Изучение эпилепсии in vivo. Пентилентетразоловая модель эпилепсии. Исследование противосудорожного эффекта вальпроата

Изучение эпилепсии in vivo.
Пентилентетразоловая модель эпилепсии.
Исследование противосудорожного эффекта вальпроата
натрия на пентилентетразоловой и абсансной формах
эпилепсии
Выполнили ученицы 10н СУНЦ МГУ
Кузнецова Анна и Сизова Мария
Научный руководитель:
Аббасова Кенуль Расимовна
Биологический Факультет МГУ
Кафедра физиологии животных и человека
Содержание
I. Проблема эпилепсии, её распространенность
II. Симптомы эпилепсии; классификация форм эпилепсии
III. Механизмы эпилептогенеза
IV. Классификация припадков
V. Эпилептический статус
VI. Основные современные противоэпилептические препараты
VII.ЭЭГ; модели эпилептических припадков на животных
1. Пентилентетразолиевая модель
VIII. Практическая часть.
IX. Список литературы
I. Проблема эпилепсии.
Эпилепсия - это хроническое заболевание головного мозга,
характеризующееся повторяющимися непровоцируемыми приступами с
нарушением двигательных, чувствительных, вегетативных, мыслительных
или психических функций, часто с судорожной активностью мышц и потерей
сознания, которые возникают вследствие чрезмерных нейронных разрядов
(Максимова, Мухин, 2005).
Эпилепсия является одним из самых распространенных неврологических
заболеваний, его распространенность варьирует от 0,3 до 0,6% в популяции.
В мире насчитывается около 50 миллионов больных эпилепсией, ежегодно
регистрируется около 2,4 миллиона новых больных. Вследствие эпилепсии
нарушаются мыслительные процессы, появляется психологическая
неустойчивость, могут частично разрушаться некоторые структуры мозга. К
тому же, начало припадка непредсказуемо; опасности подвержен не только
сам больной, но и окружающие его люди. Из этого можно сделать вывод, что
эпилепсия является медицинской и социальной проблемой, требующей
постоянного поиска решений.
II. Симптомы, классификация припадков.
Главный симптом эпилепсии – повторяющиеся припадки с регистрируемой
на ЭЭГ повышенной активностью нейронов. Припадки могут
сопровождаться судорогами, потерей сознания, замиранием, повышенным
слюноотделением и т. д.
По этиологии выделяют три формы эпилепсии: симптоматическую,
идиопатическую и криптогенную.
Симптоматические формы – это эпилептические синдромы с известной
причиной и морфологическими нарушениями головного мозга (опухоли,
кисты, рубцы, дисгенезии и т. д.)
Идиопатические – формы, при которых эпилепсия является
самостоятельным заболеванием, так как отсутствуют заболевания, которые
могут быть её причиной. В настоящее время установлена генетическая
определяемость таких форм эпилепсии.
Если причина неясна, т. е. синдром не удовлетворяет критериям
идиопатических форм, но нет и доказательств его симптоматического
характера, так как не определяются структурные изменения, то это
криптогенная форма эпилепсии.
III. Механизмы эпилептогенеза.
Эпилептогенез связан с нарушением баланса возбуждающих и тормозных
процессов нейронов головного мозга. На уровне нейронов в основе
эпилептогенеза лежит нестабильность потенциала покоя мембраны с
избыточными деполяризационными сдвигами. Деятельность нейрона
определяется как внешними факторами: ионная среда вокруг клетки,
действия медиаторов или нейропептидов, так и внутренними: свойствами
мембраны тела нейрона и её отростков, величиной мембранного потенциала,
системам вторичных мессенджеров, экспрессии генов белков мембранных
рецепторов, их синтезу и правильной сборке в структуры. При нарушении
механизмов внутреннего контроля нейроны могут образовать генератор
эпилептической активности.
Определённый уровень синхронизации активности систем мозга является
необходимым условием его надёжности. Но при дефектности тормозных
механизмов на тот же объём афферентного притока мозговые системы
реагируют синхронным ответом гораздо больших популяций нейронов. В
свою очередь, генерируемые этими нейронами более массивные залпы
обусловливают более массивные ответы нейронов последующих каскадов.
