòà (7). Âñëåäñòâèå íèçêîé ÷àñòîòû ïåðåêðåñòíîãî îïûëåíèÿ â åñòåñòâåííûõ óñëîâèÿõ Åâðîïåéñêîå àãåíòñòâî ïî îêðóæàþùåé ñðåäå (European Environment Agency — EEA) è Åâðîïåéñêèé íàó÷íûé ôîíä (European Science Foundation — ESF) ðàññìàòðèâàþò ïøåíèöó êàê êóëüòóðó ñ î÷åíü íèçêèì ðèñêîì âåðòèêàëüíîãî ïåðåíîñà òðàíñãåíîâ â ãåíîì äèêîðàñòóùèõ ðîäñòâåííûõ âèäîâ (8). Íåñìîòðÿ íà ýòî, ïðè âîçäåëûâàíèè ïøåíèöû íà ïîëÿõ íåëüçÿ èñêëþ÷àòü âåðîÿòíîñòü âåðòèêàëüíîãî ïåðåíîñà ãåíîâ îò ãåííîìîäèôèöèðîâàííûõ ê íåìîäèôèöèðîâàííûì ñîðòàì ïøåíèöû âñëåäñòâèå ïåðåíîñà ïûëüöû, ïåðåîïûëåíèÿ è îáðàçîâàíèÿ ãèáðèäíûõ ïî ãåòåðîëîãè÷íûì ãåíàì çåðíîâîê, ÷òî ìîæåò îòðàçèòüñÿ íà ÷èñòîòå ïðîèçâîäèìîãî ñåìåííîãî ìàòåðèàëà è êà÷åñòâå çåðíà. Èññëåäîâàíèÿ ïî âåðòèêàëüíîìó ïåðåíîñó òðàíñãåíîâ ñ ïûëüöîé ó çåðíîâûõ êóëüòóð ñòàëè ïðîâîäèòüñÿ ñ êîíöà ÕÕ âåêà. Ïðè ýòîì áîëåå èçâåñòíû ðàáîòû ïî àíàëèçó âåðòèêàëüíîãî ïåðåíîñà òðàíñãåíîâ, âûïîëíåííûå íà ñîðòàõ êóêóðóçû (9), ñîðãî (10), ðèñà (11) è ÿ÷ìåíÿ (12). Íà ïøåíèöå â îñíîâíîì àíàëèçèðîâàëè äðåéô ãåíîâ ñ ïûëüöîé ó íåòðàíñãåííûõ ñîðòîâ (13, 14).  åäèíñòâåííîé èçâåñòíîé ïóáëèêàöèè, ïîñâÿùåííîé âåðòèêàëüíîìó ïåðåíîñó òðàíñãåíîâ ó ïøåíèöû (15), àâòîðû îãðàíè÷èâàþòñÿ èíôîðìàöèåé îá îáðàçîâàíèè ãèáðèäíûõ òðàíñãåííûõ ôîðì F1 ïðè ñîâìåñòíîì âûðàùèâàíèè íà äåëÿíêàõ íåòðàíñãåííûõ è òðàíñãåííûõ ðàñòåíèé ñ ãåíàìè bar è gus, îäíàêî äàííûå î ÷àñòîòå ïåðåíîñà òðàíñãåíîâ íå ïðèâîäÿòñÿ, à àíàëèç ôàêòîðîâ, âëèÿþùèõ íà ýôôåêòèâíîñòü ïåðåíîñà, îòñóòñòâóåò èç-çà íåäîñòàòî÷íîãî îáúåìà âûáîðêè. Ìû èçó÷èëè èçìåíåíèå ÷àñòîòû âåðòèêàëüíîãî ïåðåíîñà ãåíîâ îò òðàíñãåííûõ ê íåòðàíñãåííûì ðàñòåíèÿì ìÿãêîé ïøåíèöû â çàâèñèìîñòè îò íàïðàâëåíèÿ ãîñïîäñòâóþùèõ âåòðîâ, óäàëåíèÿ íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé îòíîñèòåëüíî òðàíñãåííûõ, à òàêæå ïðîàíàëèçèðîâàëè íàñëåäîâàíèå ïåðåíåñåííûõ òðàíñãåíîâ â ñëåäóþùåì ñåìåííîì ïîêîëåíèè. Ìåòîäèêà. Îïûòû ïðîâîäèëè â òå÷åíèå 2 ëåò (2004 è 2005 ãîäû). Îáúåêòàìè èññëåäîâàíèé ñëóæèëè íåòðàíñãåííûå ðàñòåíèÿ ÿðîâîé ïøåíèöû ñîðòà Àíäðîñ è åãî òðàíñãåííûå ôîðìû, ïîëó÷åííûå íà ñòàíöèè èñêóññòâåííîãî êëèìàòà «Áèîòðîí» (Ôèëèàë Èíñòèòóòà áèîîðãàíè÷åñêîé õèìèè ÐÀÍ, Ìîñêîâñêàÿ îáë.) ïîñðåäñòâîì áàëëèñòè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèè âåêòîðíîé êîíñòðóêöèåé psGFP-BAR ñ ïîìîùüþ ãåííîé ïóøêè (16).  ðàáîòå èñïîëüçîâàëè ãîìîçèãîòíîå ñåìåííîå ïîòîìñòâî Ò3. Îíî áûëî îòîáðàíî â ðåçóëüòàòå ðàçìíîæåíèÿ ïåðâè÷íîãî òðàíñãåííîãî ðàñòåíèÿ A20, íåñóùåãî ãåí àöåòèëôîñôîòðàíñôåðàçû bar, êîòîðûé ñîäåðæàë èíòðîí ãåíà ubi1 êóêóðóçû è íàõîäèëñÿ ïîä êîíòðîëåì ïðîìîòîðà ubi1 êóêóðóçû (17), à òàêæå ãåí çåëåíîãî ôëóîðåñöåíòíîãî áåëêà gfp (GFP) ñ èíòðîíîì ãåíà act1 ðèñà ïîä äåéñòâèåì ïðîìîòîðà act1 ðèñà (18). Ýêñïåðèìåíòàëüíûé ó÷àñòîê çàêëàäûâàëè íà òåððèòîðèè êàðàíòèííîãî ïèòîìíèêà Âñåðîññèéñêîãî ÍÈÈ ñåëåêöèè ïëîäîâûõ êóëüòóð (ã. Îðåë). Óäàëåíèå îò ïðîìûøëåííûõ ïîëåé, íà êîòîðûõ âîçäåëûâàþòñÿ êîììåð÷åñêèå ñîðòà ïøåíèöû, ñîñòàâëÿëî íå ìåíåå 10 êì. 38  îáà ãîäà èñïûòàíèé òðàíñãåííûå ñåìåíà ïøåíèöû âûñåâàëè âíóòðè êðóãà äèàìåòðîì 1 ì èç ðàñ÷åòà 500 øò/ì2. Íåòðàíñãåííûå ñåìåíà íà ó÷àñòêå 1-ãî ãîäà èññëåäîâàíèé (2004 ãîä) âûñåâàëè â 2 ðÿäà ñ ìåæäóðÿäüåì 10 ñì íà ðàññòîÿíèè 1 ì îò âíåøíåãî ïåðèìåòðà êðóãà, çàñåÿííîãî òðàíñãåííûìè ñåìåíàìè, íà ó÷àñòêå 2-ãî ãîäà (2005 ãîä) — íà ðàññòîÿíèè 1, 2 è 3 ì îò âíåøíåãî ïåðèìåòðà. Ïåðâûé êðóã íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèéðåöèïèåíòîâ áûë ñïëîøíûì, âòîðîé è òðåòèé êðóã (2-é ãîä èñïûòàíèé) çàêëàäûâàëè â âèäå âîñüìè ñåêòîðàëüíûõ ó÷àñòêîâ (äëèíîé 1 ì), îðèåíòèðîâàííûõ ïî ñòîðîíàì ñâåòà. Ïåðåä óáîðêîé êîëîñüåâ ïåðâûé êðóã òàêæå ðàçäåëÿëè íà âîñåìü ðàâíûõ ñåêòîðîâ â ñîîòâåòñòâèè ñî ñòîðîíàìè ñâåòà. Äëÿ àíàëèçà ðàñòåíèé ïøåíèöû F1 íà âåðòèêàëüíûé ïåðåíîñ òðàíñãåíîâ ñåìåíà F1 îò íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé âûñåâàëè â çèìíèõ òåïëèöàõ íà ñòåëëàæíûå ñòîëû, çàïîëíåííûå ñìåñüþ âåðõîâîãî òîðôà è ïåñêà (3:1). Ïîñëå äîñòèæåíèÿ âñõîäàìè âûñîòû 9-11 ñì ïðîâîäèëè 1-êðàòíóþ îáðàáîòêó ïîñåâîâ â âå÷åðíåå âðåìÿ 1 % ðàñòâîðîì ãåðáèöèäà Áàñòà («Bayer CropScience», Ãåðìàíèÿ) ñîãëàñíî ðåêîìåíäàöèÿì ïðîèçâîäèòåëÿ. ×åðåç 1 íåä ïîñëå îáðàáîòêè âûæèâøèå ðàñòåíèÿ âûêàïûâàëè, ïåðåñàæèâàëè â îòäåëüíûå ãîðøêè è ïðîäîëæàëè âûðàùèâàíèå. Àêòèâíîñòü ýêñïðåññèè ãåíà gfp îöåíèâàëè ïðè ôëóîðåñöåíòíîì èññëåäîâàíèè ïûëüöû ðàñòåíèé F1 ñ ïîìîùüþ ñâåòîâîãî ìèêðîñêîïà ICM 405 («Opton», Ãåðìàíèÿ) ñî ñâåòîôèëüòðàìè 450-490 íì (äëèíà âîëíû âîçáóæäåíèÿ) è 515-530 íì (äëèíà âîëíû ýêñòèíêöèè áåëêà GFP). Ãåíîìíóþ ÄÍÊ ðàñòåíèé F1, óñòîé÷èâûõ ê ãåðáèöèäó, ýêñòðàãèðîâàëè ñîãëàñíî îïèñàíèþ (19) ñ ïðèìåíåíèåì 2½ÑÒÀÂ-áóôåðà, òîòàëüíóþ ìàòðè÷íóþ ÐÍÊ (ìÐÍÊ) — â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðèâåäåííîé ìåòîäèêîé (20). Íàëè÷èå âñòàâîê ãåíîâ gfp è bar â ãåíîìå ðàñòåíèé F1 àíàëèçèðîâàëè ñ ïîìîùüþ ïîëèìåðàçíîé öåïíîé ðåàêöèè (ÏÖÐ); íàëè÷èå àíàëîãè÷íûõ ôðàãìåíòîâ â êÄÍÊ, ñèíòåçèðîâàííîé ñ ìÐÍÊ ðàñòåíèé F1, — ïðèìåíÿÿ ÏÖÐ ñ îáðàòíîé òðàíñêðèïöèåé (ÎÒ-ÏÖÐ). Èñïîëüçîâàëè ñëåäóþùèå ïàðû ïðàéìåðîâ: äëÿ ãåíà bar — bar for 5′-TGC ACC ATC GTC AAC CAC TA-3′, bar rev 5′-ACA GCG ACC ACG CTC TTG AA-3′ (ðàçìåð îæèäàåìîãî ôðàãìåíòà — 310 ï.í.); äëÿ ãåíà gfp — sgfp for 5′-GCG ACG TAA ACG GCC ACA AG-3′, sgfp rev 5′-CCA GCA GGA CCA TGT GTG ATC G-3′ (ðàçìåð îæèäàåìîãî ôðàãìåíòà — 600 ï.í.). Ðåæèì àìïëèôèêàöèè: ñòàðò ïðè 95 °Ñ, 5 ìèí; äåíàòóðàöèÿ ïðè 94 °Ñ, 45 ñ; ýëîíãàöèÿ ïðè 72 °Ñ, 45 ñ; òåìïåðàòóðà îòæèãà — 60 °Ñ, 40 ñ (30 öèêëîâ). Àìïëèôèêàöèþ ïðîâîäèëè íà ïðèáîðå MasterCycler Gradient («Eppendorf», Ãåðìàíèÿ). Ïðîäóêòû àìïëèôèêàöèè ðàçäåëÿëè â ýëåêòðîôîðåçíîé êàìåðå («Hoeffer», ÑØÀ) â 1,2 % àãàðîçíîì ãåëå â 0,5½ÒÀÅ-áóôåðå ñ äîáàâëåíèåì áðîìèñòîãî ýòèäèÿ, ïðèìåíÿÿ ìàðêåð Ì23 («ÑèáÝíçèì», Ðîññèÿ). Íàñëåäîâàíèå òðàíñãåííîãî ïðèçíàêà â ñåìåííîì ïîòîìñòâå îöåíèâàëè ïî ôëóîðåñöåíöèè GFP â ìîëîäûõ çàðîäûøàõ ïøåíèöû â F2 in vitro íà 2-å-3-è ñóò ïîñëå èíèöèàöèè ïðîðàñòàíèÿ. Ñòàòèñòè÷åñêèé àíàëèç ðåçóëüòàòîâ ïðîâîäèëè ñ èñïîëüçîâàíèåì êðèòåðèÿ ñîîòâåòñòâèÿ χ2 (21). Ðåçóëüòàòû. Ñõåìû ðàçìåùåíèÿ òðàíñãåííûõ è íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé íà ó÷àñòêàõ ïðèâåäåíû íà ðèñóíêå 1. Íà ïîëåâûõ ó÷àñòêàõ 1-ãî è 2-ãî ãîäà èññëåäîâàíèé ïîñëå ïðîðàñòàíèÿ ñåìÿí íàáëþäàëè ñèíõðîííîå ðàçâèòèå òðàíñãåííûõ è íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé (êóùåíèå, âûõîä â òðóáêó, êîëîøåíèå è öâåòåíèå).  1-é ãîä öâåòåíèå îòìå÷àëè ñ 26 èþíÿ ïî 13 èþëÿ, âî 2-é — ñ 25 èþíÿ ïî 9 èþëÿ.  ïåðèîä öâåòåíèÿ ðàñòåíèé ïøåíèöû íàïðàâëåíèå ïðåîáëàäàþ39 ùèõ âåòðîâ áûëî ñõîäíûì (çàïàäíîå, ñåâåðî-çàïàäíîå è ñåâåðíîå), îäíàêî ñêîðîñòü âåòðà âî 2-é ãîä îêàçàëàñü íèæå, ÷òî îòðàçèëîñü íà çíà÷åíèè ñóììàðíîãî ïðîáåãà âåòðà (òàáë. 1).  1-é ãîä èññëåäîâàíèé ÷èñëî ñåìÿí F1, ñîáðàííûõ ñ íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé ïøåíèöû íà êðóãîâîì ó÷àñòêå, êîòîðûé ðàñïîëàãàëñÿ íà ðàññòîÿíèè 1 ì îò òðàíñãåííûõ, ñîñòàâèëî 62 221 øò., âî 2-é — áîëåå 125 òûñ. øò. Âñëåäñòâèå òîãî, ÷òî êëèìàòè÷åñêèå óñëîâèÿ 2-ãî ãîäà Ðèñ 1. Ñõåìàòè÷åñêîå èçîáðàæåíèå îïûòíîãî ó÷àñòêà ïî èññëåäîâàíèé îêàçàëèñü ìåèçó÷åíèþ âåðòèêàëüíîãî ïåðåíîñà ãåíîâ îò òðàíñãåííûõ íåå áëàãîïðèÿòíûìè (ãîä áûë ê íåòðàíñãåííûì ðàñòåíèÿì ïøåíèöû â 2004 (À) è 2005 (Á) ãîäó (êàðàíòèííûé ïèòîìíèê Âñåðîññèéñêîãî ÍÈÈ çàñóøëèâåå), óðîæàé ñåìÿí íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé ñíèñåëåêöèè ïëîäîâûõ êóëüòóð, ã. Îðåë). çèëñÿ ïî ñðàâíåíèþ ñ òàêîâûì â ïðåäûäóùèé ãîä (òàáë. 2). Ïðè ýòîì ñðåäíÿÿ ìàññà 1000 ñåìÿí óìåíüøèëàñü íà 14 %. 