МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ ЯРОСЛАВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ Рекомендуется Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для студентов медицинских вузов РУКОВОДСТВО К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО ЧАСТНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ (для студентов лечебных и педиатрических факультетов высших медицинских учебных заведений) Под редакцией профессора В.А.Романова Ярославль, 2004 УДК 579.61+612.017.1 (076) ББК 52.64 Р85 Руководство к практическим занятиям по частной микробиологии (для студентов лечебных и педиатрических факультетов высших медицинских учебных заведений). Ярославль, 2004 г., с. 211 Ответственный редактор: Романов Виталий Александрович – доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕ, Почетный работник высшего профессионального образования РФ, заведующий кафедрой микробиологии, с вирусологией и иммунологией ЯГМА. Составители: проф. В.А.Романов, проф. Э.В.Малафеева, доц. А.Ю.Дульчевский, доц. Е.Н.Шевьева, старшие преподаватели В.Л.Крылов, А.В.Цветков, асс. Н.В.Романова Достижения современной микробиологии, иммунологии и вирусологии позволили добиться впечатляющих успехов в деле борьбы с инфекциями. Вместе с тем, в области инфекционной патологии возникли новые проблемы, связанные с появлением новых возбудителей (ВИЧ, вирусы гепатитов, прионы и др.), необычным поведением известных микробов (например, коронавирусов), возникновением вспышек экзотических инфекций в цивилизованных странах, угрозой биотерроризма и т.д. Четко обозначилась также роль микроорганизмов в развитии неинфекционных болезней (ассоциация геликобактериозной инфекции с язвенной болезнью желудка и 12-перстной кишки, этиологическая роль вирусов в развитии онкологических заболеваний и т.д.) Прогресс современной биотехнологии позволил создать принципиально новые медико-биологические препараты (вакцины, иммуноглобулины, цитокины и т.д.) на основе новых технологий и существенно усовершенствовать имеющиеся. Успехи генетики вооружили практическую микробиологию полимеразной цепной реакцией, которая за короткий промежуток времени стала лидирующим методом экспресс-диагностики ряда инфекций. В связи с этим освоение студентами вопросов частной медицинской микробиологии на современном уровне является чрезвычайно важным этапом в изучении не только микробиологии, но и смежных дисциплин. Предлагаемое пособие, созданное на основе действующей программы по микробиологии, иммунологии и вирусологии для студентов лечебных, медико-профилактических и педиатрических факультетов (Москва, 2000), позволит студентам ознакомиться с современными методами лабораторной диагностики, профилактики и лечения инфекционных болезней. Наличие перечня вопросов, знаний и умений к каждому занятию, подробное описание методов лабораторной диагностики, самостоятельной работы, существенно облегчит подготовку студентов к практическим занятиям и самостоятельную работу на них. Пособие предназначено для студентов медицинских вузов, а также может быть использовано при подготовке и проведении практических занятий со студентами, аспирантами и преподавателями кафедры микробиологии и кафедр смежных специальностей. Учреждение-разработчик: Ярославская государственная медицинская академия Рецензенты: заведующий кафедрой инфекционных болезней доктор медицинских наук, профессор Н.А.Благов, член-корреспондент РАЕН, заслуженный врач РФ; заведующий кафедрой детских инфекций кандидат медицинских наук, доцент В.П.Киселев, заслуженный врач РФ Рекомендовано к печати: цикловой методической комиссией по морфологическим и патоморфологическим дисциплинам ЯГМА от 20.05. 2004 (протокол № 1); Утверждено и рекомендовано к изданию: Центрально-координационным методическим советом и Редакционно-издательским советом ЯГМА, председатель – профессор Ю.П.Троханов (протокол № 2, от 03.06.2004) Ярославская государственная медицинская академия, 2004 Список сокращений БГКП ВИЧ ГЗТ ЖСА ИР ИФА ИЭМ ИЭФ ЛПС МКАТ МПА МПБ МПК НК ООИ - бактерии группы кишечной палочки - вирус иммунодефицита человека - гиперчувствительность замедленного типа - желточно-солевой агар - изотонический раствор хлорида натрия - иммуноферментный анализ - иммуноэлектронная микроскопия - иммуноэлектрофорез - липополисахарид - моноклональные антитела - мясопептонный агар - мясопептонный бульон - минимальная подавляющая концентрация - нуклеиновая кислота - особо опасная инфекция 2 ОРА – ориентировочная реакция агглютинации на стекле ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция ОРЗ - острое респираторное заболевание ПВ - пептонная вода ПЦР - полимеразная цепная реакция РА - реакция агглютинации РГА - реакция гемагглютинации РИА - радиоиммунный анализ РИФ - реакция иммунофлюоресценции РН - реакция нейтрализации РНГА - реакция непрямой гемагглютинации РП - реакция преципитации РСК — реакция связывания комплемента РТГА — реакция торможения гемагглютинации СПИД— синдром приобретенного иммунодефицита ЦПД — цитопатическое действие CTL — цитотоксические лимфоциты spp. - виды (species) Оглавление 1. Микробиологические методы исследования. Основы клинической микробиологии. Возбудители гнойно-воспалительных и раневых аэробных инфекций. Патогенные кокки: стафилококки, стрептококки, условно-патогенная микрофлора…………….. 2. Возбудители раневой анаэробной инфекции: анаэробной газовой инфекции, столбняка. Бактероиды…………………………………………………………………... 3. Возбудители бактериальных зоонозных инфекций: чумы, туляремии, сибирской язвы……………………………………………………………………………………….. 4. Возбудители бактериальных зоонозных инфекций: бруцеллеза, лептоспироза, боррелиозов, листериоза………………………………………………………………… 5. Микробиология бактериальных кишечных инфекций: сальмонеллы - возбудители брюшного тифа, паратифов и пищевых токсикоинфекций…………………………... 6. Микробиология бактериальных кишечных инфекций: патогенные кишечные палочки, иерсинии, кампилобактерии, геликобактерии…………………………………. 7. Микробиология бактериальных кишечных инфекций: возбудители дизентерии, холеры. Пищевые интоксикации бактериальной природы…………………………… 8. Возбудители бактериальных воздушно-капельных инфекций: дифтерии, коклюша, гемофильной и пневмококковой инфекции……………………………………………. 9. Возбудители бактериальных воздушно-капельных бактериальных инфекций: туберкулеза, менингококковой инфекции и актиномикоза …………………………….. 10. Возбудители бактериальных инфекций, передающихся половым путем: гонореи, сифилиса, бактериального вагиноза, урогенитального хламидиоза и микоплазмоза.. 11. Возбудители риккетсиозов……………………………………………………………… 12. Общая вирусология: морфология и ультраструктура вирусов, методы их культивирования. Экспресс-диагностика вирусных инфекций……………………….. 13. Общая вирусология: диагностика вирусных инфекций. Вирусологический метод исследования. индикация и идентификация вирусов. Серологический метод диагностики вирусных инфекций……………………………………………………………. 14 Вирусы - возбудители гриппа и ОРВИ. Парамиксовирусы - возбудители кори и эпидемического паротита. Вирусы, поражающие кожу и слизистые оболочки (поксвирусы, герпесвирусы). Коронавирусы……………………………………………… 15. Пикорнавирусы. Вирусы гепатитов. Ротавирусы…………………………………….. стр. 5 21 28 41 50 59 69 81 94 105 118 125 131 141 151 3 16 Арбовирусы. Нейровирусы. Онкогенные вирусы. Медленные вирусные инфекции. Ретровирусы……………………………………………………………………………… 158 17. Патогенные грибы. Возбудители глубоких и субкутанных микозов, дерматомикозов, оппортунистич 168 18. Микробиологическая диагностика протозойных инфекций…………………………... 203 4 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ Тема 1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. ОСНОВЫ КЛИНИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ. ВОЗБУДИТЕЛИ ГНОЙНОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И РАНЕВЫХ АЭРОБНЫХ ИНФЕКЦИЙ. ПАТОГЕННЫЕ КОККИ: СТАФИЛОКОККИ, СТРЕПТОКОККИ, УСЛОВНО-ПАТОГЕННАЯ МИКРОФЛОРА. Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей раневой и гнойной инфекции, методов лабораторной диагностики, профилактики и лечения гнойновоспалительных и раневых инфекций. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Цели, задачи и методы клинической микробиологии 2. Проблема госпитальной раневой и гнойной инфекции (характеристика микроорганизмов, вызывающих госпитальную инфекцию, пути передачи, профилактика). 3. Стафилококки. Таксономия. Биологические свойства. Характеристика токсинов и ферментов патогенности. Патогенез стафилококковых инфекций, их роль в развитии госпитальных инфекций. Особенности иммунитета. Методы микробиологической диагностики стафилококковых инфекций. Препараты для специфической профилактики и терапии. 4. Стрептококки. Таксономия. Биологические свойства. Характеристика токсинов и ферментов патогенности. Патогенез стрептококковых инфекций. Особенности иммунитета. Методы микробиологической диагностики стрептококковых заболеваний. 5. Этиологическая и патогенетическая роль стрептококков группы А при респираторных инфекциях, рожистом воспалении, ангине, скарлатине, остром гломерулонефрите, ревматизме, стоматологических заболеваниях, сепсисе и др. 6. Условно-патогенные грамотрицательные бактерии – возбудители раневых и гнойных инфекций, их биологическая характеристика. 7. К л ебси еллы. Их роль в патологии. Характеристика клебсиелл пневмонии, озены, риносклеромы. Микробиологическая диагностика. Проблема специфической профилактики. Этиотропная терапия. 8. Прот еи . Виды. Этиологическая и патогенетическая роль протея при гнойных и смешанных инфекциях, при пищевой токсикоинфекции. Роль во внутрибольничных инфекциях. Микробиологическая диагностика. 9. Псевдомонады. Таксономия. Экология. Резистентность. Синегнойная палочка. Биологические свойства. Факторы патогенности. Патогенность для человека. Роль в возникновении внутрибольничных инфекций. Микробиологическая диагностика. Этиотропная терапия. Ознакомление с правилами взятия материала для микробиологического исследования 1. Материал для исследования берут с соблюдением правил асептики (стерильные инструменты, посуда и т.д.) в ранние сроки инфекции, желательно до начала антимикробной терапии, не допуская, с одной стороны, попадание в него антисептических, дезинфицирующих средств и микроорганизмов внешней среды, а с другой стороны – заражения материалом окружающих лиц и загрязнения предметов окружающей среды. Взятый от больного материал помещают в герметичную посуду, а затем в специальные биксы, металлические пеналы или контейнеры (подвергающиеся затем дезинфекции) и в кратчайшие сроки доставляют в лабораторию. Разрешается непродолжительное хранение исследуемого материала в холодильнике при температуре 40 С или в термостате при температуре 370 С в зависимости от терморезистентности микроорганизма. В ряде случаев отбор материала осуществляется в специальные транспортные среды, жизнеспособность возбудителя в которых поддерживается в результате создания оптимальных условий (влажность, рН, наличие питательных веществ и т.д.). При анаэробной инфекции материал помещают в бескислородные условия (применение сред для анаэробов, емкостей с бескислородной газовой атмосферой). Направление на микробиологиче5 ское исследование пишется на специальном бланке, в котором указываются фамилия, имя, отчество больного, возраст, вид материала, дата взятия, предполагаемый клинический диагноз и другие сведения. 2. Кровь для серологического исследования (5-6 мл) у больного берут натощак из локтевой вены с соблюдением правил асептики. Пробирку с кровью помещают в термостат на 30—60 мин, образовавшийся кровяной сгусток отделяют от стенки стерильной стеклянной палочкой и оставляют в холодильнике на 18—20 ч. Отстоявшуюся сыворотку сливают в стерильную пробирку. Сыворотка не должна быть гемолизированной или содержать примесь эритроцитов и может храниться в стерильных условиях в холодильнике до 1 мес. Длительное хранение осуществляется при температуре от -20 до –700 С или же сыворотки подвергают лиофильной сушке (высушивание в вакууме при низких температурах). 3. Все остатки инфекционного материала уничтожают путем автоклавирования. Более подробная информация о правилах взятия и доставки биологических материалов для микробиологических исследований представлена в приложении. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Методы обнаружения возбудителя инфекции в материале от больного Для обнаружения возбудителя в материале от больного применяют следующие методы: - микроскопические (бактериоскопические, микоскопические, вирусоскопические, направленные соответственно на выявление в исследуемом материале от больного бактерий, грибов, вирусов); - микробиологические (бактериологические, микологические, вирусологические), предполагающие выделение чистой культуры микроорганизма; - биологические (биопробы). Микроскопические методы используют для обнаружения возбудителей (бактерий, грибов, простейших, вирусов) в окрашенных мазках или в нативных препаратах из исследуемого материала с помощью световой микроскопии. Достоинства этого метода состоят в быстроте, простоте и невысокой стоимости, недостатки - в невозможности определения вида микроорганизмов и невысокой чувствительности (не менее 106 микробных клеток в 1 мл или 1 г исследуемого материала). Микроскопический метод имеет, как правило, ориентировочное значение. При некоторых инфекциях (например, при гонорее, микозах и заболеваниях, вызванных простейшими) диагностическая ценность микроскопического исследования высокая, являясь основанием для постановки окончательного диагноза заболевания. Вирусоскопические исследования имеют ограничения, связанные с необходимостью использования дорогостоящего прибора - электронного микроскопа. Для диагностики вирусных инфекций могут применяться цитологические методы, выявляющие внутриклеточные включения в зараженных клетках (например, телец Бабеша-Негри при бешенстве, телец Пашена и Гварниери при оспе или цитомегалических клеток при заболеваниях, вызванных цитомегаловирусом). Микробиологические методы основаны на выделении чистой культуры возбудителя из материала, полученного от больного, с ее последующей идентификацией до уровня вида на основании изучения биологических свойств микроорганизма, а в последнее время по данным методов генодиагностики (гибридизация ДНК, ПЦР). Микробиологические методы отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, являясь «золотым» стандартом при диагностике многих инфекций. Располагая чистой культурой возбудителя, можно определить факторы вирулентности и чувствительность к антибиотикам, что необходимо для рационального выбора этиотропной терапии. Ограничения микробиологического метода могут быть связаны с низкой скоростью размножения возбудителей, требовательностью к условиям культивирования (состав питательных сред, необходимость создания особых условий в зависимости от типа дыхания микроорганизма т.д.), а порой – невозможностью культивирования микроорганизма в искусственных условиях. 6 Для эпидемиологического анализа вспышек инфекционных заболеваний проводят типирование культур возбудителей, выделенных от разных больных и носителей патогенных микробов, а также из внешних объектов, являющихся возможными источниками инфицирования (вода, пищевые продукты и т.д.) с целью определения их биовара, хемовара, серовара, фаговара и т.д. Микологические исследования с целью выделения чистых культур грибов выполняются при диагностике ряда микозов (кандидозы, глубокие микозы и т.д.). Вирусологический метод является «золотым» стандартом в диагностике многих вирусных инфекций, однако является достаточно трудоемким, что связано с особенностями хранения, транспортировки и обработки исследуемого материала, использованием культур клеток, сложностью и длительностью культивирования ряда вирусов. Идентификацию выделенного вируса осуществляют, как правило, иммунологическими методами на основании изучения антигенной структуры, а также с помощью биохимических и молекулярно-биологических методов (ПЦР, гибридизация НК, и др.). Биологические методы (биопробы) направлены на выделение микроорганизма или на обнаружение его токсинов путем заражения чувствительных лабораторных животных материалом, полученным от больного. Этот метод используют для выделения чистой культуры возбудителя в тех случаях, когда микроорганизмы не растут или плохо культивируются на питательных средах, для дифференциации патогенных микробов или для определения их вирулентности. В настоящее время применение биопроб ограничено из-за соображений гуманности, финансовых трудностей, существованием повышенного риска заражения персонала лаборатории и в ряде случаев – длительностью выполнения биопробы, а также неспособностью современных штаммов микроорганизмов воспроизводить типичную инфекцию у чувствительного лабораторного животного. Наиболее часто биопробу применяют для выделения чистых культур возбудителей зоонозных инфекций (например, туляремии), а также для обнаружения ботулинистического токсина. Иммунохимические методы диагностики возбудителя или его антигенов в материале от больного Метод иммунофлюоресценции (ИФ) позволяет обнаружить в материале от больного или в зараженных вирусом клетках антигены бактерий и вирусов с помощью специфических антител, меченных флюорохромами. Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ). Сущность метода заключается в том, что исследуемый материал, содержащий вирусы, обрабатывают специфическими антителами, образовавшиеся иммунные комплексы осаждают высокоскоростным центрифугированием, а затем вирусы в составе иммунных комплексов выявляют с помощью электронной микроскопии. ИЭМ позволяет значительно повысить чувствительность и специфичность вирусоскопического метода. Разработаны твердофазные методы ИЭМ, сущность которых состоит в предварительной фиксации специфических антител (немеченных или меченных частицами золота) на сетках для электронной микроскопии с последующей обработкой сеток исследуемым вируссодержащим материалом и выявлением связанных антителами вирионов с помощью электронной микроскопии. Другие серологические реакции (РИФ, ИФА, РИА, РНГА, РП) также могут применяться для обнаружения антигенов бактерий и вирусов в материалах от больного. Биохимические и молекулярно-биологические методы диагностики Метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ) используют для обнаружения продуктов метаболизма микроорганизмов (летучих жирных кислот, спиртов, нелетучих органических кислот и т.д.) в исследуемом материале. Методы генодиагностики. Специфические фрагменты нуклеиновых кислот (НК) различных возбудителей можно обнаружить в исследуемом материале от больного с помощью методов гибридизации нуклеиновых кислот (ДНК-зондов) или чаще - ПЦР, которая широко используется как высокочувствительный экспресс-метод для постановки предварительного диагноза при различных инфекциях. Ограничения ПЦР могут быть обусловлены высокой изменчи7 востью НК некоторых микроорганизмов, а также неадекватным подбором праймеров для реакции, что обеспечивает ложноотрицательные результаты, или же загрязнением реакционной смеси микроорганизмами или фрагментами их НК, приводя к возникновению ложноположительных реакций. Серодиагностика и аллергодиагностика Серодиагностика (serum – сыворотка). Метод основан на обнаружении антител в сыворотке крови больного и определении динамики нарастания их титра в ходе заболевания. Для серодиагностики инфекционных болезней применяют различные иммунологические реакции (РА, РСК, РНГА, ИФА, ИФМ и т.д.), используя в качестве антигенов живые культуры микроорганизмов или диагностикумы (инактивированные взвеси микроорганизмов или антигены из них, полученные химическим путем). Серологические исследования проводят также для эпидемиологического анализа инфекционной заболеваемости (определение специфических антител у здоровых лиц, свидетельствующее о перенесении ими инфекции или о контакте с соответствующим возбудителем), а также для определения уровня специфических антител с целью оценки эффективности вакцинопрофилактики. При серологических исследованиях учитывается диагностический титр выявленных антител (максимальное разведение исследуемой сыворотки, дающее положительный результат). Наиболее информативными являются серологические исследования парных сывороток крови больного, взятых в начале болезни и через разные промежутки времени в процессе ее развития. Диагностическое значение имеет нарастание титра в 4 раза и более. Методы серодиагностики отличаются высокой специфичностью и чувствительностью. В последние годы широкое распространение получил метод ИФА. Серологические реакции, несмотря на ряд достоинств, имеют некоторые ограничения, связанные с возможностью возникновения ложноотрицательных и ложноположительных реакций. Ложноотрицательные реакции могут появляться в результате нейтрализации антител избытком микроба или его антигенов в организме больного, а также в результате неоптимальных соотношений антигенов и антител при постановке реакции. Ложноположительные (псевдоиммунологические) реакции могут возникать при использовании гемолизированной или загрязненной микроорганизмами сыворотки крови, при нарушениях соотношения альбуминов и глобулинов, являться результатом перекрестных иммунологических реакций. Ложноположительные реакции могут появляться у беременных женщин, наркоманов, больных тяжелыми хроническими болезнями (красная волчанка, ревматоидный артрит, хронические гепатиты и т.