Проект Клинические рекомендации ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННОГО ГЕПАТИТА У ДЕТЕЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА ИММУНОБЛОТИНГА Москва 2015 1 Содержание Стр. Разработчики…………………………………………………………………….. 3 1. Введение………………………………………………………………………. 4 2. Методология………………………………………………………………….. 6 3. Описание медицинской разработки.……………………………………….. 8 3.1. Методика определения аутоиммунных антител…………..………….. 8 3.2. Характеристики теста…………..………….…………..………….…… 9 3.3. Результаты научно-исследовательской работы……………………… 10 3.4. Сведения о патентовании……………………………………………… 15 3.5. Степень готовности медицинской технологии к внедрению………. 15 3.6. Область применения медицинской технологии……………………. 15 3.7. Реализация в практике……………………………………………….. 16 4. Заключение…………………………………………………………………… 16 Список литературы……………………………………………………….. 17 2 Разработчики: д.м.н. Строкова Т.В,, д.м.н., проф. Т.Б. Сенцова, к.б.н. Сурков А.Г., к.м.н. Багаева М.Э., к.м.н. Зубович А.И., к.м.н. Ворожко И.В., Черняк О.О. В.н.с. отделения педиатрической гастроэнтерологии, гепатологии и диетологии, д.м.н. _______________ Строкова Т.В.. Заведующая лабораторией клинической биохимии, иммунологии и аллергологии, д.м.н., профессор _______________ Сенцова Т.Б. С.н.с. отделения педиатрической гастроэнтерологии, гепатологии и диетологии, к.м.н. _______________ Сурков А.Г. С.н.с. отделения педиатрической гастроэнтерологии, гепатологии и диетологии, к.м.н. _______________ Багаева М.Э. С.н.с. лаборатории клинической биохимии, иммунологии и аллергологии, к.м.н. _______________ Ворожко И.В. Н.с. отделения педиатрической гастроэнтерологии, гепатологии и диетологии, к.м.н. _______________ Зубович А.И. Н.с. лаборатории клинической биохимии, иммунологии и аллергологии, к.м.н. _______________ Черняк О.О. Организация-разработчик: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт питания» 3 1. Введение Успехи современной гепатологии в диагностике и лечении хронических диффузных заболеваний печени у взрослых и детей определяются во многом расшифровкой их этиологии. В то же время остается группа нозологических форм с неясным этиологическим фактором, патогенез которых представляет собой аутоиммунную агрессию, в том числе и против неизмененных компонентов ткани печени. В ряду различных аспектов детской гепатологии аутоиммунные заболевания печени наименее изучены. В качестве возможных причин следует выделить редкость данной патологии не только у детей, но и у взрослых, а также сложность диагностики этих поражений печени (клинической, лабораторной и инструментальной). В то же время аутоиммунный гепатит (АИГ), первичный склерозирующий холангит (ПСХ), перекрестный аутоиммунный синдром могут дебютировать в детском и подростковом возрасте, что требует от педиатров четких диагностических и терапевтических позиций. В соответствии с современными представлениями, АИГ - это хроническое воспалительное заболевание печени неизвестной этиологии, характеризующееся пери-портальным воспалением, значительной гипергаммаглобулинемией, появлением в сыворотке крови широкого спектра печеночно-ассоциированных аутоантител и положительным ответом на иммуносупрессивную терапию. Как следует из приведенного определения, причины заболевания остаются невыясненными и, следовательно, понятие «аутоиммунный» в большей степени характеризует не этиологию, а патогенез процесса. Следует учитывать, что невозможность определения этиологического фактора хронического заболевания печени не обязательно свидетельствует о диагнозе АИГ. При АИГ первичной мишенью аутоиммунных реакций является гепатоцит, при первичном билиарном циррозе (ПБЦ) и ПСХ вначале повреждаются клетки желчных протоков и только потом - паренхима печени. Факторы, приводящие к развитию подобных реакций, до конца не изучены. Обсуждается триггерная роль вирусов, токсинов, бактерий, метаболитов лекарственных веществ и других патогенных факторов. АИГ относится к редким заболеваниям, может возникать в любом возрасте, встречается в основном у женщин в возрасте 10-30 лет и 50-70 лет. Соотношение заболевших женщин и мужчин составляет, по разным данным, от 2,0 : 0,2 (Тайвань) и 4,7 : 1 (Южная Америка) до 8 : 2 (Европа). У детей АИГ обычно диагностируют в возрасте 6-10 лет, соотношение девочек и мальчиков составляет от 4 : 1 до 7 : 1. По данным нашего наблюдения, среди 58 детей с АИГ, госпитализированных в НЦЗД РАМН, соотношение девочек (43) и мальчиков (15) равнялось 2,8 : 1. 