1. Ïðîäîëæèòåëüíîñòü öâåòåíèÿ (ÏÖ) ó òðàíñãåííûõ è íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé ïøåíèöû ñîðòà Àíäðîñ è êëèìàòè÷åñêèå õàðàêòåðèñòèêè â ýòîò ïåðèîä íà ïîëåâîì ó÷àñòêå ïî ãîäàì èññëåäîâàíèé (600-2100, êàðàíòèííûé ïèòîìíèê Âñåðîññèéñêîãî ÍÈÈ ñåëåêöèè ïëîäîâûõ êóëüòóð, ã. Îðåë) Ñðåäíÿÿ òåì- Îòíîñèòåëü- Ñóììàðíûé Äîëÿ â íàïðàâëåíèè ãîñïîäñòâóþùèõ âåòðîâ, % ÏÖ, ïåðàòóðà âîç- íàÿ âëàæ- ïðîáåã âåòáåç ñóò Ñ Ñ-  Þ-Â Þ Þ-Ç 3 Ñ-3 íîñòü, % ðà, ì äóõà, °Ñ âåòðà 2004 ã î ä 18,0 2,3 1,6 4,7 5,5 10,2 25,8 28,1 3,9 2005 ã î ä 16 18,5 67,3 2959 27,5 4,2 6,3 2,1 2,1 8,4 24,2 17,9 7,4 Ï ð è ì å ÷ à í è å. Ñ, Ñ-Â, Â, Þ-Â, Þ, Þ-Ç, Ç è Ñ-Ç — ñîîòâåòñòâåííî ñåâåðíûé, ñåâåðî-âîñòî÷íûé, âîñòî÷íûé, þãî-âîñòî÷íûé, þæíûé, þãî-çàïàäíûé, çàïàäíûé è ñåâåðî-çàïàäíûé âåòåð. 18 18,1 74,4 3877 2. Ðàñïðåäåëåíèå ñåìÿí F1, ñîäåðæàùèõ ãåíû bar è gfp, ó íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé ïøåíèöû ñîðòà Àíäðîñ â çàâèñèìîñòè îò èõ ðàñïîëîæåíèÿ îòíîñèòåëüíî òðàíñãåííûõ ðàñòåíèé (êàðàíòèííûé ïèòîìíèê Âñåðîññèéñêîãî ÍÈÈ ñåëåêöèè ïëîäîâûõ êóëüòóð, ã. Îðåë) ×èñëî ñåìÿí F1, ñîáðàííûõ ñ íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé Ó÷àñòîê ïøåíèöû, øò. 2004 ãîä 2005 ãîä 1ì 1ì 2ì 3ì ×èñëî óñòîé÷èâûõ ê ×àñòîòà âåðòèêàëüíîãî ïåðåãåðáèöèäó ïðîðîñòêîâ F1 íîñà ñ ïûëüöîé (gene flow), % (bar+/gfp+) , øò. 2004 ãîä 2005 ãîä 2004 ãîä 2005 ãîä 1ì 1ì 2ì 3ì 1ì 1ì 2ì 3ì Ñ 8468 5539 3902 3056 8 5 0 0 0,094 0,090 0 Ñ- 8020 6312 5967 4930 49 13 4 1 0,611 0,206 0,067 0,020  6660 5604 3382 5839 53 13 1 0 0,796 0,232 0,030 0 Þ- 7404 5571 5945 5311 59 17 1 0 0,797 0,305 0,017 0 Þ 7980 5161 4398 5565 45 11 1 0 0,564 0,213 0,023 0 Þ-Ç 9071 6613 4748 7860 24 1 2 0 0,265 0,015 0,042 0 Ç 8400 6352 4712 3500 18 4 4 0 0,214 0,063 0,085 0 Ñ-Ç 8446 6617 3837 4398 4 0 0 0 0,047 0 0 0 Âñåãî 62221 47669 36891 40459 259 64 13 1 0,416 0,134 0,035 0,002 Ï ð è ì å ÷ à í è å. Ñ, Ñ-Â, Â, Þ-Â, Þ, Þ-Ç, Ç è Ñ-Ç — îïèñàíèå ó÷àñòêîâ ñ äîëåé ãîñïîäñòâóþùèõ âåòðîâ (ñîîòâåòñòâåííî ñåâåðíûé, ñåâåðî-âîñòî÷íûé, âîñòî÷íûé, þãî-âîñòî÷íûé, þæíûé, þãî-çàïàäíûé, çàïàäíûé è ñåâåðî-çàïàäíûé) ñì. â òàáëèöå 1.  1-é ãîä èñïûòàíèé ïîñëå òîãî, êàê âñå ñîáðàííûå ñåìåíà F1 âûñåÿëè â çèìíèå òåïëèöû è íà 10-å ñóò îáðàáîòàëè âñõîäû ãåðáèöèäîì, ïðîèçîøëà ãèáåëü áîëåå 99,5 % ïðîðîñòêîâ. Îäíàêî áûëè òàêæå îáíàðóæåíû 40 ðàñòåíèÿ, êîòîðûå íå ïðîÿâëÿëè ïðèçíàêîâ ïîâðåæäåíèÿ, ïðîäîëæàëè óñïåøíî ðàñòè è ôîðìèðîâàòü ëèñòüÿ. Äîëÿ óñòîé÷èâûõ ê ãåðáèöèäó ðàñòåíèé F1, êîòîðûå ïîëó÷èëè èç ñåìÿí íåòðàíñãåííûõ ôîðì, ïðîèçðàñòàâøèõ íà ðàññòîÿíèè 1 ì îò òðàíñãåííûõ (ïðè îáùåì ÷èñëå âûæèâøèõ ðàñòåíèé 259 øò.), çàìåòíî âàðüèðîâàëà â çàâèñèìîñòè îò òîãî, â êàêîì íàïðàâëåíèè îòíîñèòåëüíî öåíòðàëüíîãî êðóãà íàõîäèëèñü ðàñòåíèÿ-ðåöèïèåíòû (ñì. òàáë. 2). Íà ñåâåðíîì è ñåâåðî-çàïàäíîì ó÷àñòêàõ ÷èñëî ãèáðèäíûõ ñåìÿí, äàâøèõ íà÷àëî óñòîé÷èâûì ê ãåðáèöèäó ðàñòåíèÿì, ñîñòàâèëî 1-2 øò. íà 2000 ñåìÿí, òîãäà êàê íà âîñòî÷íîì è þãî-âîñòî÷íîì — äîñòèãëî 8 øò. íà 1000 ñåìÿí. Ïðè òåñòèðîâàíèè íà ýêñïðåññèþ ãåíà GFP ñèíòåç ýòîãî ìàðêåðíîãî áåëêà îòìå÷àëè ó âñåõ 259 ðàñòåíèé F1, âûæèâøèõ ïîñëå îáðàáîòêè ãåðáèöèäîì (äëÿ èññëåäîâàíèÿ ìû èñïîëüçîâàëè ïûëüöó, êîòîðàÿ íå ñîäåðæèò õëîðîôèëë, ÷òî îáëåã÷àåò âèçóàëèçàöèþ). Ïðîâåäåííûé ÏÖÐ-àíàëèç ÄÍÊ (ðèñ. 2, À) ïîëíîñòüþ ïîäòâåðäèë ïðèñóòñòâèå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè òðàíñãåíîâ â ãåíîìå ó âñåõ ïðîàíàëèçèðîâàííûõ ãèáðèäíûõ ðàñòåíèé F1, ïîñêîëüêó âî âñåõ îáðàçöàõ ïðîèñõîäèëà àìïëèôèêàöèÿ ôðàãìåíòîâ îæèäàåìîé äëèíû — 310 ï.í. (ãåí bar ) è 600 ï.í. (ãåí gfp). ÎÒ-ÏÖÐ-àíàëèç ýêñïðåññèè ãåíîâ bar è gfp ñ èñïîëüçîâàíèåì òîòàëüíîé ðàñòèòåëüíîé ÐÍÊ (ñì. ðèñ. 2, Á) òàêæå ïîäòâåðäèë íàëè÷èå âñòàâêè òðàíñãåíîâ, ñ êîòîðûõ óñïåøíî òðàíñêðèáèðîâàëèñü ìÐÍÊ, íåîáõîäèìûå äëÿ ñèíòåçà àöåòèëôîñôîòðàíñôåðàçû, îáåñïå÷èâøåé óñòîé÷èâîñòü ê ãåðáèöèäó, à òàêæå ìàðêåðíîãî ôëóîðåñöåíòíîãî áåëêà GFP. Êàê ñâèäåòåëüñòâóþò íàøè ïðåäûäóùèå èññëåäîâàíèÿ (16), â òðàíñãåííûõ ðàñòåíèÿõ — äîíîðàõ ïûëüöû ãåíû bar è gfp íàñëåäóþòñÿ ñöåïëåííî, ïîñêîëüêó îáà èçíà÷àëüíî íàõîäÿòñÿ â îäíîé âåêòîðíîé êîíñòðóêöèè psGFP-BAR, êîòîðàÿ èñïîëüçîâàëàñü äëÿ ïîëó÷åíèÿ òðàíñãåííûõ ðàñòåíèé ëèíèè À-20. À Á Ðèñ. 2. Òèïè÷íûå ýëåêòðîôîðåãðàììû àìïëèêîíîâ, ïîëó÷åííûõ ó ïøåíèöû ñîðòà Àíäðîñ ïðè àíàëèçå òîòàëüíîé ÄÍÊ ìåòîäîì ïîëèìåðàçíîé öåïíîé ðåàêöèè (À) è àíàëèçå òîòàëüíîé êÄÍÊ ìåòîäîì ïîëèìåðàçíîé öåïíîé ðåàêöèè ñ îáðàòíîé òðàíñêðèïöèåé (Á) íà ïðèñóòñòâèå ãåíîâ gfp (âåðõíèé ðÿä) è bar (íèæíèé ðÿä) â ãåíîìå óñòîé÷èâûõ ê ãåðáèöèäó ðàñòåíèé F1, êîòîðûå áûëè îáíàðóæåíû ïðè âûñåâå ñåìÿí îò íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé, âûðàùåííûõ íà ðàññòîÿíèè 1 ì îò òðàíñãåííûõ: Ì — ìàðêåð ìîëåêóëÿðíîé ìàññû (1500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 è 100 ï.