Новый подход к исследованию биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР в режиме реального времени. Болдырева М.Н., д.м.н., в.н.с. ин-та иммунологии ФМБА России, Тумбинская Л.В., к.б.н., рук. отд. инновационного развития ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Донников А.Е. зам. ген. директора по качеству «Многопрофильная диагностическая лаборатория» В настоящее время инфекционно-воспалительные заболевания урогенитального тракта у женщин занимают в структуре акушерско-гинекологической заболеваемости первое место в мире. Их частота в различных популяциях колеблется от 30 до 80 % (Е. Ф. Кира, 1994, Коршунов В.М. и соавт. 1999; Mead P.B. et al, 1993). Заболевания, вызванные условно-патогенной микрофлорой могут протекать как с клинически выраженной симптоматикой, так и бессимптомно (Кубанова А.А. и соавт., 1996; Klebanoff M.A. et al, 2004). Бессимптомное течение заболевания в ряде случаев приводит к развитию серьезных осложнений. Установлено, что урогенитальные заболевания, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, являются причиной увеличения риска заболевания инфекциями, передающимися половым путем (сифилис, трихомониаз, гоноррея, хламидиоз) (Wiesenfeld HC et al, 2003; Brotman RM et al, 2007) и ВИЧ-инфекцией (Hashemi F.B. et al. 1999; Sewankambo N. et al., 1997). Несвоевременная диагностика инфекционных заболеваний, вызванных условнопатогенной микрофлорой, может стать причиной нарушения репродуктивной функции женщины. Так, воспалительные процессы в малом тазу могут нарушать нормальный транспорт ооцита, и стать причиной трубного бесплодия (Hager W.D., et al. 1983). Заболевания, вызванные условно-патогенной микрофлорой у матери, могут быть причиной спонтанных абортов (French J.I. et al., 1999), преждевременных родов (Leitich H. et al., 2003), а также внутриутробного инфицирования (French J.I. et al., 1999) и задержки внутриутробного развития плода (Paneth N.S., 1995). Своевременно не диагностированные заболевания могут стать причиной осложнений после хирургических вмешательств на органах малого таза (Larsson PG, Carlsson B., 2002) и постнатальных осложнений матери и ребенка (Paneth N.S., 1995). Проблема усугубляется отсутствием надежных объективных методов лабораторной диагностики, доступных практическому здравоохранению, позволяющих на ранних стадиях, в короткие сроки и до развития осложнений диагностировать такие заболевания. Учитывая важность и актуальность решения проблемы объективной лабораторной диагностики урогенитальных инфекционно-воспалительных заболеваний, вызванных условно-патогенной микрофлорой для репродуктивного здоровья женщин, возникла настоятельная потребность в разработке и внедрении в практическое здравоохранение новых диагностических подходов, позволяющих своевременно (до развития осложнений) диагностировать такие заболевания. Также необходимо определение объема медикаментозного вмешательства и осуществление объективного контроля эффективности лечения и выздоровления пациенток. В настоящее время для диагностики инфекционно-воспалительных урогенитальных заболеваний у женщин используют следующие методы клинической и лабораторной диагностики. Клиническая диагностика включает выяснение и анализ жалоб, сбор анамнеза и физикальный осмотр пациента (Бодяжина В.И. и соавт., 1990; Василевская Л.Н. и соавт., 1985). Результаты клинической диагностики дают возможность только лишь предположить наличие заболевания, так как инфекции, передающиеся половым путем (трихомониаз, гонорея, сифилис и хламидиоз) и вызванные условно-патогенной микрофлорой в подавляющем большинстве случаев не имеют специфических 1 клинических симптомов. Клиническое обследование не позволяет установить этиологическую природу заболевания, которая выявляется исключительно с помощью лабораторных методов исследования. Наиболее частым заболеванием, ассоциированным с нарушением микрофлоры урогенитального тракта является бактериальный вагиноз. БВ встречается у 24% женщин в структуре общей гинекологической заболеваемости и у 87,7% больных, обращающихся по поводу обильных длительных выделений (Кира Е.