Подпишитесь на DeepL Pro и переводите документы большего объема. Подробнее на www.DeepL.com/pro. Клиническая биохимия 37 (2004) 277 - 285 Новый автоматизированный метод прямого измерения общей антиоксидантной способности с использованием более стабильного катион-радикала ABTS нового поколения Озкан Эрель* Кафедра клинической биохимии, медицинский факультет, исследовательская больница, Университет Харран, Sßanlıurfa TR63200, Турция Получено 20 мая 2003 г.; получено в пересмотренном виде 27 ноября 2003 г.; принято 28 ноября 2003 г. Аннотация Задачи: Разработать новый колориметрический и автоматизированный метод прямого измерения общей антиоксидантной способности (ОАС). Дизайн и методы: Использован более стабильный окрашенный 2,2V-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислотный радикал-катион нового поколения (ABTS*+ ). ABTS*+ обесцвечивается антиоксидантами в соответствии с их концентрацией и антиоксидантной способностью. Изменение цвета измеряется как изменение поглощения при 660 нм. Этот процесс осуществляется на автоматическом анализаторе, а анализ калибруется по тролоксу. Результаты: Новый анализ линеен до 6 ммоль тролокс-эквивалента/л, его прецизионность ниже 3%, отсутствуют помехи со стороны гемоглобина, билирубина, ЭДТА и цитрата. Разработанный метод достоверно коррелирует с определением общего антиоксидантного статуса (ОАС) Randox- (r = 0,897, P < 0,0001; n = 91) и с определением железовосстанавливающей способности плазмы (FRAP) (r = 0,863, P < 0,0001; n = 110). Уровень TAC в сыворотке крови был ниже у пациентов с глубокой депрессией (1,69 F 0,11 ммоль тролокс-эквивалента/л), чем у здоровых людей (1,75 F 0,08 ммоль тролокс-эквивалента/л, P = 0,041). Выводы: Описанный простой, стабильный, надежный, чувствительный, недорогой и полностью автоматизированный метод может быть использован для измерения общей антиоксидантной способности. D 2004 Канадское общество клинических химиков. Все права защищены. Ключевые слова: ABTS; катион-радикал ABTS; антиоксидант; антиоксидантная способность; автоматическое измерение; FRAP; свободные радикалы; окислительный стресс; общая антиоксидантная способность Введение Реактивные формы кислорода (ROS) образуются в ходе метаболических и физиологических процессов, и вредные окислительные реакции могут происходить в организмах, которые удаляют их с помощью ферментативных и неферментативных антиоксидантных механизмов. При определенных условиях увеличение количества оксидантов и уменьшение количества антиокс идантов невозможно предотвратить, и окислительный или антиокислительный баланс смещается в сторону окислительного статуса. В результате развивается окислительный стресс, который связывают с более чем 100 заболеваниями [1]. Молекулы антиоксидантов предотвращают или ингибируют эти вредные реакции [2]. Концентрация различных антиоксидантов в сыворотке (или плазме) может быть измерена в лабораториях отдельно, но эти измерения требуют много времени, трудоемки, затратны и требуют сложных методик. Поскольку измерение * Факс: +90-414-3151181. Адрес электронной почты: erelozcan@hotmail.com. Если измерение различных антиоксидантных молекул по отдельности нецелесообразно, а их антиоксидантные эффекты аддитивны, то измеряется общая антиоксидантная способность образца, которая называется общей антиоксидантной способностью (ОАС) [3], общей антиоксидантной активностью (ОАА) [4], общей антиоксидантной силой (ОАС) [5,6], общим антиоксидантным статусом (ОАС) [7], общим антиоксидантным ответом или другими синонимами. Для измерения TAC были разработаны различные методы [3-13]. В этих методах, как правило, в ходе анализа генерируется один из типов радикалов и измеряется антиоксидантная активность образца по отношению к этому радикалу. Наиболее широко используются колориметрические методы на основе 2,2V-азинобис(3-этилбензо-тиазолин-6-сульфоната) (ABTS.+ ), в которых бесцветная молекула восстановленного ABTS окисляется до характерного сине-зеленого ABTS.+ . При смешивании окрашенного ABTS.+ с любым веществом, которое может быть окислено, он снова восстанавливается до исходной бесцветной формы ABTS, а прореагировавшее вещество, наоборот, окисляется. Эта особенность является основным принципом методов, использующих ABTS. 0009-9120/$ - см. переднюю панель D 2004 Канадское общество клинических химиков. Все права защищены. doi:10.1016/j.clinbiochem.2003.11.015 278 O. Erel / Clinical Biochemistry 37 (2004) 277-285 Согласно описанным методам, восстановленные молекулы ABTS окислялись различными агентами. В некоторых исследованиях для окисления молекул ABTS использовались различные окислители, такие как персульфат калия [8], MnO 2[14] и 2,2V-азо-бис(2аминопропан) (ABAP) радикалы [15]. В некоторых исследованиях для окисления молекул ABTS использовались пары, включающие перекись водорода и фермент пероксидазу [16] или неферментативный пероксидазный агент, такой как метмиоглобин [3]. Насколько мне известно, ни один пероксидазный агент, кроме перекиси водорода, не использовался для окисления молекул ABTS. В данном исследовании я создал более стабильный ABTS.