í.); P — ïîëîæèòåëüíûé êîíòðîëü (ÄÍÊ ïëàçìèäû psGFP-BAR, èñïîëüçîâàâøåéñÿ ïðè ïîëó÷åíèè òðàíñãåííîé ëèíèè); Ê1 — îòðèöàòåëüíûé êîíòðîëü (ÄÍÊ íåòðàíñãåííîãî ðàñòåíèÿ ïøåíèöû); K2 — ðåàêöèîííàÿ ñìåñü, íå ñîäåðæàùàÿ ÄÍÊ; 1-9 — ãèáðèäíûå ðàñòåíèÿ F1 (ñîîòâåòñòâåííî 9/2, 1/10, 4/7, 5/15, 4/4, 4/9, 5/12, 4/13 è 17/1); ðàçìåð îæèäàåìîãî ôðàãìåíòà äëÿ ãåíà bar — 310 ï.í., äëÿ ãåíà gfp — 600 ï.í. Òàêèì îáðàçîì, â 1-é ãîä ìîëåêóëÿðíî-áèîëîãè÷åñêèé àíàëèç ïîêàçàë, ÷òî âñå âûæèâøèå ïðè îáðàáîòêå ãåðáèöèäîì ðàñòåíèÿ ïðåäñòàâëÿþò ñîáîé ïîòîìñòâî F1 ñî âñòàâêîé ãåíîâ bar è gfp â ãåíîìå, êîòîðîå ïîëó÷åíî â ïîëåâûõ óñëîâèÿõ íà îïûòíîì ó÷àñòêå â ðåçóëüòàòå åñòåñòâåííîãî ïåðåîïûëåíèÿ òðàíñãåííûõ è íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé ïøåíèöû. 41 Âî 2-é ãîä èññëåäîâàíèé íåòðàíñãåííûå ðàñòåíèÿ-ðåöèïèåíòû äîïîëíèòåëüíî âûñàäèëè íà ðàññòîÿíèè 2 è 3 ì îò òðàíñãåííûõ. Ïîñëå îáðàáîòêè âñõîäîâ ñåìÿí F1 ãåðáèöèäîì îáíàðóæèëè 78 âûæèâøèõ ïðîðîñòêîâ áåç ïðèçíàêîâ ïîâðåæäåíèÿ. Äîëÿ âûæèâøèõ ðàñòåíèé F1 çíà÷èòåëüíî âàðüèðîâàëà â çàâèñèìîñòè îò óäàëåíèÿ àíàëèçèðóåìûõ ñåìåííûõ ó÷àñòêîâ îò ðàñòåíèé — äîíîðîâ ïûëüöû. Òàê, ó ðàñòåíèé-ðåöèïèåíòîâ, ïðîèçðàñòàâøèõ íà ðàññòîÿíèè 3 è 2 ì îò òðàíñãåííûõ, óñòîé÷èâóþ ê ãåðáèöèäó ôîðìó F1 äàëè ñîîòâåòñòâåííî 1 è 13 ñåìÿí (ñì. òàáë. 2). Ïðè óäàëåíèè íà 2 ì ðàñïðåäåëåíèå ãèáðèäíûõ ðàñòåíèé F1 âàðüèðîâàëî îò 0 øò. (ñåâåðíûé è ñåâåðî-âîñòî÷íûé ó÷àñòêè) äî 4 øò. (ñåâåðî-âîñòî÷íûé è çàïàäíûé ó÷àñòêè). Ïðè óäàëåíèè íà 3 ì åäèíñòâåííîå óñòîé÷èâîå ðàñòåíèå F1 áûëî îáíàðóæåíî íà ñåâåðî-âîñòî÷íîì ó÷àñòêå. Ó íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé, ðàçìåùåííûõ íà ðàññòîÿíèè 1 ì îò òðàíñãåííûõ, óñòîé÷èâûå ê ãåðáèöèäó ôîðìû F1 ïîëó÷èëè îò 64 ñåìÿí, ïðè ýòîì ÷àñòîòà âåðòèêàëüíîãî ïåðåíîñà èçìåíÿëàñü â çàâèñèìîñòè îò àíàëèçèðóåìîãî ó÷àñòêà: íà þãî-âîñòî÷íîì ÷èñëî òàêèõ ñåìÿí ñîñòàâèëî 3 øò. íà 1000, òîãäà êàê íà ñåâåðî-çàïàäíîì èõ íå îáíàðóæèëè (ñì. òàáë. 2). Ôëóîðîìåòðè÷åñêîå èññëåäîâàíèå ïûëüöû ó âñåõ 78 ðàñòåíèé F1 ïîäòâåðäèëî ñöåïëåííûé ïåðåíîñ ïðèçíàêîâ ôëóîðåñöåíöèè è óñòîé÷èâîñòè ê ãåðáèöèäó. Ðåçóëüòàòû âûïîëíåííîãî ìîëåêóëÿðíî-áèîëîãè÷åñêîãî àíàëèçà (ÏÖÐ è ÎÒ-ÏÖÐ) ñîâïàëè ñ äàííûìè ôèçèîëîãè÷åñêîãî è áèîõèìè÷åñêîãî òåñòèðîâàíèÿ. ÏÖÐ-àíàëèç ïîêàçàë, ÷òî â ãåíîìå âñåõ àíàëèçèðóåìûõ ãèáðèäíûõ ðàñòåíèé F1 ïðèñóòñòâîâàëè ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ãåíîâ gfp è bar, à òàêæå íàáëþäàëàñü èõ ýêñïðåññèÿ íà óðîâíå ìÐÍÊ. Òàêèì îáðàçîì, îòîáðàííûå â ðåçóëüòàòå îáðàáîòêè ãåðáèöèäîì ðàñòåíèÿ F1 òðàíñãåííû ïî ãåíàì bar è gfp, ïåðåíîñ êîòîðûõ ïðîèçîøåë ïðè ïåðåîïûëåíèè òðàíñãåííîé ïûëüöîé. Äëÿ ïîäòâåðæäåíèÿ òîãî, ÷òî îáíàðóæåííûå óñòîé÷èâûå ê ãåðáèöèäó ôîðìû íå ÿâëÿþòñÿ ñëåäñòâèåì ñëó÷àéíîãî çàãðÿçíåíèÿ ñåìåíàìè òðàíñãåííûõ ðàñòåíèé-äîíîðîâ, à äåéñòâèòåëüíî îáðàçîâàëèñü â ðåçóëüòàòå ïåðåíîñà ïûëüöû, ìû ïðîàíàëèçèðîâàëè íàñëåäîâàíèå ïðèîáðåòåííûõ ãåíîâ ïðè äàëüíåéøåì ñåìåííîì ðàçìíîæåíèè.  