Ф., 1995). Под бактериальным вагинозом понимают полимикробный клинический синдром, характеризующийся специфическими аномалиями вагинальных выделений и нарушением вагинальной экологии, при котором нормальная флора замещается факультативными и строго анаэробными микроорганизмами. При этом наблюдается пролиферация условнопатогенной флоры (Gardnerella vaginalis, Mobiluncus spp. и др.). Для упрощения диагностики бактериального вагиноза и повышения ее достоверности разработано несколько критериев. Критерии Амсела (Spiegel CA, Amsel R, Holmes KK, 1983) – наиболее быстрый и распространенный способ диагностики баквагиноза. Наличие трех из четырех признаков (рН отделяемого влагалища более 4,5; белые гомогенные выделения, покрывающие слизистую влагалища; положительный аминный тест с КОН и наличие «ключевых клеток»). Наличие бессимптомных форм бактериального вагиноза в 50% случаев, а также недостаточно высокая чувствительность критериев Амсела привели к поиску более чувствительных методов для диагностики бактериального вагиноза. Широкое распространение получила балловая диагностическая система Ньюджента (Nugent criteria) (Nugent RP et al, 1991). Эта система основана на подсчете бактерий в мазке, окрашенном по Граму, определенной морфологии и характере окрашивания, соответствующих лактобактериям, гарднереллам, бактероидам и мобилункусу. При наборе от 7 до 10 баллов ставится диагноз бактериальный вагиноз. Система Ньюджента применяется на Западе наравне с критериями Амсела, тем не менее в одном многоцентровом исследовании было показано, что у 11% женщин с диагнозом бактериальный вагиноз по критериям Амсела система Ньюджента не подтверждала диагноз, а у 30% женщин с бактериальным вагинозом по системе Ньюджента отсутствовали критерии Амсела (Тихомиров А.Л., Лубнин Д.М., 2003). Дискордантность полученных результатов может быть связана с тем, что при микроскопии можно выявить только те микроорганизмы, которые обладают размерами, достаточными для визуализации. Многие виды и роды условно-патогенных микроорганизмов имеют похожие морфотипы, тогда как их патогенные свойства и чувствительность к антибиотикам могут значительно отличаться. Некоторые бактерии, например Atopobium vaginae (Ferris MJ et al.2004;), Mycoplasma hominis, т.д., о которых известно, что они ассоциированы с развитием бактериального вагиноза, не визуализируются при микроскопии. Недостатком микроскопического исследования мазков, окрашенных по Граму, является качественная оценка, ограниченная определением морфотипа без возможности видовой характеристики микроорганизмов и приблизительная количественная оценка состава микробиоты. Микроскопия не позволяет идентифицировать ряд этиологически значимых для развития патологических процессов условно-патогенных возбудителей. Имеет место субъективизм и зависимость результата исследования от профессиональной квалификации врача клинической лабораторной диагностики. Более информативным является способ диагностики урогенитальных заболеваний, вызванных условно-патогенной микрофлорой, путем микробиологического (культурального) исследования (Приказ МЗ СССР №535 от 22.04.1985). Этот способ позволяет установить видовой состав аэробных, факультативно-анаэробных и некоторых облигатно-анэробных бактерий и тем самым подтвердить принадлежность 2 микроорганизмов к морфотипам, обнаруженным при микроскопии мазков, окрашенных по Грамму (Анкирская А.С. и соавт., 2001). Количественная оценка роста микроорганизмов на питательных средах характеризует их этиологическую значимость у конкретного пациента. Так, например, установлены критерии нормобиоты урогенитального тракта у женщин при использовании культуральной диагностики: 1) общая микробная обсемененность – не превышает 106 -108 КОЕ/мл; 2) абсолютно преобладают лактобациллы; 3) условно-патогенные микроорганизмы определяются в низком титре (104 КОЕ/мл) или отсутствуют (Анкирская А.