д.) и инфекциями (бруцеллез и др.) Аллергодиагностика. Наиболее часто при диагностике ряда инфекционных заболеваний (туберкулез, бруцеллез, туляремия и др.) ставят внутрикожные аллергические пробы для выявления гиперчувствительности замедленного типа к аллергенам микробов. Могут использоваться также методы аллергодиагностики in vitro, позволяющие оценить состояние специфической сенсибилизации лейкоцитов крови в отношении определенного антигена, например, реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), реакция лейкоцитолиза (повреждения нейтрофилов) в присутствии специфического микробного антигена. Оценка результатов клинико-диагностических микробиологических исследований Обнаружение патогенных микроорганизмов, являющихся возбудителями заболеваний имеет решающее значение для постановки диагноза. Инфекционный процесс способны вызвать также на фоне иммунной недостаточности (действие радиации, цитостатиков, сахарный диабет, СПИД и другие инфекции, первичные иммунодефициты и др.) условно-патогенные (оппортунистические) микроорганизмы, представляющие обширную группу аэробных и анаэробных бактерий, грибов, простейших. Эти микроорганизмы широко распространены во внешней среде, в организме человека и животных. Наибольшую роль в патологии человека играют условно-патогенные микроорганизмы родов Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Citrobacter, 8 Serratia, Pseudomonas, Haemophilus, Bacteroides, Veillonella, Vibrio, Peptococcus, Peptostreptococcus, Mycobacterium, Mycoplasma, Candida и др. У здорового человека эти микроорганизмы заболеваний не вызывают. Поэтому констатация этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов в патологии человека должна основываться на следующих критериях: 1. Условно-патогенные микроорганизмы выделяются из жидкостей организма (кровь, спинномозговая жидкость и др.), которые у здоровых людей являются стерильными. 2. Количество условно-патогенных микроорганизмов в исследуемом материале достаточно высоко, при этом многократное исследование больного в динамике процесса показывает повторное выделение одного и того же вида условно-патогенного микроорганизма из одного и того же материала. Нередко одни и те же виды условно-патогенных микробов высеваются из разных образцов материала. 3. При серологическом исследовании парных сывороток крови больного констатируют нарастание титра антител в 4 раза и более к определенному условно-патогенному микроорганизму, а также появление положительных кожных аллергических реакций у больных с аллергенами из условно-патогенных микроорганизмов. 4. При внутрибольничных (госпитальных или нозокомиальных) инфекциях условнопатогенные микроорганизмы одного и того же вида выделяются от группы больных, а также либо от бактерионосителей, либо из внешней среды или предметов обихода. 5. Наблюдается совпадение данных лабораторного определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам с эффективностью антимикробной терапии. Результаты микробиологических исследований оформляют на специальных бланках, в которых указывают вид патогенных или условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при микробиологическом исследовании, а также результаты определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. ВОЗБУДИТЕЛИ РАНЕВЫХ И ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ Гнойно-воспалительные и раневые инфекции относятся к распространенным инфекциям, встречаясь практически во всех отраслях медицины, но наиболее часто – в хирургической и акушерско-гинекологической практике, в дерматовенерологии, оториноларингологии, стоматологии и т.д.. Нередко эти инфекции приобретают характер внутрибольничных или госпитальных инфекций. Особенно тяжело протекают гнойно-воспалительные процессы у детей. Возбудителями указанных инфекций являются многочисленные разнообразные микроорганизмы (табл. 1). Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций Методы микробиологической диагностики стафилококковых заболеваний отражены в схеме 1. Выполняется следующий комплекс методов исследования. Бактериоскопический метод – микроскопия мазков из материала от больного, окрашенных по Граму. Выявление в мазках кокков, располагающихся небольшими группами по 2-3 бактерии; типичное расположение в виде гроздьев винограда характерно для чистых культур стафилококка (рис. 1 – цветная вкладка). Бактериологический метод. Исследуемый материал засевают на чашки с желточносолевым (ЖСА) и кровяным МПА, инкубируют при 370С сутки. На 2 день учитывают характер роста колоний на обеих средах. На желточно-солевом агаре колонии стафилококка имеют ровные края, гладкую поверхность, вокруг колонии образуется радужный венчик в результате расщепления лецитина яичного желтка ферментом лецитовителлазой; цвет пигмента колоний варьирует от золотистого до белого. На кровяном МПА вокруг колоний образуются зоны гемолиза. Из типичных для стафилококка колоний делают мазок, окрашивают его по Граму, микроскопируют. Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный МПА для получения чистой культуры. На 3 день проводят идентификацию выделенной культуры стафилококка с дифференциацией основных видов в соответствии с таблицей 2, определяют чувствительность к антибиотикам методом бумажных дисков и фаговар (набор для фаготипирования состоит из фагов 21 типа, разделенных на 4 группы; при внутрибольничных инфекциях наиболее часто встречаются фаговары 77 и 80). 9 Таблица 1. Этиология бактериальных раневых и гнойно-воспалительных инфекций Аэробы Грамположительные бактерии Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Erysipelotrix rhusiopathiae Грамотрицательные бактерии Burkholderia cepacia, Citrobacter koseri, Edwardsiella tarda, Eikenella corrodens, Enterobacter spp, Escherichia coli, Haemophylus influence, Klebsiella spp, Listeria monocytogenes, Moraxella catarrhalis, Proteus spp, Pseudomonas spp, Salmonella enterica, Serratia spp, Spirillum minus, Streptobacillus moniliformis, Vibrio vulnificus Анаэробы Неспорообразующие грамположительные бактерии Bacteroides spp, Prevotella spp, Porphiromonas spp, Fusobacterium spp, Veilonella spp Неспорообразующие грамотрицательные бактерии Peptostreptococcus spp, Propionibacterium spp Cпорообразующие грамположительные бактерии Clostridium perfringens, Clostridium novy, Clostridium oedematiens, Clostridium septicum, Clostridium sordelli, Clostridium histolyticum, Clostridium sporogenes, Clostridium ramosum Схема 1. Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций Материал: гной, раневое отделяемое, пунктаты из полостей и абсцессов, кровь, мокрота, моча, ликвор, рвотные массы, испражнения, остатки пищи. На кровяном МПА - зоны гемолиза, в МПБ – Микроскопический метод Выявление грамположительных кокков (груправномерное помутнение. В мазке из колоний в пами по 2-3 клетки) в мазках из материала от окраске по Граму – кокки в виде гроздьев больного, окрашенных по Граму винограда. Пересев оставшейся части колонии на скошенный МПА для получения чистой Серологический метод культуры, а с сахарного МПБ на кровяной МПА РНГА или РН для определения α-антитоксина в и ЖСА для получения изолированных колоний. сыворотке крови больных хроническими 3 день - идентификация выделенной культуры стафилококковыми инфекциями. ИФА для стафилококка, дифференциация видов по определения антител к стафилококку. Имеет биохимическим свойствам, определение вспомогательное значение чувствительности к антибиотикам и фаговара. Бактериологический метод Выделение чистой культуры с ЖСА и 1 день. Посев материала на чашки с желточно- кровяного МПА. солевым (ЖСА), кровяным МПА, сахарным 4 день. Заключение о виде стафилококка. МПБ. Идентификация культуры, выделенной из 2 день - учет характера роста колоний. На ЖСА сахарного МПБ колонии стафилококка с ровными краями, 5 день. Заключение о виде стафилококка, гладкой поверхностью, радужным венчиком выделенного из сахарного МПБ. вокруг, цвет - от золотистого до белого. Таблица 2. Дифференциация основных видов стафилококка Признаки Плазмокоагулаза Лецитиназа Альфа-токсин Анаэробная ферментация глюкозы Анаэробная ферментация маннита Чувствительность к новобиоцину S. aureus + + + + + S Виды стафилококков S. epidermidis S. saprophyticus + S R Обозначения: (+) – наличие признака; (-) – отсутствие признака; S - чувствительный; R – резистентный. 10 Для выявления плазмокоагулазы цитратную плазму крови кролика разводят в 2 раза, разливают по 0,4 мл в пробирки, куда вносят петлей культуру стафилококков. Результаты регистрируют через 2, 4, 24 часа. При наличии плазмокоагулазы образуется сгусток. В некоторых случаях у выделенных чистых культур стафилококка определяют наличие ДНК-азы, каталазы, лизоцимной активности, фибринолизина, гиалуронидазы. Лизоцимную активность выявляют по зонам просветления вокруг колоний стафилококка при его посеве на МПА в чашках Петри с культурой Micrococcus luteus. Определение ДНК-азы. Суточную агаровую культуру стафилококка засевают на МПА в чашке Петри, содержащий ДНК. После инкубации посевов при температуре 370 С в течение 1824 часов поверхность МПА заливают 1 N раствором соляной кислоты. Наличие ДНК-азы характеризуется появлением зоны просветления вокруг колоний. Каталазный тест. Чистую культуру стафилококка вносят в каплю 3%-10%-го раствора перекиси водорода на стекле и растирают круговыми движениями. При наличии каталазы перекись водорода разлагается с образованием пузырьков кислорода. Cерологический метод в диагностике стафилококковых инфекций имеет вспомогательное значение, используясь, в основном, для диагностики хронических процессов (остеомиелит, септикопиемия и др.). Для определения антител к токсину стафилококка применяют РНГА с эритроцитарным диагностикумом, нагруженным α-токсином стафилококка или РН (реакция нейтрализации гемолитической активности стафилококкового токсина антитоксинами сыворотки крови больного в присутствии эритроцитов кролика). У здоровых лиц титр стафилококкового антитоксина составляет 0,5-4 АЕ. Разработан также ИФА. Клинически значимые виды стафилококка Коагулазоположительные: S. aureus, S. hyicus Коагулазоотрицательные: S. epidermidis, S. saprophyticus, S. haemolyticus, S.hominis Самостоятельная работа студентов 1. Микроскопия мазков из чистой культуры золотистого стафилококка – Staphylococcus aureus. Стафилококки окрашиваются по Граму положительно, выглядят в виде гроздьев винограда 2. Учет характера роста золотистого стафилококка (демонстрация) на ЖСА (расщепление лецитина в виде радужного венчика вокруг колоний) и кровяном МПА (гемолиз). 3. Дифференциация основных видов стафилококка (таблица 2) – (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus по образованию плазмокоагулазы, лецитиназы, альфа-токсина, ферментации маннита и глюкозы в анаэробных условиях - демонстрация). 4. Учет теста на антибиотикорезистентность методом бумажных дисков (демонстрация). 5. Определение фаговара стафилококка (демонстрация). 6. Знакомство с препаратами, используемыми для диагностики, профилактики и лечения стафилококковых и стрептококковых инфекций. - стафилококковая вакцина - взвесь клеток коагулазоположительных штаммов S.aureus, убитая нагреванием. Используется для лечения вяло текущих стафилококковых инфекций; - антифагин стафилококковый - экстракт из культур патогенных стафилококков, инактивированных при 1000 С, профильтрованный через бактериальный фильтр. Применяется для лечения хронических пиодермий; 11 - иммуноглобулин человеческий противостафилококковый - гамма-глобулиновая фракция сыворотки крови, содержащая стафилококковые антитоксические антитела. Применяется с лечебной целью; - стафилококковый бактериофаг (жидкий) - фильтрат фаголизата стафилококка. Применяют наружно, внутрикожно и внутримышечно для лечения; - диагностические стафилококковые фаги - набор типоспецифических фагов для фаготипирования стафилококков; - стафилококковый анатоксин (очищенный адсорбированный) – получают из нативного анатоксина (токсин, обезвреженный формалином) путем осаждения трихлоруксусной кислотой и этанолом, с последующей адсорбцией на гидроксиде алюминия. Применяется для активной иммунизации с целью профилактики и лечения стафилококковых инфекций; Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций. Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций отражена в схеме 2. Выполняются следующие методы исследования. Бактериоскопический метод – выявление в мазке из гноя патогенных кокков, располагающихся в виде небольших цепочек. Типичное расположение в виде цепочек характерно для чистых культур стрептококка (рис. 2 цветная вкладка). Схема 2. Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций Материал: гной, раневое отделяемое, пунктаты из полостей и абсцессов, кровь, мокрота, моча, ликвор, рвотные массы, испражнения, остатки пищи. 3 день - идентификация выделенной Микроскопический метод. Выявление грамположительных кокков в культуры стрептококка, дифференциация виде цепочек в мазках из материала от основных видов, определение больного. чувствительности к антибиотикам. Выделение чистой культуры с кровяного Бактериологический метод. 1. день. Посев материала на чашки МПА. кровяным МПА, пробирки или флаконы с 4 день. Заключение о виде стрептококка. сахарным МПБ. Идентификация культуры, выделенной из 2 день - учет характера роста колоний (на сахарного МПБ кровяном МПА - зоны гемолиза, в МПБ – 5 день. Заключение о виде стрептококка, равномерное помутнение). В мазке из выделенного из сахарного МПБ. Серологический метод колоний в окраске по Граму – кокки в виде цепочек. Оставшуюся часть колонии Реакция нейтрализации (РН) для опредепересевают на скошенный МПА для ления антистрептолизина-О (гемолизина) и получения чистой культуры. Пересев с антигиалуронидазы в сыворотке крови больных стрептококковыми инфекциями. сахарного МПБ на кровяной МПА Бактериологический метод. Исследуемый материал засевают на кровяной МПА в чашках Петри. После выращивания в термостате при 370 С в течение суток учитывают характер роста колоний (колонии очень мелкие, величиной с булавочную головку, круглые, мутноватые, матовые). Слизистые колонии типичны для свежевыделенных штаммов, стрептококка, матовые – для вирулентных стрептококков с высоким содержанием М-протеина, блестящие – для невирулентных штаммов. На кровяном МПА стрептококки вызывают α–гемолиз (зеленоватая зона вокруг колоний) или β-гемолиз (полностью прозрачная зона гемолиза). Негемолитические стрептококки обычно непатогенны. Из типичных для стрептококка колоний готовят мазок в окраске по Граму и после микроскопии (Streptococcus pyogenes окрашивается по Граму положительно, располагается в виде цепочек) делают пересев в пробирки с сахарным МПБ и кровяным МПА. На 3 день учитывают характер роста (на сахарном МПБ рост стрептококка в виде придонно-пристеночного осадка, сама среда прозрачна), готовят мазок в окраске по Граму и проводят идентификацию выделенной культуры стрептококка по 12 антигенным свойствам. Серогруппу стрептококков определяют в реакциях преципитации, латекс-агглютинации или коагглютинации с целью выявления группоспецифического полисахаридного антигена А, используя группоспецифические сыворотки (обычно групп A, B, C, F, G). Большинство патогенных для человека стрептококков являются β-гемолитическими и относятся к группе A. Серовар выделенной культуры стрептококка выявляют с помощью реакции агглютинации (выявление типового протеинового антигена М, по которому выделяют около 100 сероваров) с типоспецифическими стрептококковыми сыворотками. Для идентификации β-гемолитических стрептококков применяют PYR-тест (на пирролидониламидопептидазу), CAMP-тест (на белок синергидного гемолиза), тест ФогесПроскауэра (на образование ацетоина), чувствительность к бацитрацину (0,04 ЕД на диск), галотолерантность (рост в присутствии 6,5% хлорида натрия), гидролиз гиппурата натрия, ферментацию трегалозы, сорбита и т.д. α -гемолитические стрептококки идентифицируют, используя тесты на чувствительность к желчи, оптохину, на гидролиз эскулина и т.д. (табл. 3). PYR -mecm. В МПБ, содержащий 0,01 % L-пирролидонил- β –нафтиламин, вносят петлю агаровой культуры стрептококка, инкубируют при 370 С в течение 4 ч. Положительная реакция характеризуется появлением ярко-красного окрашивания после внесения 1 капли специального реактива. САМР-тест. S. agalactiae вырабатывают внеклеточный протеин синергидного гемолиза, усиливающий лизис эритроцитов β -лизином стафилококка. Для его определения на чашку с кровяным МПА засевают перпендикулярными штрихами исследуемую культуру стрептококка и суточную бульонную культуру стандартного β -гемолитического штамма Staphylococcus aureus. В качестве положительного и отрицательного контролей засевают соответственно культуры S. agalactiae и S. pyogenes, инкубация 18 ч при 37 °С. При положительном САМР-тесте на месте пересечения стафилококка и S. agalactiae появляется зона усиления гемолиза в виде «крыла бабочки». Таблица 3 . Дифференциальные признаки стрептококков Свойства S. pyogenes Вид гемолиза Гидролиз гиппурата натрия CAMP-тест PYR-тест Желчно-эскулиновый тест Рост в солевом МПБ Чувствительность к бацитрацину Чувствительность к сульфаметоксазолу и триметоприму Β + + - Микроорганизмы S. agalactiae Стрептококки S. bovis групп C и G β, α β α, + + + + + + Обозначения: (+) - постоянный признак, (-) – отсутствие признака Исследование крови. Для выделения гемокультуры посев обычно производят в сахарный бульон. При наличии стрептококка на дне флакона появляется хлопьевидный придонный осадок, а в мазках обнаруживаются длинные цепочки стрептококков. Для выделения чистой культуры и определения характера гемолиза делают пересев в чашку с кровяным агаром. Через сутки (3-й день исследования) появляются типичные мелкие колонии, окруженные зоной гемолиза. Дальнейший ход исследования аналогичен описанному выше. Генодиагностика. Разработан метод ДНК-ДНК-гибридизации для обнаружения специфических фрагментов ДНК стрептококка в исследуемом материале, что дает основание поставить предварительный диагноз стрептококковой инфекции. 13 Серодиагностика (определение антител к гемолизину – стрептолизину-О) проводится при подозрении на ревматизм. Сущность реакции заключается в нейтрализации антителами сыворотки крови больного гемолитической активности стрептококкового стрептолизина-О. Титр антистрептолизина-О у здоровых людей – до 250 АЕStO. При ревматизме с первых дней болезни титр антистрептолизина-О составляет 500 АЕStO и выше. Самостоятельная работа студентов 1. Микроскопия мазка из чистой культуры Streptococcus pyogenes (демонстрационный микропрепарат, окраска по Граму). Клетки стрептококка круглые, располагаются в виде цепочек, по Граму окрашиваются положительно. 2. Микроскопия мазка из чистой культуры энтерококка - Streptococcus faecalis (демонстрационный микропрепарат, окраска по Граму). Клетки энтерококка овальные, располагаются в виде коротких цепочек, по Граму окрашиваются положительно. 3. Знакомство с культуральными свойствами стрептококков. На кровяном МПА стрептококки образуют мелкие, мутные, круглые колонии с прозрачной зоной гемолиза вокруг. На сахарном МПБ характерен придонно-пристеночный рост в виде зернистого осадка, среда остается прозрачной. 4. Определение серогруппы (демонстрация реакции латекс-агглютинации с солянокислым экстрактом исследуемой культуры и группоспецифическими сыворотками A,B,C,D), серовара стрептококка (реакция агглютинации исследуемой культуры с типоспецифическими стрептококковыми сыворотками 5,12, 23). 5.. Знакомство с препаратами, используемыми для диагностики, профилактики и лечения стафилококковых и стрептококковых инфекций. - стрептококковый бактериофаг - фильтрат фаголизата стрептококка. Применяется наружно, внутрикожно, внутримышечно для лечения стрептококковых инфекций Микробиологическая диагностика заболеваний, вызываемых гноеродными условно-патогенными грамотрицательными аэробными микроорганизмами. Бактериоскопический метод (микроскопия мазков из исследуемого материала, окрашенных по Граму). При наличии грамотрицательных бактерий дается предварительный ответ. Бактериологический метод. Для выделения культуры синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa) исследуемый материал засевают в чашки Петри на МПА или на селективную среду - ЦПХ-агар с цитилпиридиний хлоридом, ингибирующим рост сопутствующей микрофлоры. Посевы инкубируют при 370 С в течение суток. Pseudomonas aeruginosa образует круглые, плоские, слизистые колонии. Среда окрашивается в сине-зеленый цвет в результате выработки водорастворимого пигмента – пиоцианина. Палочки окрашиваются по Граму отрицательно, подвижны. Идентификация культур Р.aeruginosa проводится по биохимическим свойствам и образованию пигмента. Для эпидемиологического анализа госпитальных инфекций определяют серовары Pseudomonas aeruginosa с помощью реакции агглютинации, а также пиоциновары и фаговары. Выделение энтеробактерий осуществляется путем посева исследуемого материала на одну из дифференциально-диагностических сред для энтеробактерий (Эндо или Левина) с последующим выделением чистых культур и их идентификацией с помощью общепринятых методов. Для выделения бактерий рода Proteus применяют метод Шукевича (посев в конденсационную воду скошенного МПА). Самостоятельная работа студентов 1. Морфологические свойства Proteus vulgaris (грамотрицательные палочки). Окраска по Граму (демонстрационный микропрепарат). 2. Культуральные свойства Proteus vulgaris (демонстрация) на МПА в чашке Петри (отметить "ползучий" рост на поверхности плотных питательных сред). 