4 Основным критерием диагноза АИГ считают выявление определенного спектра аутоантител, что лежит в основе классификации АИГ. Следует отметить, что только при повторных обнаружениях аутоантител в высоких концентрациях и с одновременным повышением уровня аминотрансфераз можно думать об АИГ. В настоящее время, в зависимости от спектра выявляемых аутоантител, выделяют АИГ 1-го, 2-го и 3-го типов. АИГ 1-го типа встречается в любом возрасте, но обычно от 10 до 20 лет или от 45 до 70 лет. На этот «классический» вариант болезни приходится 80% всех случаев АИГ, он характеризуется наличием в сыворотке антинуклеарных (antinuclear antibodies, АNA) и/или антигладкомышечных (smooth muscle antibodies, SMA) аутоантител. У 65-93% больных обнаруживаются также перинуклеарные ней-трофильные цитоплазматические антитела (pANCA). При АИГ 2-го типа мишенью для иммунных клеток является антиген микросом печени и почек 1-го типа, в сыворотке определяются антитела к микросомам печени и эпителиальных клеток клубочкового аппарата почек типа 1 (анти-LKM1). АИГ 2-го типа редко диагностируется у взрослых, большую часть больных составляют дети от 2 до 14 лет. Некоторые авторы выделяют АИГ 3-го типа, который характеризуется наличием антител к растворимому печеночному антигену (анти-SLA), но у 74% этих больных выявляют также ANA и SMA, что ставит под сомнение существование данного типа АИГ как отдельной нозологической формы. Наличие аутоантител является одним из основных условий постановки диагноза АИГ. Тем не менее, у приблизительно 15-20% детей с АИГ аутоантитела не выявляются. АИГ характеризуется широким спектром клинических проявлений - от бессимптомного до тяжелого, иногда фульминант-ного, гепатита, с наличием внепеченочных проявлений или без них. У детей бессимптомное течение АИГ встречается редко. Диагноз АИГ является показанием для проведения иммуносупрессивной терапии. АИГ в детском возрасте без иммуносупрессивной терапии имеет чрезвычайно неблагоприятное течение и плохой прогноз: 5-летняя выживаемость у таких больных составляет 50%, 10летняя - 10%. Применение современных схем иммуносупрессии позволяет достаточно эффективно контролировать течение процесса при АИГ у детей. Монотерапия преднизолоном или преднизолоном в комбинации с азатиоприном вызывает клиническую, биохимическую и гистологическую ремиссию у 65% пациентов в течение 3 лет. Таким образом, своевременная диагностика АИГ определяет качество и прогноз жизни больных. В связи с этим возрастает необходимость внедрения новых высокочувствительных и высокоспецифических методов диагностики аутоиммунного поражения печени. Одним из таких являются методы лабораторной диагностики, основанные на методе иммуноблотинга. 5 Терминология Аутоиммунный гепатит – хроническое воспалительное заболевание печени неизвестной этиологии, характеризующееся перипортальным воспалением, значительной гипергаммаглобулинемией, появлением в сыворотке крови широкого спектра печеночноассоциированных аутоантител и положительным ответом на иммуносупрессивную терапию. Иммуноблотинг (вестерн-блотинг) – современный высокочувствительный аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков с помощью антител. 