Для эпилептогенеза существенны не только изменения нейронов, но и
изменения клеток глии. Глия регулирует концентрацию ионов вокруг
нейронов и участвует в транспорте нейромедиаторов. Астроциты
регистрируют колебания кальция и могут выделять в межклеточное
пространство глутамат.
IV. Классификация припадков.
Принято выделять первично-генерализованные, парциальные и вторичногенерализованные припадки.
При простых парциальных приступах наблюдаются судороги или онемение в
определенных частях тела, сознание обычно сохранено. Пациент может
подробно описать свои ощущения. При сложных парциальных приступах
сознание выключается, при этом нет судорог, а больной продолжает
автоматизированно продолжать прерванное действие. После такого припадка
возможны кратковременная спутанность сознания, сонливость. Обычно
парциальные приступы длятся не более 30 секунд.
Генерализованные приступы бывают судорожные и бессудорожные.
Судорожные припадки делятся на тонические (длительное напряжение
мышц), клонические кратковременные сокращения мышц, чередующиеся с
их расслаблением), миоклонические ( еще кратковременные сокращения
мышц) и тонико-клонические (сначала фаза тонических судорог – около 10
секунд, затем около 40 секунд клонических судорог и кома, преходящая в
сон или кратковременное оглушение). Если большому судорожному
припадку предшествует аура, он относится к вторично генерализованным.
Аура – начальная фаза эпилептического припадка, до потери сознания; о ней
у больного сохраняется воспоминание. Аура может выражаться в форме
неопределённого страха или других эмоциональных состояний, дежавю,
жамевю, ощущений определённого запаха или вкуса, холода, озноба или
сложных галлюцинаций.
Бессудорожные припадки называются абсансы. При этом у больного
внезапно выключается сознание, он замирает и пристально смотрит в одну
точку, возможно автоматическое перебирание пальцами, бормотание,
дрожание век и т.д. Продолжаются такие припадки 5-20 секунд и часто
остаются незамеченными. Абсансу соответствует характерный ЭЭГ-паттерн:
генерализованная двусторонне-симметричная пик-волновая активность с
частотой около 3 Гц. Абсансная эпилепсия появляется обычно у детей и
подростков в возрасте от 2 до 15 лет.
V. Эпилептический статус.
Эпилептический статус (ЭС) – особо опасное проявление эпилепсии,
состояние, которое характеризуется продолжительными судорогами и
потерей сознания и имеет отличные от обычной серии припадков механизмы.
«Острое эпилептическое состояние, характеризующееся продолжительными
припадками (парциальными и генерализованными, судорожные и
бессудорожные), длящимися по крайней мере 30 мин, или прерывающимися
припадками без полного восстановления сознания в течение 30 мин»
(Wasterlain, Chen, 2006).
ЭС может вызывать крупные и необратимые поражения мозга,
способствовать дальнейшему эпилептогенезу. Развивается обычно в раннем
возрасте или у пожилых людей. Механизмы возникновения и протекания ЭС
до конца не ясны. ЭС может возникать вследствие тяжелых повреждений
мозга: опухолях, инфекциях, травмах, а также при нарушении режима
приема антиэпилептических препаратов. При ЭС повреждаются зачастую
гиппокамп, зубчатая извилина, амигдала, таламус. Предполагается, что
причиной гибели нейронов является цитотоксическое действие глутамата.
Известно, что при ЭС происходит интернализация ГАМКА-рецепторов,
мобилизация NMDA-рецепторов, сокращение количества ГАМКВрецепторов.
VI. Противоэпилептические препараты.
Основными противоэпилептическими препаратами на данный момент
являются бензодиазепины, фенобарбитал, фенитоин. В большинстве своем
противоэпилептические препараты либо ингибируют действие глутамата,
либо взаимодействуют с ГАМК-комплексом. Один из самых широко
применяемых—вальпроат (вальпроевая кислота, вальпроат натрия), имеет
широкий спектр действия.