3. Ферментативные свойства Proteus vulgaris. (Посев на пестрый ряд Гисса, демонстрация). 14 4. Морфологические свойства Pseudomonas aeruginosa (демонстрационный микропрепарат). Окраска по Граму (грамотрицательные палочки). 5. Культуральные свойства Pseudomonas aeruginosa на МПА (круглые плоские слизистые колонии с характерным сине-зеленым пигментом и запахом); на МПБ (равномерное помутнение среды и характерное сине-зеленое окрашивание диффундирующим в среду водорастворимым пигментом) (демонстрация). 6. Ферментативные свойства Pseudomonas aeruginosa (Посев на пестрый ряд Гисса, демонстрация). Педиатрические аспекты темы 1. Удельный вес стафилококковых заболеваний у детей весьма значителен, особенно у новорожденных и детей раннего возраста, проявляясь в виде стафилококковых пневмоний, энтеритов, сепсиса, остеомиелита и т.д. 2. Поскольку сепсис у детей часто протекает по типу септикопиемии, для увеличения процента бактериологических подтверждений необходимо делать многократно повторные посевы крови, забирая ее у новорожденных детей из вен черепа или из пятки. 3. Наиболее достоверным методом для установления этиологии стафилококковой пневмонии является пункция гнойного очага и плевральной полости с посевом полученного материала на питательные среды с целью выделения чистой культуры стафилококка. 4. Количественный учет микробного обсеменения материала, взятого для исследования, имеет важное значение для установления стафилококковой этиологии энтерита и пневмонии, После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей гнойной и раневой инфекции, а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: выполнить микробиологическое исследование с целью диагностики гнойной и раневой инфекции, оценить результаты микробиологических анализов при этих инфекциях. Тема 2. ВОЗБУДИТЕЛИ РАНЕВОЙ АНАЭРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ: АНАЭРОБНОЙ ГАЗОВОЙ ИНФЕКЦИИ, СТОЛБНЯКА. БАКТЕРОИДЫ. Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей раневой анаэробной инфекции, методов ее лабораторной диагностики, профилактики и лечения. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Клостридии. Таксономия. Экология. Биологические свойства. Анаэробиоз. Резистентность к факторам окружающей среды. Факультативный паразитизм и патогенность для человека. Локализация в организме. Токсичность. Генетический контроль токсинообразования. 2. Способы культивирования и методы выделения чистых культур анаэробов. 3. Клостридии раневой анаэробной инфекции. Морфологические, культуральные, биохимические и антигенные свойства. Факторы патогенности, токсины. Энтеротоксин и его роль при пищевой токсикоинфекции. Патогенез раневой анаэробной инфекции. Роль микробных ассоциаций в патогенезе. Антитоксический иммунитет. Микробиологическая диагностика. Специфическое лечение и профилактика. 4. Клостридии столбняка. Морфологические, культуральные, биохимические и антигенные свойства. Факторы патогенности, токсины. Патогенез заболевания. Столбняк у новорожденных детей. Антитоксический иммунитет. Микробиологическая диагностика. Специфическое лечение и профилактика столбняка. 5. Грамотрицательные анаэробные палочки. Бактероиды, фузобактерии, лептотрихии, превотеллы, порфиромонады. Таксономия. Биологические свойства. Роль в патологии человека. Микробиологическая диагностика. Этиотропная терапия. 6. Пептококки, пептострептококки, их биологические свойства и роль в патологии человека. Микробиологическая диагностика инфекции, вызванной анаэробными кокками. 15 7. Анаэробные грамотрицательные кокки – вейлонеллы. Таксономия. Биологические свойства. Факторы патогенности. Роль в патологии человека. Методы микробиологической диагностики. Микробиологическая диагностика анаэробной инфекции. Раневую анаэробную инфекцию у человека вызывают как спорообразующие анаэробные бактерии (Clostridium perfringens, Clostridium novy, Clostridium oedematiens, Clostridium septicum, Clostridium sordelli, Clostridium histolyticum), так и неспорообразующие анаэробные микроорганизмы родов Bacteroides, Peptococcus, Peptostreptococcus, Veilonella и др. Методы микробиологических исследований при анаэробной инфекции представлены в схеме 3. Бактериоскопический метод. Проводится микроскопия окрашенных по Граму, ЦилюНильсену и Гинсу-Бурри мазков, приготовленных из раневого отделяемого, отечной жидкости, некротизированной ткани. Обнаружение в препаратах крупных прямых грамположительных палочек, образующих капсулы и центрально или субтерминально расположенные споры (рис. 3), дает основание поставить предварительный диагноз газовой гангрены. Для экспрессдиагностики применяют прямой метод иммунофлюоресценции. Схема 3. Микробиологическая диагностика анаэробных инфекций Материал: кусочки некротизированных тканей, экссудат, гной, отделяемое ран, кровь, секционный материал. МПА), Китт-Тароцци, железо-сульфитный Микроскопический метод. Микроскопия окрашенных по Граму, Цилю- агар (ЖСА) и молоко (образование через 3Нильсену и Гинсу-Бурри мазков, приготов- 4 часа губкообразного сгустка, ленных из материала от больного с целью погруженного в прозрачную жидкость). 2 обнаружения крупных грамположительных день – учет роста (помутнение и палочек, образующих капсулы и централь- образование газа на среде Китт-Тароцци; но или субтерминально расположенные черные в виде чечевичек, дисков, комочков споры ваты колонии в глубине ЖCA; шероховатые, крупные, плоские сероватые Биопроба Заражение морских свинок материалом от колонии с зоной гемолиза на среде больного в смеси с антитоксическими Цейсслера). Пересев на среду Китт-Тароцци сыворотками против различных видов для выделения чистой культуры. клостридий (РН) или без них. Гибель 3 день – Проверка чистоты выделенной контрольной морской свинки через 30 культуры, пересев на среды «пестрого» минут – 4 часа. В РН выживает одна ряда с целью определения биохимических морская свинка, у которой токсин свойств, выявление токсинов (биопроба) и нейтрализуется соответствующим видом факторов патогенности с целью сыворотки. идентификации выделенной культуры анаэробов. Бактериологический метод. 1. день. Посев исследуемого материала на 4 день. Заключение о виде выделенной среды Цейсслера (анаэробный кровяной культуры анаэробов. Бактериологический метод. Производят посев исследуемого материала на среды Цейсслера (анаэробный кровяной МПА), Китт-Тароцци, железо-сульфитный агар (ЖСА) и молоко. В молоке через 3-4 часа образуется губкообразный сгусток, погруженный в прозрачную жидкость. На среде Китт-Тароцци через сутки регистрируется помутнение и образование газа, на ЖCA - черные колонии в глубине агарового столбика, на среде Цейсслера – шероховатые (реже – гладкие), крупные, плоские сероватые колонии с зоной гемолиза. В глубине плотных питательных сред образуются колонии в виде чечевичек, дисков, комочков ваты и т.д. В мазках из колоний обнаруживают крупные грамположительные палочки (рис. 5). Для выделения чистой культуры возбудителей газовой гангрены типичные колонии пересевают на среду Китт16 Тароцци и идентифицируют до вида в соответствии с таблицами 4 и 5. Рис. 4. Возбудитель газовой гангрены (Clos- Рис. 5. Возбудитель газовой гангрены. Чиtridium perfringens) в материале от больно- стая суточная культура Clostridium го. Окраска по Граму. х 900 perfringens. Окраска по Граму. х 900 Таблица 4. Биологические свойства неспорообразующих и спорообразующих анаэробов Обозначения: (+) - постоянный признак, признака, V- вариабельный признак C.histolyticum C.sordelli C.septicum C.novy C.perfringens палочки - ± + + ± ± ± ± ± - палочки + + + - палочки + + - палочки кокки палочки + + + ± палочки кокки Подвижность Споры Окраска по Граму Ферментация углеводов Свертывание молока Продукция H2S Продукция индола Разжижение желатины Редукция нитратов Гемолиз эритроцитов Образование токсина кокки Морфология Veilonella Bacteroides Peptostreptococcus Бактерии Peptococcus Свойства + + + + + ± + + + + + + v + ± + + + + + + + ± + + + + + + + v + + + + + + + v + + + (±) - непостоянный признак, (-) – отсутствие 17 Таблица 5. Биологические свойства основных возбудителей газовой гангрены и столбняка Виды клостридий Clostridium perfringens Clostridium Novy Clostridium septicum Clostridium Tetani Капсула Подвижность Лецитиназа Индол Ферментация лактозы сахарозы маннита + + + + - + - - + + - - - - - + _ - + - - - + _ + - - - Обозначения: (+) - постоянный признак, (-) – отсутствие признака, Определение лецитиназной активности. Положительная реакция на лецитиназу проявляется в виде помутнения взвеси лецитина. При отрицательной реакции, которая наблюдается при нейтрализации фермента соответствующей антисывороткой, жидкость остается прозрачной. Окончательную идентификацию выделенных клостридий газовой гангрены проводят с помощью биопробы (см. ниже) путем постановки реакции нейтрализации с поливалентными и моновалентными сыворотками для выявления и типирования экзотоксинов клостридий. Биопроба. Смесь исследуемого материала с моновалентными антитоксическими сыворотками против различных видов клостридий вводят подкожно морским свинкам. Контролем служит морская свинка, которой вводят исследуемый материал без сывороток. При наличии токсина контрольная морская свинка погибает через 30 минут – 4 часа после инъекции материала. В опытах нейтрализации токсина антитоксическими сыворотками выживает одна морская свинка, при этом вид сыворотки соответствует виду токсина. Самостоятельная работа студентов. 1. Изучить питательные среды и аппараты, применяемые для культивирования патогенных анаэробов (демонстрация). 2. Морфологические свойства Clostridium perfringens в чистой культуре (окраска по Граму, демонстрация – рис. 5). Зарисовать. Палочки крупные, грамположительные, образуют споры и капсулы. 3. Культуральные cвойства Clostridium perfringens на среде Китт- Тароцци, железосульфитном агаре (ЖСА) и молоке (демонстрация). В молоке через 3-4 часа образуется губкообразный сгусток, отделившаяся жидкость прозрачна. На среде Китт-Тароцци - помутнение, на ЖСА - черные колонии в глубине агарового столбика (рис. 3). 4. Ферментативная активность возбудителей анаэробной инфекции на средах Гисса. Обратить внимание на высокую ферментативную активность С.perfringens. 5. Лецитиназная активность Clostridium perfringens. Положительная реакция на лецитиназу проявляется в виде помутнения взвеси лецитина. При отрицательной реакции, которая наблюдается при нейтрализации фермента соответствующей антисывороткой, жидкость остается прозрачной. Демонстрацию описать, зарисовать. 6. Знакомство с препаратами для специфической профилактика и терапии газовой гангрены (антитоксические сыворотки моновалентные – против Clostridium perfringens, Clostridium novy, Clostridium oedematiens, Clostridium septicum и т.д., а также поливалентная, полученные при гипериммунизации лошадей). Микробиологическая диагностика столбняка. 18 Для обнаружения столбнячной палочки обычно исследуют шовный и перевязочный материал, а в случае неясного течения болезни гной, кровь, кусочки тканей, выделения из матки, секционный материал. Выполняются следующие методы исследования: Бактериоскопический метод. Не позволяет дать заключение о наличии клостридий столбняка в материале, поскольку в нем могут отсутствовать споры или находиться бактерии, сходные по морфологии с Clostridium tetani. Бактериологический метод. Клиническая картина столбняка (высокая интоксикация, тонические и клонические судороги) весьма типична, поэтому бактериологическое исследование имеет ограниченное применение. Кроме того, бактериологический метод при столбняке не дает своевременных результатов. Это исследование проводят обычно при неясном течении болезни. Материал для исследования засевают на среду Китт-Тароцци, инкубируют при 370 С в течение 3-4 суток, отмечая придонный рост бактерий. Пересевы осуществляют на сахарный МПА в чашке Петри и в пробирке с последующим выращиванием посевов в анаэростате. Нежные прозрачные колонии пересевают для получения чистой культуры на среду Китт-Тароцци, затем определяют морфологические (прямая палочка с шаровидной спорой на конце в виде барабанной палочки – рис. 6), биохимические свойства (характерна низкая ферментативная активность – табл. 5), токсинообразование. Возможно выявление столбнячного токсина в исследуемом материале с помощью РНГА. С этой целью к исследуемому материалу добавляют эритроциты, нагруженные антителами к столбнячному токсину. Положительная реакция характеризуется выпадением эритроцитов с в виде осадка с фестончатыми краями. Биопроба. Смесь исследуемого материала с антитоксической противостолбнячной сывороткой вводят внутримышечно белой мыши. Контролем служит мышь, которой вводят исследуемый материал без сыворотки. При наличии токсина у опытной мыши через 1-2 дня появляется ригидность мышц хвоста и Рис. 6. Палочка столбняка (Clostridium tetani). задних конечностей, хвост принимает вид Окраска по Граму. Грамположительные споро- дуги и животное погибает. В опыте образующие бациллы, напоминающие бара- нейтрализации мышь выживает. В настоящее время в реальной практике биопроба не банную палочку используется. Самостоятельная работа студентов. 1. Морфологические свойства Clostridium tetani (окраска по Граму). Возбудитель столбняка выглядит в виде прямой палочки с шаровидной спорой, расположенной на конце, напоминая барабанную палочку. 2. Биохимические свойства Clostridium tetani (демонстрация – см. табл. 5). 3. Выявление столбнячного токсина в РНГА. К исследуемому материалу добавлены эритроциты, нагруженные антителами к столбнячному токсину. Положительная реакция характеризуется выпадением осадка эритроцитов с фестончатыми краями. 4. Ознакомление с биопрепаратами, применяемыми для специфической профилактики и терапии столбняка: - адсорбированный столбнячный анатоксин. Получают путем обезвреживания столбнячного токсина формалином. Входит в состав ассоциированной коклюшно-дифтерийно- 19 столбнячной вакцины, дифтерийно-столбнячного анатоксина; выпускается также в виде монопрепарата. Применяется для профилактики; - противостолбнячная сыворотка. Получают из сыворотки крови лошадей, гипериммунизированных столбнячным анатоксином. Применяют для пассивной профилактики и лечения столбняка; - иммуноглобулин донорский противостолбнячный. Получен из гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови доноров, ревакцинированных столбнячным анатоксином. Применяется для пассивной иммунизации при экстренной профилактике или для лечения начавшегося заболевания. Микробиологическая диагностика неклостридиальной анаэробной инфекции Анаэробную инфекцию могут вызывать не только клостридии, но представители других родов, чаще всего бактероиды (Bacteroides fragilis, другие виды бактероидов, входящих в состав нормальной микрофлоры организма человека), реже - превотеллы, порфиромонады, фузобактерии, пептококки и пептострептококки. Для диагностики инфекции, вызванной бактероидами, применяются следующие методы микробиологического исследования. Бактериоскопический метод имеет ориентировочное значение и заключается в микроскопии мазков из патологического материала, окрашенных по Граму. Бактероиды – грамотрицательные неспорообразующие полиморфные палочки. Бактериологический метод. Материал засевают на кровяной агар Цейсслера или селективные среды (кровяной агар с желчью и канамицином), посевы инкубируют при 37 0 С в бескислородной или газовой атмосфере, состоящей из смеси азота, водорода, кислорода. Через 2-3 дня на поверхности агара образуются небольшие выпуклые серовато-белые колонии с ровными краями. Идентификацию культуры проводят в соответствии с признаками, указанными в табл.4. Педиатрические аспекты темы 1. Столбняк у детей наблюдается в двух формах: а) травматический столбняк стартах детей, б) столбняк новорожденных. Столбняк новорожденных возникает в результате проникновения столбнячной палочки в пупочную рану в условиях неасептического ухода. Заболевание протекает крайне тяжело с летальным исходом в течение первых 3-5 суток с явлениями пневмонии, диспепсии, тяжелых судорог и сердечных расстройств. 2. При выборе площадки для размещения детского сада и яслей необходимо исследовать анаэробный титр почвы. Показатели, превышающие допустимые санитарные нормы, свидетельствуют о загрязнении почвы анаэробами, среди которых могут находиться и Сlostridium tetani После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей раневой анаэробной инфекции, а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: выполнить микробиологическое исследование с целью диагностики раневой анаэробной инфекции, оценить результаты микробиологических анализов при этих инфекциях. Тема 3. ВОЗБУДИТЕЛИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗООНОЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ: ЧУМЫ, ТУЛЯРЕМИИ, СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей бактериальных зоонозных инфекций - чумы, туляремии, сибирской язвы, методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Понятие об особо-опасных, зоонозных, карантинных инфекциях. Правила работы с возбудителями особо-опасных инфекций. 2. Возбудитель чумы, история изучения, биологические свойства. Роль отечественных ученых в изучении чумы. Патогенез, иммунитет, методы микробиологической диагностики и специфической профилактики. 20 3. Возбудитель туляремии. Биологические свойства. Патогенез, иммунитет, методы микробиологической диагностики и специфической профилактики туляремии. 4. Возбудитель сибирской язвы. Морфологические, культуральные, биохимические и антигенные свойства. Резистентность. Патогенность для человека и животных. Факторы патогенности, токсины. Патогенез заболевания у человека, иммунитет. Микробиологическая диагностика. Специфическое лечение и профилактика сибирской язвы. Микробиологическая диагностика чумы. Возбудитель чумы – Yersinia pestis относится к высокопатогенным микроорганизмам (1 группы патогенности). Взятие, доставка материала при подозрении на чуму и работа с ним производятся в специализированных лабораториях с соблюдением особых правил предосторожности (в противочумном костюме, с применением специальных средств и устройств, предотвращающих попадание микроорганизма на кожу, слизистые оболочки и в дыхательные пути медицинского персонала, а также на различные объекты внешней среды). В зависимости от способа заражения различают бубонную, легочную, кишечную формы, реже возникает септическая и кожная формы. Материал, подлежащий исследованию на чуму (см. схему 4), помещают в банки, которые герметично закрывают, обрабатывают снаружи 5% раствором лизола, наклеивают этикетку с указанием вида материала, даты и места его взятия, фамилии и инициалов больного, а также диагноза. Банки плотно укладывают в герметичную тару, на крышке которой указывают «Верх»; в банку вкладывают опись направляемых на исследование материалов. Материалы подлежат немедленной отправке в лабораторию на специальном транспорте с сопровождающим лицом. Перед исследованием тара с материалом и другие потенциально зараженные предметы обрабатываются дезинфицирующим раствором. Лица, контактировавшие с материалом, подозрительным на содержание возбудителя чумы, подвергаются полной санитарной обработке. Принципы микробиологической диагностики чумы отражены в схеме 4. Бактериоскопический метод. Мазки, приготовленные из исследуемого материала, фиксируют в смеси Никифорова, окрашивают по Граму и метиленовым синим. С целью экспрессдиагностики мазки обрабатывают также меченой люминесцирующей сывороткой к Y. pestis (прямой ИФМ). Предварительный положительный ответ выдается в случае обнаружения в мазках биполярно окрашенных грамотрицательных овоидных бактерий, окруженных нежной капсулой (рис.7), дающих специфическое свечение в РИФ. В качестве других методов экспресс-диагностики чумы применяют РНГА с иммуноглобулиновым чумным диагностикумом, ИФА для индикации антигенов возбудителя. Методы ускоренной и экспресс-диагностики дают возможность дать предварительный ответ через 4 ч от начала исследования, окончательный - через 18-20 ч. Бактериологическое исследование. Кровь при подозрении на чуму засевают на МПБ во флаконах; содержимое бубона, отделяемое язвы, мокроту и другой материал — на МПА с цельной или гемолизированной кровью кролика или лошади в чашках Петри с антифаговой сывороткой для нейтрализации чумного фага, раствором генцианового фиолетового и сульфита натрия для подавления роста посторонней микрофлоры, находящейся в исследуемом материале. Применяют также селективную среду с антибиотиками — агар CIN. Посевы инкубируют при 25—28 °С. Через 16—20 ч на чашках под малым увеличением микроскопа обнаруживают рост колоний в виде скоплений осколков битого стекла, которые к 48 ч приобретают вид Rформы с компактным приподнятым центром и ажурной полупрозрачной периферией («кружевные платочки» - рис. 8). На поверхности МПБ через 24 ч образуется рыхлая пленка, от которой спускаются тяжи, напоминающие сталактиты. Схема 4. Микробиологическая диагностика чумы Материал: пунктат из бубона, мокрота, кровь, испражнения 21 Микроскопический метод Микроскопия окрашенных по Граму и метиленовым синим мазков из материала от больного с целью обнаружения биполярно окрашенных грамотрицательных овоидных бактерий, окруженных нежной капсулой и дающих специфическое свечение оболочки в РИФ Серологический метод Постановка РНГА, ИФА, РИФ, РНАг с целью определения антител в крови больного Генодиагностика Биопроба Постановка ПЦР Подкожное, внутрибрюшинное, накожное или скарификационное заражение материалом от больного морских свинок или белых мышей. Микроскопическое и бактериологическое исследование трупов павших животных Бактериологический метод. 