ñëó÷àå îïûëåíèÿ íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé òðàíñãåííîé ïûëüöîé ãîìîçèãîòíûõ ðàñòåíèé ëèíèè À-20 ãèáðèäíûå ðàñòåíèÿ F1 äîëæíû ïðåäñòàâëÿòü ñîáîé ãåòåðîçèãîòû ïî ïðèîáðåòåííûì ãåíàì bar è gfp. Ïðè ïîñëåäóþùåì ñàìîîïûëåíèè òàêèõ ðàñòåíèé F1 íàñëåäîâàíèå áóäåò ñîîòâåòñòâîâàòü îäíîëîêóñíîìó õàðàêòåðó âñòðàèâàíèÿ, ïîñêîëüêó ãåíû bar è gfp èìåþò ðåãóëÿòîðíûå ýëåìåíòû (ïðîìîòîðû) ãåíîâ act1 è ubi1 ðèñà è êóêóðóçû, îïðåäåëÿþùèõ äîìèíàíòíûå ïðèçíàêè. Åñëè æå ýòè ðàñòåíèÿ ïîëó÷åíû èç ñëó÷àéíî ïîïàâøèõ ñåìÿí ãîìîçèãîòíûõ òðàíñãåííûõ ðàñòåíèé-äîíîðîâ, òî ðàñùåïëåíèÿ ïðèçíàêîâ ïðîèñõîäèòü íå äîëæíî, à ôëóîðåñöåíöèÿ áóäåò íàáëþäàòüñÿ âî âñåõ ðàñòåíèÿõ-ïîòîìêàõ. Õàðàêòåð íàñëåäîâàíèÿ ýêñïðåññèè ãåíà gfp èçó÷èëè äëÿ 14 691 çåðíîâêè F2 (òàáë. 3). Óðîâåíü ýêñïðåññèè gfp ó òðàíñãåííûõ ñåìÿí âàðüèðîâàë, îäíàêî â ïîòîìñòâå ó âñåõ 337 ãèáðèäíûõ ðàñòåíèé F1 íàáëþäàëîñü ñòàáèëüíîå íàñëåäîâàíèå ïðèîáðåòåííîãî ãåòåðîëîãè÷íîãî ãåíà. Ñòàòèñòè÷åñêèé àíàëèç ïî χ2-êðèòåðèþ ñîîòâåòñòâèÿ ïîêàçàë, ÷òî äëÿ áîëüøèíñòâà ðàñòåíèé, ïîëó÷åííûõ êàê â 1-é, òàê è âî 2-é ãîä, áûëà õàðàêòåðíà îäíîëîêóñíàÿ ìîäåëü íàñëåäîâàíèÿ 3:1 (ñì. òàáë. 3), íåñìîòðÿ íà êîëåáàíèÿ ðåàëüíîãî ñîîòíîøåíèÿ ÷èñëà òðàíñãåííûõ è íåòðàíñãåííûõ ïîòîìêîâ F2, ïîëó÷åííûõ îò èíäèâèäóàëüíûõ ðàñòåíèé F1, îò 1:1 äî 11:1. Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî áîëüøèíñòâî «íåîáû÷íûõ» ðàñùåïëåíèé íàáëþäàëè ó ðàñòåíèé, ñôîðìèðîâàâøèõ îãðàíè÷åííîå ÷èñëî ñåìÿí (10-20 øò.). Ïðè ýòîì íå áûëî 42 3. Ðåçóëüòàòû àíàëèçà íàñëåäîâàíèÿ ýêñïðåññèè ãåíà gfp â ñåìåííîì ïîêîëåíèè ãèáðèäíûõ ðàñòåíèé F1, ïîëó÷åííûõ â ðåçóëüòàòå âåðòèêàëüíîãî ïåðåíîñà ãåíîâ îò òðàíñãåííûõ ê íåòðàíñãåííûì ðàñòåíèÿì ïøåíèöû ñîðòà Àíäðîñ â çàâèñèìîñòè îò èõ ðàñïîëîæåíèÿ îòíîñèòåëüíî òðàíñãåííûõ ðàñòåíèé (ñòàíöèÿ èñêóññòâåííîãî êëèìàòà «Áèîòðîí», Ôèëèàë Èíñòèòóòà áèîîðãàíè÷åñêîé õèìèè ÐÀÍ, ã. Ïóùèíî) Ãîä À Á Â Ã Ä 2004 2005: âñåãî â òîì ÷èñëå 1 259 9970 239 92,3 78 4721 68 87,2 1 64 3842 57 89,1 2 13 814 10 76,9 3 1 65 1 100 Ï ð è ì å ÷ à í è å. À — ðàññòîÿíèå ìåæäó òðàíñãåííûìè è íåòðàíñãåííûìè ðàñòåíèÿìè, ì; Á — ÷èñëî bar+/gfp+ ðàñòåíèé F1, øò.;  — ÷èñëî çàðîäûøåé bar+/gfp+ ðàñòåíèé F1, ïðîàíàëèçèðîâàííûõ íà ýêñïðåññèþ GFP, øò.; à — ÷èñëî bar+/gfp+ ðàñòåíèé F1, ïîêàçàâøèõ ðàñùåïëåíèå ïî gfp 3:1 ñîãëàñíî χ2, øò.; Ä — äîëÿ çàðîäûøåé, ïîêàçàâøèõ ðàñùåïëåíèå 3:1, %. îáíàðóæåíî ðàñòåíèé F1, íàñëåäóþùèõ ôëóîðåñöåíöèþ GFP êàê ãîìîçèãîòíûé ïðèçíàê. Òî, ÷òî âñå óñòîé÷èâûå ê ãåðáèöèäó ðàñòåíèÿ F1 äåìîíñòðèðîâàëè íàñëåäîâàíèå òðàíñãåííîãî ïðèçíàêà êàê ãåòåðîçèãîòíîãî, ñâèäåòåëüñòâóåò î ôàêòå âåðòèêàëüíîãî ïåðåíîñà ãåíîâ ïîñðåäñòâîì åñòåñòâåííîãî ïåðåîïûëåíèÿ òðàíñãåííîé ïûëüöîé. Íàøè èññëåäîâàíèÿ ïîÀ Á êàçàëè, ÷òî ÷àñòîòà âåðòèêàëüíîãî ïåðåíîñà òðàíñãåíîâ bar è gfp íà îïûòíûõ ó÷àñòêàõ â ðàçíûå ãîäû âàðüèðîâàëà, ÷òî ìîæåò áûòü îáóñëîâëåíî âëèÿíèåì ðàçëè÷íûõ êëèìàòè÷åñêèõ ôàêòîðîâ â ïåðèîä àêòèâíîãî öâåòåíèÿ êîëîñüåâ ïøåíèöû. Òàê, äëÿ ðåöèïèåíòíûõ ðàñòåíèé, ðàñïîëîæåííûõ íà ðàññòîÿíèè 1 ì îò äîíîðíûõ, â 2004 è 2005 ãîäó îíà â ñðåäíåì ñîñòàâèëà ñîîòâåòñòâåííî 0,416 è 0,134 % (ñì. òàáë. 3). Ñêîðåå âñåãî, íàáëþäàåìîå ïðåâûøåíèå â 1-é ãîä èññëåäîâàíèé âûçâàíî òåì, ÷òî âî Ðèñ. 3. ×àñòîòà âåðòèêàëüíîãî ïåðåíîñà ãåíîâ bar è gfp (âåðõíèé ðÿä) â çàâèñèìîñòè îò íàïðàâëåíèÿ âåòðà 2-é ãîä ïðîäîëæèòåëüíîñòü (íèæíèé ðÿä) ïðè óäàëåíèè íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé öâåòåíèÿ â öåëîì áûëà êîðîïøåíèöû ñîðòà Àíäðîñ îò òðàíñãåííûõ íà ðàññòîÿíèå ÷å, â ïåðèîä âûáðîñà ïûëü1 ì â 2004 (À) è 2005 (Á) ãîäó. íèêîâ íàáëþäàëàñü áîëåå âû âåðõíåì ðÿäó çàêðàøåííàÿ îáëàñòü ïîêàçûâàåò ðàñïðåäåëåíèå ÷àñòîòû ïåðåíîñà òðàíñãåíîâ (îäíî ñîêàÿ òåìïåðàòóðà âîçäóõà ïðè äåëåíèå — 0,1 %) â çàâèñèìîñòè îò ãåîãðàôè÷åñêîãî áîëåå íèçêîé âëàæíîñòè, ïûëüïîëîæåíèÿ íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé îòíîñèòåëüíî öåí- öà õóæå ìèãðèðîâàëà, ïîñêîëüòðàëüíîãî êðóãîâîãî ó÷àñòêà, çàñåÿííîãî òðàíñãåííîé ïøåíèöåé.  