2. Методология Методы, использованные для сбора/селекции доказательств: поиск в электронных базах данных (Pubmed, Embase). Методы, использованные для оценки качества и силы доказательств: оценка значимости в соответствии с уровнями доказательности и классами рекомендаций (табл.1, 2). Таблица 1. Уровни доказательности Уровень 1 2 3 4 Источник доказательств Проспективные рандомизированные контролируемые исследования. Достаточное количество исследований с достаточной мощностью, с участием большого количества пациентов и получением большого количества данных. Крупные мета-анализы. Как минимум одно хорошо организованное рандомизированное контролируемое исследование. Репрезентативная выборка пациентов Проспективные с рандомизацией или без исследования с ограниченным количеством данных. Несколько исследований с небольшим количеством пациентов. Хорошо организованное проспективное исследование когорты. Мета-анализы ограничены но проведены на хорошем уровне. Результаты непрезентативны в отношении целевой популяции. Хорошо организованные исследования «случай-контроль» Нерандомизированные контролируемые исследования. Исследования с недостаточным контролем. Рандомизированные клинические исследования с как минимум 1 значительной или как минимум 3 незначительными методологическими ошибками. Ретроспективные или наблюдательные исследования. Серия клинических наблюдений. Противоречивые данные, не позволяющие сформировать окончательную рекомендацию Мнение эксперта/данные из отчета экспертной комиссии, экспериментально подтвержденные и теоретически обоснованные 6 Таблица 2. Уровни рекомендаций. Уровень A B Описание Рекомендация основана на высоком уровне доказательности (как минимум 1 убедительная публикация 1 уровня доказательности, показывающая значительное превосходство пользы над риском) Рекомендация основана на среднем уровне доказательности (как минимум 1 убедительная публикация 2 уровня доказательности, показывающая значительное превосходство пользы над риском) C Рекомендация основана на слабом уровне доказательности (но как минимум 1 убедительная публикация 3 уровня доказательности, показывающая значительное превосходство пользы над риском) или нет убедительных данных ни о пользе, ни о риске) D Отсутствие убедительных публикаций 1, 2 или 3 уровня доказательности, показывающих значительное превосходство пользы над риском, либо убедительные публикации 1, 2 или 3 уровня доказательности, показывающие значительное превосходство риска над пользой Расшифровка Метод/терапия первой линии; либо в сочетании со стандартной методикой/терапией Метод/терапия второй линии; либо при отказе, противопоказании, или неэффективности стандартной методики/терапии. Рекомендуется мониторирование побочных явлений Нет возражений против данного метода/терапии или нет возражений против продолжения данного метода/терапии. Рекомендовано при отказе, противопоказании или неэффективности стандартной методики/терапии, при условии отсутствия побочных эффектов Рекомендация основана на мнении экспертов, нуждается в проведении исследований Методы, использованные для анализа доказательств: Обзоры опубликованных мета-анализов; Систематические обзоры с таблицами доказательств. Описание методов, использованных для анализа доказательств: При отборе публикаций, как потенциальных источников доказательств, использованная в каждом исследовании методология изучается для того, чтобы убедиться в ее валидности. Результат изучения влияет на уровень доказательств, присваиваемый публикации, что в свою очередь влияет на силу вытекающих из нее рекомендаций. Для минимизации субъективного фактора и возможных ошибок каждое исследование 7 оценивалось независимо, по меньшей мере, двумя членами рабочей группы. Какие-либо различия в оценках обсуждались рабочей группой в полном составе. Экономический анализ: Анализ стоимости не проводился и публикации по фармакоэкономике не анализировались. Основные рекомендации: Сила доказательности (1-4) приводятся при изложении текста технологии. 