1. день. Посев на МПБ, кровяной МПА с антифаговой сывороткой, раствором генцианового фиолетового и сульфита натрия, селективную среду с антибиотиками (агар CIN). Инкубация посевов при 25-280 С. 2 день Учет характера роста под малым увеличением микроскопа (рост колоний в виде скопления осколков битого стекла; через 48 часов появление R-форм в виде «кружевных платочков»; в жидких средах рост, напоминающий сталактиты). Микроскопическое исследование типичной колонии, ее пересев на скошенный МПА для накопеления чистой культуры. 3 день. Проверка чистоты выделенной культуры, пересев на среды «пестрого» ряда для определения ферментативных свойств, постановка проб на фаголизабельность и чувствительность к антибиотикам. Идентификация культуры по антигенным свойствам (выявление капсульного и соматического антигенов). 4 день. Заключение о виде выделенной культуры на основании ее идентификации по морфологическим, культуральным, ферментативным, антигенным свойствам и фаголизабельности. а б Рис. 7. Возбудитель чумы (Yersinia pestis). а - чистая культура, окраска метиленовым синим. Палочки овоидной формы, окрашенные биполярно.х 630. б – мазок из материала от больного, окраска по Граму. Грамотрицательные, биполярно окрашенные, капсулообразующие палочки овоидной формы. х1350 Типичные колонии пересевают на скошенный МПА, чистую культуру чумных бактерий идентифицируют по морфологическим, культуральным, ферментативным, антигенным свойствам (РА с использованием диагностических сывороток против высокоспецифичного капсульного и соматического антигенов), фаголизабельности, определяют ее чувствительность к антибиотикам. Возбудитель чумы восстанавливает нитраты в нитриты, ферментирует глюкозу, ксилозу, маннит с образованием кислоты (без газа). В отличие от многих других представителей семейства энтеробактерий имеет более низкий температурный оптимум роста и физиологической активности - 28 °С. В процессе идентификации возбудитель чумы необходимо дифференцировать с другими иерсиниями (табл. 6). 22 Биологическое исследование. Заражают морских свинок или мышей подкожно, внутрибрюшинно или накожно, материалом от трупов – методом скарификации. Животные погибают на 2—7-е сутки. Одно из зараженных животных умерщвляют на 2— 3-й день с целью выделения культуры иерсиний из крови и внутренних органов. В мазках из внутренних органов, крови, экссудата погибших животных обнаруживают большое количество грамотрицательных, биполярно окрашенных бактерий. После исследования трупы животных погружают в 5% лизол, а затем сжигают. Рис. 8. Колонии возбудителя чумы (Yersinia pestis). х56 Таблица 6. Биологические свойства иерсиний Свойства Подвижность при: 250 С 28-370 С Ферментация: рамнозы раффинозы инозита мочевины сахарозы уреаза орнитиндекарбоксилаза Фракция 1 Мышиный токсин Пестицин 1 Плазмокоагулаза Фибринолизин Чувствительность к чумному фагу Вирулентная форма колоний Y. pestis - Y. pseudotuberculosis + - Y. enterocolitica + - + + + + + + R + + + S + + + + S Серологическое исследование проводится с целью ретроспективной диагностики чумы. Ставят РНГА с эритроцитами, на которых адсорбирован капсульный антиген возбудителя чумы, реакцию нейтрализации антигена (РНАг), ИФА и непрямую РИФ. Диагностический титр 1:40 и выше. Генодиагностика. Разработана ПЦР для экспресс-диагностики чумы. Самостоятельная работа студентов 1. Изучение правил пользования противочумным костюмом. 2. Изучение морфологии Yersinia pestis (мазки из содержимого бубона больного чумой – демонстрация); 3. Знакомство с методами лабораторной диагностики чумы. Используется наглядный материал (таблицы, схемы, слайды). Бактериоскопический метод (обратить внимание на типичную морфологию возбудителя). 23 Бактериологический метод (обратить внимание на характер роста; биохимическую активность - чумная палочка разлагает с образованием кислоты левулёзу, арабинозу, глюкозу, мальтозу, маннит; антигенные свойства; фаголизабельность). 4. Знакомство с препаратом для специфической профилактики чумы - живой аттенуированной вакциной из штамма EV. Микробиологическая диагностика туляремии Резервуаром возбудителя туляремии (Francisella tularensis) являются грызуны, человек заражается от них всеми известными способами (при прямом и непрямом контакте, алиментарным, аэрогенным, трансмиссивным путем). По клиническим проявлениям тулерямия напоминает чуму, однако летальность при этой инфекции не высока (1-2%). Выделяют язвенножелезистую (бубонную), глазо-бубонную, ангинозно-буббонную, кишечную и легочную формы туляремии. Методы микробиологической диагностики туляремии отражены в схеме 5. Для лабораторной диагностики туляремии широко используются иммунологические методы (серологическая диагностика, аллергические пробы), осуществляемые в обычных клинических условиях. Биопробы с выделением чистой культуры возбудителя проводятся в специализированных лабораториях особо-опасных инфекций. Серологический метод. В сыворотке крови больных специфические антитела появляются с 10-12 дня болезни. В диагностических целях используют развернутую РА (диагностический титр 1:100 и выше), РНГА (диагностический титр 1:1280 и выше), ИФА. Аллергическая проба. Выпускается 2 вида аллергена – тулярина для постановки соответственно накожной и внутрикожной аллергической пробы – раннего (положительная реакция ГЗТ с 5 дня болезни) и специфического метода диагностики туляремии. Наличие инфильтрата и гиперемии диаметром 1 см и более через 24-48 часов после введения тулярина расценивается как положительная реакция. Биологический и бактериологический методы. Выделить культуры возбудителя от больного путем непосредственного посева материала на питательные среды не удается. Для выделения чистой культуры возбудителя туляремии применяется биопроба. С этой целью исследуемый материал (см. схему 5) вводят мышам или морским свинкам подкожно, накожно, внутрибрюшинно и/или через рот. Если экспериментальные животные в течение 7-15 дней не погибают, их умерщвляют и трупы подвергают бактериоскопическому и бактериологическому исследованию. Для этого готовят мазки-отпечатки из внутренних органов и окрашивают их по Романовскому-Гимзе. Возбудитель туляремии - мелкие (0,2-0,7 мкм) кокковидные и палочковидные бактерии, располагающиеся в мазках-отпечатках из органов внутриклеточно и в виде скоплений с образованием нежной капсулы (рис. 8). Применяют также методы экспресс- диагностики (обнаружение возбудителя в материале с помощью ИФМ и ИФА). Параллельно с микроскопическим исследованием кровь, костный мозг, участки внутренних органов и лимфатических узлов трупа животного засевают на одну из плотных питательных сред (желточная среда, среда МакКоя, глюкозо-цистиновый агар с кроличьей кровью и антибиотиками), которую культивируют при 370 С. Рост туляремийного микроба в виде нежных мелких колоний (рис. 10) появляется на 3-5-20 день, иногда позже. Возбудитель туляремии хорошо размножается также в желточном мешке 12-дневного куриного эмбриона. Выделенную чистую культуру идентифицируют по морфологическим, антигенным (РА с туляремийной агглютинирующей сывороткой) и биологическим свойствам, определяют ее чувствительность к антибиотикам. В биохимическом отношении возбудитель туляремии мало активен (ферментация глюкозы, продукция сероводорода). Схема 5. Микробиологическая диагностика туляремии Материал: кровь, пунктат из бубона, соскоб из язвы, отделяемое конъюнктивы, налет из зева, мокрота и др., органы павших и больных животных, переносчики (слепни, клещи, комары), объекты внешней среды (вода, пищевые продукты, воздух). 24 Серологический метод Постановка РНГА, РА, ИФА, с целью определения антител в крови больного Аллергодиагностика Постановка внутрикожной аллергической пробы с тулярином. Учет через 24-48 часов. Биопроба Подкожное, внутрибрюшинное, или пероральное заражение материалом от больного морских свинок или белых мышей. Микроскопическое и бактериологическое исследование трупов павших животных Биологический и бактериологический метод. Выделить чистую культуру возбудителя туляремии удается только методом биопробы. 1. день. Заражение морских свинок или белых мышей. 7-15 дни. Бактериоскопическое и бактериологическое исследование трупа животного. Мазки-отпечатки из внутренних органов, окраска по Романовскому-Гимзе, РИФ. Посев на глюкозо-цистиновый агар с кроличьей кровью и антибиотиками (на желточную среду или на среду МакКоя). Культивирование посевов при 370 С в течение 3-20 дней. 10-30 дни. Учет характера роста (нежные мелкие колонии). Микроскопическое исследование типичной колонии, ее пересев на скошенный глюкозо-цистиновый агар для выделения чистой культуры. 12-33 дни. Проверка чистоты выделенной культуры, пересев на среды «пестрого» ряда для определения ферментативных свойств, постановка проб на фаголизабельность и чувствительность к антибиотикам. Идентификация культуры по антигенным свойствам (выявление специфический антигенов с помощью РА и РИФ, ИФА). 14-35 дни. Заключение о виде выделенной культуры на основании ее идентификации по морфологическим, культуральным, ферментативным, антигенным свойствам и фаголизабельности. Геноди 25 а б Рис. 9. Возбудитель туляремии (Francisella tularensis) в мазках из чистой культуры (а) и в мазках-отпечатках органов белой мыши (б), погибшей в результате биопробы. х630. Рис. 10. Колонии возбудителя туляремии на глюкозо-цистеиновом агаре. х56 Генодиагностика. Для обнаружения ДНК возбудителя туляремии разработана ПЦР. Самостоятельная работа студентов 1. Микроскопия демонстрационных микропрепаратов Francisella tularensis (окраска по Граму). Возбудитель туляремии представляет собой полиморфные мелкие бактерии кокковидной или палочковидной формы. Препараты зарисовать. 2. Серологический метод диагностики туляремии. РА с сывороткой крови больного туляремией и туляремийным диагностикумом (демонстрация, диагностический титр 1:100). РНГА с сывороткой крови больного туляремией и эритроцитарным туляремийным диагностикумом (демонстрация, диагностический титр 1:1280). ИФА с сывороткой крови больного туляремией (демонстрация, диагностический титр 1:100). 3. Специфическая профилактика туляремии: живая вакцина (высушенная живая культура вакцинного штамма туляремии). Микробиологическая диагностика сибирской язвы Основным источником инфекции являются больные травоядные животные, от которых человек заражается при непосредственном контакте, алиментарным, аэрогенным или трансмиссивным путями. Чаще всего возникает кожная форма инфекции с образованием характерного сибиреязвенного карбункула в виде уголька (anthrax), реже – кишечная, легочная, септическая формы. Методы микробиологической диагностики сибирской язвы отражены в схеме 6. Схема 6. Микробиологическая диагностика сибирской язвы Материал: отделяемое карбункула или язвы, испражнения, моча, мокрота, кровь 26 Микроскопический метод. Микроскопия окрашенных по Граму и Романовскому-Гимзе мазков из материала от больного с целью обнаружения крупных грамположительных капсулообразующих бацилл в виде цепочек, дающих специфическое свечение оболочки в РИФ Бактериологический метод. 1. день. Посев на кровяной МПА или PLETагар. Культивирование посевов при 370 С. 2 день Учет характера роста (шероховатые колонии в виде «головы медузы»). Микроскопическое исследование типичной колонии, ее пересев на скошенный МПА для выделения чистой культуры. 3 день. Проверка чистоты выделенной культуры, пересев на среды «пестрого» ряда для определения ферментативных свойств; постановка проб на фаголизабельность и чувствительность к антибиотикам. Биопроба. 4 день. Заключение о виде выделенной культуры на основании ее идентификации по морфологическим, культуральным, ферментативным, антигенным свойствам и фаголизабельности. Микроскопическое и бактериологическое исследование трупа животного, павшего в результате биопробы Биопроба Заражение материалом от больного белых мышей. Микроскопическое и бактериологическое исследование трупов Генодиагностика. ПЦР павших животных Серологический метод Постановка РНГА, РА с целью определения антител в крови больного Аллергодиагностика Постановка внутрикожной аллергической пробы с тулярином. Учет через 24-48 часов. Выявление сибиреязвенного антигена Постановка реакции термопреципитации Асколи с преципитирующей противосибириязвенной сыМикроскопический метод. Мазки из исследуемого материала окрашивают по Граму, Ромавороткой новскому-Гимзе, Ребитеру (капсула), а также люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой. Обнаружение в препаратах окруженных капсулой крупных грамположительных бацилл в виде цепочек дает возможность поставить предварительный диагноз сибирской язвы (рис.11 а). В качестве экспресс-метода диагностики применяется РИФ, с помощью которой выявляют характерные сибиреязвенные бациллы в виде палочек со светящимся желто-зеленым ободком (рис. 11 б.). Бактериологический метод - посев исследуемого материала на МПА, кровяной агар в чашках Петри или PLET-arap с полимиксином В, лизоцимом, этилен-диаминотетраацетатом (ЭДТА) и ацетатом таллия. Контаминированный материал из внешней среды, от животных, из старых трупов предварительно прогревают при 63 °С в течение 15 мин с целью уничтожения вегетативных форм микроорганизмов. Посевы помещают в термостат на сутки. Через 20 —24 ч инкубации посевов при 370 С на МПА обнаруживают характерные шероховатые колонии в виде «головы медузы», края которых при малом увеличении микроскопа имеют вид вьющихся локонов или «львиной гривы» - рис. 12. В бульоне характерен придонный рост, напоминающий комочек ваты, при этом среда остается прозрачной. Из осадка делают мазок и препарат висячей капли. В мазке обнаруживают бескапсульные грамположительные стрептобациллы (расположение в виде длинных цепочек в виде «бамбуковой палки»). В отличие от других почвенных бацилл возбудитель сибирской язвы неподвижен. Для выделения чистой культуры типичные колонии пересевают на скошенный МПА. Капсулообразование можно выявить путем биопробы или при посевах в бульон Хоттингера, на специальную среду, содержащую раствор Хенкса и 40 % стерильной сыворотки крупного рогатого скота, МПА с 0,7 % бикарбоната натрия, среду Буза (3% голодный агар с 15% дефибринированной крови барана), а также в дефибринированную лошадиную кровь. Посевы выращивают в течение 18-24 часов при температуре 370 С в атмосфере 5-7% СО2. 27 а б Рис. 11. Возбудитель сибирской язвы (Bacillus anthracis). а - окраска по Граму, б – РИФ. х630 Рис. 12. Колония Bacillus anthracis. х56 Идентификацию выделенной культуры Bacillus anthracis (3-й день исследования) и ее дифференциацию от сходных непатогенных бацилл проводят путем посева уколом в желатину (разжижение в виде елочки, перевернутой вершиной вниз), изучения биохимических свойств, фаголизабельности и заражения животных. Определяют также чувствительность культуры к антибиотикам. Одним из характерных признаков возбудителя сибирской язвы является тест «жемчужного ожерелья». На поверхность МПА в чашке Петри с 0,5 и 0,05 ЕД/мл пенициллина засевают 3-часовую бульонную культуру выделенного микроорганизма, через 3 ч инкубирования при 370 С готовят мазки, в которых при микроскопии находят «жемчужные ожерелья» в виде округлившихся стрептобацилл сибирской язвы. Почвенные бациллы сохраняют форму палочек, расположенных цепочками. Биологические свойства возбудителя сибирской язвы и сходных с ним бацилл отражены в табл. 7. Наличие сибиреязвенного антигена в разложившемся трупе животного, коже (свежей, сухой, выделанной) и изделиях из нее, шкурках, мехе, шерсти определяют с помощью реакции термопреципитации по Асколи. Исследуемый материал измельчают, заливают 10 —20-кратным объемом физиологического раствора, кипятят в течение 10-45 мин., после чего фильтруют. Полученный экстракт осторожно наслаивают на преципитирующую сибиреязвенную сыворотку в узкой преципитационной пробирке. На границе экстракта и преципитирующей сыворотки в течение 1- 5 мин в случае положительной реакции появляется кольцо белого цвета (преципитат). Контроли включают постановку реакций с заведомо положительной и отрицательной сывороткой, нормальной сывороткой и т.д. 28 Биопроба. Исследуемым материалом подкожно заражают двух белых мышей., которые погибают через 24-48 ч после заражения. В мазках из внутренних органов и крови обнаруживают типичные капсульные бациллы. Проводится бактериологическое исследование трупа белой мыши с целью выделения чистой культуры сибиреязвенных бацилл. Таблица 7. Дифференциально-диагностические признаки сибиреязвенной и других бацилл Bacillus cereus Bacillus mycoides Bacillus thuringiensis Bacillus subtilis Bacillus Megaterium Капсула Подвижность Гемолиз Рост в анаэробных условиях Лецитиназа Аргининдегидролаза Нитpaтpeдyктaзa Патогенность для мышей Ферментация до кислоты: глицерина маннита салицина Вид микроорганизмов Bacillus anthracis Признак + + + + + + + + + V + - + + V + - + + + + + + - + + - + + - - V V + + + + + + + + + + Обозначения: «-« - отрицательная; «+» - положительная; «V» - вариабельная реакции. Серологический метод выполняется в тех случаях, когда не удается обнаружить возбудителя в материале. Для определения антител в сыворотке крови больного используют реакции латексагглютинации и РНГА с протективным сибиреязвенным антигеном. Аллергический метод – постановка внутрикожной аллергической пробы с аллергеном сибиреязвенной бациллы - антраксином. Результаты учитывают через 24 ч. Пробу считают положительной при наличии гиперемии и инфильтрата диаметром более 15 мм. Самостоятельная работа студентов 1. Микроскопия демонстрационных микропрепаратов возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis, окраска по Граму). Бациллы сибирской язвы - крупные спорообразующие, капсульные грамположительные палочки, располагающиеся цепочками, напоминая бамбуковую палку. 2. Бактериологический метод. Изучить характер роста на МПА и МПБ культуры B.cereus, имитирующей рост Bacillus anthracis. На жидкой питательной среде (бульон Хоттингера) рост бацилл напоминает комочек ваты, на плотной питательной среде (МПА, сывороточный МПА для выявления капсулообразования) - «гриву льва», или «голову медузы». Сибиреязвенная палочка разжижает желатин в виде елочки верхушкой вверх. Под действием пенициллина сибиреязвенные палочки образуют сферопласты в виде жемчужин, что используется для дифференциации Bacillus anthracis от непатогенных бацилл. Отразить в рабочей тетради биологические свойства Bacillus anthracis и сходных с ней бацилл, пользуясь таблицей7. Для оценки загрязненности сырья (шерсть, шкуры животных) возбудителем сибирской язвы используется реакция кольцепреципатации по Асколи. Поставить реакцию по Асколи. Ингредиенты: преципитирующая сибиреязвенная сыворотка, термостабильный антиген из исследуемого материала, физиологический раствор. Схема постановки реакции Асколи: в препипта29 ционную пробирку наливают 0,5 мл преципитирующей сыворотки, пастеровской пипеткой сверху осторожно наслаивают антиген. В положительном случае на границе сыворотки и антигена появляется преципитат в виде кольца. В контрольную пробирку вместо антигена вносят физиологический раствор. 3. Серологическая диагностика сибирской язвы. Учесть реакцию непрямой гемагглютинации с сывороткой крови больного и эритроцитарным сибиреязвенным диагностикумом. 4. Аллергический метод диагностики сибирской язвы. Для постановки кожной аллергической пробы у больных сибирской язвой используется сибиреязвенный аллерген - антраксин (белково-полисахаридно-нуклеиновый комплекс, полученный при гидролизе бацилл сибирской язвы). 5. Специфическая профилактика сибирской язвы: живая вакцина СТИ (высушенная взвесь живых спор вакцинного штамма - варианта сибиреязвенных бацилл, названа в честь Санитарно-технического института, в котором она была разработана). 6. Специфическое лечение сибирской язвы: противосибиреязвенный иммуноглобулин (гамма-глобулиновая фракция сыворотки крови лошадей, гипериммунизированных живой вакциной и вирулентным штаммом В.anthracis). После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей основных бактериальных зоонозных инфекций (чумы, туляремии, сибирской язвы), а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: уметь ставить серологические реакции при туляремии, трактовать результаты микробиологических анализов при чуме,туляремии, сибирской язве. Педиатрические аспекты темы 1. Дети в возрасте от 1 до 2 лет прививаются противочумной вакциной только при неблагоприятной эпидемической ситуации, при этом дети до 7 лет прививаются накожно, а с 7 лет накожно и подкожно. 2. В неблагополучной по туляремии местности прививкам живой вакциной подвергают все население с 7-летнего возраста. По эпидемическим показаниям вакцинируют детей старше 2 лет. Тема 4. ВОЗБУДИТЕЛИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗООНОЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ: БРУЦЕЛЛЕЗА, ЛЕПТОСПИРОЗА, БОРРЕЛИОЗОВ, ЛИСТЕРИОЗА Цель занятия: изучение биологических свойств возбудителей бактериальных зоонозных инфекций - бруцеллеза, лептоспироза, клещевого боррелиоза, листериоза и методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Бруцеллы. Таксономия. Характеристика основных свойств. Морфологические, культуральные, биохимические признаки. Антигенное строение. Дифференциация бруцелл. Патогенность для человека и животных. Факторы патогенности. Патогенез и иммунитет при бруцеллезе. Методы микробиологической диагностики. Препараты для специфической профилактики и терапии. 