С. и соавт. 2001). До настоящего времени культуральный метод остается «золотым стандартом» этиологической лабораторной диагностики любого инфекционного процесса, в том числе вызванного условно-патогенной микрофлорой. Однако и культуральный способ диагностики не лишен ряда серьезных недостатков. Условно-патогенная биота, являющаяся наиболее частой причиной урогенитальных заболеваний у женщин, представлена, главным образом, анаэробными микроорганизмами. Для обеспечения анаэробных условий культивирования таких микроорганизмов требуется специальное оснащение лаборатории дорогостоящим оборудованием, специальные селективные, питательные среды и высококвалифицированные врачи микробиологи. Подавляющее большинство лечебных учреждений практического здравоохранения в настоящее время не имеют подобных условий. Кроме того, в последние годы молекулярно-биологическими методами был обнаружен целый ряд новых, этиологически значимых условно-патогенных микроорганизмов (Atopobium vaginae, Mycoplasma genitalium и др.), которые либо не поддаются культивированию, либо являются трудно культивируемыми стандартной техникой (Ferris MJ et al.2004; Zhou X et al, 2004). Существенными недостатками культурального метода также являются длительные сроки культивирования микроорганизмов (в среднем 5 дней) и необходимость сохранения их высокой жизнеспособности до момента поступления биоматериала в лабораторию, что накладывает дополнительные ограничения на его хранение и транспортировку. В случае использования сухого тампона для взятия биоматериала, срок транспортировки образца в лабораторию ограничен часами. При использовании транспортных сред продолжается размножение микроорганизмов до поступления в лабораторию и возможно изменение их количественного соотношения. Культуральный метод не дает точной количественной оценки и используется только для ориентировочной оценки соотношения микроорганизмов между собой (приказ №535 от 22.04.85). Объективные и субъективные ограничения методов лабораторной диагностики, применяемые сегодня в мировой медицинской практике, приводят к большому количеству диагностических ошибок: при манифестированном баквагинозе - более чем в 60%, при кандидозном вульвовагините – до 77%; при микст-инфекции – до 87% (Schwiertz A. et al. 2006). Все это побуждает к поиску новых подходов к оценке микрофлоры урогенитального тракта. Достижения молекулярной биологии, связанные с разработкой метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), предоставили новые возможности в изучении микробного состава различных биотопов человека. В последние годы ПЦР широко используется в лабораторной практике для качественной идентификации инфекций, передающихся половым путем, таких как трихомониаз, гонорея, ВИЧ инфекция и т.д. Преимуществом этого метода является то, что он имеет высокую специфичность и чувствительность, универсален для диагностики любых микроорганизмов и поэтому лишен недостатков, связанных с высокими требованиями ряда микроорганизмов к 3 условиям культивирования. К достоинствам метода следует отнести также возможность тестирования большого количества любых клинических образцов. На сегодняшний день метод ПЦР широко используется в российской лабораторной практике, в том числе и для идентификации условно-патогенной микробиоты урогенитального тракта – Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum, Ureaplasma parvum и т.