VII. ЭЭГ; модели припадков.
Наиболее адекватным инструментальным методом исследования при
эпилепсии является электроэнцефалографический. Электрографические
феномены отражают важнейшие патофизиологические механизмы
заболевания. Поскольку гиперсинхронный разряд возникает благодаря
синхронному и синфазному разряду большого количества нейронов, он
имеет высокоамплитудную пикоподобную форму и характеризуется
негативностью. При длительности периода такого потенциала 5-50 мс он
расценивается как пик или спайк, а при длительности свыше 50-70, но менее
200 мс – как острая волна. Амплитуда таких разрядов может достигать сотен
микровольт. Нередко за пиком следует волна или за острой волной –
медленная. В таких случаях говорят о комплексах пик-волна и острая волнамедленная волна.
Модели эпилепсии
1. Пентилен-тетразолиевая модель.
Пентилентетразоловая модель эпилепсии широко используется для
исследования генерализованных миоклонических, тонических и клонических
судорог, инициируемых из стволовых структур мозга. С её помощью
возможно выявление противоэпилептических препаратов, которые могут
быть неэффективными на других моделях.
Пентилентетразол (ПТЗ) – производное тетразола, состоящее из
тетразольного и ппенпентаметиленового колец. Он быстро проходит сквозь
гемато-энцефалический барьер и вызывает судороги у мышей, крыс, кошек и
приматов при парентеральном введении. Доза, вызывающая клонические
судороги у 97% подопытных животных для мышей составляет 85 мк/кг, а для
крыс – 70- мк/кг.
Введение ПТЗ внутрибрюшинно приводит к развитию приступа, состоящему
из 3-х фаз. Сначала появляются вздрагивание тела, характерное искривление
хвоста, затем развиваются клонические судороги, за которыми часто следует
период оцепенения и тонико-клонические судороги, обычно приводящие к
смерти.
ЭЭГ в течение приступа характеризуется пачковыми разрядами, состоящими
из 3-6 спайков средней амплитуды (50-100 мкВ), которые переходят в
периодическую высокоамплитудную спайковую активность. Такая ЭЭГактивность может быть непрерывной или периодически прерываться
межприступной активностью и среднеамплитудными судорожными
спайковыми комплексами.
На срезах поля СА3 гиппокампа морских свинок при аппликации ПТЗ
показано развитие периодической пароксизмальной активности, причём
пароксизмальная гипер- и деполяризация происходила синхронно в парах
нейронов. При анализе связывания меченого лиганда было показано, что
ГАМК-рецептор-ионофорный комплекс включает рецептор ГАМК, рецептор
пикротоксина или барбитуратов и рецептор бензодиазепинов. ГАМКрецептор представляет собой пентамер, состоящий из пяти типов
субъединиц, причем каждый тип может иметь разные подтипы.
Субъединичный состав изменяется в зависимости от расположения в
определенных структурах мозга. Каждая субъединица пересекает мембрану
четыре раза, второй трансмембранный домен участвует в образовании
хлорного канала.
В 1982 году было обнаружено, что ПТЗ является ингибитором
связывания3Н-диазепама. На основании этого было предположено, что
действие ПТЗ обусловлено его взаимодействием с бензодиазепиеновым
рецептором, однако позже было доказано, что ПТЗ связывается с
пикротоксин-чувствительным сайтом. Было обнаружено, что изменения
субъединичного состава рецептора оказывало лишь небольшой эффект на
вызванное ПТЗ ингибирование тока через канал, а сродство пиротоксина к
рецептору сильно увеличивлось при удалении α -субъединицы. Было
показано, что ПТЗ снижал вероятность открытия канала, за счёт увеличения
длительности закрытого состояния, но не влиял на длительность открытого
состояния и его проводимость. α-изопропил-α-метил-γ-бутиролактон,
проявляющий антагонизм по отношению к пикротоксину, также уменьшал
эффект ПТЗ. Эти данные позволяют предположить, что ПТЗ и пикротоксин
взаимодействуют с перекрывающимися, но различными доменами ГАМКрецептора. При исследовании изменений судорожной активности крыс при
микроинъекциях мусцимола (агониста ГАМК) или трансаминазы γ-винил-γаминомасляной кислоты (ингибитора ГАМК) в различные области мозга до и
после внутрибрюшинного введения ПТЗ были обнаружены структуры,
ответственные за возникновение и распространение ПТЗ-вызванных судорог.