+ с очень долгим сроком жизни без использования каких-либо пероксидазных агентов, помимо перекиси водорода. Согласно литературе, это первый случай, когда это было достигнуто. В первом разработанном колориметрическом методе на основе ABTS метмиоглобин реагирует с перекисью водорода с образованием радикала ferrylmetmyoglobin. Этот радикал окисляет молекулу ABTS до ABTS.+ , и возникает характерная окраска. Антиоксиданты подавляют развитие окраски [3]. Однако время жизни рабочего реагента невелико (48 ч при 4jC), а коммерчески доступный набор стоит дорого. Кроме того, разбавление образцов сыворотки приводит к ложноположительным результатам [12]. Более быстро реагирующие антиоксиданты могут способствовать уменьшению радикала феррилмиоглобина, что может привести к положительной интерференции [17]. Кроме того, гемоглобин и пероксиды создают дополнительную окраску и приводят к отрицательным результатам [17]. вмешательство в анализ. Новые версии методов на основе ABTS являются дополнительными. В этих методах ABTS.+ образуется до добавления образца [8]. Несмотря на то что существует множество сообщений об использовании пост-добавочных методов для измерения TAC напитков, фруктовых соков и чистых растворов, недостаточно сообщений об использовании этих методов для измерения TAC сыворотки (плазмы). Целью данного исследования была разработка простого, надежного, чувствительного, автоматизированного и недорогого метода прямого измерения общей антиоксидантной способности с использованием реагентов с длительным сроком службы. Материалы и методы Химикаты Хлорид железа, сульфат железа аммония, витамин С (L(+) аскорбиновая кислота), аскорбат-оксидаза, билирубин, мочевая кислота, восстановленный глутатион (GSH), (F)-катехин, 2,4,6-трипиридил-S- триазин (TPTZ), этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 2,2V-азино-бис(3-этилбенз-тиазолин-6сульфокислота) (ABTS), перекись водорода, персульфат калия и цитрат натрия были приобретены у компаний Sigma и Merck Co. Водорастворимый аналог витамина Е (тролокс; 6-ги-рокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2карбоновая кислота) был получен от Sigma-Aldrich Chemical Co. Все химические вещества были стабильными в течение длительного времени. 279 При разбавлении более концентрированным ацетатным буферным раствором при высоких значениях рН (ацетатный буфер 0,4 моль/л рН 5,8) происходит самопроизвольное и медленное обесцвечивание. Антиоксиданты, присутствующие в образце O. Erel / Clinical Biochemistry 37 (2004) 277-285 Использовалась ультрачистая вода и деионизированная вода I типа. Образцы Этот новый метод измерения может быть применен к широкому спектру сложных биологических жидкостей, включая сыворотку, плазму, семенную плазму, спинномозговую, плевральную и асцитическую жидкости, мочу, простые и гетерогенные растворы чистых антиоксидантов, напитки и фруктовые соки. Образцы крови Образцы крови были получены от здоровых людей, которые наблюдались в нашей поликлинике и банке крови, и от пациентов с глубокой депрессией, которым диагноз был поставлен специалистами-психиатрами в нашей больнице. Все пациенты не получали психотропных препаратов в течение не менее 2 месяцев. Из исследования исключались пациенты с наркоманией или зависимостью, серьезными медицинскими заболеваниями, тяжелой черепномозговой травмой или судорожными расстройствами. Здоровые испытуемые не принимали никаких лекарств в течение не менее 2 месяцев до забора крови. Обе группы состояли из некурящих людей. Перед забором образцов испытуемые постились в течение 12 ч. Они были проинформированы о цели исследования. Полученные образцы венозной крови × центрифугировали при 1500 g в течение 10 мин. Образцы выполнялись сразу или хранились при 80jC. Антиоксиданты Маточные растворы (1,0 ммоль/л) аскорбиновой кислоты, глутатиона и (F)-катехина готовили отдельно в деионизированной воде. Мочевую кислоту и твердый билирубин растворяли в 10 ммоль/л растворе NaOH. Тролокс растворяли в фосфатном буфере (30 ммоль/л pH 7,4). Аппарат Использовались спектрофотометр Cecil 3000 с термостатируемым держателем кювет (Cecil) и автоматический анализатор Aeroset (Abbott). Анализы Новый анализ Принцип действия нового метода измерения Восстановленная молекула ABTS окисляется до ABTS.+ с помощью одной только перекиси водорода в кислой среде (ацетатный буфер 30 ммоль/л pH 3,6). В ацетатном буферном растворе концентрированные (темно-зеленые) молекулы ABTS.+ остаются более 280 O. Erel / Clinical Biochemistry 37 (2004) 277-285 ускоряют скорость отбеливания в степени, пропорциональной их концентрации. Эта реакция может быть проконтролирована спектрофотометрически, а скорость обесцвечивания находится в обратной зависимости от TAC образца. Скорость реакции калибруется по тролоксу, который широко используется в качестве традиционного стандарта для измерения TAC, а результаты анализа выражаются в ммоль тролокс-эквивалента/л. Реагенты для анализа Реагент 1 0,4 моль/л ацетатного буферного раствора (pH 5,8). получали следующим образом: 32,8 г CH3 COONa растворили в 1000 мл деионизированной воды (конечная концентрация: 0,4 моль/ л). Реагентную ледяную уксусную кислоту (22,8 мл) разбавили до 1000 мл деионизированной водой (конечная концентрация: 0,4 моль/л). Раствор ацетата натрия (940 мл) смешивали с 60 мл раствора уксусной кислоты под рНметром; рН уксусная кислота - ацетатный буфер натрия составляла 5,8. Буферный