д. Однако «классическая» ПЦР с регистрацией результата по окончании реакции не предполагает количественной характеристики микроорганизмов, что не позволяет врачу клиницисту оценить состояние биоценоза в целом. Нормофлора урогенитального тракта характеризуется большим количеством разнообразных микроорганизмов. Очень редкие из них действительно вызывают заболевание. К патогенным микроорганизмам, при выявлении которых обязательно назначается этиотропная терапия, относят такие как Treponema pallidum, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus ducrei, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, а также простейшее Trichomonas vaginalis. Существует большая группа условно патогенных микроорганизмов, которые могут вызывать заболевание при определенных условиях — это микоплазмы (Mycoplasma hominis, Mycoplasma fermentans), уреаплазмы (Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum), энтерококки, энтеробактерии, стафилококки, стрептококки, гарднереллы (Gardnerella vaginalis), дрожжеподобные грибы (Candida spp.). Эти же микроорганизмы могут входить в состав нормального физиологического микробиоценоза гениталий (Савичева А.М., 2008). Дисбиотические процессы характеризуются нарушением количественных соотношений нормо- и условно-патогенной микрофлоры при большом видовом разнообразии последней. Поэтому качественная оценка условно-патогенной микрофлоры, не позволяет определить этиологическое значение тех или иных микроорганизмов в развитии дисбиотических нарушений, что, в свою очередь, может привести к диагностическим ошибкам и назначению неадекватной терапии, которая, в ряде случаев, лишь усугубляет течение заболевания. Успех лечения бактериального вагиноза зависит от правильности выбранной тактики для каждой конкретной пациентки. А это неизбежно влечет за собой количественную оценку условно-патогенной микрофлоры урогенитального тракта в соотношении с количеством нормальной флоры. Это является принципиальным моментом для понимания этиологии возникшего дисбаланса. Компания «НПО ДНК-Технология» предлагает новый подход к исследованию условно-патогенной флоры, основанный на комплексной оценке основных групп микроорганизмов, формирующих урогенитальный биоценоз, методом ПЦР в режиме реального времени. Предлагаемый подход дает возможность количественно исследовать нормофлору, наличие, степень и характер дисбаланса условно-патогенной и нормальной флоры, что позволяет в случае необходимости выбрать правильную терапию и контролировать эффективность её проведения. Для этого разработаны и предлагаются клинико-диагностическим лабораториям наборы реагентов для исследования биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР в режиме реального времени Фемофлор 16, Фемофлор 8 и Фемофлор 4 (см. табл.1). 4 Таблица 1. Состав комплектов реагентов Фемофлор. Группа Контроль Диагностика нормоценоза Аэробные микроорганизмы (факультативные анаэробы) Анаэробные микроорганизмы (строгие анаэробы) Специфические компоненты комплекта реагентов Фемофлор 4 Enterobacterium spp. Streptococcus spp. √ √ √ √ Eubacterium spp. Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp. Megasphaera spp./Veilonella spp./Dialister spp. √ √ Грибы Atopobium vaginae Mycoplasma (hominis +genitalium ) Ureaplasma (urealyticum + parvum) Candida spp. √ √ √ Lachnobacterium spp./ Clostridium spp. Mobiluncus spp./Corynebacterium spp. Peptostreptococcus spp. Группа Микоплазм Фемофлор 16 √ √ √ √ √ Staphylococcus spp. Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp. √ √ √ √ Фемофлор 8 √ √ √ √ √ Положительный контроль Контроль взятия материала общая бактериальная масса нормофлора – Lactobacillus spp. /ВК √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ Из одной биопробы методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени выполняется количественная оценка общей бактериальной массы, урогенитальной нормофлоры (лактобациллы) и комплекса аэробных и анаэробных микроорганизмов, микоплазм, грибов рода Candida, участвующих в развитии дисбиотических процессов в урогенитальном биоценозе. Сравнение количества лактобацилл с общей бактериальной массой позволяет исследовать состояние нормофлоры. Сравнение количеств представителей условно-патогенной биоты с количеством лактобацилл позволяет определять этиологическую значимость тех или иных микроорганизмов в развитии дисбиоза и степень его выраженности. Количественное определение геномной ДНК эпителиальных клеток человека, попадающих в биопробу при правильном взятии материала, обеспечивает контроль качества преаналитического этапа, исключает получение ложноотрицательных результатов исследования. Использование предлагаемого способа диагностики не только дает возможность врачу-клиницисту определять объем необходимого вмешательства, но и позволяет определить этиологическую направленность терапии. Индивидуальный подход к терапии позволит уменьшить число побочных эффектов для пациентов в результате избыточного приема лекарственных препаратов. Впервые можно выполнять мониторинг действия лекарственных средств на микробиоту, включая оценку эффективности лечения и восстановления нормоценоза. 