3. Описание медицинской разработки 3.1 Методика определения аутоиммунных антител Метод иммуноблотинга основан на комбинации гель-электрофореза и иммунохимической реакции «антиген-антитело». С помощью гель-электрофореза белки разделяются в полиакриламидном геле. Далее белки переносят на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану. Затем их детектируют с использованием антител методом «сэндвича»: сначала белки связываются с первичными (моно- или поликлональными) антителами, которые в свою очередь связываются со вторичными антителами, конъюгированными с ферментами (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой). Визуализация исследуемого белка достигается путем проведения соответствующей биохимической реакции колориметрическим, с образованием хемилюминесцентным, продукта, который флуоресцентным определяется методами детекции. Количество белка может быть оценено с помощью денситометрии. Высокая степень разрешения достигается за счет электрофоретического разделения белков и специфичности моноклональных антител. В оптимально отработанных условиях Вестернблоттингом можно обнаруживать антиген в количествах менее 1нг. Для выявления печеночных IgG-аутоантител к к 9 различным антигенам печени: AMA-M2 (пируват- дегидрогеназному комплексу), М2-3E (BPO, белку субъединиц Е2 дегидрогеназ альфа-2-оксикислот внутренней мембраны митохондрий), Sp100 (белку ядерных гранул, ядерных пятен), PML (белку промиелоцитарной лейкемии, ядерных пятен), gp210 (интегральному белку ядерной мембраны, комплекс ядерных пор), LKM-1 (микросомам печени и почек; цитохрому Р450 II D6), LC-1 (цитозольному антигену печени 1 типа; формиминотрансферазе-циклодеаминазе), SLA/LP (растворимому печеночному антигену/печеночно-панкреатическому антигену) и Ro-52 в сыворотке и плазме крови были использованы наборы EUROLINE Profile Autoimmune Liver Diseases (EUROIMMUN AG, Германия). 8 3.2. Характеристики теста Набор содержит тестовые стрипы, на которые нанесены параллельные полосы очищенных антигенов. Тестовые стрипы инкубируют на первой стадии реакции с образцом разведенной сыворотки или плазмы крови пациента. В случае если образец положительный, специфические антитела класса IgG (а также классов IgA и IgM) будут связываться с соответствующими антигенами. Для обнаружения связанных антител проводится вторая инкубация с использованием ферментного конъюгата (антитела к IgG человека, меченные щелочной фосфатазой), который способен вызывать развитие цветной реакции. Диапазон определения: метод EUROLINE является качественным, диапазон определения не дается. Принято, что предельный титр антител устанавливается при разведении образца 1:101. Антигены. Нативный антиген AMA-M2 получен очисткой из сердца быка; в качестве главного компонента он содержит субъединицу Е2 (74 кДа) пируватдегидрогеназного комплекса (PDH). Антиген М2-3E (BPO) – объединенный рекомбинантный белок, продуцируемый E. coli и представляющий собой иммуногенные домены субъединиц Е2 дегидрогеназы 2- пируватдегидрогеназы оксикислот (РDH) и с 2- разветвленными цепями оксоглутаратдегидрогеназы (BCOADH), (OGDH), вместе называемые ВРО. Антигены Sp100 и PML являются компонентами ядерных телец лейкемичных промиелоцитов (ядерные тельца PMLNB, ядерные гранулы). Соответствующая кДНК человека была экспрессирована в E. coli. Антиген gp210 является компонентом комплекса ядерных пор (NPC). Соответствующая кДНК человека была экспрессирована в E. coli. Антиген LKM-1 локализован в микросомальной фракции печени и почек. Путем клонирования и секвенирования он был идентифицирован как цитохром Р450 II D6. Соответствующая кДНК человека была экспрессирована в E. coli. Рекомбинантный антиген LC-1 (формиминотрансфераза- циклодеаминаза) был экспрессирован путем клонирования соответствующей кДНК человека в клетках насекомых с использованием системы бакуловируса. Рекомбинантный SLA/LP (белоксуппрессор UGA, ассоциированный с тРНК) получен клонированием соответствующей кДНК человека в E. coli. Ro-52: Рекомбинантный белок Ro-52 (52 кДа). Соответствующая кДНК человека была экспрессирована в клетках насекомых с использованием системы бакуловируса. Перекрестные реакции: перекрестных реакций с другими