раствор был стабилен в течение как минимум 6 месяцев при температуре 4jC. Реагент 2 Ацетатный буферный раствор 30 ммоль/л, pH 3,6, готовили следующим образом: 2,46 г CH3 COONa растворяли в 1000 мл деионизированной воды (конечная концентрация: 30 ммоль/л). Ледяная уксусная кислота реактивного качества (1,705 мл) была разбавлена до 1000 мл деионизированной водой (конечная концентрация: 30 ммоль/л). Раствор ацетата натрия (75 мл) смешивали с 925 мл раствора уксусной кислоты под рН-метром; рН уксусно-кислотно-ацетатного буфера составлял 3,6. Затем 278 Al коммерческого раствора H O22 (35%, Merck) разбавили до 1000 мл буферным раствором (конечная концентрация - 2 ммоль/л). Затем 0,549 г ABTS растворили в 100 мл приготовленного раствора (конечная концентрация 10 ммоль/л). Через 1 ч инкубации при комнатной температуре появился характерный цвет ABTS.+ . Окраска реагента была стабильной в течение не менее 6 месяцев при температуре 4jC. Автоматизированное измерение После ручной спектрофотометрической оптимизации метод был применен на автоматическом анализаторе (Aeroset). Формат теста представлен ниже. Реагент 1 моль/л pH 5,8). Объем пробы объем200 Al (Реагент 1: ацетатный буфер 0,4 Al (сыворотка или другие жидкости, чистые или комплексные растворы антиоксидантов). объем20 Al (Реагент 2: ABTS.+ в ацетатном буфере 30 ммоль/л pH 3,6). Длина волны660 нм (или другая длина волны пика 420 и 740 нм, как показано на рис. 1). Точка считывания Первая абсорбция анализа берется досмешивания R1 и R2 (в качестве холостого образца), а последняя абсорбция берется в конце периода инкубации (через 5 минут после смешивания). Тип калибровки Линейная Реагент 2 Методы измерения способности общей 281 кислоты и общего билирубина в сыворотке крови определяли с помощью коммерческих наборов (Abbott) на автоматическом анализаторе (Aeroset, Abbott). O. Erel / Clinical Biochemistry 37 (2004) 277-285 антиоксидантной Методы измерения, основанные на обесцвечивании катион-радикала ABTS Анализ антиоксидантной емкости, эквивалентной тролоксу (Randox-TEAC; Randox-TAS). Автоматизированный анализ TEAC проводился на автоматическом анализаторе Aeroset (Abbott) с использованием коммерчески доступных наборов (Total Antioxidant Status, Ran- dox Laboratories). Поэтому в данном исследовании его иногда называли анализом Randox- TAS. В этом анализе 2,2V-азинобис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат) (ABTS) инкубируется с метмиоглобином и перекисью водорода с образованием ABTS.+ . Этот вид имеет сине-зеленый цвет. Антиоксиданты, присутствующие в образце, вызывают снижение поглощения пропорционально их концентрации. Значение TAC тестируемых образцов выражается как эквивалент миллимолярной концентрации раствора Тролокса [3,12]. Усовершенствованный анализ обесцвечивания катион-радикала ABTS (пост-добавочный анализ). ABTS растворяли в воде до концентрации 7 ммоль/л. ABTS.+ получали путем реакции исходного раствора ABTS с 2,45 ммоль/л персульфата калия (конечная концентрация) и выдерживали смесь в темноте при комнатной температуре в течение 12 - 16 ч перед использованием. Для исследования образцов исходный раствор ABTS.+ разбавляли фосфатнобуферным солевым раствором 5 ммоль/л, pH 7,4 до абсорбции 0,70 при 734 нм. После добавления 1,0 мл разбавленного ABTS.+ к 10 Al образца, показания абсорбции снимали через 5 минут после первоначального перемешивания [8]. Обесцвечивание теста происходило линейно с увеличением концентрации тролокса. Анализ восстановительной способности плазмы (восстановительная/антиоксидантная сила железа) (FRAP). Анализ FRAP, разработанный Benzie и Strain [5,6], проводили, как описано ранее. Вкратце, 1,5 мл рабочего, предварительно подогретого до 37jC FRAP-реагента (10 объемов 300 ммоль/л ацетатного буфера, pH 3,6 + 1 объем 10 ммоль/л 2,4,6трипиридил-S-триазина в 40 ммоль/л HCl + 1 объем 20 ммоль/л FeCl3 ) смешивали с 50 Al тестового образца и стандартов. Все перемешивалось вихревым методом, и через определенное время после смешивания образца и реагента считывалась абсорбция при 593 против холостого реагента. Тест проводился при 37jC, использовалось время реакции от 0 до 4 минут. Конечные результаты выражены в ммоль тролокс-эквивалента/л. Измерение концентрации альбумина, общего белка, мочевой кислоты и билирубина в образцах сыворотки крови Концентрацию альбумина, общего белка, мочевой Измерение концентрации восстановленного аскорбата в образцах плазмы крови Концентрацию восстановленного аскорбата в плазме крови определяли методом FRASC с использованием аскорбат-оксидазы [6]. 282 O. Erel / Clinical Biochemistry 37 (2004) 277-285 Статистический анализ Тест Стьюдента, корреляционный анализ и линейный регрессионный анализ проводились с помощью программы SPSS for Windows Release. 9.5 (SPSS Inc.). Результаты Оптимизационные исследования Тип, молярность и pH буферных растворов, используемых в анализе Молекулы ABTS могли окисляться до ABTS.+ только в ацетатном буфере при низких значениях pH и при наличии достаточного количества пероксида водорода. При высоких значениях рН окисление не происходило. В ацетатном буфере с самыми низкими значениями pH время жизни образующегося ABTS.+ было самым продолжительным (не менее 6 месяцев при 4jC). Восстановление (обесцвечивание; отбеливание) ABTS.