5 Программное обеспечение, разработанное для амплификатора ДТ-96, позволяет настроить параметры интерпретации результатов, согласно критериям, принятым в каждой конкретной лаборатории. Для получения корректных результатов большое значение имеет качество взятия образца биоматериала для исследования, его хранение, транспортировка и предварительная обработка. Для этого в системе предусмотрена возможность анализа контроля взятия материала. Данный показатель служит для контроля правильности взятия материала врачом-клиницистом и позволяет отличать случаи биоценозов со сниженной бактериальной массой, от случаев некорректного взятия материала. Рис.1. Результат исследования биоценоза урогенитального тракта (набор реагентов комплектация Фемофлор 16), полученный при работе с амплификатором ДТ-96. Определение этиологической структуры дисбаланса необходимо для решения вопросов, связанных с терапией. Дисбаланс между нормальной и условно патогенной флорой, в зависимости от этиологической причины, может быть анаэробными, аэробными и смешанными. Инфекционный процесс, вызванный грибами рода Candida, может протекать без дисбиотических нарушений со стороны условно-патогенной флоры, а также может сочетаться с дисбиозом. Предлагаемый подход к исследованию состояния урогенитального биоценоза у женщин показан для: - оценки качественного и количественного состава микроорганизмов, образующих биоценоз урогенитального тракта; - определения этиологической причины инфекционного процесса, что делает возможным осуществление направленной этиологической терапии; - определения степени выраженности дисбиотических нарушений, в результате чего становится возможной индивидуализация объема терапии; - осуществления мониторинга эффективности проводимой терапии и оценки результатов лечения; - мониторинг восстановления нормальной микрофлоры; - контроль проведения гормонозаместительной терапии при менопаузе. 6 Таким образом, впервые предложено объективное исследование, позволяющее наиболее полно и точно охарактеризовать качественный и количественный состав биоценоза урогенитального тракта у женщин. В рамках данного исследования возможно выявление 23 групп микроорганизмов (факультативных и облигатных анаэробов, микроаэрофилов, микоплазм и грибов). Для проведения этого анализа разработано русскоязычное программное обеспечение для детектирующего амплификатора ДТ-96, позволяющее автоматически анализировать полученные данные и выдавать заключение в удобном для интерпретации виде. Данный метод пригоден как для повседневной лабораторной диагностики, так и в качестве чувствительного и высокоспецифичного инструмента для научных исследований. В дополнение к настоящему методу, который позволяет определить этиологическую причину инфекционного процесса вызванного условно-патогенной биотой, рекомендуется: - использование метода световой микроскопии для лабораторного подтверждения местной воспалительной реакции, - качественное ПЦР исследование возбудителей урогенитальных инфекций, передаваемых половым путем - Chlamidia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis и др. Список использованной литературы: 1. Анкирская А.С., Муравьева В.В. Опыт микробиологической диагностики оппортунистических инфекций влагалища. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерпия., 2001, т.3, №2, с.190-194. 2. Бодяжина В.И., Сметник В.П., Тумилович Л.Г. Неоперативная гинекология: Руководство для врачей. – М.: Медицина, 1990. – 540с. 3. Василевская Л.