аутоантителами не обнаружено. Интерференция: не отмечено изменения аналитических характеристик при исследовании в данном наборе гемолизированных, липемических или желтушных образцов с 9 концентрациями гемоглобина вплоть до 5 мг/мл, триглицеридов – до 20 мг/мл и билирубина – до 0,4 мг/мл. Воспроизводимость: воспроизводимость результатов между опытами оценивали многократным повторным исследованием одних и тех же охарактеризованных образцов в течение нескольких дней, воспроизводимость в пределах одного опыта – многократным исследованием охарактеризованных образцов в течение одного дня. В каждом случае интенсивность полос находилась в пределах установленного диапазона. Таким образом, данный тест EUROLINE показывает очень высокую воспроизводимость в пределах одной постановки и между постановками. Результаты проведенных клинических исследований: Для верификации теста фирмойпроизводителем на наличие антител к AMA-M2, 3E (BPO), Sp100, PML и gp210 было исследовано 49 сывороток взрослых пациентов с аутоиммунным гепатитом (АИГ), 200 сывороток пациентов с вирусными гепатитами С или В и 50 сывороток здоровых доноров крови. При АИГ 94% сывороток содержали антитела хотя бы к одному из названных антигенов. В другом исследовании, на наличие аутоантител к антигенам печени были проверены сыворотки 24 взрослых пациентов, страдающих АИГ 2 типа, сыворотки 26 пациентов с первичным билиарным циррозом, сыворотки 109 человек контрольной группы с прочими заболеваниями печени и сыворотки 57 здоровых доноров крови. Специфичность анти-SLA/LP и анти-LC-1 к АИГ составляла 100%, тогда как анти-LKM-1 присутствовали как при АИГ, так и при вирусных гепатитах. Доказательность медицинской технологии соответствует уровню 4 согласно прилагаемой рейтинговой системе доказательности (Таблица 1). 3.3 Результаты научно-исследовательской работы Обследовано 38 детей (мальчиков - 15, девочек - 23) в возрасте 10,1±0,7 лет (2г 3 мес – 17 лет). Обследование детей включало: 1. Общеклинические исследования (сбор анализа, клинический анализ крови, общий анализ мочи). 2. Исследование маркеров вирусных гепатитов (анти-HAV, анти-HCV, HBsAg). 3. Биохимическое исследование крови (билирубин общий+прямой, АСТ, АЛТ, ЩФ, ГГТ, креатинин, глюкоза, холестерин, общий белок + протеинограмма). 4. Исследование уровня иммуноглобулинов (Ig) классов G, A, и M. 5. Ультразвуковое исследование органов брюшной полости. 6. – Исследование аутоантител pANCA, ANA, ASMA, a-LKM1, AMA-M2, М2-3E (BPO), Sp100, PML, gp210, LC-1, SLA/LP иммуноферментным методом и 10 исследование аутоантител a-LKM1, AMA-M2, М2-3E (BPO), Sp100, PML, gp210, LC-1, SLA/LP методом иммуноблотинга. 7. ЭГДС и биопсия печени проводились по показаниям. Анализируя результаты обследования указанной группы детей, было выявлено, что дебют заболевания был в возрасте 8,9±0,7 (1,9 – 15,5) лет. У 23 детей зарегистрировано острое начало заболевания, связанное с появлением желтухи, гепато- и/или гепатоспленомегалии; у 15 – постепенное. В связи с отсутствием возможностей проведения иммунологических исследований у большинства детей был установлен диагноз хронического криптогенного гепатита. В связи с чем эти пациенты в течение длительного времени не получали полноценной патогенетической терапии. У всех детей была назначена лишь гепатопротективная терапия, у части из них – короткие курсы лечения иммуносупресивными препаратами в низких дозах, что способствовало прогрессированию заболевания. Возраст установления диагноза составлял 10,1±0,7 лет. Таким образом, медиана периода между появлением первых симптомов заболевания и установлением диагноза составила в 1 год 4 мес. При проведении обследования у всех детей были исключены острые и хронические вирусные гепатиты, наследственные болезни обмена. В клиническом анализе крови средний уровень гемоглобина составил 123,6±2,4 г/л, эритроцитов 4,2±0,09 х 1012/л. При этом анемия (Hb<100г/л) была зарегистрирована у двоих детей (5,3%). Уровень лейкоцитов был 7,8±0,5 х 109/л, тромбоцитов 220,0±17,4 х 109/л. Вместе с тем, несмотря на нормальные средние показатели тромбоцитов, тромбоцитопения (<150 х 109/л) наблюдалась у 9 (23,7%). Одним из маркеров воспаления является уровень СОЭ, который значительно повышается при различных аутоиммунных заболеваниях. Средний уровень СОЭ у обследованных детей составил 18,6±2,8 мм/час. Следует отметить, что нормальный уровень данного показателя наблюдался у 21 ребенка (55,3%), у остальных – он был повышен (рис 1). Средние показатели биохимического анализа крови представлены в таблице 1. 