Прежде всего, было обнаружено, что электролитическое разрушение
мамилло-таламического тракта, обеспечивающего связь между передним
таламусом и мамиллярными телами, предотвращает развитие ПТЗвызванных судорог. Билатеральные микроинъекции мусцимола или GVG в
передний таламус подавляли высокоамплитудные синхронные разряды на
ЭЭГ и поведенческие компоненты вызванного ПТЗ судорожного приступа.
Такой же эффект наблюдался при инъекциях GVG во многие зоны среднего
мозга, моста и продолговатого мозга, относящиеся к ретикулярной
формации. Наибольшее действие проявлялось при введении GVG в
гигантоклеточное ядро, дорзальную часть покрышки среднего мозга и моста,
включая центральное серое вещество, дорзальное тегментальное ядро и
вестибулярные ядра. Напротив, введение GVG в чёрную субстанцию, MD и
VA ядра таламуса или в цереброспинальную жидкость не оказывало
противосудорожного эффекта. Было предположено, что противосудорожное
действие мусцимола и GVG связано с нарушением синхронизации
кортикальных нейронов, которая опосредуется таламо-кортикальными
взаимодействиями. Переднее ядро таламуса при ПТЗ-вызванных судорогах
может, таким образом, выполнять релейную функцию при распространении
пароксизмальной активности между подкорковыми структурами и зонами
коры больших полушарий, обладающими низким порогом судорожной
активности. Это, прежде всего, цингулярная кора и гиппокамп, которые
вместе с передним таламусом и мамиллярными телами входят в состав круга
Пэйпеца, а также префронтальная кора, имеющая многочисленные связи с
поясной извилиной и другими лимбическими областями.
Действие ПТЗ заключается в связывании с рецептором ГАМК и подавлением
тормозных процессов, что ведет к развитию судорожных приступов,
выраженность которых зависит от дозы введенного ПТЗ.
ПТЗ-вызванные судороги опосредуются системой, включающей
ретикулярную формацию, определенные зоны промежуточного и
продолговатого мозга, и, возможно, исходящие от них двигательные пути.
Мамиллярные тела, передний таламус и мамилло-таламический тракт играют
важную роль в инициации и распространении судорожной активности.
Практическая часть
В теоретической части работы мы говорили о существовании разных
моделей эпилепсии. Очевидно, что существуют они ради проверки
противоэпилептических препаратов. В практической части мы рассмотрели
действие вальпроата на разные виды эпилепсии у крыс: эпилепсию с тоникоклоническими судорогами в птз-модели и абсансную эпилепсию у крыс
линии
Цель:
WAG/Rij,
Изучить
генетически
противосудорожное
к
ней
влияние
предрасположенных.
вальроата
натрия
на
пентилентетразоловой модели и на модели абсансной эпилепсии.
Задачи:
1. Исследовать противосудорожное действие
вальпроата натрия на
пентилентетразоловой модели.
2. Исследовать противосудорожное действие вальпроата натрия на
абсансную эпилепсию.
3. Освоить некоторые методы работы с лабораторными животными.
Материалы и методы:
6 белых нелинейных крыс (самки, массой 280-330г), пентилентетразол (25
мг/кг), вальпроат (300мг/кг, 100мг/мл), шкала оценки судорог, три клетки,
шприцы, 2 крысы породы WAG/Rij, стереотаксический прибор, новокаин,
хлорал гидрат (400мг/кг, 100мг/мл), перекись водорода (30%), пинцеты,
физраствор, ножницы, иглы, вата, зубной цемент, часовой болт, электроды,
электроэнцефалограф.
1. Пентилентетразоловая модель.
Крысы были разделены на две группы: первая группа—крысы, которым
вводился только птз, и вторая группа, которой помимо птз вводился еще и
вальпроат.
Крысам первой группы внутрибрюшинно была введена доза
пентилентетразола (25 мг/кг). Далее наблюдалось состояние крыс. Через 15
мин, если не развивались судороги 4-5 стадии, соответствующие тоникоклоническим судорогам, укол повторялся, но не более трех раз за опыт.
Ниже приведена шкала оценки тяжести судорог.