2. Лептоспиры. Таксономия. Характеристика и дифференциация основных свойств. 3. Возбудители лептоспироза. Морфологические, культуральные свойства. Серовары лептоспир. Патогенность для человека и животных. Патогенез лептоспирозов. Иммунитет. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика. Лечение. 3. Листерии. Таксономия. Экология. Морфологические, культуральные, биохимические и антигенные свойства. Резистентность. Патогенность для животных. Токсинообразование. Патогенез заболеваний у человека. Иммунитет. Микробиологическая диагностика. Профилактика и лечение заболевания. 4. Боррелии. Возбудители эпидемического и эндемического возвратных тифов, клещевой боррелиоз. Морфологические и культуральные свойства. Патогенез и иммунитет. Микро30 биологическая диагностика. Неспецифическая профилактика, лечение. Биологические свойства возбудителя клещевого боррелиоза. Микробиологическая диагностика, профилактика и лечение заболевания. Микробиологическая диагностика бруцеллеза Возбудители бруцеллеза (Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis и Brucella canis) высоко контагиозны и работа с ними проводится в специализированных лабораториях особо опасных инфекций. Постановку серологических реакций и аллергических проб для диагностики бруцеллеза производят соответственно в обычных микробиологических лабораториях и больничных условиях. Главным резервуаром бруцелл являются домашние сельскохозяйственные животные, а также другие виды животных, от которых человек заражается преимущественно контактным или контактно-бытовым, реже алиментарным путем. Клинические проявления бруцеллеза многообразны, поражаются лимфатическая, сосудистая, гепато-лиенальная системы и особенно опорно-двигательный аппарат Методы микробиологической диагностики бруцеллеза представлены в схеме 7. Схема 7. Микробиологическая диагностика бруцеллеза Материал: кровь, костный мозг, моча, испражнения, грудное молоко у кормящих женщин Серологический метод Постановка РНГА, РА (реакция Райта, Хеддльсона), РСК, РИФ, ИФА, реакции Кумбса (определение неполных антител) с целью определения антител в крови больного Аллергодиагностика постановка внутрикожной аллергической пробы Бюрне с бруцеллином. Учет через 24-48 часов. Генодиагностика. ПЦР Биопроба Внутрибрюшинное или подкожное заражение материалом от больного морских свинок или белых мышей. Микроскопическое и бактериологическое исследование трупов павших животных Бактериологический метод. 1. день. Посев крови на печеночного МПБ или на глюкозный МПБ с 2 % глицерина и антифаговой сывороткой. Культивирование посевов при 370 С до 30 дней в обычных условиях и в атмосфере 10% СО2. Пересевы на скошенный печеночный МПА или эритрит-агар каждые 4-5 дней. 5-30 дни. Учет характера роста на печеночном МПА, эритрит-агаре (округлые, диаметром до 5 мм, серовато-белые, блестящие, прозрачные колонии) и глюкозном МПБ (помутнение и слизистый осадок). Пересев типичных колоний на скошенный МПА. 3 день. Проверка чистоты выделенной культуры, пересев на среды «пестрого» ряда для определения ферментативных свойств; постановка проб на фаголизабельность, чувствительность к антибиотикам и к бактериостатическому действию красителей. Идентификация по антигенной структуре в РА. Биопроба. 4 день. Заключение о виде выделенной культуры на основании ее идентификации по морфологическим, культуральным, ферментативным (биохимическая инертность), антигенным свойствам и фаголизабельности. Микроскопическое и бактериологическое исследование трупа животного, павшего в результате биопробы Серологический метод - постановка РА с сывороткой крови больного (реакция Райта, ставят в начале 2-й недели болезни, диагностический титр 1:200 и выше), ускоренной РА на стекле (реакция Хеддльсона), РСК и ИФА. Диагностикумом в реакции Райта и Хеддльсона является взвесь убитых бруцелл с красителем генциановым фиолетовым или метиловым фиолетовым. Реакцию агглютинации Хеддльсона ставят на стеклянной пластинке, на которую наносят микропипеткой неразведенную исследуемую сыворотку в количествах 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 и 0,02 мл, добавляют по 0,03 мл бруцеллезного диагностикума, кроме последней дозы, в которую 31 вносят 0,03 мл ФР (контроль сыворотки). Контролем диагностикума является смесь из 0,03 мл антигена и 0,03 мл ФР. Все капли перемешивают стеклянной палочкой или бактериологической петлей и после легкого покачивания стекла наблюдают за появлением мелкозернистого окрашенного агглютината. Отсутствие агглютинации во всех пробах сыворотки оценивается как отрицательная реакция, наличие агглютинации в 1-й пробе (0,08 мл сыворотки) - сомнительная, во 2-й (0,04 мл) - слабоположительная, в 3-й или 4-й пробах (0,02-0,01 мл) - положительная, во всех пробах - резко положительная реакция. Поскольку реакция агглютинации Хеддльсона иногда бывает положительной у здоровых людей за счет нормальных антител, она обязательно подтверждается реакцией Райта. РИФ, РНГА, РСК и особенно ИФА более чувствительны, чем реакция агглютинации. Для ранней диагностики бруцеллеза особую ценность имеет ИФА, позволяющий выявить в сыворотке больных антибруцеллезные антитела класса IgM, которые в отличие от IgG появляются в ранние сроки болезни, свидетельствуя о свежем инфицировании. Аллергический метод – постановка внутрикожной аллергической пробы Бюрне с 15-20 дня заболевания. Учет реакции проводится через 24-48 часов, положительной считается реакция в случае появления на месте введения аллергена (бруцеллина) болезненности, гиперемии и инфильтрации кожи диаметром 3 см и более. Положительная аллергическая реакция на бруцеллин сохраняется в течение длительного времени после перенесенного бруцеллеза, а также после прививки. Бактериологический метод - посев крови для выделения гемокультуры в 2 флакона с 50 мл печеночного или асцитического бульона (рН 7,1-7,2) или МПБ с добавлением 1 % глюкозы, 2 % глицерина и антифаговой сыворотки (для инактивации бруцеллезного бактериофага) в первые дни болезни при наличии лихорадки. При отрицательных результатах исследование повторяют, т.к. бактериемия наблюдается в течение 1 года и более. Один флакон выращивают в обычных аэробных условиях, другой — в герметично закрытом сосуде с 10 % углекислого газа (или СО2-инкубаторе) при температуре 370 С до 1 месяца, делая пересевы на скошенный печеночный агар или эритрит-агар каждые 4-5 дней. На жидких средах бруцеллы растут с образованием легкого помутнения и небольшого слизистого осадка, на плотных средах в виде округлых, диаметром до 5 мм, серовато-белых, блестящих, прозрачных с янтарным оттенком в проходящем свете колоний. Типичные колонии пересевают на скошенный агар и идентифицируют выделенную культуру до уровня вида. Выполняются также посевы исследуемого материала в желток свежего куриного яйца или в желточный мешок куриного эмбриона с последующей их инкубацией в течение 5 дней при 370 С и пересевом содержимого желточного мешка на плотные и жидкие питательные среды для выделения чистой культуры бруцелл. Бруцеллы идентифицируют на основании изучения морфологических (рис. 13 - грамотрицательные коккобактерии), культуральных, биохимических (они не ферментируют уг- Рис. 13. Возбудитель бруцеллеза (Brucella melitensis). Окраска по Граму. Мелкие грамотрицательные коккобактерии. леводы, не свертывают молоко и не разжижают желатину, выделяют сероводород), антигенных свойств (постановка РА с моноспецифическими сыворотками против антигенов А, М, R), чув32 ствительности к специфическому бактериофагу и бактериостатическому действию анилиновых красителей (табл. 8). Таблица 8. Дифференциация основных видов бруцелл Признак Вид бруцелл Br. melitensis аэробные Br. abortus 10% СО2 Br. suis аэробные фуксином 1:50000 + + - тионином 1:25000 + - + пиронином 1:200000 + + - - ± ± А ± ± + М ± ± ± - + ± Условия культивирования Рост на средах с красителями: Образование Н2S РА с монорецепторными сыворотками Чувствительность к бруцеллезному фагу . Обозначения: «-« - отрицательная; «+» - положительная; «±» - непостоянная реакции. Самостоятельная работа студентов 2. Серологический метод. Реакция Хеддльсона (РA на стекле) – самостоятельная работа. Ингредиенты: бруцеллёзный диагностикум, сыворотка больного, физиологический раствор. Реакция ставится на стекле по схеме.. Реакция считается положительной при появлении хлопьев в каплях, в которые внесено 0,02 или 0,01 мл сыворотки больного, Реакция Pайта (развернутая РА) с сывороткой крови больного с подозрением на бруцеллез и бруцеллёзным диагностикумом (демонстрация). Диагностический титр I:100. реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) с сывороткой крови больного с подозрением на бруцеллез и эритроцитарным бруцеллезным диагностикумом (демонстрация). Диагностический титр 1:100. Реакция связывания комплемента (РСК) с сывороткой крови больного с подозрением на бруцеллез. Иммуноферментный анализ (ИФА) с сывороткой крови больного с подозрением на бруцеллез 2. Специфическая профилактика и лечение бруцеллёза: живая вакцина для профилактики, убитая вакцина для лечения, сыворотки бруцеллезные, агглютини рующие диагностические диагностикум бруцеллезный для постановки реакций Райта и Хеддльсона с целью выявления антител в крови больных, бруцеллин- аллерген для постановки внутрикожных аллергических проб Микробиологическая диагностика лептоспироза Возбудитель лептоспироза – Leptospira interrogans вызывает нетрасмиссивную природноочаговую зоонозную инфекцию, протекающую в виде почечной (безжелтушной) или почечнопеченочной (желтушной) формах. Описано более 200 сероваров патогенных лептоспир, объединенных в 23 серогруппы. Наиболее распространены серовары pomona, grippotyphosa, canicola, icterohaemorrhagiae, hebdomadis. Источниками инфекции являются грызуны, дикие и сельскохозяйственные животные. Заражение человека происходит при купании и использова33 нии воды из открытых водоемов, зараженных мочой больных животных, при контакте с инфицированным сырьем, употреблении зараженных лептоспирами продуктов. Методы микробиологической диагностики лептоспироза отражены в схеме 8. Бактериоскопический метод. Обычно проводится микроскопическое исследование материала с целью обнаружения живых лептоспир с помощью темнопольной микроскопии в препаратах «раздавленной капли». При микроскопии с использованием большого увеличения лептоспиры выглядят в виде тонких спиралевидных микроорганизмов с концами, напоминающими буквы С или S. Лептоспиры обладают поступательным, вращательным, сгибательным движением. Схема 8. Микробиологическая диагностика лептоспироза Материал: кровь, моча, спинно-мозговая жидкость, секционный материал Микроскопический метод. Темнопольная микроскопия материала в препаратах «раздавленной капли». Выявление тонких спиралевидных микроорганизмов с концами в виде букв С или S, обладающих поступательным, вращательным, сгибательным движением Серологический метод Постановка реакции микроагглютинации и лизиса лептоспир (РМАЛ) РИФ, ИФА, РНГА с целью определения антител в крови больного Бактериологический метод. 1. день. Посев на жидкие сывороточные питательные среды (Ферворта-Вольфа, Терских и др.) Культивирование посевов при 25-280 С в течение 10 дней и более. Лептоспиры не вызывают изменений внешнего вида среды. Их наличие в среде определяют темнопольной микроскопией. Идентификация по антигенным свойствам с помощью РА Биопроба Внутрибрюшинное заражение материалом от больного морских свинок или хомячков. Микроскопическое и бактериологическое исследование трупов павших животных Генодиагностика. ПЦР Бактериологический метод. Для выделения лептоспир применяют жидкие питательные среды (Ферворта-Вольфа, Терских и др.), в состав которых входит инактивированная кроличья сыворотка. Лептоспиры растут медленно (до 10 дней и более), не изменяя внешнего вида среды. Наличие лептоспир в среде подтверждается с помощью метода темнопольной микроскопии. Биопроба. Ставится на морских свинках или золотистых хомячках. При наличии в материале лептоспиры серовара icterohaemorrhagiae у морских свинок через 5-10 дней появляется желтушная окраска склер и слизистых оболочек и через 48 часов после этого животные погибают. В моче и крови при микроскопии обнаруживают лептоспиры. Хомячки погибают в течение первых дней или месяца. С целью обнаружения лептоспир у зараженных животных проводится темнопольная микроскопия, а также посевы крови и ткани почек для выделения культуры лептоспир. Серологический метод - постановка реакции микроагглютинации и лизиса лептоспир (РМАЛ - диагностический титр 1:10), РИФ, ИФА, РНГА с целью выявления специфических антител в крови больных. Генодиагностика – разработана ПЦР для определения специфических фрагментов ДНК лептоспир. Самостоятельная работа студентов 1. Микроскопическое исследование морфологии возбудителя лептоспироза - Leptospira interrogans методом темнопольной микроскопии. Обратить внимание на характерную мор34 фологию (тонкие спиралевидные микроорганизмы с концами в виде букв С или S, обладающие поступательным, вращательным, сгибательным движением). 2. Знакомство с питательными средами для выращивания лептоспир (среды Ферворта-Вольфа, Терских) 3. Учет РНГА и ИФА, поставленных с сыворотками крови больных с подозрением на лептоспироз. 4. Знакомоство с биопрепаратами для профилактики и лечения лептоспироза. лептоспирозная вакцина - для профилактики заболевания, содержит культуры убитых нагреванием лептоспир. Лептоспирозный иммуноглобулин, полученный из сыворотки крови животных, иммунизированных убитыми лептоспирами. Микробиологическая диагностика боррелиозов (возвратные тифы, болезнь Лайма) Возбудителями боррелиозов являются Borrelia recurrentis (возбудитель эпидемического вшивого возвратного тифа, в настоящее время в России не регистрируется), Borrelia dutton, Borrelia persica, Borrelia sogdianum и др. (возбудители африканского и среднеазиатского эндемических клещевых возвратных тифов), а также Borrelia burgdorferi, Borrelia garini, Borrelia afzellii – возбудители клещевого боррелиоза (болезни Лайма). Возвратные тифы характеризуются развитием возвратной лихорадки, болезнь Лайма в начальной стадии – поражением кожи в виде мигрирующей эритемы, позднее – поражением сердца, опорно-двигательного аппарата, нервной системы и кожи. Исследуемым материалом является кровь. Для диагностики боррелиозов применяются следующие методы. Микроскопический метод – исследование мазков крови и толстой кровяной капли, окрашенных по Романовскому-Гимза. Боррелии – извитые лилового цвета микроорганизмы, образующие до 9 крупных неравномерных завитков. При болезни Лайма микроскопический метод не применяется, т.к. в периферической крови возбудитель не обнаруживается. Бактериологический метод. Боррелии удается культивировать на специальной среде (BSK-11), однако в реальной практике метод не используется. Серологическое исследование. Является основным методом лабораторной диагностики при болезни Лайма. Для определения антител к Borrelia burgdoferi применяется метод иммунофлюоресценции, ИФА. Самостоятельная работа студентов 1. Морфология боррелий – возбудителей возвратного тифа (Borrelia recurrentis). Мазок из крови больного возвратным тифом (демонстрация). Окраска по Романовскому - Гимза. Среди эритроцитов заметны тонкие лиловые удлиненные спирохеты, образующие до 9 крупных неравномерных завитков. 2. Учет ИФА, поставленного с сывороткой крови больного с подозрением на болезнь Лайма для выявления специфических антител. Микробиологическая диагностика листериоза Источником инфекции являются различные виды диких и домашних животных. Человек заражается алиментарным, аэрогенным путями, при контакте с больными животными, а также половым путем при листерийных уретритах. Листериоз протекает в виде глазо-железистой или ангинозно-железистой, нервной (менингит, менингоэнцефалит, энцефалит) и смешанной форм. Листериоз у беременных женщин сопровождается инфицированием плода, приводя либо к его гибели, либо к развитию у него различных уродств. Материалом для исследования является кровь, смывы из зева, спинномозговая жидкость, околоплодные воды, плацента. Применяются следующие методы диагностики. Бактериоскопический метод. В мазках из исследуемого материала, окрашенных по методу Грама, листерии выглядят в виде мелких коротких (0,5-2x0,4-0,5 мкм) грамположительных палочек. Метод имеет ориентировочное значение. В качестве экспресс-диагностики используют прямой метод иммунофлюоресценции. 35 Бактериологический метод – посев на специальные питательные среды (кровяной агар, сердечно-мозговой бульон и др.) и на среды, содержащие селективные добавки (NaCl в высокой концентрации, антибиотики полимиксин и цефтазидим, другие селективные добавки). Посевы культивируют при температуре 350 С в течение 5-7 дней. На кровяном агаре листерии вызывают β-гемолиз. Идентификацию культуры до уровня вида осуществляют на основании изучения морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических и антигенных свойств (по Н- и Оантигену). Выполняется также фаготипирование. Г е н од и а гн о ст и к а . Д ля постановки предварительного диагноза применяют ПЦР с целью обнаружения ДНК возбудителя. Серологические методы диагностики листериоза в реальной практике не применяется, т.к. они мало информативны. Педиатрические аспекты темы 1. При рассмотрении вопросов по бруцеллёзу обратить внимание на следующее: дети заражаются бруцеллёзом в 60,8% случаев алиментарным путем при употреблении сырого молока и молочных продуктов, реже (в 30,5%), отмечается контактный путь заражения. Внутриутробная передача бруцеллеза и заражение грудных детей через молоко больной матери бывают крайне редко; заболеваемость бруцеллёзом появляется в весенние месяцы (март, апрель, май) в период массового окота скота; при серодиагностике бруцеллеза у детей диагностический титр в реакциях Райта и Хеддльсона ниже, чем у взрослых -1:100; профилактика бруцеллёза заключается в том, что дети и подростки не допускаются ко всем видам работ с инфицированными животными, а также с сырьем, получаемым от них. Дети, больные бруцеллёзом и дети из очагов инфекции берутся под непрерывное диспансерное наблюдение; в очагах бруцеллёза беременные женщины обязательно обследуются на бруцеллез. Больные бруцеллезом беременные женщины находятся под диспансерным наблюдением; специфическая профилактика бруцеллёза у детей проводится с 7- летнего возраста живой бруцеллёзной вакциной. После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей бактериальных зоонозных инфекций (бруцеллеза, лептоспироза, боррелиозов, листериоза), а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: уметь ставить серологические реакции Райта и Хеддльсона при бруцеллезе, оценивать результаты микробиологических анализов при бруцеллезе, лептоспирозе, боррелиозе, листериозе. Тема 5. МИКРОБИОЛОГИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ: САЛЬМОНЕЛЛЫ - ВОЗБУДИТЕЛИ БРЮШНОГО ТИФА, ПАРАТИФОВ И ПИЩЕВЫХ ТОКСИКОИНФЕКЦИЙ Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей бактериальных кишечных инфекций – брюшного тифа, паратифов, пищевых токсикоинфекций, методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Семейство Enterobacteriaceae. Таксономия. Общая характеристика, их эволюция. Морфологические, культуральные, биохимические свойства. Антигенная структура. Ферменты. Токсины. Бактерионосительство. 2. С ал ь мон еллы. Классификация по Кауфману-Уайту. Патогенность для человека и животных. 3. Сальмонеллы – возбудители брюшного тифа и паратифов А, В. Биологические свойства. Антигенная структура. Патогенез заболеваний. Патогенетические основы микробиологи- 36 ческой диагностики. Особенности иммунитета. Бактерионосительство. Специфическая профилактика и этиотропная терапия. 4. Сальмонеллы – возбудители сальмонеллезов. Патогенез. Роль энтеро- и эндотоксинов в возникновении диарейного синдрома. Микробиологическая диагностика. Этиотропная терапия. 5. Сальмонеллы – возбудители госпитальных инфекций. Микробиологическая диагностика брюшного тифа и паратифов Ознакомиться со схемой лабораторной диагностики брюшного тифа и паратифов Возбудителями брюшного тифа и паратифов (А, В) являются бактерии рода Salmonella, в состав которого входят два вида: Salmonella enterica с 6 подвидами (включая возбудители брюшного тифа, паратифов, сальмонеллезов – всего более 2400 сероваров) и Salmonella bongori (редко встречающиеся сальмонеллы). Возбудитель брюшного тифа обозначается как Salmonella серовара Typhi (Salmonella enterica spp. enterica ser. typhi, прежнее название Salmonella typhi), паратифа А — Salmonella серовара Paratyphi A, паратифа В — Salmonella серовара Paratyphi В. Методы микробиологической диагностики брюшного тифа и паратифов представлены в схеме 9. Выбор материала и метода микробиологической диагностики этих заболеваний зависит от стадии патогенеза. На первой неделе заболевания и в течение всего лихорадочного периода возбудитель можно выделить из крови (гемокультура), с конца второй и на третьей неделе — из мочи (уринокультура) и испражнений (копрокультура). Высокий процент высеваемости возбудителя отмечается при исследовании костного мозга (выделение миелокультуры). Удается обнаружить сальмонеллы в скарификате розеол (розеоло-культура), ликворе, содержимом двенадцатиперстной кишки, секционном материале. У реконвалесцентов исследуют испражнения и желчь (выделение биликультуры). Начиная со второй недели заболевания проводят серологическое исследование. Микроскопическое исследование материала от больного не проводится, т.