11 7,9 2,6 2,6 55,3 31,6 N до 2N до 3N до 4N до 5N Рисунок 1. Показатели СОЭ у детей с АИГ Средние показатели общего билирубина превышали норму в 2 раза (40,6±4,6 мкмоль/л). При этом нормальный уровень данного показателя был зарегистрирован лишь у 12 (32,4%) детей, у остальных он превышал норму в 1,5-5 раз. Таблица 1. Показатели (M±m) биохимического анализа крови. Показатели Средний уровень Референсные значения Билирубин общий 40,6±4,6 5-20 Билирубин прямой 18,5±2,8 <5 АСТ 643,2±105,9 5-40 АЛТ 607,3±91,9 5-40 ЩФ 284,8±30,5 <400 ГГТ 81,8±6,9 5-35 Общий белок 83,7±2,2 65-85 Альбумин 43,7±1,5 55,8-65,0 γ-глобулины 32,5±1,8 11,5-18,6 IgG 25,26±2,4 7,0-16,0 IgA 2,21±0,2 0,7-4,0 IgM 1,78±0,1 0,4-2,3 Единицы измерения Мкмоль/л Мкмоль/л Ед/л Ед/л Ед/л Ед/л г/л % % г/л г/л г/л Как известно, аутоиммунные заболевания печени протекают с выраженным синдромом цитолиза. В дебюте заболевания средний уровень АСТ был 727,7±111,1 Ед/л, АЛТ – 733,0±115,5 Ед/л. На момент госпитализации в отделение педиатрической гастроэнтерологии, гепатологии и диетологии данные показатели соответствовали 643,2±105,9 и 607,3±91,9 Ед/л соответственно (рис.2). Статистически значимых различий между величинами АЛТ и АСТ в момент дебюта заболевания и на момент госпитализации не выявлено (p>0.05), что свидетельствует о сохраняющийся высокой активности заболевания в течение длительного времени. 12 800 600 400 200 0 АСТ АЛТ Дебют Госпитализация Рисунок 2. Показатели синдрома цитолиза у детей с АИГ (p>0.05) 13 В тоже время, величины АЛТ и АСТ имели достаточно большие диапазоны колебаний, что было связано с проведением небольших курсов иммуносупрессивной терапии накануне госпитализации в НИИ питания (рис.3, таблица 2). Таблица 2. Величины АЛТ и АСТ в зависимости от уровня превышения верхней границы нормального значения (N), Ед/л (M±SD). <3 N 3-5N 6-10 N >10N АСТ 73,3±12,6 187,7±8,9 325,0±25,5 1066,2±150,1 АЛТ 77,9±13,5 153,5±7,8 308,4±21,7 995,9±122,8 100% 80% 50 50 21,1 10,5 18,4 21,1 АСТ АЛТ 60% 40% 20% 0% <3N 18,4 10,5 3-5N 6-10N >10N Рисунок 3. Выраженность синдрома цитолиза у детей с АИГ на момент госпитализации. Следует отметить, что у подавляющего большинства детей (92,1%) отмечалось повышение уровня ГГТ, что свидетельствовало о наличии холестаза. Средний уровень ГГТ составил 81,8±6,9 ед/л. Повышение щелочной фосфатазы наблюдалось лишь в 21,1% случаев. Изменения в протеинограмме были зарегистрированы у всех детей. Анализ показателей общего белка выявил, что нормальный его уровень был у 55,3% детей. Повышение белка, свидетельствующее об активном воспалении, наблюдалось у 34,2%, снижение, связанное с нарушением белково-синтетической функции печени – 10,5%. У 86,8% детей – выявлена гапергаммаглобулинемия, свидетельствующая о наличии активного воспаления, а у 10,5% - гипоальбуминемия, связанная с прогрессированием заболевания, глубоким поражением печеночной ткани и нарушением белково-синтетической функции печени. Исследование уровня IgG выявило ее повышение у 81,6% детей. 