íèæíåì ðÿäó ïóíêòèðîì îáîçíà÷åíà ìå- êó îòìå÷àëîñü ñíèæåíèå ñóìòåîðîëîãè÷åñêàÿ ðîçà âåòðîâ, çàêðàøåííàÿ îáëàñòü — ìàðíîãî ïðîáåãà âåòðà (ñì. ðîçà âåòðîâ, îáðàòíàÿ ìåòåîðîëîãè÷åñêîé (êàðàíòèííûé òàáë. 1). Íà óìåíüøåíèå ÷àñïèòîìíèê Âñåðîññèéñêîãî ÍÈÈ ñåëåêöèè ïëîäîâûõ òîòû ïåðåíîñà òàêæå ïîâëèÿêóëüòóð, ã. Îðåë). ëî îáùåå ñíèæåíèå óðîæàéíîñòè â 2005 ãîäó (íà 23 %) âñëåäñòâèå ìåíåå áëàãîïðèÿòíîãî âîäíîãî ðåæèìà (íåäîñòàòî÷íîå êîëè÷åñòâî îñàäêîâ). Ðàçäåëåíèå àíàëèçèðóåìîãî êðóãîâîãî îïûòíîãî ó÷àñòêà íà âîñåìü 43 ñåãìåíòîâ â ñîîòâåòñòâèè ñî ñòîðîíàìè ñâåòà ïîçâîëèëî âûÿâèòü êîððåëÿöèþ ìåæäó ðàñïðåäåëåíèåì òðàíñãåííûõ ãèáðèäíûõ ñåìÿí è íàïðàâëåíèåì ãîñïîäñòâóþùèõ âåòðîâ â ïåðèîä ìàññîâîãî öâåòåíèÿ ïøåíèöû. Íàïðàâëåíèå ïðåîáëàäàþùèõ âåòðîâ â îáà ãîäà èññëåäîâàíèé áûëî ñõîæèì (çàïàäíîå, ñåâåðî-çàïàäíîå è ñåâåðíîå íàïðàâëåíèÿ) (ðèñ. 3). Áîëüøàÿ ÷àñòü òðàíñãåííûõ ãèáðèäíûõ ñåìÿí F1 áûëà îáíàðóæåíà íà ÷åòûðåõ ó÷àñòêàõ, íàõîäÿùèõñÿ ïî ïåðå÷èñëåííûì íàïðàâëåíèÿì, à òàêæå ïî þãî-âîñòî÷íîìó íàïðàâëåíèþ.  1-é ãîä íà ñåâåðî-âîñòî÷íîì, âîñòî÷íîì, þãî-çàïàäíîì è þæíîì ó÷àñòêàõ (îòíîñèòåëüíî öåíòðàëüíîãî êðóãà) îáíàðóæèëè 206 òðàíñãåííûõ ãèáðèäíûõ ñåìÿí (èëè 81 % îò èõ îáùåãî ÷èñëà), âî 2-é — 45 ñåìÿí (èëè 84 % îò îáùåãî ÷èñëà).  îáà ãîäà èññëåäîâàíèé ñàìóþ âûñîêóþ ÷àñòîòó ïåðåíîñà ðåãèñòðèðîâàëè ó ðàñòåíèé, íàõîäÿùèõñÿ ïî íàïðàâëåíèþ ñåâåðî-çàïàäíîãî âåòðà: â 2004 è 2005 ãîäó îíà ñîñòàâèëà ñîîòâåòñòâåííî 0,797 è 0,305 % (èëè 59 è 17 óñòîé÷èâûõ ê ãåðáèöèäó ðàñòåíèé). Ñîâåðøåííî èíûì áûëî ðàñïðåäåëåíèå ãèáðèäíûõ ñåìÿí íà ó÷àñòêàõ êðóãà íåòðàíñãåííûõ ðàñòåíèé, íàõîäèâøèõñÿ â íàïðàâëåíèè þæíîãî, þãî-âîñòî÷íîãî, âîñòî÷íîãî è ñåâåðî-âîñòî÷íîãî âåòðîâ.  ñóììå äîëÿ ãèáðèäíûõ ñåìÿí, îáðàçîâàâøèõñÿ â ñåêòîðàõ âíåøíåãî êðóãà â ýòèõ íàïðàâëåíèÿõ, ðàâíÿëàñü âñåãî 19 % (2004 ãîä) è 16 % (2005 ãîä) îò îáùåãî ÷èñëà îáíàðóæåííûõ ãèáðèäíûõ ñåìÿí.  îáà ãîäà èññëåäîâàíèé ìèíèìàëüíóþ ÷àñòîòó âåðòèêàëüíîãî ïåðåíîñà òðàíñãåíîâ ðåãèñòðèðîâàëè íà ñåâåðî-âîñòî÷íîì ó÷àñòêå. Ýòè äàííûå ïîçâîëÿþò óòâåðæäàòü, ÷òî îáùåå êîëè÷åñòâî ïåðåíîñèìîé òðàíñãåííîé ïûëüöû â çàâèñèìîñòè îò íàïðàâëåíèÿ âåòðà ìîãëî ðàçëè÷àòüñÿ â 4-5 ðàç, ÷òî è ïðèâåëî ê íàáëþäàåìûì êîëåáàíèÿì. Ïðè óâåëè÷åíèè ðàññòîÿíèÿ îò òðàíñãåííûõ ðàñòåíèé — äîíîðîâ ïûëüöû äî íåòðàíñãåííûõ ïðîèñõîäèëî î÷åâèäíîå ñíèæåíèå âåðîÿòíîñòè ïåðåíîñà òðàíñãåíîâ ñ ïûëüöîé. Òàê, ïðè óäàëåíèè íà 1 ì ÷àñòîòà ïåðåíîñà â ñðåäíåì ñîñòàâèëà 0,134 %, ñíèçèâøèñü ïðè 2-êðàòíîì óâåëè÷åíèè ðàññòîÿíèÿ ïî÷òè â 4 ðàçà (0,035 %), ïðè 3-êðàòíîì — â 66 ðàç (0,002 %). Ýòè äàííûå â öåëîì ñîãëàñóþòñÿ ñ ðåçóëüòàòàìè èññëåäîâàíèé, â êîòîðûõ èçó÷àëàñü ÷àñòîòà ïåðåêðåñòíîãî îïûëåíèÿ ó íåêîòîðûõ ñîðòîâ ìÿãêîé è òâåðäîé ïøåíèöû â ðàçíûõ óñëîâèÿõ (1, 3, 5, 6, 13, 14). Âûâîäû, èçëîæåííûå â íàøåé ðàáîòå, îñíîâàíû íà èíòåðïðåòàöèè ýêñïåðèìåíòàëüíûõ äàííûõ, êîòîðûå áûëè ïîëó÷åíû äëÿ âûÿñíåíèÿ òîãî, íàñêîëüêî âåëèêà îïàñíîñòü äðåéôà òðàíñãåíîâ ñ ïûëüöîé â åñòåñòâåííûõ óñëîâèÿõ. Ïîäîáíûå äàííûå ïðåäîñòàâëÿþò âîçìîæíîñòü ïðîàíàëèçèðîâàòü ýôôåêò ðàçëè÷íûõ ôàêòîðîâ (óäàëåííîñòü ðàñòåíèé-ðåöèïèåíòîâ, íàïðàâëåíèå ãîñïîäñòâóþùåãî âåòðà, ñåçîííîñòü è êëèìàòè÷åñêèå õàðàêòåðèñòèêè), ÷òî íåîáõîäèìî äëÿ îïðåäåëåíèÿ óñëîâèé, ïðè êîòîðûõ ïåðåíîñ òðàíñãåííûõ ïðèçíàêîâ ñ ïûëüöîé áóäåò ñâåäåí ê íåêðèòè÷åñêîìó ìèíèìóìó èëè ïîëíîñòüþ ïðåäîòâðàùåí. Ýòî ïîçâîëèò èçáåæàòü çàñîðåíèÿ íåòðàíñãåííîãî çåðíà òðàíñãåííûìè ïðèìåñÿìè (è íàîáîðîò), à òàêæå îáåñïå÷èò ãåíåòè÷åñêóþ öåëîñòíîñòü ñîðòîâ ïøåíèöû, âîçäåëûâàåìûõ â õîçÿéñòâàõ, ãäå ñóùåñòâóåò âåðîÿòíîñòü «ñîïðèêîñíîâåíèÿ» îáû÷íûõ è ãåííî-ìîäèôèöèðîâàííûõ ñîðòîâ. Èòàê, â ïîëåâûõ óñëîâèÿõ ó ïøåíèöû ïðîäåìîíñòðèðîâàíà âîçìîæíîñòü âåðòèêàëüíîãî ïåðåíîñà òðàíñãåíîâ ïðè âîçäåëûâàíèè ôîðì, áëèçêèõ ïî ôåíîëîãèè. Ïîäîáíûå ýêñïåðèìåíòû ïðîâåäåíû â Ðîññèè âïåðâûå. Ïîëó÷åííûå íàìè äàííûå ïîêàçûâàþò, ÷òî äëÿ îáåñïå÷åíèÿ áåçîïàñíîé èçîëÿöèè òðàíñãåííûõ ïîñåâîâ îò íåòðàíñãåííûõ íåîáõîäèì àíàëèç áîëüøåé âûáîðêè, èçó÷åíèå ïîñëåäñòâèé óäàëåíèÿ ðàñòåíèé íà áóëüøèå ðàññòîÿíèÿ, ó÷åò îáúåìà ïåðåíîñèìîé ñ âåòðîì òðàíñãåíîé ïûëüöû â çàâèñèìîñòè 44 îò ïëîùàäè âûðàùèâàíèÿ ðàñòåíèé è ò.