к. все энтеробактерии (как патогенные, так и непатогенные, например, E.coli) по морфологическим свойствам идентичны (рис. 14). Бактериологическое исследование является основным лабораторным методом диагностики брюшного тифа и паратифов. Ранним и надежным методом бактериологической диагностики является выделение возбудителей из крови (гемокультура). Взятую в асептических условиях кровь (15-20 мл) засевают на 10% желчный бульон или среду Рапопорт (10% желчный бульон, 1 % маннита или 2 % глюкозы, 1 % индикатора Андреде; в среду помещен поплавок для улавливания газа) в соотношении крови и среды 1:10 для накопления сальмонелл. Посевы инкубируют при 370 С 18 —24 ч. При наличии сальмонелл маннит или глюкоза расщепляется с образованием кислоты и среда приобретает красный цвет; появление в поплавке газа свидетельствует о газообразовании - характерном признаке паратифозных бактерий. Схема 9. Микробиологическая диагностика брюшного тифа и паратифов. 37 Материал для исследования: кровь, моча, испражнения, пунктат костного мозга, скарификат розеол, ликвор, желчь, секционный материал и др. Бактериологический метод 1 день. Посев крови на среду Раппопорт, испражнений, мочи и др. на среду Плоскирева, Эндо, висмут-сульфит агар ВСА) и среды накопления (селенитовую, магниевую, тетратионатную, Кауфмана, Мюллера). Культивирование сутки при 370 С. 2 день. Учет характера роста на среде Раппопорт (при наличии сальмонелл среда окрашивается в красный цвет в результате расщепления маннита или глюкозы; паратифозные бактерии вызывают газообразование). На средах Плоскирева, МакКонки или Эндо - бесцветные (лактозоотрицательные) колонии, на ВСА – черные (колонии сальмонелл паратифа А на ВСА окрашены в зеленый цвет, так как не образуют сероводород). Из типичных колоний готовят мазок, окрашивают по Граму и после микроскопии остаток колонии пересевают на среду Ресселя или Олькеницкого. Пересев на те же среды материал со сред обогащения при отсутствии на них типичных колоний. 3-й день. Учет характера роста на средах Ресселя или Олькеницкого, проверка чистоты выделенной культуры, пересев в среды «пестрого» ряда для изучения биохимических свойств, постановка ОРА со смесью сальмонеллезных О-сывороток, а затем с монорецепторными О- и Н-сыворотками с целью антигенной идентификации сальмонелл брюшного тифа и паратифов. Постановка развернутой РА, посев для определения фаголизабильности и фаговара. 4-й день. Учет изменений в средах «пестрого» ряда, результатов развернутой РА, фаголизабельности и фаговара. Формулировка ответа. Серологический метод Постановка реакции Видаля (развернутая РА) с ОН, О- брюшнотифозным, паратифозным А и паратифозным В диагностикумами, РНГА с эритроцитарными групповыми (А, В, С, Д, Е) и монорецепторными диагностикумами, ИФА с парными сыворотками крови больного в динамике заболевания с целью определения соответствующих антител и нарастания их титра в крови больного. Определение антител к Vi-антигену S.typhi в сыворотке крови брюшнотифозных бактерионосителей с помощью РНГА а б Рис. 14. а - кишечная палочка (E.coli ув. Х1350), б - возбудитель брюшного тифа (S.typhi, ув. Х630) в мазках из чистой культуры. Окраска по Граму. Грамотрицательные беспорядочно расположенные палочки средних размеров. 38 Копрокультуру выделяют путем посева фекалий на среду Плоскирева, Эндо, висмут-сульфит агар и среды накопления (селенитовую, магниевую, тетратионатную, Кауфмана, Мюллера) с последующей 18 —24-часовой инкубацией при 37 °С. На 2-й день на средах Плоскирева, МакКонки или Эндо вырастают бесцветные (лактозоотрицательные) колонии, а на висмут-сульфит-агаре – черные. Колонии сальмонелл паратифа А окрашены в зеленый цвет, так как не образуют сероводород. Из типичных колоний готовят мазок, окрашивают по Граму и после микроскопии остаток колонии пересевают на среду Ресселя или Олькеницкого. При отсутствии типичных колоний на те же среды засевают материал со среды обогащения. На 3-й день исследования учитывают характер роста на среде Ресселя или Олькеницкого (окрашивание столбика среды Ресселя в синий цвет, среды Олькеницкого в желтый в результате ферментации глюкозы в анаэробных условиях; скошенная часть среды не изменена – отсутствие ферментации лактозы), готовят мазок для проверки чистоты выделенной культуры, выполняют пересев в среды «пестрого» ряда для изучения биохимических свойств (см. табл. 10), после чего ставят ориентировочную, а потом развернутую РА. Ориентировочную РА ставят со смесью Осывороток, включающей агглютинины к О-антигенам 2, 4, 7, 8, 9, 3-10. При отсутствии РА с этой смесью используют смесь монорецепторных О-сывороток к редким группам сальмонелл (антитела к антигенам 11, 13, 15, 19, 23 и т.д.) При получении положительных результатов культуру испытывают отдельно с каждой из О-сывороток, входящих в состав смеси. После этого культуру агглютинируют с Н-сыворотками 1 фазы (a, b, i, c, d, g, m) а потом 2 фазы (1,2; 1,5), устанавливая антигенную формулу выделенной сальмонеллы в соответствии со схемой Кауфмана-Уайта (таблица 9). Эта схема разработана на основании изучения у сальмонелл О и Н антигенов и применяется с целью антигенной идентификации патогенных сальмонелл. Таблица 9. Антигенная структура сальмонелл (сокращенная схема Кауфмана-Уайта) Группа Серовар О-антиген А B Paratyphi A Paratyphi B Typhi murium Paratyphi C Cholerae suis 1, 2, 12 1, 4, 5, 12 1, 4, 5, 12 6, 7, Vi 6, 7 Typhi Enteritidis 9, 12, Vi 1, 9, 12. C D Н-антиген Фаза 1 Фаза 2 a b 1, 2 i 1, 2 c 1, 5 c 1, 5 d g, m - На 4-й день от начала исследования учитывают изменения сред «пестрого» ряда (см. табл. 10), результаты развернутой РА и выдают ответ. Выделенные культуры подвергают фаготипированию, что позволяет установить источник и пути заражения. Мочу, дуоденальное содержимое, соскоб розеол, секционный материал с целью выделения тифо-паратифозных бактерий засевают на плотные среды (Эндо, Мак-Конки и т.п. в чашке Петри), а также в среды накопления. При наличии характерного роста идентификация проводится по вышеописанной схеме. Таблица 10. Биохимические свойства возбудителей брюшного тифа и паратифов Биовар S.enterica Typhi Paratyphi A Paratyphi В ЛактоЗы - Ферментация Глю- Маль- Сахакозы тозы розы К К КГ КГ КГ КГ - Маннита К КГ КГ Продукция NH3 индола + + + - Н2S 39 Обозначения: (+) - наличие свойства, (-) - отсутствие свойства, К – образование кислоты, КГ – образование кислоты и газа. Аналогично проводится исследование испражнений у переболевших брюшным тифом и паратифом лиц, а также у работников детских учреждений, питания и водоснабжения с целью выявления бактерионосителей. Серологическое исследование. Для серологической диагностики брюшного тифа и паратифов ставят реакцию Видаля (развернутая РА) с целью определения соответствующих антител в крови больного. Антитела к возбудителям брюшного тифа, паратифов А и В обнаруживаются в сыворотке крови больных с 8— 10-го дня заболевания. Исследуемую сыворотку крови разводят двукратно в 6 параллельных рядах пробирок от 1:100 до 1: 1600 в объеме 1 мл, куда вносят по 2 капли ОН- и О- брюшнотифозного, паратифозного А и паратифозного В диагностикумов. Одиагностикумы получают кипячением или обработкой спиртом взвеси соответствующих культур, ОН-диагностикумы - обработкой формалином. Для контроля антигена диагностикумы вносятся в той же дозе в 1 мл физиологического раствора, а для контроля сыворотки используют сыворотку в разведении 1:100 без добавления диагностикумов. О-антитела имеют диагностическое значение, они появляются в крови на второй неделе заболевания и исчезают к его концу, а Н-агглютинины нарастают к концу заболевания. и диагностической ценности не имеют. Н-антитела могут обнаруживаться также у переболевших и вакцинированных. Ряд брюшнотифозных вакцин вызывает также выработку Vi – и О антител. Диагностический титр О-антител в реакции Видаля у неиммунизированных лиц 1 :100, а при отсутствии типичной клинической картины - 1 :200. Однако титр антител у больных может быть ниже диагностического в связи с ранним назначением антибиотиков или наличием у больного вторичного иммунодефицита. Таким образом, отрицательная реакция Видаля не исключает тифопаратифозное заболевание. С другой стороны, повышенные титры О-антител могут быть обусловлены прививками. Поэтому при подозрении на брюшной тиф или паратифы целесообразно исследовать сыворотку крови как можно раньше (до появления антител), а затем в динамике (с интервалом 7-12 дней) для выявления нарастания титра антител более чем в 4 раза. Если сыворотка крови больного агглютинирует одновременно два или три вида диагностикумов, учитывают титр агглютинации: специфическая агглютинация происходит обычно с более высокими, а групповая — с более низкими разведениями сыворотки. Более чувствительны РНГА с эритроцитарными групповыми (А, В, С, Д, Е) и монорецепторными диагностикумами, а также ИФА, которые ставят с парными сыворотками в динамике заболевания. Vi-антитела чаще обнаруживаются у бактерионосителей сальмонелл брюшного тифа, т.к. Viантиген способствует длительной персистенции возбудителя в организме. При обследовании лиц, подозрительных на носительство брюшнотифозных палочек, применяется РНГА с эритроцитарным Vi-диагностикумом для определения соответствующих антител и их принадлежности к классу IgG. Самостоятельная работа студентов Изучить основные этапы бактериологического метода диагностики брюшного тифа. 1. Бактериологический метод – выделение гемокультуры: Учесть характер роста бактерий на среде Раппопорт (желчный МПБ с глюкозой, индикатором Андреде и поплавком для улавливания газа), висмут-сульфит агаре, среде Левина (МПА с лактозой, с эозином и метиленовым синим), среде Олькеницкого (МПА с глюкозой, лактозой, сахарозой, мочевиной и индикатором феноловым красным). Разложение глюкозы сопровождается пожелтением столбика, скошенная часть остается без изменений в случае отсутствия разложения лактозы. При разложении лактозы наблюдается пожелтение скошенной части среды. При образовании сероводорода на границе скошенной части и столбика наблюдается почернение. Среда позволяет также учесть газообразование. При разложении мочевины среда окрашивается в красный цвет. Используется также накопительная селенитовая среда; 40 контроль чистоты выделенной культуры. Со среды Олькеницкого приготовлен мазок, окрашен его по Граму. Промикроскопировать и зарисовать демонстрационные препараты сальмонелл – возбудителей тифо-паратифозных заболеваний (S.typhi, S.paratyphi, S.schottmuelleri, окраска по Граму), приготовленные из чистых культур. Сальмонеллы – грамотрицательные палочки с закругленными краями, идентичны по морфологическим свойствам; идентификация выделенной культуры возбудителя: - по антигенным свойствам – учесть ориентировочную реакцию агглютинации (ОРА) на предметном стекле со смесью монорецепторных агглютинирующих О-сывороток, а также с отдельными О- (2, 4, 7, 9), Н- 1 фазы (a, b, c, d) и Н-2 фазы (1,2) сыворотками. Развернутая реакция агглютинации (демонстрация) ставится в пробирках с двукратными последовательными разведениями специфической агглютинирующей сыворотки от I:200 и выше до титра (титр указывается на ампуле с сывороткой) и выделенной культурой; в качестве контроля используется физиологический раствор. Во все пробирки вносят по 2 капли исследуемой культуры, выдерживают в термостате при 370 С в течение 2 часов, затем 18-20 часов при комнатной температуре, после чего производят учет. - по биохимическим свойствам - определить биохимическую активность исследуемой культуры по пестрому ряду Гисса или Пешкова (демонстрация). Обратить внимание на расщепление глюкозы и отсутствие расщепления лактозы и сахарозы. - по фаголизабельности - учесть пробу на фаголизабельность (демонстрация) Определение фаговара выделенной культуры (демонстрация). Сделан посев выделенной культуры "газоном" на чашку с МПА. На поверхность посева нанесено по 1 капле специфических типовых фагов. Фаговар определяют по наличию "стерильных" пятен на месте нанесения типового фага cooответствующего фаговару культуры через сутки инкубации в термостате при 370 С. Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикам методом бумажных дисков (демонстрация). 2. Серологический метод диагностики тифо-паратифозных заболеваний. Учесть демонстрационную реакцию агглютинации Видаля, поставленную с четырьмя диагностикумами (брюшнотифозными О и Н, паратифозными А и В ОН). Сыворотка крови больного титруется от 1:100 и выше. Диагностический титр - 1:200. Учесть реакцию непрямой Vi-гемагглютинации (демонстрация). Реакция поставлена с сывороткой крови больного и зритроцитарным Vi -диагностикумом. Диагностический титр 1:50 – I:100 3. Изучать биопрепараты, используемые для диагностики, лечения и профилактики тифопаратифозных заболеваний: - диагностикумы (взвеси убитых бактерий) для постановки реакции агглютинации (Видаля) брюшнотифозные О и Н, паратифозные А и В ОН с целью определения антител в крови больного; - эритроцитарный Vi-диагностикум - взвесь эритроцитов, конъюгированных с Viантигеном S.typhi. Используется для постановки реакции непрямой Vi- гемагглютинации с целью и выявления бактерионосительства; - сальмонеллезные групповые адсорбированные и монорецепторные О- и Н- агглютинирующие сыворотки для определения антигенной структуры сальмонелл с помощью РА - типовые сальмонеллезные бактериофаги для фаготипирования сальмонелл - брюшнотифозные вакцины. На протяжении ряда лет для профилактики брюшного тифа используются убитые цельноклеточные брюшнотифозные вакцины, которые заменяют в нестоящее время живой оральной или полисахаридной вакцинами. Одна из них - ВИАНВАК, обогащенная хроматографически чистым полисахаридным Vi-антигеном, для профилактики брюшного тифа. Разработана также живая пероральная брюшнтифозная вакцина. Кроме того, в России зарегистрирована вакцина ТИФИМ Ви производства французской фирмы Авентис Пастер, приготовленная на основе полисахарида, выделенного из бактерий Salmonella typhi. 41 - поливалентный брюшнотифозный бактериофаг (таблетки с кислотоустойчивым покрытием) для экстренной профилактики брюшного тифа. Педиатрические аспекты темы 1. Диагностический титр в реакции Видаля у детей 1:100. Положительная реакция Видаля у детей от 1 года до 14 лет регистрируется в 65 – 90% случаях в конце первой, начале второй недели заболевания. Микробиологическая диагностика сальмонеллезов Помимо сальмонелл – возбудителей брюшного тифа и паратифов А и В, описано более 2400 патогенных сероваров сальмонелл, вызывающих у человека острые гастроэнтериты, тифоподобные и септикопиемические формы заболевания, объединенных под названием сальмонеллез. Основными возбудителями сальмонеллеза являются Salmonella сероваров enteritidis, typhimurium, choleraesuis, haifa и т.д. Бактериологический метод является ведущим методом в лабораторной диагностике сальмонеллеза (схема 10). Культуры сальмонелл чаще всего удается выделить из испражнений больных, несколько реже — из рвотных масс и промывных вод желудка, еще реже — из крови, мочи и желчи. Выделение сальмонелл из крови, костного мозга, спинномозговой жидкости, рвотных масс и промывных вод желудка подтверждает диагноз сальмонеллеза. У бактерионосителей сальмонеллы можно обнаружить в кале, моче, желчи. Исследуемый материал засевают на чашки с висмут-сульфитным агаром и в среды накопления (магниевую, селенитовую), из которых через 6— 10 ч делают пересев на висмут-сульфит агар. Посевы выращивают при температуре 370 С, на второй день отбирают колонии черного цвета и пересевают на среду Олькеницкого (или Ресселя) для накопления чистой культуры. На 3-й день исследования выделенные чистые культуры пересевают в среды «пестрого» ряда и ставят РА с поливалентными и групповыми (А, В, С, Д, Е) адсорбированными сальмонеллезными сыворотками. Если получен положительный результат с одной из групп сывороток, проводят РА с адсорбированными О-сыворотками, характерными для данной группы, а затем с монорецепторными Н-сыворотками (неспецифической и специфической фазами) для определения серогруппы и серовара сальмонеллы в соответствии со схемой Кауфмана-Уайта. На 4-й день исследования учитывают изменения сред «пестрого» ряда (табл. 10). Возбудители сальмонеллеза так же, как сальмонеллы паратифа В, не ферментируют лактозу и сахарозу, расщепляют глюкозу, маннит и мальтозу с образованием кислоты и газа, не образуют индола и (за небольшим исключением) выделяют сероводород. Схема 10. Микробиологическая диагностика сальмонеллезов. Материал для исследования: испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка, кровь, моча и желчь, пунктат костного мозга, спинномозговая жидкость. 42 Бактериологический метод 1 день. Посев на ВСА и в среды накопления (магниевую, селенитовую). Пересев из сред накопления через 6— 10 ч на ВСА. Культивирование сутки при 370 С. 2 день. Пересев колоний черного цвета с ВСА на среду Олькеницкого (или Ресселя) для накопления чистой культуры. 3-й день. Учет характера роста на средах Ресселя или Олькеницкого, проверка чистоты выделенной культуры, пересев выделенной чистой культуры в среды «пестрого» ряда, постановка ОРА с поливалентными и групповыми (А, В, С, Д, Е) адсорбированными сальмонеллезными сыворотками. При положительном результате с одной из групп сывороток, проводят РА с адсорбированными О-сыворотками, характерными для данной группы, а затем с монорецепторными Н-сыворотками (неспецифической и специфической фазами) для определения серогруппы и серовара сальмонеллы в соответствии со схемой Кауфмана-Уайта. 4-й день. Учет изменений в средах «пестрого» ряда. Формулировка ответа. Серологический метод Постановка РНГА с парными сыворотками крови больных, взятыми с интервалом в 7-10 дней и сальмонеллезными поливалентными и групповыми (групп А, В, С, Д, Е) диагностикумами с целью выявления антител. Биопроба. Материалом от больного производят пероральное заражение белых мышей, которые через 1-2 дня погибают от септицемии. При посеве крови из сердца и материала из внутренних органов выделяется культура сальмонелл. Серологическое исследование - исследование с помощью РНГА парных сывороток крови больных, взятых с интервалом в 7-10 дней с сальмонеллезными поливалентными и групповыми (группы А, В, С, Д, Е) диагностикумами. Диагностическое значение имеет повышение титра антител в четыре и более раз. Самостоятельная работа студентов Изучить основные этапы бактериологического исследования метода диагностики сальмонеллёзов. 1. Учет посевов сальмонелл на среде Левина и Олькеницкого (демонстрация). 2. Контроль чистоты наделенной культуры сальмонелл (со среды Олькеницкого приготовлен мазок, окрашен его по Граму). Промикроскопировать и зарисовать демонстрационные микропрепараты возбудителей сальмонеллёзов S.enterica spp. enterica ser. enteritidis, typhimurium, choleraesuis. Возбудители сальмонеллёзов — идентичные по морфологии грамотрицательные палочки с закругленными концами. 3. Идентификация выделенной культуры возбудителя: - по антигенным свойствам – учет ориентировочной реакции агглютинации на стекле с диагностическими монорецепторными сальмонеллезными агглютинирующими О- и Н сыворотками в соответствии со схемой Кауфмана-Уайта; - по биохимическим свойствам - определение биохимической активности изучаемой культуры по "пестрому" ряду Гисса или Пешкова (демонстрация). Обратить внимание на расщепление глюкозы, отсутствие расщепления лактозы и сахарозы. - по фаголизабельности (учет пробы с фагом - демонстрация) 4. Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикам методом бумажных дисков (демонстрация). Педиатрические аспекты темы Постановка реакции типа Видаля при пищевых токсикоинфекциях имеет важное диагностическое значение у детей раннего возраста, т.к. процент положительных гемокультур и выделения возбудителя из испражнений невысок. Диагностическим титром является положительная реакция с разведением сыворотки 1:100. 43 После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей брюшного тифа, паратифов и сальмонеллезов, а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: уметь ставить РА на стекле и реакцию Видаля при брюшном тифе, оценивать результаты микробиологических анализов при бруцеллезе, лептоспирозе, боррелиозе, листериозе. Тема 6. МИКРОБИОЛОГИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ: ПАТОГЕННЫЕ КИШЕЧНЫЕ ПАЛОЧКИ, ИЕРСИНИИ, КАМПИЛОБАКТЕРИИ, ХЕЛИКОБАКТЕРИИ Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей бактериальных кишечных инфекций - патогенных кишечных палочек, иерсиний, кампилобактерий, геликобактерий, методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Эшери х ии . Их основные свойства. Физиологическая роль в кишечнике человека и санитарно-показательное значение эшерихий, их значение в генетических и генно-инженерных работах. Диареегенные эшерихии, их дифференциация от условно-патогенных. Микробиологическая диагностика энтеральных и парентеральных эшерихиозов. Этиотропное лечение. 2. Иерсинии – возбудители кишечного иерсиниоза. Биологические свойства. Патогенность для человека и животных. Микробиологическая диагностика иерсиниозов. Этиотропная терапия. 