14 Наличие синдрома холестаза у подавляющего большинства детей, незначительного (не более 3-х норм) синдрома цитолиза, отсутствие повышения уровня IgG у 18,4% детей, накануне госпитализации получавших иммуносупрессивную терапию, требуют проведения исследования аутоантител. Исследование аутоантител иммуноферментным методом выявило следующие спектры аутоантител: pANCA – в 2,6%, ANA – в 26,3%, ASMA – в 13,2%, ANA+ASMA – в 31,6%, ANA+ASMA+AMA – в 7,9%, a-LKM1 – в 10,5%, AMA-M2 – в 0%, М2-3E (BPO) – в 0%, Sp100– в 0%, PML– в 0%, gp210– в 0%, LKM-1– в 0%, LC-1– в 0%, SLA/LP – в 0% и Ro-52– в 0%, отсутствие аутоантител наблюдалось в 7,9% случаев (рис. 4). По результатам исследования аутоантител был подтвержден диагноз аутоиммунного гепатита 1-го типа у 30 (79%), 2-го типа – у 4 (10,5%) детей. % 35 31,6 30 26,3 25 20 13,2 15 10 10,5 7,9 5 7,9 2,6 0 pANCA ANA ASMA ANA+ASMA ANA+ASMA+AMA aLKM1 отсут.а/т Рис.4. Спектр аутоантител, выявленных у пациентов с АИГ. При применении метода иммуноблотинга у той же когорты пациентов была получена 100% чувствительность и воспроизводимость этого метода: a-LKM1 –выявлены в 10,5%, AMA-M2 – в 0%, М2-3E (BPO) – в 0%, Sp100– в 0%, PML– в 0%, gp210– в 0%, LKM-1– в 0%, LC-1– в 0%, SLA/LP – в 0% и Ro-52– в 0% случаев. Полученные данные, подтверждают результаты исследований, проведенных у взрослых. 3.4. Сведения о патентовании: нет. 3.5. Степень готовности исследовательская медицинской разработка может технологии быть внедрена к в внедрению: научно- практику лечебно- профилактических учреждений Российской Федерации для диагностики аутоиммунного гепатита у детей. 3.6. Область применения медицинской технологии: - здравоохранение: педиатрия, внутренние болезни, гастроэнтерология, инфекционные болезни, иммунология, 15 ревматические болезни, обучение студентов высших медицинских учебных заведений, курсантов циклов профессиональной переподготовки и повышения квалификации. 3.7. Реализация в практике: клиника ФГБНУ «НИИ питания», кафедра диетологии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России, кафедра диетологии и нутрициологии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России. 4. Заключение Результаты проведенного исследования показывают, что АИГ в детском возрасте плохо диагностируется (в среднем, через 1 г. 4 мес. после дебюта заболевания) и характеризуется высокой степенью активности воспалительного процесса в печени при отсутствии адекватной патогенетической терапии. Это в значительной мере повышает риск быстрого развития необратимых процессов поражения печеночной ткани – фиброзирования и цирроза. В связи с чем своевременная диагностика АИГ приобретает первостепенное значение. В проведенном нами сравнительном исследовании была установлена высокая чувствительность и воспроизводимость определения аутоантител методом иммуноблотинга, что позволяет рекомендовать его для диагностики аутоиммунного гепатита у детей. 16 Список литературы 1. Huguet S. и др. Identification by proteomic tool of atypical anti-liver/kidney microsome autoantibodies targets in de novo autoimmune hepatitis after liver transplantation // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2007. Т. 1109. С. 345–357. 2. Eyraud V. и др. Significance of antibodies to soluble liver antigen/liver pancreas: a large French study // Liver Int. 2009. Т. 29. № 6. С. 857–864. 3. Efe C. и др. Antibodies to soluble liver antigen in patients with various liver diseases: a multicentre study // Liver Int. 2013. Т. 33. № 2. С. 190–196. 4. Liberal R. и др. Diagnostic criteria of autoimmune hepatitis // Autoimmun Rev. 2014. Т. 13. № 4-5. С. 435–440. 5. Баранов А.А., Каганов Б.С., Гундобина О.С. Аутоиммунный гепатит у детей // Детский доктор. 2001. Т. 1. № 18. С. 34–40. 6. Ивашкин В.Т., Буеверов А.О. Аутоиммунные заболевания печени в практике клинициста. Москва: ООО «Издательский дом »М-Вести", 2001. 201 с. 7. Детская гепатология / под ред. Б.С. Каганов. Москва: Династия, 2009. 576 с. 8. Антитела класса IgG к антигенам печени EUROLINE [Электронный ресурс]. URL: http://www.analytica.ru/instructions/immunochemistry/immunoblot/kits/Euroimmun/euroimmun _dl1300-1601-4g_liver_profile.pdf (дата обращения: 25.03.2015). 9. Вестерн-блоттинг (Western-blotting) [Электронный ресурс]. URL: http://web- local.rudn.ru/web-local/kaf/rj/index.php?id=8&p=3046 (дата обращения: 25.03.2015). 17