+ можно проводить с использованием ацетатного буфера при высоких значениях pH. Максимальная скорость восстановления наблюдалась при использовании ацетатного буфера с самым высоким значением pH. Оптимальное значение pH ацетатного буфера для получения ABTS.+ было следующим 3,6 и 5,8 для восстановительных процессов. С другой стороны, концентрация ацетатного буфера для окислительного процесса составляла 30 ммоль/л, а для восстановительного - 400 ммоль/л. Соотношение объемов ацетатного буфера (0,4 моль/л)/ацетатного буфера (30 ммоль/л) в анализируемой среде составляло 200/20. Оптимизация концентраций ABTS и перекиси водорода Второй реагент был разбавлен в 21 раз реагентом 1 в реакционной среде; поэтому для получения достаточной абсорбции ABTS использовался в концентрации 10 ммоль/л, а соотношение 1/5 было оптимальным для [пероксид водорода]/[ABTS]. При таком соотношении не наблюдалось помех, связанных с гемолизом или ионами железа. Спектральные анализы Спектры поглощения ABTS.+ и его восстановленной формы (ABTS) приведены на рис. 1. Как видно из рисунка, максимумы поглощения наблюдаются при 420, 740 и 666 нм. Кинетика реакции холостого опыта и различных образцов сыворотки крови Кинетика реакции, проведенной в автоматическом анализаторе, для холостых образцов и образцов сыворотки крови здорового человека, здоровой беременной женщины и младенца с неонатальным физиологическим иктеритом приведена на рис. 2. Кинетика реакции и дозозависимые характеристики чистых антиоксидантов Кинетика реакции и характеристики некоторых эндогенных и экзогенных антиоксидантов, а именно тролокса (водорастворимого аналога витамина Е), витамина С, восстановленного глюта-. O. Erel / Clinical Biochemistry 37 (2004) 277-285 Рис. 1. Спектры поглощения катион-радикала ABTS и его в о с с т а н о в л е н н о й формы. тиона (GSH), билирубина, мочевой кислоты и (F)катехина. Дозо-ответные характеристики чистых растворов антиоксидантов представлены на рис. 3. Антиокислительное действие витамина С, тролокса и (F)-катехина проявлялось быстро и завершалось в начале реакции. Антиокислительный эффект GSH завершался позже, чем у тролокса и витамина С. Антиокислительный эффект билирубина и мочевой кислоты завершался позже, чем у GSH (рис. 4). Линейность Проводились серийные разведения раствора тролокса. Верхний предел линейности в анализе составил 6,0 ммоль тролокс-эквивалента/л. При регрессионном анализе значение r составило 1,000 (P < 0,001 Sy/x = 0,023), наклон - 6,870 (P < 0,001 Sy/x = 0,019), а перехват составил -4,814 (P < 0,001 Sy/x = 0,021). Кроме того, уменьшая соотношение объемов образца, можно увеличить верхний предел линейности. Аналитическое восстановление Процентное восстановление нового метода определялось путем добавления 1 ммоль/л витамина С к образцам сыворотки. Среднее процентное восстановление добавленного витамина С составило 98 - 101 %. Аналитическая чувствительность Аналитическая чувствительность, представляющая собой наклон калибровочной линии, составила 0,207 Абсорбция / [Сумма], [AX (ммоль/л) ].—1 Нижний предел обнаружения Предел обнаружения метода определялся путем 10кратной оценки нулевого калибратора. Предел обнаружения, 283 284 O. Erel / Clinical Biochemistry 37 (2004) 277-285 Рис. 2. Кинетика реакции для различных образцов сыворотки крови. определенное как среднее значение TAC нулевого калибратора + 3 SD, составило 0,04 ммоль тролоксэквивалента/л. Точность Чтобы определить точность нового метода, я проанализировал три уровня сывороток. Пул сывороток с высоким уровнем TAC был получен из образцов младенцев с неонатальным иктеритом. Пул сывороток со средним уровнем TAC был получен от здоровых людей. Пул сывороток с низким уровнем TAC был получен от нормальных беременных женщин. Внутри- и межсерийная точность, рассчитанная для каждого из трех пулов сывороток, представлена в таблице 1. На TAC сыворотки не влияли хранение при 4jC в течение 1 дня или при -80jC в течение 3 месяцев. Помехи Гемолиз и билирубин не мешали анализу, как и гепарин, ЭДТА, цитрат и оксалат. Значения TAC Рис. 4. Скорости уменьшения поглощения при 660 нм растворов индивидуальных антиоксидантов (1,0 ммоль/л) и образца сыворотки (после вычитания холостого реагента). в образцах плазмы крови были на 12 % выше, чем в образцах сыворотки крови у тех же людей. Разница между значениями ПВР в плазме и сыворотке достоверно коррелировала с разницей между уровнями общего белка в образцах плазмы и сыворотки (r = 0,63, P = 0,02; n = 21). Известно, что фибриноген, являющийся белком, присутствует только в плазме, но не в сыворотке, и было показано, что фибриноген обладает антиоксидантной активностью [18]. Разница между значениями TAC в сыворотке и плазме может быть обусловлена фибриногеном. Влияние липемии изучалось путем смешивания образца с повышенными уровнями триглицеридов и TAC пропорционально образцу с низкими концентрациями триглицеридов и TAC. Концентрация триглицеридов до 15,8 ммоль/л (1400 мг/дл) не влияла на восстановление. Образцы уремической плазмы не мешали проведению анализа. Разбавление Разбавление сыворотки не повлияло на результаты нового анализа. Сообщалось, что разбавление сыворотки растворов некоторых эндогенных и экзогенных