ä. ËÈÒÅÐÀÒÓÐÀ 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. L a w r i e R.G., M a t u s - C a d r i z M.A., H u c l P. Estimating outcrossing rates in spring wheat cultivars using the contact method. Crop Sci., 2006, 4: 247-249. D ’ S o u z a V.L. Investigations concerning the suitability of wheat as a pollen-donor for cross pollination by wind as compared to rye, Triticale and Secalotricum. Zeitschrift fur Pflanzenzuchtung, 1970, 63: 246-269. K h a n M.N., H e y n e E.G., A r p A.L. Pollen distribution and the seed set on Triticum aestivum L. Crop Sci., 1973, 13: 223-226. V i r m a n i S.S., E d w a r d s I.B. Current status and prospects for breeding hybrid rice and wheat. Adv. Agron., 1983, 36: 145-214. D e V r i e s A.P. Flowering biology of wheat particularly in view of hybrid seed production: a review. Euphytica, 1971, 20: 152-170. H e g d e S.G., W a i n e s J.G. Hybridization and introgression between bread wheat and wild and weedy relatives in North America. Crop Sci., 2004, 44: 1145-1155. R a j k i E. Effect on pollination of the amount of pollen on the surface of the stigma. Növénytermelés, 1962, 11: 35-44. E a s t h a m K., S w e e t J. Genetically modified organisms (GMOs): The significance of gene flow through pollen transfer. Environmental Issue (Report ¹ 28), European Environment Agency. Copenhagen, 2002: 75. M a B.L., S u b e d i K.D., R e i d L.M. Extent of cross-fertilization in maize by pollen from neighboring transgenic hybrids. Crop Sci., 2004, 44: 1273-1282. S c h m i d t M., B o t h m a G. Risk assessment for transgenic sorghum in Africa: crop-tocrop gene flow in Sorghum bicolor (L.) Moench. Crop Sci., 2006, 46: 790-798. M e s s e g u e r J., F o g h e r C., G u i d e r d o n i E., M a r f a V., C a t al a M.M., B a l d i G., M e l e E. Field assessments of gene flow from transgenic to cultivated rice (Oryza sativa L.) using a herbicide resistance gene as tracer marker. Theor. Appl. Genet., 2001, 103: 1151-1159. R i t a l a A., N u u t i l a A.M., A i k a s a l o R., K a u p p i n e n V., T a m m i s o l a J. Measuring gene flow in the cultivation of transgenic barley. Crop Sci., 2002, 42: 278-285. M a t u s - C a d i z M.A., H u c l P., H o r a k M.J., B l o m q u i s t L.K. Gene flow in wheat at the field scale. Crop Sci., 2004, 44: 718-727. H a n s o n B.D., M a l l o r y - S m i t h C.A., S h a f i i B., T h i l l D.C., Z e m et r a R.S. Pollen-mediated gene flow from blue aleurone wheat to other wheat cultivars. Crop Sci., 2005, 45: 1610-1617. G a t f o r d K.T., B a s r i Z., E d l i n g t o n J., L l o y d J., Q u r e s h i J.A., B r e tt e l l R., F i n c h e r G.B. Gene flow from transgenic wheat and barley under field conditions. Euphytica, 2006, 151: 383-391. Ô è ë è ï ï î â Ì.Â., Ì è ð î ø í è ÷ å í ê î Ä.Í.,  å ð í è ê î â ñ ê à ÿ Ä.È., Ä î ëã î â Ñ.Â. Ïîäáîð îïòèìàëüíûõ ïàðàìåòðîâ áàëëèñòè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèè ãåíîìà ìÿãêîé ïøåíèöû. Ñ.-õ. áèîë., 2006, 1: 67-73. C h r i s t e n s e n A.H., S h a r r o c k R.A., Q u a i l P.H. Maize poly-ubiquitin genes: genes, structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplast by electroporation. Plant Mol. Biol., 1992, 18: 675-689. M c E l r o y D., Z h a n g W., C a o J., W u R. Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation. Plant Cell, 1990, 2: 163-171. R o g e r s S., B e n d i c h A. Extraction of total cellular DNA from plants, algae and fungi. In: Plant molecular biology manual /S. Gelvin, R. Schiperoort (eds.). Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, Boston, London, 1995: Section 7-1. G e h r i g H., W i n t e r K., C u s h m a n J., B o r l a n d A., T a y b i T. An improved RNA isolation method for succulent plant species rich in polyphenols and polysaccharides. Plant Mol. Biol. Rep., 2000, 18: 369-376. Ë à ê è í Ñ.Ô. Áèîìåòðèÿ: ó÷. ïîñ. äëÿ áèîë. âóçîâ. Ì., 1990. 1Ôèëèàë Èíñòèòóòà áèîîðãàíè÷åñêîé õèìèè èìåíè àêàäåìèêîâ Ì.Ì. Øåìÿêèíà è Þ.