Балл
Поведенческие проявления судорог
0
Нормальное поведение животного
1
2
Абнормальное поведение животного (замирание,
затаивание), жевание, отдельные вздрагивания головы
Атипичные миоклонические судороги головы
Клонические судороги конечностей и тела. Сильные
3
клонические судороги конечностей и тела с отрывом обеих
конечностей от пола
4
5
Поза «кенгуру»: клонические судороги конечностей,
тонические судороги тела
Тяжелые тонико-клонические судороги с потерей позы
Крысам второй группы за 30 мин до введения дозы птз вводилась доза
вальпроата(300 мг/кг) , а затем повторялась та же процедура: введение птз и
наблюдение.
Замечание: VPA сам по себе действует на состояние крыс. Они заторможены,
нарушается
координация.
Было показано, что ВПА в дозе
Крысы
шатаются.
300 мг/кг купировал судороги (не
превышаюших 1-ю стадию) в течение наблюдаемых 45 минут после введения
ПТЗ.
На графике видно, что у опытной группы судорог не было; они были
купированы вальпроатом.
2. Наблюдение абсансных припадков.
Для того, чтобы наблюдать припадок на ЭЭГ, необходимо вживить
электроды.
Ход операции:
1. Стерилизация инструментов
2. Введение хлорал гидрата (400 мг/кг) внутрибрюшинно
3. Расположение животного в стереотаксическом приборе
4. Очищение верхней части черепа от мягких тканей, обработка перекисью.
Перед этим необходимо обколоть место надреза 2% р-ром новокаина.
5. Закрепление часового болта в черепе, создание отверстий для трех
электродов: пишущего (в теменную кору, по координатам AP=2, L=2, H=2.),
индифферента и заземляющего (симметричные несквозные отверстия в
затылочной части черепа, над мозжечком).
6. Установка электродов, заливка их зубным цементом (создание
закрепляющей «шапки»).
Через три дня после операции мы приступили к записи ЭКоГ. Так как
крысы— ночные животные, то днем они находятся в полусонном состоянии,
и именно на грани сна и бодрствования возникают припадки абсансной
эпилепсии, которые хорошо видны на ЭКоГ.
Сначала мы записывали ЭКоГ крыс без введения вальпроата, по 30 мин на
каждую. Затем мы вводили вальпроат внутрибрюшинно, и снова записывали
30 мин. После получения ЭКоГ мы подсчитывали пики и анализировали их с
помощью программы Power Graph.
На графике показано, что продолжительность приступов у опытной группы
значительно ниже, чем у контрольной.
К наиболее вероятным механизмам действия вальпроата относят:
- увеличение синтеза и выделения ГАМК, следователно, потенциация
ГАМК–ергической передачи в отдельных зонах головного мозга;
- уменьшение выделения возбуждающих аминокислот, b–гидроксимасляной
кислоты и ослабление возбуждения нейронов, обусловленное активацией N–
метилD–аспартат (NMDA) рецепторов глютамата;
- прямое влияние на возбуждение мембран, блок вольтаж–зависимых
натриевых каналов;
- блок фермента ГАМК-трансферазы.
Возможно, вальпроат может активировать фермент, осуществляющий
превращение глутамата в ГАМК. Или, может быть, влияет на количество или
связываемость ГАМК-рецепторов (вальпроат так же увеличивает влияние
карбамазепина, этосуксимида, ламотриджина, топирамата, фенитоина и
фенобарбитала; возможно, что за счет этого). Возможно также, что,
связываясь с ГАМК-рецептором, вальпроат не дает связываться с ним
пентилентетразолу.
Вывод:
Вальпроат способен значительно ослаблять судороги при птз-припадке и
синхронную активность нейронов вообще, действует при разных вариантах
эпилепсии, имеет, скорее всего, множественный механизм действия.
Список литературы.
1)
Мухин К. Ю. Идиопатическая генерализованная эпилепсия:
диагностика и лечение. – НейроNews, №3, 2007.
2)
Карлов В. А. Эпилепсия. – М.: Медицина, 1990.
3)
Чепурнов С. А., Чепурнова Н. Е. Нейробиологические основы
эпилептогенеза
развивающегося
мозга;
Успехи
физиологических наук, том 28, 1997.
4)
Болдырев А.И. Эпилептические синдромы // М: Медицина,
1976
5)
Зенков Л.Р., Притыко А.Г. Фармакорезистентные эпилепсии //
М.: МЕДпресс-информ, 208 с., 2003.