антиоксидантов. Рис. 3. Дозо-ответные характеристики чистых антиоксидантных O. Erel / Clinical Biochemistry 37 (2004) 277-285 Таблица 1 Данные о внутри- и межсерийной прецизионности сыворотки, полученной с помощью нового метода метод Номер Измерение в пределах партии Высокий 20 Средний 20 Низкий 20 Межсерийные дни Высокий 20 Средний 20 Низкий 20 Среднее значение (ммоль тролоксэквивалент/л) SD CV (%) 2.05 0.026 1.3 1.76 1.22 0.026 0.031 1.4 2.5 2.13 1.75 1.21 0.031 0.029 0.035 1.5 1.6 2.9 285 286 O. Erel / Clinical Biochemistry 37 (2004) 277-285 Таблица 2 Относительная антиоксидантная активность отдельных антиоксидантов и их предполагаемый вклад в общую антиоксидантную способность (ОАС) свежей постной сыворотки Антиоксидант Относит Сыворотка Оценка ельно компонент деятельн концентрация вклад в ость сыворотка TAC (Амоль/л) сыворотки крови (ммоль тролокса эквивалент/л) -СН Мочевая кислота Витамин C Билирубин общий Витамин Е Другие Всего Оценка вклад в TAC из сыворотка (%) 2.20 1.85 303 - 525 150 - 470 0.91 0.57 52.9 33.1 1.35 3.80 28 - 85 3 - 17 0.08 0.04 4.7 2.4 1.000 12 - 45 0.03 0.09 1.72 1.7 5.2 100 образцы давали увеличение до 15% по результатам анализа Randox-TAS [12]. Относительная антиоксидантная активность антиоксидантных компонентов сыворотки крови и их предполагаемый вклад в TAC Относительная антиоксидантная активность отдельных антиоксидантов и их предполагаемый вклад в TAC свежей постной сыворотки представлены в таблице 2. Как видно из таблицы, основными антиоксидантными компонентами сыворотки были общий белок и мочевая кислота. Взаимосвязь между новым методом, другими методами измерения TAC и антиоксидантными компонентами образцов сыворотки (и плазмы). Как видно из таблицы 3, уровень TAC в сыворотке крови, измеренный новым методом, значительно коррелировал с уровнем мочевой кислоты и общего белка в сыворотке крови в группе здоровых (n = 25). Новый анализ также значительно коррелировал с анализом Randox-TAS, улучшенным анализом обесцвечивания ABTS.+ и анализом FRAP. Новый анализ положительно коррелировал с уровнем билирубина и сниженным уровнем аскорбата, но не значительно. Рис. 5. Взаимосвязь между значениями TAC в сыворотке крови, измеренными новым методом и первым анализом на основе ABTS.+ (Randox-TAS). С другой стороны, для определения взаимосвязи между новым методом и анализом Randox-TAS, улучшенным анализом обесцвечивания ABTS.+ , анализом FRAP, а также уровнем общего белка и мочевой кислоты в образцах сыворотки, полученных от пациентов, отобранных таким образом, чтобы включить широкий спектр патологических состояний, были проведены исследования (рис. 5-7). Корреляции между измеряемыми параметрами в смешанной группе пациентов были аналогичны таковым в группе здоровых. Контрольный интервал Для определения референсного интервала для TAC в сыворотке крови были проанализированы образцы сыворотки 113 здоровых людей (56 женщин, 57 мужчин, 17-45 лет). Референсный диапазон составил 1,49 - 1,97 ммоль тролокс-эквивалента/л. Таблица 3 Взаимосвязь между новым методом, другими использованными методами измерения общей антиоксидантной емкости и антиоксидантными компонентами образцов сыворотки (и плазмы) здоровых людей Анализ Randox-TAS Улучшенный анализ FRAP-анализ обесцвечивания ABTS Общий белок Мочевая кислота Билирубин общий Витамин C r = 0.511, P < 0.011; n = 25 r = 0.348 P = 0.088; n = 25 r = 0.774, r = 0.871, P < 0.0001; n = 25 r = 0.901, P < 0.0001; n = 25 r = 0.559, r = 0.05, P = 0.812; n = 25 r = 0.038, P = 0.857; n = 25 r = 0.012, r = 0.091, P = 0.665; n = 25 r = 0.128, P = 0.541; n = 25 r = 0.017, .+ Новый метод Анализ Randox-TAS Улучшенный ABTS.+ r = 0.902, P < 0.0001; n = 25 r = 0.773, P < 0.0001; n = 25 r = 0.621, P = 0.001; n = 25 r = 0.853, P < 0.0001; n = 25 r = 0.847, P < 0.0001; n = 25 r = 0.575, анализ на обесцвечивание O. Erel / Clinical Biochemistry P = 0.003;37 (2004)P 277-285 < 0.0001; P = 0.004; P = 0.959; 287 P = 0.939; n = 25 n = 25 r = 0.919 P < 0.0001; n = 25 n = 25 r = 0.228, P = 0.273; n = 25 n = 25 r = 0.036, P = 0.863; n = 25 FRAP-анализ r = коэффициент корреляции, P = значимость, n = количество испытуемых. n = 25 r = 0.167, P = 0.424; n = 25 288 O. Erel / Clinical Biochemistry 37 (2004) 277-285 используемые колориметрические методы измерения TAC. Существует две основные версии методов на основе ABTS .+[3,8]. Первый Рис. 6. Взаимосвязь между новым методом и улучшенным анализом обесцвечивания катион-радикала ABTS. Результаты исследования здоровых людей и пациентов с глубокой депрессией Не было выявлено существенных различий в возрасте, индексе массы тела (ИМТ) и соотношении женщин и мужчин между пациентами с глубокой депрессией и здоровыми людьми. Уровень TAC в сыворотке крови у пациентов с депрессией был ниже, чем у здоровых людей (1,69 F 0,11 ммоль тролокс-эквивалента/л n = 30, 1,75 F 0,08 ммоль тролокс-эквивалента/л n = 30; P = 0,041, соответственно). Наблюдалась обратная зависимость между длительностью заболевания и ПВР (r = -0,387), но корреляция не была статистически значимой (P = 0,154). Обсуждение Были разработаны различные методы измерения общего антиоксидантного статуса, но до сих пор не существует общепринятого эталонного метода. Еще не приняты окончательные решения в отношении стендовардизаций, используемых терминов и единиц измерения. Это означает, что данная тема нуждается в дальнейшем изучении. И действительно, в последние два десятилетия исследовательские работы в этой области активизировались. Наиболее широко используемыми методами измерения TAC являются колориметрический, флуоресцентный и хемилюминесцентный [10-12]. Методы флуоресценции и хемилюминесценции требуют сложной техники, и в большинстве рутинных клинических биохимических лабораторий такие усовершенствованные системы отсутствуют. Методы на основе ABTS.