3. Кампилобактерии. Хеликобактерии. Таксономия. Морфологические, культуральные, биохимические и серологические свойства. Патогенность для человека и животных. Патогенез кампилобактериозов у человека. Роль хеликобактерий в возникновении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Микробиологическая диагностика. Этиотропная терапия. Микробиологическая диагностика эшерихиозов Среди видов Escherichia coli семейства Enterobacteriaceae, наряду с непатогенными кишечными палочками - представителями нормальной микрофлоры кишечника, имеются их патогенные варианты, в том числе: энтерогеморрагические кишечные палочки (ЭГКП) - возбудители энтерогеморрагического эшерихиоза с гемолитико-уремическим синдромом); энтероинвазивные (ЭИКП), вызывающие заболевания, сходные с дизентерией; энтеротоксигенные (ЭТКП), вызывающие холероподобный эшерихиоз или диарею путешественников; ЭПКП (энтеропатогенные) - возбудители детских колиэнтеритов и других кишечных инфекций, а также уропатогенные эшерихии, поражающие мочевыводящие пути. Наиболее часто встречающиеся серовары патогенных эшерихий, входящих в состав перечисленных групп, представлены в таблице 11. Таблица 11. Серовары наиболее часто встречающихся патогенных эшерихий. Энтеротоксигенные О6, О8, О15, О20, О25, О27, О63, О78, О80, О85, О115, О128, О139, О148, О153, О159, О168 Энтеропатогенные О18, О44, О55, О111, О112, О114, О119, О125-128, О142 Энтероинвазивные Энтерогеморрагические О28, О29, О124, О157, О126, О111 О136, О143, О144, О152, О164, О167 Часть эшерихий относится к условно-патогенным микроорганизмам, способных вызывать оппортунистические инфекции (пневмонии, нагноения ран и полостей, менингиты, сепсис и т.д.). 44 При накоплении в пищевых продуктах эшерихии могут стать причиной пищевого отравления. Методы микробиологической диагностики эшерихиозов отражены в схеме 11. Бактериоскопический метод в диагностике эшерихиозов в практике бактериологических лабораторий не применяется из-за сходства морфологических и тинкториальных свойств патогенных и условно-патогенных энтеробактерий. Бактериологический метод является основным методом диагностики эшерихиозов. Для выделения эшерихий используют среды Эндо, Левина и среду Мак-Конки с сорбитом для выделения Escherichia coli 0157 : HI из группы ЭГКП. Схема 11. Микробиологическая диагностика эшерихиозов Экспресс-методы (индикация патогенной E.coli или ее продуктов в исследуемом материале) ДНК-зонды или исследования: ПЦР для выявления специфического ДНКтампона патогенной E.coli Материал для испражнения, слизьфрагмента с ректального РИФ Бактериологический метод 1 день. Посев материала на среду Эндо, Левина и Мак-Конки с сорбитом Культивирование в течение суток при 370 С. 2 день. Учет характера роста на средах Эндо, Левина (гладкие, выпуклые, с ровными краями колонии, окрашенные в результате разложения лактозы, с характерным металлическим блеском) и Мак-Конки (бесцветные колонии). Постановка ОРА со смесью специфических эшерихиозных ОК- сывороток и содержимого 10 лактозоположительных колоний. Пересев оставшейся части колонии уколом в столбик и штрихом на поверхность скошенной части среды на полускошенную среду Ресселя (или Олькенцикого) с целью накопления культуры. 3-й день. Учет характера роста на средах Ресселя или Олькеницкого (пожелтение и разрывы столбика среды в результате ферментации глюкозы в анаэробных условиях, пожелтение скошенной части среды в результате ферментации лактозы и сахарозы). Проверка чистоты выделенной культуры, постановка ОРА с поливалентной ОК-сывороткой, а затем — развернутой РА с адсорбированными групповыми сыворотками для определения ОК-серогруппы. Определение антигенов выделенной культуры по результатам постановки развернутой РА с ОК сывороткой (или диагностическим иммуноглобулином) и живой культурой (типирование по Кантигену), а также развернутой РА с ОК сывороткой и гретой (кипяченой в течение 1-2 ч) культурой с целью определения специфического О-антигена. Постановка развернутой РА, пересев в среды «пестрого» ряда для изучения биохимических свойств, посев для определения фаголизабильности, фаговара, колициногеновара. 4-й день. Учет результатов развернутой РА, изменений в средах «пестрого» ряда, фаголизабильности, фаговара, колициногеновара. Формулировка ответа при наличии положительной РА с кипяченой культурой (наличие специфического О-антигена) Серологический метод - РА, РНГА, ИФА с целью выявления антител к эшерихиям и их динамики (исследование парных сывороток) в процессе инфекции. Через 18 —24 ч инкубации при 370 С изучают характер колоний (гладкие, выпуклые, с ровными краями колонии, окрашенные в красный цвет в результате разложения лактозы, с характерным металлическим блеском), выросших на плотных питательных средах. Патогенные эшерихии по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам не отличаются от обычных эшерихий, обитающих в кишечнике человека. Исключение составляют лактозоотрицательные ЭПКП. Принадлежность выделенных микроорганизмов к патогенным эшерихиям устанавливают по антигенной структуре с помощью ОРА со смесью специфических эшерихиозных 45 ОК- сывороток и содержимого 10 лактозоположительных колоний. На среде Мак-Конки с сорбитом ЭГКП образуют бесцветные колонии, тогда как другие эшерихии ферментируют сорбит, образуя красные колонии. При положительном результате РА оставшуюся часть колонии пересевают уколом в столбик и штрихом на поверхность скошенной части среды на комбинированную полускошенную полиуглеводную среду (например, Ресселя) с целью накопления культуры. На 3-й день учитывают изменения на среде Ресселя. Ферментацию глюкозы с образованием кислоты или кислоты и газа выявляют по изменениям столбика агара (пожелтение и его разрывы среды в результате ферментации глюкозы в анаэробных условиях) и скошенной части (пожелтение в результате ферментации лактозы и сахарозы). При отсутствии ферментации углеводов среда приобретает щелочную реакцию за счет выделения аминов при разложении белка и приобретает красный цвет. Проверяют чистоту выделенной культуры, определяют ее биохимические свойства (посев на среды Гисса); проводят серотипирование путем постановки сначала ориентировочной РА на стекле с поливалентной ОК-сывороткой, а затем — развернутой РА с адсорбированными групповыми сыворотками для определения ОК-серогруппы. Можно использовать латексные диагностикумы, покрытые соответствующими антителами (реакция латексной агглютинации). Антигенную формулу выделенной культуры определяют по результатам постановки развернутой РА с ОК сывороткой (или диагностическим иммуноглобулином) и живой культурой (типирование по К-антигену), а также развернутой РА с ОК сывороткой и гретой (кипяченой в течение 1-2 ч) культурой с целью определения специфического О-антигена. Кипячение или автоклавирование разрушает поверхностно расположенный К-антиген, мешающий определению специфического О-антигена. Через сутки инкубирования при 370 С гомологичные сыворотке штаммы должны агглютинироваться до титра или до половины титра сыворотки. Культуру, положительно прореагировавшую в развернутой РА с одной из сывороток, засевают на дифференциально-диагностические среды для окончательной идентификации. Для выявления источника инфекции и путей заражения у выделенного штамма определяют фаговар и колициногеновар. У выделенных культур или в патологическом материале можно определить адгезивность и инвазивность микроскопическим методом с использованием культур ткани Нер-2 или HeLa, а также плазмиды вирулентности с помощью ДНК-зондов или ПЦР. Для ускоренной идентификации возбудителя в исследуемом материале применяют прямой или непрямая РИФ. Серологический метод является вспомогательным, направленным на обнаружение антител и их динамики в процессе инфекции (исследование парных сывороток) с помощью РА, РНГА, ИФА. Самостоятельная работа студентов 1. Бактериологический метод. Изучить этапы выделения чистой культуры возбудителя: Учет посевов фекалий от больного с подозрением на эшерихиоз на средах Эндо, Левина, Ресселя, Олькеницкого, скошенном MПA (демонстрация). Провести контроль чистоты выделенной культуры. Со скошенного МПА приготовлен мазок, окрашен по Граму. Промикроскопировать и зарисовать демонстрационный препарат кишечной палочки. Escherichia coli – беспорядочно расположенные грамотрицательные палочки с закругленными краями. Идентификация выделенной культуры возбудителя по антигенным свойствам. Учесть ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с комплексной ОВ-коли сывороткой (О111, О-55, О-26) и типовыми О-коли сыворотками О-III, 0-55, О-26. Учесть развернутую реакцию агглютинации, поставленную с живой и кипяченой культурами и типовой сывороткой, с которой была положительная ориентировочная реакция агглютинации (демонстрация). Положительное заключение выдается только при положительной РА с убитой культурой (обнаружение специфического О-антигена). 2. Серологический метод. Учет демонстрационных реакций (РА, РНГА, ИФА) в парных сыворотках больных с целью определения нарастания титра антител к возбудителям эшерихио46 зов. 3. Биопрепараты для диагностики эшерихиозов: типовые агглютинирующие 0-коли сыворотки 0-111,0-55, 0-26. Микробиологическая диагностика иерсиниозов Энтеропатогенные иерсинии (Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis) вызывают кишечные инфекции, характеризующиеся поражением лимфоидного аппарата кишечника, токсико-аллергическими осложнениями, развитием генерализованных процессов. Микробиологическая диагностика иерсиниозов включает бактериологическое и серологическое исследования. Бактериологическое исследование. Материал, подлежащий исследованию (фекалии, кишечные биоптаты, лимфоузлы или ткань удаленного аппендикса, кровь, слизь из ротоглотки), обрабатывают в течение 1 минуты 0,5% раствором гидроксида калия в 0,5% хлориде натрия, затем делают посевы на агар CIN, Серова или среду Эндо, которые после посева инкубируют при 32 °С в течение 24—48 ч или 24 ч при 370 С и столько же при комнатной температуре. Параллельно посевы помещают в холодильник при температуре +40 С (иерсинии хорошо растут при низких температурах). Пересевы со среды накопления выполняют на 3, 5, 10, 15-е сутки на указанные выше питательные среды. На 2-й (3-й) день изучают первичные посевы. Энтеропатогенные иерсинии образуют более мелкие колонии, чем прочие энтеробактерии, на среде CIN колонии имеют красный центр и бесцветную периферию («бычий глаз»), на среде Эндо колонии бесцветные или с более интенсивно окрашенным центром. У Y. enterocolitica и у Y. pseudotuberculosis часто наблюдается диссоциация колоний с переходом в R (шероховатые) формы. Характерные для иерсиний колонии пересевают для накопления чистой культуры на скошенный МПА или на среду Ресселя или Олькеницкого. На 3-й (4-й) день проводят идентификацию чистой культуры по биохимическим и антигенным свойствам (биовар, серогруппа с помощью РА у культур, выращенных при температуре ниже 300 С), учитывают температуру физиологического оптимума иерсиний (28-300 С), определяют чувствительность к антибиотикам. Возбудители иерсиниоза и псевдотуберкулеза оксидазоотрицательны, ферментируют до кислоты глюкозу, обладают нитратредуктазой и другими свойствами (см. табл. 5). В отличие от возбудителя псевдотуберкулеза, бактерии вида Y. enterocolitica по биологическим свойствам гетерогенны, включая безусловно-патогенные, условно-патогенные (возбудители оппортунистической инфекции или пищевого отравления) и непатогенные для человека иерсинии. Определение факторов вирулентности у Y. enterocolitica предполагает постановку реакций аутоагглютинации и кальцийзависимости, пиразинамидазного теста, определение плазмидассоциированных антигенов. Тест аутоагглютинации. В две пробирки со средой Кларка засевают исследуемый штамм, инкубируют в течение 24 ч одну пробирку при 370 С, другую - при 26 - 280 С. При наличии вирулентности бактерии, выращенные при температуре 370 С, склеиваются в виде хлопьев, оседающих на дно и стенки пробирки. Культура, инкубированная при температуре 26 – 280 С, не агглютинируется. Определение пиразинамидазной активности. На скошенную среду с пиразинамидом, засевают исследуемые культуры, выращенные при температуре 25-300 С на ПА, инкубируют при той же температуре в течение 48 часов, после чего смачивают скошенную поверхность раствором сульфата аммонийного железа, оставляя пробирку при комнатной температуре в течение 15 мин. В пробирках с культурами патогенных иерсиний цвет среды остаются без изменений; непатогенные иерсинии меняют цвет скошенной части среды на коричневый. Тест кальцийзависимости ставят на кальций-дефицитном агаре, который готовят путем добавления раствора оксалата натрия к расплавленному МПА. После перемешивания вносят 4 мл 0,5М раствора хлорида магния. Исследуемую культуру засевают на 2 чашки с кальцийдефицитным агаром, одну чашку инкубируют 24 — 48 часов при 370 С, другую - при 26 - 280 С. При наличии вирулентности при дефиците кальция у клеток, инкубированных при 37 °С (но не 26 – 280 С), прекращается рост бактерий, при этом колонии на чашке либо имеют карликовые 47 размеры (Y. enterocolitica), либо отсутствуют совсем (чаще у Y. pseudotuberculosis). При 26 – 280 С так же, как у непатогенных иерсинии при двух температурных режимах, наблюдается рост колоний обычных размеров. Серологическое исследование заключается в постановке РА, РНГА или ИФА с иерсиниозными диагностикумами и парными сыворотками крови больных с подозрением на иерсиниоз с целью определения специфических антител. Генодиагностика – обнаружение типичных фрагментов ДНК патогенных иерсиний в клиническом материале или пищевых продуктах методами ДНК-ДНК-гибридизация или ПЦР-анализа. Самостоятельная работа студентов 1. Бактериологический метод. Изучение культуральных (на среде Эндо и скошенном МПА) и биологических (тесты аутоагглютинации и кальцийзависимости, определение пиразинамидазной активности) свойств Y.enterocolitica (демонстрация). 2. Серологический метод учет РНГА, поставленной с иерсиниозным эритроцитарным диагностикумом и сыворотками крови больного, взятыми на 3 и 10 дни заболевания (демонстрация). 3. Серологический метод учет ИФА, поставленной с сыворотками крови больного, взятыми на 3 и 10 дни заболевания (демонстрация). Микробиологическая диагностика кампилобактериозов Возбудителями кампилобактериозов - кишечных инфекций, склонных к генерализации и выраженным токсико-аллергическим осложнениям, являются Campylobacter jejuni и Campylobacter coli. Оппортунистические инфекции различной локализации и тяжести вызываются преимущественно Campylobacter fetus. Материалом для исследования в зависимости от характера заболевания являются испражнения, гной, ликвор, кровь, рвотные массы и др., которые с учетом нестойкости возбудителя во внешней среде должны быть доставлены в лабораторию как можно скорее. Бактериоскопический метод является весьма чувствительным ввиду характерной морфологии кампилобактеров (грамотрицательные изогнутые, S-образные или извитые палочки размером 0,20,9x0,5-5,0 мкм). Бактериологический метод. Для выделения чистых культур исследуемый материал засевают на селективные плотные среды (с кровью, факторами роста и антибиотиками) или используют для выделения метод фильтрации. Неконтаминированный материал засевают на неселективные среды обогащения (бруцеллезные бульон или агар, содержащий пептон, дрожжевой экстракт, глюкозу и гидросульфит натрия в качестве редуцента). Селективные среды (Скирроу, Престона, эритрит-агар) для кампилобактеров содержат баранью кровь (фактор роста) и селективные добавки (антибиотики триметоприм, ванкомицин, амфотерицин Д, полимиксин В и цефалотин), ингибирующие рост нормальной микрофлоры. Культивирование кампилобактеров осуществляется в специальной газовой атмосфере, состоящей из азота, углекислого газа и кислорода в соотношении 85:10:5, которая создается применением специальных газогенераторных пакетов, помещаемых вместе с посевами в герметично закрывающиеся емкости. Посевы инкубируют при 420 С. Метод фильтрации основан на способности подвижных кампилобактеров активно проходить через мембранные фильтры с порами диаметром 0,45 — 0,65 мкм. Фильтр укладывают на поверхность неселективной плотной среды в чашке Петри, наносят на него 10—15 капель суспензии фекалий, инкубируют чашку при 370 С в течение 1 ч, после чего фильтр снимают, а чашку инкубируют в микроаэрофильных условиях. Проникшие через фильтр кампилобактеры образуют через 48 — 96 ч на поверхности среды характерные колонии - серые, плоские, с неровным краем, сливающиеся по ходу штрихов. На более сухих средах колонии выпуклые, блестящие, округлые, без выраженной тенденции к распространению; гемолиз отсутствует. Выделенные культуры идентифицируют по морфологии (мазки, окрашенные по Граму), характерной «винтообразной» подвижности (исследование в препарате «раздавленная капля с использованием темнопольной или фазово-контрастной микроскопии), биохимическим свойствам и чувствительности к антибиотикам. Основные свойства некоторых видов кампилобактеров и Heli48 cobacter pylori представлены в таблице 12. Важным признаком С. jejuni является гидролиз гиппурата натрия (в 0,4 мл 1% водного раствора гиппурата суспендируют петлю выделенной культуры, пробирку помещают на 2 часа в термостат при 370 С, после чего добавляют 0,2 мл 3,5% раствора нингидрина в ацетон-бутаноловой смеси и вновь помещают в термостат). Пурпурное окрашивание взвеси свидетельствует о положительная пробе. Культура с типичной морфологией, выросшая при 42 °С на селективной среде, положительными пробами на оксидазу и на гидролиз гиппурата, относится к виду С. jejuni. Нитратный тест культуру выполняют на нитратном бульоне Барретта или полужидкой среде Мюллера-Хинтона с 0,2 % нитрата калия; тест-реактивом является сульфоновая кислота в смеси с нафтиламином. Положительный нитратный тест характеризуется появлением красного окрашивания. Таблица 12. Дифференциация некоторых видов кампилобактеров и Helicobacter pylori Биологические свойства Рост при 420 С Рост при 250 С Уреаза Нитратредуктаза Гидролиз гиппурата натрия Каталаза Устойчивость к: налидиксовой кислоте Цефалотину Campylobacter Jejuni + + + + Campylobacter coli + + + Campylobacter fetus + + + Helicobacter pylori + + ± + + ± - + + Обозначения: (+) - наличие свойства, (-) - отсутствие свойства, (±) – непостоянное свойство Генодиагностика. Для диагностики кампилобактериоза предложена ПЦР. Серологическая диагностика при кампилобактериозе не проводится из-за наличия у кампилобактера групповых антигенов и возникновения вследствие этого перекрестных реакций антител против этого микроорганизма с другими микробами. Самостоятельная работа студентов 1. Изучение морфологии Campylobacter jejuni (грамотрицательные изогнутые, S-образные или извитые палочки - демонстрация). 2. Учет культуральных свойств Campylobacter jejuni на эритрит-агаре (серые, плоские, сливающиеся колонии с неровным краем - демонстрация). Микробиологическая диагностика геликобактериоза Возбудителем геликобактериоза — хронической инфекции желудка и 12-перстной кишки — является Helicobacter pylori. Материалом для исследования являются биоптаты слизистой оболочки из очагов поражения, желудочный сок, секционный и резекционный материал (слизистая оболочка тела, антрального и пилорического отделов желудка, луковицы 12-перстной кишки), реже материал из полости рта (зубной налет, материал у воспаленных десен). Исследование необходимо проводится сразу ввиду нестойкости геликобактера во внешней среде; допускается непродолжительное хранение материала (до 4 ч) в транспортных средах для кампилобактеров при 4 0 С. Бактериоскопический метод - исследование гистологических срезов, окрашенных гематоксилин-эозином, из биоптата слизистой оболочки желудка и 12-перстной кишки, полученного при фиброгастродуоденоскопии. При микроскопии геликобактеры имеют характерную спиралевидную морфологию. 