À. Îâ÷èííèêîâà ÐÀÍ, Ïîñòóïèëà â ðåäàêöèþ 24 àïðåëÿ 2011 ãîäà 142290 Ìîñêîâñêàÿ îáë., ã. Ïóùèíî, ïðîñï. Íàóêè, 6; 2Âñåðîññèéñêèé ÍÈÈ ñåëüñêîõîçÿéñòâåííîé áèîòåõíîëîãèè Ðîññåëüõîçàêàäåìèè, 127550 ã. Ìîñêâà, óë. Òèìèðÿçåâñêàÿ, 42, e-mail: miroshnichenko@fibkh.serpukhov.su 45 ANALYSIS OF VERTICAL GENE TRANSFER FROM TRANSGENIC TO NONTRANSGENIC PLANTS OF WHEAT (Triticum aestivum L.) D.N. Miroshnichenko1, M.V. Filippov1, S.V. Dolgov1, 2 Summary During cultivation of transgenic wheat a vertical gene transfer is possible from genetically modified to usual varieties as a result of pollen transfer, subbing and formation of seeds, hybridous on transgenes. In field trials the authors demonstrated the vertical transfer of transgenes in spring wheat with moving away nontransgenic plants of the Andros variety at a distance of 1, 2 and 3 m from genetically modified plants of the same variety. The transgenic homozygous line used as a pollen donor contains the heterologous sequences of bar gene and gfp gene which encode resistance to herbicides and green fluorescent protein, respectively. In two-years study it was shown that the frequency of transgenes transfer depends on prevailing wind direction and remoteness of nontransgenic plants from transgenic ones. In the field investigations the frequency of vertical flow of transgenes to seeds of nontransgenic plants varied from 0.000 to 0.797 %. The transgenic status of hybridous seeds was confirmed by the resistance to used herbicide, the tissue fluorescence, the presence of transgene sequence in plant genome (the data of PCR and RT-PCR) and also by the specific inheritance of transgenes in the next seed generation. Such experiments were carried out for the first time in Russia. Íàó÷íûå ñîáðàíèÿ ÌÅÆÄÓÍÀÐÎÄÍÀß ÊÎÍÔÅÐÅÍÖÈß «ÕÐÎÌÎÑÎÌÀ 2012» (ã. Íîâîñèáèðñê, 2-7 ñåíòÿáðÿ 2012 ãîäà) Îðãàíèçàòîðû êîíôåðåíöèè: Èíñòèòóò ìîëåêóëÿðíîé è êëåòî÷íîé áèîëîãèè Ñèáèðñêîãî îòäåëåíèÿ ÐÀÍ (ÈÌÊÁ ÑÎ ÐÀÍ), Íîâîñèáèðñêîå îòäåëåíèå Ìåæðåãèîíàëüíîé îáùåñòâåííîé îðãàíèçàöèè «Âàâèëîâñêîå îáùåñòâî ãåíåòèêîâ è ñåëåêöèîíåðîâ» (ÍÎ ÂÎÃèÑ), Îáùåñòâî ñ îãðàíè÷åííîé îòâåòñòâåííîñòüþ «Òåõíîëîãèè Áèîñèñòåì» (ÎÎÎ «ÒÁ») Êîíôåðåíöèÿ «Õðîìîñîìà 2009», ïðîøåäøàÿ â Íîâîñèáèðñêîì íàó÷íîì öåíòðå, ïî ìíåíèþ ó÷àñòíèêîâ, âûïîëíèëà öåëü âîçðîæäåíèÿ íàó÷íûõ ñåìèíàðîâ, èäåéíûì âäîõíîâèòåëåì è îðãàíèçàòîðîì êîòîðûõ áûëà Aëåêñàíäðà Àëåêñååâíà Ïðîêîôüåâà-Áåëüãîâñêàÿ. Ñîáðàíèåì ó÷àñòíèêîâ áûëî ïðèíÿòî ðåøåíèå î ïðîâåäåíèè àíàëîãè÷íûõ íàó÷íûõ ôîðóìîâ íà ðåãóëÿðíîé îñíîâå. Ïëàíèðóåìûå ñåêöèè: Îðãàíèçàöèÿ ãåíîìà, ïðîñòðàíñòâåííàÿ îðãàíèçàöèÿ ÿäðà è õðîìîñîì Ñïåöèàëèçèðîâàííûå ðàéîíû õðîìîñîì Õðîìîñîìû ìèòîõîíäðèé Õðîìîñîìû è ýâîëþöèÿ Õðîìîñîìû ÷åëîâåêà. Õðîìîñîìû ïðè ïàòîëîãèÿõ Õðîìîñîìû â êëåòî÷íûõ äåëåíèÿõ Ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷åñêèå ìåõàíèçìû èíàêòèâàöèè Õ-õðîìîñîìû ó ìëåêîïèòàþùèõ Ïîëèòåííûå õðîìîñîìû Êîíòàêòû è èíôîðìàöèÿ: http://chromosome2012.mcb.nsc.ru IV ÌÅÆÄÓÍÀÐÎÄÍÀß ÊÎÍÔÅÐÅÍÖÈß «ÌÀÒÅÌÀÒÈ×ÅÑÊÀß ÁÈÎËÎÃÈß È ÁÈÎÈÍÔÎÐÌÀÒÈÊÀ» (ã. Ïóùèíî, 14-19 îêòÿáðÿ 2012 ãîäà) Îðãàíèçàòîðû: Ðîññèéñêàÿ àêàäåìèÿ íàóê, Íàó÷íûé Ñîâåò ïî ìàòåìàòè÷åñêîé áèîëîãèè è áèîèíôîðìàòèêå, Èíñòèòóò ìàòåìàòè÷åñêèõ ïðîáëåì áèîëîãèè Ðîññèéñêîé àêàäåìèè íàóê Êîíôåðåíöèÿ ïîñâÿùåíà 40-ëåòèþ Èíñòèòóòà ìàòåìàòè÷åñêèõ ïðîáëåì áèîëîãèè ÐÀÍ. Îñíîâíûå íàó÷íûå íàïðàâëåíèÿ: Âûñîêîïðîèçâîäèòåëüíûå âû÷èñëåíèÿ â ìîäåëèðîâàíèè áèîëîãè÷åñêèõ ñèñòåì Ìàòåìàòè÷åñêîå ìîäåëèðîâàíèå ñòðóêòóðû è äèíàìèêè áèîïîëèìåðîâ Ìàòåìàòè÷åñêîå ìîäåëèðîâàíèå íàíîáèîýëåêòðîííûõ ñèñòåì Ìàòåìàòè÷åñêîå ìîäåëèðîâàíèå ãåííûõ è ìåòàáîëè÷åñêèõ ñåòåé Ìàòåìàòè÷åñêèå ìîäåëè îáðàáîòêè èíôîðìàöèè â ñòðóêòóðàõ ìîçãà Ìîäåëè ýâîëþöèè è ðàçâèòèÿ â áèîëîãèè Ìàòåìàòè÷åñêîå ìîäåëèðîâàíèå â èììóíîëîãèè è ýïèäåìèîëîãèè Ïîïóëÿöèîííîå ìîäåëèðîâàíèå è âû÷èñëèòåëüíàÿ ýêîëîãèÿ Ìàòåìàòè÷åñêàÿ áèîôèçèêà Ìàòåìàòè÷åñêèå ìåòîäû îáðàáîòêè è àíàëèçà áèîëîãè÷åñêèõ äàííûõ Áèîèíôîðìàòèêà Êîíòàêòû è èíôîðìàöèÿ: icmbb12@impb.ru 46