+ - наиболее часто O. Erel / Clinical Biochemistry 37 (2004) 277-285 версия широко используется в последнее десятилетие. В этом методе используются два реагента. Первый реагент содержит ABTS и метмиоглобин, второй - перекись водорода. Образец добавляют к реагенту 1, а затем добавляют реагент 2. Образуется радикал феррилмиоглобин, который окисляет бесцветную восстановленную молекулу ABTS и тем самым приводит к появлению характерного сине-зеленого цвета. Антиоксиданты подавляют образование окраски, поскольку они восстанавливают ABTS.+ . В настоящее время этот метод выпускается в виде коммерческого набора компанией Randox. По этой причине некоторые исследователи называют его Randox-TAS или Randox-TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) assay [12]. Последний метод представляет собой усовершенствованный (пост-добавочный) метод, в котором катион-радикал ABTS генерируется непосредственно в стабильной форме до реакции с предполагаемыми антиоксидантами. Хотя сообщалось, что результаты, полученные с помощью усовершенствованного метода, не всегда могут быть напрямую сопоставимы с результатами анализа Randox-TAS [8], в данном исследовании было показано, что результаты обоих методов значительно коррелируют с результатами нового метода у здоровых людей и в смешанной группе (табл. 3, рис. 5 и 6). Другим широко используемым колориметрическим методом измерения TAC является FRAP-анализ [5,6]. В этом методе бесцветный комплекс Fe3+ - TPTZ под действием антиоксидантов восстанавливается до синего комплекса Fe2+ -TPTZ. Антиоксидантное действие мочевой кислоты, билирубина, витамина С, тролокса и полифенолов заметно, но влияние белков слабое, поэтому уровни TAC в образцах сыворотки, измеренные методом FRAP, ниже, чем при использовании метода Randox-TAS. Новый метод также продемонстрировал значительную корреляцию с FRAP-анализом (рис. 7, табл. 3). Это является преимуществом, поскольку, по имеющимся данным, не Рис. 7. Взаимосвязь между значениями TAC в сыворотке крови, измеренными новым методом, и FRAP-анализом (FRAP: железовосстанавливающая способность плазмы). 289 290 O. Erel / Clinical Biochemistry 37 (2004) 277-285 Была обнаружена значительная корреляция между FRAP и Randox-TAS анализами [12]. Референсный диапазон сывороточного TAC меняется от метода к методу, поскольку не существует определенной молекулы-мишени или стандарта анализа. В различных исследованиях для калибровки анализов использовались тролокс [3,8,12], мочевая кислота [4], витамин С [19] и растворы ионов железа [5,6]. Однако тролокс является наиболее широко используемым традиционным стандартом, поэтому в новом методе тролокс был использован в качестве стандарта анализа. При использовании FRAP-анализа референтный диапазон TAC сыворотки крови самый низкий, поскольку этот анализ практически измеряет небелковую общую антиоксидантную способность. Однако белки составляют основной антиоксидантный компонент сыворотки (плазмы). Как видно из таблицы 3, корреляция между уровнем общего белка и FRAP в сыворотке крови была незначительной. В Randox-TAS можно определить антиоксидантное действие билирубина, витамина С, мочевой кислоты, полифенолов и белков, поэтому референсный диапазон для TAC в сыворотке выше, чем в FRAP-анализе, так как учитывается антиоксидантное действие белков. Хотя корреляция между уровнем общего белка в сыворотке крови и значением TAC, измеренным с помощью анализа Randox-TAS, выше, чем у анализа FRAP, она не является статистически значимой (табл. 3). В методе обесцвечивания после добавления ABTS.+ антиоксидантные эффекты белков выражены ярко, а корреляция между уровнем общего белка и уровнем TAC, измеренным методом после добавления, в образцах сыворотки крови значительна. Новый метод более чувствителен для определения антиоксидантного действия билирубина, мочевой кислоты, витамина С, полифенолов и белков. Антиокислительный эффект восстановленного глутатиона выше, чем у тролокса в новом методе (рис. 3, табл. 2), а также обнаружены значительные корреляции между уровнем TAC и общего белка в сыворотке крови в здоровой и смешанной группах. Таким образом, уровень TAC в сыворотке крови, измеренный новым методом, выше, чем в анализах Randox-TAS и FRAP. Время реакции анализа RandoxTAS короче, чем у нового метода. Если сократить время реакции нового метода, то полученные результаты приблизятся к результатам анализа RandoxTAS, но при этом условии количество антиоксидантной емкости не будет соответствовать истинному значению TAC. Скорость антиокислительной активности белков не такая быстрая, как у тролокса. Тем не менее, тролокс используется в качестве традиционного стандарта для измерения TAC. В анализе Randox-TAS общее время реакции примерно в два раза меньше, чем в новом методе. Сыворотка содержит большое количество белков, которые являются основным антиоксидантным компонентом сыворотки. Это может объяснить, почему в новом методе TAC сыворотки выше, чем в анализах Randox-TAS и FRAP. С другой стороны, результаты недавно разработанных методов [4,9] выше, чем у Randox-TAS и FRAP. Сыворотка содержит различные антиоксидантные молекулы. Белки являются основным антиоксидантным компонентом сыворотки. Свободные сульфгидрильные группы белков в основном ответственны за их антиоксидативное действие. На практике свободные сульфгидрильные группы сыворотки относятся к белкам, поскольку концентрация их в сыворотке... 