Н., Грищенко В.И., Кобзева Н.В., Юровская В.П. Гинекология: учебник, - М., Медицина, 1985. 4. Кира Е.Ф. 1994. Клиника и диагностика бактериального вагиноза // Акушерство и гинекология, № 2, С. 32-35. 5. Кира Е. Ф. Бактериальный вагиноз (клиника, диагностика, лечение) // Автореферат дисс. докт. мед. наук.- Санкт-Петербург, 1995. 6. Коршунов В. М., Володин Н. Н., Ефимов Б. А., Саркисов С. Э. и др. Микроэкология влагалища. Коррекция микрофлоры при вагинальных дисбактериозах, Москва. – 1999. – 80с. 7. Кубанова А. А., Аковбян В. А., Федоров С. М., Бакалова Л. А., Халатов А. О. Состояние проблемы бактериального вагиноза // Вестник дермат. и венерол.— 1996.— № 3.— С. 22–26. 8. Методическиe указания МУ 1.3.1888-04. Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности, Москва. – 2004. 9. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебнопрофилактических учреждений. Приказ МЗ СССР №535 от 22.04.1985. 10. Савичева А.М., Лабораторная диагностика и терапия репродуктивно значимых инфекций // Лечащий врач. – 2008. - № 3. 11. Тихомиров А.Л., Лубнин Д.М.. Применение влагалищных свечей Нео-Пенотран для проведения деконтаминации влагалища перед плановой беременностью // Русский медицинский журнал. - 2003. - Том 11,N 16 . - С. 935-937. 12. Brotman RM, Erbelding EJ, Jamshidi RM, et al. Findings associated with recurrence of bacterial vaginosis among adolescents attending sexually transmitted diseases clinics. J Pediatr Adolesc Gynecol. 2007 Aug;20(4):225-31. 7 13. Ferris MJ, Masztal A, Aldridge KE. et al. Association of Atopobium vaginae, a recently described metronidazole resistant anaerobe, with bacterial vaginosis. BMC Infect Dis. 2004 Feb 13;4:5. 14. French JI, McGregor JA, Draper D et al. Gestational bleeding, bacterial vaginosis, and common reproductive tract infections: risk for preterm birth and benefit of treatment. Obstet Gynecol. 1999 May;93(5 Pt 1):715-24. 15. Hager WD, McDaniel PS Treatment of serious obstetric and gynecologic infections with cefoxitin. J Reprod Med. 1983 May;28(5):337-40. 16. Hashemi FB, Ghassemi M, Roebuck KA, Spear GT Activation of human immunodeficiency virus type 1 expression by Gardnerella vaginalis. J Infect Dis. 1999 Apr;179(4):924-30. 17. Klebanoff M.A., Schwebke JR, Zhang J et al. Vulvovaginal symptoms in women with bacterial vaginosis. Obstet Gynecol, 2004; 104:267-272. 18. Larsson PG, Carlsson B. Does pre- and postoperative metronidazole treatment lower vaginal cuff infection rate after abdominal hysterectomy among women with bacterial vaginosis? Infect Dis Obstet Gynecol. 2002;10(3):133-40. 19. Leitich H, Bodner-Adler B, Brunbauer M, Kaider A, Egarter C, Husslein P. Bacterial vaginosis as a risk factor for preterm delivery: a meta-analysis. Am J Obstet Gynecol. 2003 Jul;189(1):139-47. 20. Mead P. B. Epidemiology of bacterial vaginosis // Am. J. Obstet. Gynecol.- 1993.Vol.169, N.2, pt.2. – P.446-449. 21. Nugent RP, Krohn MA, Hillier SL Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J Clin Microbiol. 1991 Feb;29(2):297-301. 22. Paneth NS.The problem of low birth weight.. Future Child. 1995 Spring;5(1):19-34. 23. Schwiertz A, Taras D, Rusch K, Rusch V. Throwing the dice for the diagnosis of vaginal complaints? Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2006 Feb 17;5:4, 1-7. 24. Sewankambo N, Gray RH, Wawer MJ et al,.HIV-1 infection associated with abnormal vaginal flora morphology and bacterial vaginosis. Lancet. 1997 Aug 23;350(9077):54650. 25. Spiegel CA, Amsel R, Holmes KK: Diagnosis of bacterial vaginosis by direct gram stain of vaginal fluid. J Clin Microbiol 1983, 18:170-7. 26. Wiesenfeld HC.;Hillier, Sharon L.;et al. Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clin Infect Dis. 2003 Mar 1;36(5):663–66 27. Zhou X, Bent SJ, Schneider MG et aal Characterization of vaginal microbial communities in adult healthy women using cultivation-independent methods. Microbiology. 2004 Aug;150(Pt 8):2565-73. 8