291 немного. На сегодняшний день в этой области опубликовано всего три статьи [26-28]. Maes et al. [26] обнаружили, что уровень витамина Е, минорного компонента TAC плазмы, был низким; Srivastava et al. [27] обнаружили снижение удельной активности глутатионпероксидазы, антиоксидантного фермента; Bilici et al. [28] обнаружили, что уровень малондиальдегида (МДА), индикатора окислительного стресса эритроцитов, был высоким у пациентов с большой депрессией. O. Erel / Clinical Biochemistry 37 (2004) 277-285 Вклад линолевой кислоты, которая также имеет -SHгруппы, в общий уровень свободных сульфгидрилов в сыворотке очень низок, и его можно не учитывать. Было подсчитано, что общий белок вносит 52,9 % в измеренный уровень TAC в сыворотке крови здоровых людей (табл. 2). Антиоксидантная роль витамина С хорошо известна. В данном исследовании было установлено, что витамин С составлял около 4,7 % от измеренного уровня TAC в сыворотке крови здоровых людей (табл. 2). В течение многих лет желчный пигмент билирубин считался токсичным продуктом, образующимся при катаболизме гема. Однако более поздние исследования показали, что он является сильным физиологическим антиоксидантом, который может обеспечивать важную защиту от атеросклероза, ишемической болезни сердца и воспаления [20]. Также было высказано предположение, что билирубин может играть особенно важную роль в защите новорожденного от окислительного повреждения [21]. В данном исследовании было показано, что билирубин является сильной антиоксидантной молекулой (рис. 3, табл. 2) и составлял около 2,4 % от измеренного уровня TAC в сыворотке крови здоровых людей (табл. 2). Мочевая кислота является мощным антиоксидантом, обладающим радикальной и восстановительной активностью. Ее концентрация в плазме крови почти в 10 раз выше, чем у других антиокси- дантов, таких как витамин С или витамин Е [13,22]. Как видно из рис. 3 и табл. 2, антиоксидантная активность мочевой кислоты выше, чем у витамина С и тролокса. Мочевая кислота составляет около 33,1 % от общего количества TAC в сыворотке крови, измеренного новым методом у здоровых людей (табл. 2). Доказана защитная роль чая, фруктов и овощей, богатых антиоксидантными полифенольными соединениями, против рака и атеросклероза [23,24]. Количество исследований в этой области растет все быстрее. Было показано, что однократный прием чая увеличивает общую антиоксидантную способность плазмы [25]. В данном исследовании была определена антиоксидантная активность (F)-катехина, который в изобилии присутствует в чае, и проведено сравнение с другими известными антиоксидантами. Было показано, что антиоксидантная активность (F)катехина была выше, чем у витамина С, тролокса, билирубина, мочевой кислоты и GSH (рис. 3). Как видно из рис. 4, скорость антиоксидантной активности витамина С, тролокса и катехина была быстрой, и их антиоксидантное действие завершалось в течение первой минуты. Скорость антиоксидантной активности GSH была средней, а его антиоксидантный эффект завершался в течение 3 минут. Скорость антиоксидантной активности мочевой кислоты и билирубина была невысокой, но их антиоксидантный эффект завершался в течение 5 мин. Исследований, посвященных оксидативному или антиоксидантному статусу пациентов с депрессией, 292 O. Erel / Clinical Biochemistry 37 (2004) 277-285 депрессия. Насколько нам известно, нет ни одного сообщения, в котором бы приводились данные о TAC сыворотки (плазмы) крови у пациентов с большой депрессией. Наши результаты являются первыми, опубликованными на эту тему. Полученные нами результаты подтверждают предыдущие сообщения. В них говорится о том, что у пациентов с депрессией наблюдается дефицит некоторых компонентов антиоксидантного статуса и окислительное повреждение. Мы установили, что у пациентов снижается уровень TAC. Можно сделать вывод, что пациенты подвержены окислительному стрессу, и это может играть определенную роль в этиопатогенезе заболевания. В лечении заболевания может быть рассмотрено добавление антиоксидантных витаминов, таких как витамин С и витамин Е. Новый анализ является быстрым, простым, стабильным, надежным, чувствительным, недорогим и полностью автоматизированным. Разработанный метод обладает высокой линейностью и высокой воспроизводимостью результатов. Реагенты просты в приготовлении и долговечны. Гемоглобин, билирубин, ЭДТА, цитрат и оксалат не мешают разработанному анализу и могут быть использованы для измерения TAC. Ссылки [1] Халливелл Б., Гуттеридж Дж. М. К. Свободные радикалы в биологии и медицине. Третье изд. Оксфорд: Oxford Science Publications; 2000. p. 617 - 24. [2] Янг И.С., Вудсайд Дж.В. Антиоксиданты в здоровье и болезни. J Clin Pathol 2001;54:176 - 86. [3] Miller NJ, Rice-Evans C, Davies MJ, Gopinathan V, Milner A. Новый метод измерения антиоксидантной емкости и его применение для мониторинга антиоксидантного статуса у недоношенных новорожденных. Clin Sci 1993;84:407 - 12. [4] Koracevic D, Koracevic G, Djordjevic V, Andrejevic S, Cosic V. Метод измерения антиоксидантной активности в жидкостях человека. J Clin Pathol 2001;54(5):356 - 61. [5] Benzie IF, Strain JJ. Восстанавливающая способность плазмы железа (FRAP) как мера "антиоксидантной силы": анализ FRAP. Anal Biochem 1996;239:70 - 6. [6] Benzie IF, Strain JJ. Анализ восстановительной/антиоксидантной силы железа: прямое измерение общей антиоксидантной способности биологических жидкостей и модифицированная версия для одновременного измерения общей антиоксидантной способности и концентрации аскорбиновой кислоты. Methods Enzymol 1999;299:15 - 27. [7] Райс-Эванс С, Миллер Н.Дж. Общий антиоксидантный статус в плазме и жидкостях организма. Methods Enzymol 1994;234:279 93. [8] Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. Антиоксидантная активность с использованием улучшенного анализа обесцвечивания катион-радикала ABTS. Free Radic Biol Med 1999;26:1231 - 7. [9] Кампа М, Нистикаки А, Цаусис В, Малиараки Н, Нотас Г, Кастанас E. Новый автоматизированный метод определения общей антиоксидантной способности (ОАС) плазмы крови человека, основанный на анализе отбеливания кроцином. BMC Clin Pathol 2002;28(2):3. [10] Schlesier K, Harwat M, Bo¨hm V, Bitsch R. Оценка антиоксидантов [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] активность с помощью различных методов in vitro. Free Radic Res 2002; 36(2):177 - 87. Janaszewska A, Bartosz G. Определение общей антиоксидантной способности: сравнение четырех методов применительно к плазме крови человека. Scand J Clin Lab Invest 2002;62(3):231 6. Prior RL, Cao G. In vivo общая антиоксидантная способность: сравнение различных аналитических методов. Free Radic Biol Med 1999;27:1173 - 81. Ghiselli A, Serafini M, Natella F, Scaccini C. Общая антиоксидантная способность как инструмент оценки окислительно-восстановительного статуса: критический взгляд и экспериментальные данные. Free Radic Biol Med 2000;29(11):1106 - 14. Miller NJ, Sampson J, Candeias LP, Bramley PM, Rice-Evans CA. Антиоксидантная активность каротинов и ксантофиллов. Fed Eur Bio- chem Soc Lett 1996;384:240 - 2. Campos AM, Escobar J, Lissi EA. Общий реактивный антиоксидантный потенциал (TRAP) и общая антиоксидантная реактивность (TAR) экстрактов Ilex paraguayensis и красного вина. J Braz Chem Soc 1996;7: 43 - 9. Laight DW, Gunnarsson PT, Kaw AV, Anggard EE, Carrier MJ. Физиологический микроанализ общего антиоксидантного статуса плазмы в модели эндотелиальной дисфункции у крыс после экспериментального оксидантного стресса in vivo. Environ Toxicol Pharmacol 1999;7:27 - 31. Strube M, Haenen GR, Van Den Berg H, Bast A. Pitfalls in a method for assessment of total antioxidant capacity. Free Radic Res 1997; 26(6):515 - 21. Каплан IV, Аттаэльманнан М, Левинсон СС. Фибриноген антиокс идант, защищающий липопротеины в физиологических концентрациях в бесклеточной системе. Atherosclerosis 2001;158:455 - 63. Киршбаум Б. Общая антиоксидантная способность мочи. Clin Chim Acta 2001; 305:167 - 73. Майер М. Ассоциация концентрации билирубина в сыворотке крови с риском развития ишемической болезни сердца. Clin Chem 2000;46:1723 - 7. Gopinathan V, Miller NJ, Milner AD, Rice-Evans CA. Билирубин и антиоксидантная активность аскорбата в плазме новорожденных. FEBS Lett 1994; 349(2):197 - 200. Sevanion A, Davies KJ, Hochstein P. Сывороточный урат как антиоксидант для аскорбиновой кислоты. Am J Clin Nutr 1991;54:1129 - 34. Benzie IF, Szeto YT, Strain JJ, Tomlinson B. Потребление зеленого чая вызывает быстрое увеличение антиоксидантной способности плазмы у людей. Nutr Cancer 1999;34(1):83 - 7. Ching S, Ingram D, Hahnel R, Beilby J, Rossi E. Сывороточные уровни микроэлементов, антиоксидантов и общий антиоксидантный статус предсказывают риск развития рака молочной железы в контрольном исследовании. J Nutr 2002;132(2):303 - 6. Leenen R, Roodenburg AJ, Tijburg LBM, Wiseman SA. Разовая доза чая с молоком или без него повышает антиоксидантную активность плазмы крови у людей. Eur J Clin Nutr 2000;54(1):87 - 92. Maes M, Vos ND, Pioli R, Demedts P, Wauters A, Neels H, Christophe A. Более низкая концентрация витамина Е в сыворотке крови при тяжелой д е п р е с с и и . Еще один маркер снижения антиоксидантной защиты при этом заболевании. J Affect Disord 2000;58:241 - 6. Srivastava N, Barthwal MK, Dalal PK, Agarwal AK, Nag D, Seth PK, Srimal RC, Dikhsit M. Исследование оксида азота, hадренергических рецепторов и антиоксидантного статуса в полиморфноядерных лейкоцитах у пациентов с депрессией. J Affect Disord 2002;72:45 - 52. Bilici M, Efe H, Koroglu MA, Uydu HA, Bekaroglu M, Deger O. Антиокислительная активность ферментов и перекисное окисление липидов при большом депрессивном расстройстве: изменения под влиянием антидепрессантов. J Affect Disord 2001;64:43 - 51. O. Erel / Clinical Biochemistry 37 (2004) 277-285 293