49 Бактериологический метод является основным в лабораторной диагностике геликобактериоза. Для выделения чистых культур материал засевают на селективные плотные среды с кровью и антибиотиками (ванкомицин, амфотерицин В - по 10 мкг/мл и цефсулодин или триметоприм - 5 мкг/мл) , в которые для инактивации образующихся при культивировании ингибиторов можно добавить активированный уголь или крахмал, а также на неселективные питательные среды (бруцеллезный агар с 5 — 7 % лошадиной крови). Посевы инкубируют в анаэробных контейнерах с газогенераторными пакетами до 7 сут при 37 °С в атмосфере, содержащей 5 % кислорода и 10 % углекислого газа. Колонии геликобактеров на питательных средах мелкие или достаточно крупные, серые прозрачные. В мазках из колоний обнаруживают слегка изогнутые или прямые, реже, типичные грамотрицательные спирально изогнутые бактерии. При темнопольной или фазово-контрастной микроскопии выявляют характерную подвижность клеток возбудителя. Для идентификации возбудителя проводят также биохимические и другие тесты (табл. 11 ). Для этого чистую культуру геликобактера засевают на одну из сред с мочевиной и инкубируют ее в течение от 15 мин до 24 ч. В случае наличия уреазы происходит разложение мочевины с образованием щелочного продукта – аммиака, сопровождающееся изменением цвета индикатора среды. Серодиагностика. Применяют РП, РНГА, РСК, ИФА для определения антител в крови больных хеликобактериозом. С помощью ИФА определяют специфические антитела класса IgG, которые выявляются у больных с высокой частотой, более длительно персистируют и отражают активность патологического процесса. Экспресс-диагностика – прямая РИФ (специфическое свечение хеликобактеров в препаратах слизистой оболочки) Генодиагностика. Применяют ПЦР как экспресс-метод для обнаружения специфических фрагментов ДНК Helicobacter pylori в материале от больного. Самостоятельная работа студентов Изучение морфологии Helicobacter pylori (грамотрицательные спиралевидные бактерии демонстрация). Учет культуральных свойств Helicobacter pylori на эритрит-агаре (серые, плоские, прозрачные сливающиеся колонии с неровным краем - демонстрация). Учет уреазной активности Helicobacter pylori (отметить изменение цвета индикатора, свидетельствующее об изменении рН среды на щелочную в результате разложения мочевины с образованием аммиака). Учет ИФА по определению антител класса IgG к геликобактеру (демонстрация). После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей эшерихиозов, иерсиниозов, кампилобактериозов, геликобактериозов, а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: уметь ставить ориентировочную и развернутую РА для идентификации эшерихий, оценивать результаты микробиологических анализов при эшерихиозах, иерсиниозах, кампилобактериозах, геликобактериозах . Тема 7. МИКРОБИОЛОГИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ: ВОЗБУДИТЕЛИ ДИЗЕНТЕРИИ, ХОЛЕРЫ. ПИЩЕВЫЕ ИНТОКСИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей бактериальных кишечных инфекций - дизентерии, холеры, пищевых интоксикаций бактериальной природы, методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения. 50 Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Ш и геллы. Биологические свойства. Патогенез дизентерии. Роль факторов инвазии, распространение, токсины шигелл. Иммунитет. Методы микробиологической диагностики. Проблема специфической профилактики. Этиотропная терапия. 2. Семейство Vibrionaceae. Таксономия. Характеристика основных свойств. 3. Холерные вибрионы, биологические свойства, биовары. Классификация вибрионов по Хейбергу. Факторы патогенности. Токсины и их характеристика. Патогенез и иммунитет при холере. Роль экосистемного механизма в распространении холеры. Вибрионосительство. Методы микробиологической диагностики. Специфическая профилактика и терапия холеры. 4. Биологические свойства палочки ботулизма. Характеристика экзотоксина. Лабораторная диагностика ботулизма. Принципы профилактики и лечения ботулизма. 5. Пищевые интоксикации стафилококковой этиологии и их лабораторная диагностика. Лабораторная диагностика бактериальной дизентерии. Дизентерия — антропонозное инфекционное заболевание, вызываемое бактериями рода Shigella, характеризующееся язвенным поражением толстого кишечника и общей интоксикацией организма. Классификация возбудителей дизентерии (шигелл) представлена в таблице 12, методы микробиологической диагностики в схеме 13. Таблица 13. Классификация шигелл Виды шигелл Серовары шигелл 1-12 Shigella dysenteriae 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 5,6, var X, var Y Shigella flexneri 1-18 Shigella boydii Shigella sonnei Схема 12. Микробиологическая диагностика дизентерии Материал для исследования: испражнения больных, реконвалесцентов, носителей, рвотные массы, промывные воды желудка и кишечника, а также смывы с рук и с объектов внешней среды, пищевые продукты (особенно молоко). Бактериологический метод патогенной E.coli или ее продуктов в исследуемом материале) Экспресс-методы (индикация 1ДНК-зонды день. Посев на среды специфического Плоскирева, Эндо и на селенитовую среду накопления. илиматериала ПЦР для выявления фрагмента ДНК шигелл, 0 Культивирование в течение суток при 37 С. РИФ 2 день. Учет характера роста на средах Плоскирева и Эндо (бесцветные лактозоотрицательные гладкие колонии). Пересев типичной лактозоотрицательной колонии шигелл на среду Олькеницкого или Ресселя для выделения чистой культуры. 3-й день. Учет характера роста на средах Ресселя или Олькеницкого (пожелтение столбика среды в результате ферментации глюкозы в анаэробных условиях; скошенная часть среды без изменений- отсутствие ферментации лактозы) Проверка чистоты выделенной культуры, определение вида и серовара по антигенной структуре с помощью ОРА. Пересев в среды «пестрого» ряда для изучения биохимических свойств, посевы для определения фаголизабильности, фаговара, колициновара, устойчивости к антибиотикам. . 4-й день. Учет результатов развернутой РА, изменений в средах «пестрого» ряда, фаголизабильности, фаговара, колициновара. Формулировка ответа 51 Серологический метод. Постановка РА, РНГА с целью выявления антител к шигеллам и их динамики (исследование парных сывороток) в процессе инфекции. Микроскопический метод при дизентерии не применяется ввиду морфологического сходства шигелл с другими энтеробактериями. Бактериологический метод является основным методом лабораторной диагностики дизентерии. Исследуемый материал засевают на среды Плоскирева и Эндо в чашках Петри, а также на селенитовую среду для накопления, с которой через 16— 18 ч делают пересев на указанные плотные питательные среды. Посевы выращивают в термостате при 370 С 18 — 24 часов. На второй день изучают характер колоний. Бесцветные лактозоотрицательные гладкие колонии шигелл пересевают на одну из полиуглеводных сред (Олькеницкого, Ресселя, Клиглера) для накопления чистой культуры. На 3-й день учитывают характер роста на полиуглеводной среде, а также пересевают материал на дифференциальные среды (Гисса и др.) для биохимической идентификации выделенной культуры. Определяют антигенную структуру выделенной культуры с помощью ОРА с целью ее идентификации до уровней вида и серовара. На 4-й день учитывают результаты биохимической активности (табл. 14). Таблица 14. Биохимические свойства шигелл Виды шигелл Ферментация индол Глюкозы лактозы маннита дульцита ксилозы орнитина К S. dysenteriae К к S. flexneri К к ± S. boydii К ± к к+ ± к + S. sonnei Обозначения: «к» – ферментация субстрата с образованием кислоты, «+» - наличие признака, «-« отсутствие признака, «±» - непостоянный признак. Шигеллы, в отличие от эшерихий, являются неподвижными микроорганизмами, они не ферментируют лактозу, глюкозу разлагают без образования газа, не декарбоксилируют лизин. Для серотипирования сначала ставят РА на стекле со смесью сывороток против преобладающих в данной местности видов и вариантов шигелл, а затем РА на стекле с монорецепторными видовыми сыворотками. Определяют также чувствительность выделенной культуры к поливалентному дизентерийному бактериофагу и антибиотикам. С эпидемиологической целью определяют фаговар и колициновар выделенных шигелл. Одним из свойств шигелл является их способность вызывать кератит у морских свинок (кератоконъюнктивальная проба) Серологический метод. Для определения антител в крови больных дизентерией (обычно хронической формой) применяют РНГА с эритроцитарными шигеллезными диагностикумами. Диагностические титры: к шигеллам Флекснера у взрослых - 1:400, у детей до 3 лет - 1:100, у детей старше 3 лет - 1:200, к остальным шигеллам - 1:200. Реакцию ставят, как правило, повторно с сывороткой крови, взятой не менее чем через 7 дней; диагностическое значение имеет нарастание титра антител в четыре и более раз. Экспресс-методы при дизентерии - прямая и непрямая РИФ, реакция ко-агглютинации, ИФА, РНГА с антительными эритроцитарными диагностикумами для быстрого обнаружения шигелл в исследуемом материале (обычно в фекалиях), а также ПЦР. Самостоятельная работа студентов 1. Изучить основные этапы выделения чистой культуры шигелл. Учесть посевы на среды Плоскирева, Левина, Олькеницкого (демонстрация). Отметить наличие лактозоотрицательных бесцветных колоний на средах Плоскирева, Левина. 52 2. Провести контроль чистоты выделенной культуры шигелл. Со среды Олькеницкого приготовить мазок, окрасить его по Граму и промикроскопировать. Промикроскопировать и зарисовать демонстрационные препараты возбудителей дизентерии Sh.dysenteriae, Sh.flexneri, Sh.sonnei - грамотрицательные палочки с закругленными краями; 3. Идентификация выделенной культуры шигелл: по антигенным свойствам – постановка и учет РА на стекле со смесью видовых агглютинирующих сывороток Sh.dysenteriae, Sh.flexneri, Sh.boydii, Sh. sonnei и культурой, выделенной на среде Олькенипкого. Учет РА на стекле с видовыми дизентерийными сыворотками; по ферментативным свойствам - учет биохимической активности и фаголизабельности выделенной культуры шигелл, (демонстрация). 4. Колициногенотипирование. Учесть пробу по определению колициногенотипа выделенной культуры (демонстрация). Техника постановки описана в разделе «Генетика микроорганизмов». 5. Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикам методом бумажных дисков (демонстрация). 6. Изучить биопрепараты, используемые для диагностики, лечения и профилактики бактериальной дизентерии и холеры: агглютинирующие адсорбированные сыворотки к шигеллам Sh.dysenteriae, Sh.flexneri, Sh.boydii, Sh.sonnei. Используются для постановки реакции агглютинации при идентификации шигелл. дизентерийный бактериофаг таблетированный. Используется для профилактики и лечения дизентерии. диагностикумы эритроцитарные из шигелл Флекснера и Зонне. Используются для постановки РНГА при серодиагностике дизентерии. вакцина дизентерийная ШИГЕЛЛВАК, из липополисахарида шигелл Зонне. Микробиологическая диагностика холеры Холера — особо опасное, карантинное инфекционное заболевание, вызываемое Vibrio cholerae биоваров cholerae и eltor, проявляющееся в виде острого гастроэнтерита с выраженной интоксикацией и обезвоживанием (эксикозом) в результате нарушения водно-электролитного обмена, cвязанного с выработкой вибрионами холерного энтеротоксина (холерогена). Основной метод лабораторной диагностики холеры – бактериологический. При выполнении исследований на холеру необходимо строго соблюдать требования противоэпидемического режима. Материал для исследования на холеру собирают в стерильную посуду, не содержащую следов дезинфицирующих растворов, упаковывают и доставляют в лабораторию. Банки, пробирки должны быть герметично закрыты водонепроницаемыми пробками, которые заливают парафином, посуду обвязывают двойным слоем вощеной бумаги и обрабатывают дезинфицирующим раствором. В направлении указывают фамилию, инициалы, возраст больного, его домашний и служебный адрес, диагноз, даты начала болезни и госпитализации, дату и час взятия материала, а также фамилию и инициалы лица, направившего анализ. Банки и пробирки с материалом для исследования перекладывают ватой, помещают, в металлическую коробку, а затем в деревянный ящик, который пломбируют, надписывают «Верх, осторожно» и на служебном транспорте с сопровождающим лицом пересылают в лабораторию в течение 2 часов после взятия проб. Исследования на холеру проводятся круглосуточно в специальной лаборатории медицинскими работниками, прошедшими подготовку по особо-опасным инфекциям. Методы, применяемые для микробиологической диагностики холеры, представлены в схеме 13. Микроскопический метод (микроскопия окрашенных мазков и препаратов «висячей капли» из материала от больного) при холере в настоящее время не применяется в связи с низкой его информативностью. Разработаны методы экспресс-диагностики холеры (РИФ). Бактериологический метод состоит из нескольких этапов. Первый этап. Исследуемый материал засевают на щелочные (элективные) плотные питательные среды (щелочной агар Монсура – МПА с триптиказой, хлоридом натрия, таурохола53 том натрия, карбонатом натрия; TCBS - тиосульфат-цитрат-бромтимол-сахарозный агар; щелочной МПА) и жидкие среды обогащения (1% щелочная пептонная вода). Второй этап проводится через 6 —8 ч от начала анализа. Выполняют пересев из верхней части 1-й среды накопления на плотные элективные питательные среды и на 2-ю среду накопления. При наличии на 1-й пептонной воде нежной голубоватой пленки из нее готовят мазок в окраске по Граму, в котором обнаруживают грамотрицательные изогнутые в виде «запятой» вибрионы, проверяют подвижность, ставят ОРА с холерными сыворотками О-1, О-139 и RO, а также специфическую иммунофлюоресценцию. Третий этап выполняется через 12— 14 ч от начала анализа. Производится пересев из верхней части 2-й среды накопления на плотные элективные питательные среды. Изучают и отбирают для исследования типичные для холерного вибриона колонии на плотных средах, засеянных нативным материалом. Схема 13. Микробиологическая диагностика холеры Материал для исследования: испражнения, рвотные массы, желчь, трупный материал (отрезки кишечника, желчного пузыря), пищевые продукты, вода Бактериологический метод 1 этап. Посев материала на щелочные среды (Монсура, TCBS, щелочной МПА, 1% щелочная пептонная вода -ПВ). Культивирование при 370 С. 2 этап (через 6 —8 ч от начала анализа). Учет характера роста на ПВ (нежная голубоватая пленка), микроскопия мазков в окраске по Граму, проверка подвижности, РИФ. Пересев на плотные элективные питательные среды и на 2-ю среду накопления. 3 этап (через 12— 14 ч от начала анализа). Пересев из 2-й среды накопления на плотные элективные питательные среды. Изучение, отбор и пересев на селективные среды типичных для холерного вибриона колоний (прозрачные, круглые, диаметром 1—2 мм, гладкие, плоские, гомогенные, с ровными краями колонии, голубоватого цвета; на агаре TCBS ярко-желтые колонии на зеленом фоне среды; на среде Монсура — полупрозрачные бесцветные с темным центром) с плотных сред, засеянных нативным материалом. 4 этап. (через 18 —24 ч от начала анализа). Изучение и отбор типичных колоний на всех плотных средах, тест на оксидазу, ОРА с холерными сыворотками О-1, О-139 и RO,РИФ; пересев на щелочной МПА, среду Ресселя (или Олькеницкого) для выделения чистой культуры. Предварительный положительный ответ при наличии положительной РА или РИФ в сочетании с типичными морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами выделенной культуры. 5 этап (через 24 —36 ч от начала анализа). Изучение характера роста на щелочном МПА, среде Ресселя (Олькеницкого) - расщепление сахарозы (покраснением среды в Серологический метод: Постановка РА, РНГА, теста иммобилизации вибрионов столбике без образования газа), отсутствие ферментации лактозы. Микроскопия маз-с целью выявления антител вибриону и их динамики (исследование ков в окраске по Граму, тесткнахолерному оксидазу, ОРА с холерными сыворотками (О-1, RO, парныхИнаба, сывороток) в процессе инфекции. Огава, при отрицательном результате - с сывороткой О-139). При положительном результате ОРА с одной из сывороток - ответ о выделении холерного вибриона. Пересев с целью окончательной идентификации оксидазопопожительных культур по сокращенной или полной схемам. 6 этап (через 36-48 ч от начала анализа) - окончательная идентификация выделенных культур, определение их чувствительности к антибиотикам, формулировка окончательного ответа Экспрес цитарны ми сыво Четвертый этап. (через 18-24 ч от начала анализа). Изучают и отбирают с помощью стереомикроскопа типичные для холерного вибриона колонии на всех плотных средах. Холерный вибрион образует прозрачные, круглые, диаметром 1-2 мм, гладкие, плоские, гомогенные, с ровными краями колонии, имеющие голубоватый оттенок и маслянистую консистенцию. На агаре TCBS колонии холерного вибриона ярко-желтые на зеленом фоне среды, на среде Монсура — полупрозрачные бесцветные с темным центром. Колонии проверяют на наличие оксидазы (холерные вибрионы 54 оксидазоположительны), ставят РА на стекле с холерными сыворотками О-1, О-139 и RO, а также специфическую иммунофлюоресценцию. Положительная РА или ИФМ в сочетании с типичными морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами выделенной культуры позволяет выдать предварительный положительный ответ. Пятый этап проводится через 24 —36 ч от начала исследования. На этом этапе изучают и отбирают характерные для холерного вибриона культуры на среде Ресселя, на которой холерный вибрион расщепляет сахарозу, что сопровождается покраснением среды в столбике без образования газа, но не ферментирует лактозу (отсутствие изменений скошенной части среды). Со среды Ресселя готовят мазки в окраске по Граму с целью обнаружения характерных по морфологическим свойствам вибрионов, проверяют наличие подвижности и оксидазы, ставят РА с холерными сыворотками (О-1, RO, Огава, Инаба, при отрицательном результате - с сывороткой О-139) и при наличии положительных результатов выдают ответ о выделении соответствующего холерного вибриона. Окончательную идентификацию оксидазопопожительных культур проводят, используя сокращенную или полную схемы (табл. 15). Таблица 15. Дифференциация холерных вибрионов Тесты V.cholerae V.cholerae НАГ asiaticae el-tor Агглютинация О-сывороткой + + Агглютинация сыворотками Инаба и Огава + + Лизис фагами: Холерный фаг С (фаг IV) + + Фаг Эль-Тор + + Агглютинация куриных эритроцитов + + Гемолиз эритроцитов барана + + Рост на среде с полимиксином + + Гексаминовый тест + + Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) + + Сокращенная схема предполагает постановку развернутой РА с сыворотками Инаба и Огава, пробы с диагностическими холерными фагами, определение ферментативной группы по Хейбергу. Полная схема дополнительно включает тесты для дифференциации биоваров холерного вибриона (классического и Эль-Тор), в частности, определение гемагглютинирующих и гемолитических свойств, чувствительности к полимиксину, способности давать положительную реакцию ФогесПроскауэра (образование ацетилметилкарбинола - ацетоина из глюкозы). Ацетоин определяют добавлением в культуру, выращенную на глюкозо-фосфатном бульоне Кларка, 5% α-нафтола и 40%-го гидроксида калия; при встряхивании пробирок среда окрашивается в розовый или рубиново-красный цвет. Для ускоренной биохимической идентификации холерных вибрионов и их дифференциации от холероподобных и нехолероподобных вибрионов используют систему индикаторных бумажных дисков (СИБ), в состав которой входят тесты на оксидазу, индол, ферментацию лактозы, глюкозы, сахарозы, маннозы, арабинозы, маннита, инозита, аргинина, лизина и орнитина. Шестой этап (выполняется через 36-48 ч от начала анализа) - окончательная идентификация выделенных культур, определение их чувствительности к антибиотикам, формулировка окончательного ответа о выделении холерного вибриона с указанием биовара, серогруппы (серовара) и эпидемической значимости по косвенным биологическим признакам (гемолитической активности, группе Хейберга и др.). Типичные культуры Vibrio cholerae представляют собой грамотрицательные изогнутые в виде запятой или прямые полиморфные активно подвижные палочки, обладающие оксидазой, разлагающие глюкозу с образованием кислоты без газа, декарбоксилирующие 55 лизин и орнитин, но не ферментирующие аргинин, принадлежащие к 1-й (реже 2-й) группе Хейберга, агглютинирующиеся холерными сыворотками и лизирующиеся диагностическими фагами. Если выделенная культура не агглютинируется сыворотками к О1 и О139, ее относят к группе НАГ-вибрионов, а при наличии соответствующих сывороток определяют ее принадлежность к другой серогруппе. Токсигенные штаммы холерных вибрионов серогрупп О и О139 обычно не лизируют бараньи эритроциты, относятся к 1-й группе Хейберга (ферментируют маннозу и сахарозу, но не арабинозу), лизируются определенными фагами в комплексном методе с применением ХДФ. Вирулентность холерных вибрионов определяют в специализированных лабораториях путем внутрикишечного заражения кроликов-сосунков, а также методами генодиагностики (ПЦР или ДНК-ДНК-гибридизация с целью определения гена, ответственного за выработку токсина). Серодиагностика является дополнительным методом лабораторной диагностики холеры. Исследуют парные сыворотки крови больных, взятые с интервалом в 6-8 дней, с целью выявления агглютининов с помощью РА (диагностический титр 1:40 и выше), антитоксинов с помощью РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом (диагностический титр 1: 160) и вибриоцидных антител с помощью реакции иммобилизации вибрионов (диагностический титр1:1000). Учитывается также нарастание титра антител (не менее чем в 4 раза) в процессе инфекции. Экспресс-диагностика - прямая и непрямая РИФ с использованием специфических Охолерных сывороток серогрупп 01 и 0139, меченых изотиоцианатом флюоресцеина; РНГА со специфическими иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами. Ставят также реакцию иммобилизации вибрионов с теми же сыворотками (2 капли материала наносят на предметное стекло, в одну из них вносят каплю сыворотки О1 или О139 в разведении 1: 100, в другую каплю ФР - контроль). Готовят препараты «раздавленной» капли, которые исследуют с помощью темнопольного, фазово-контрастного или обычного микроскопа с опущенным конденсором при увеличении 400 - 600. Положительная реакция характеризуется потерей подвижности вибрионов и их склеиванием. Самостоятельная работа студентов 1. Микроскопический метод. Промикроскопировать и зарисовать демонстрационный микропрепарат холерного вибриона V.cholerae, окрашенный по Граму. Холерный вибрион грамотрицательная изогнутая палочка. 2. Бактериологический метод. Ознакомиться с основными биологическими свойствами классического биовара холерного вибриона и биовара Эль-Тор: фаголизабельность. Классический холерный вибрион лизируется фагом С и нечувствителен к действию фага Эль-Тор II. Вибрион Эль-Тор лизируется фагом Эль-Тop и нечувствителен к фагу С (демонстрация); чувствительность к полимиксину. Учесть рост классического холерного вибриона и вибриона Зль-Тор на среде с добавлением полимиксина. Вибрион Эль-Тор к полимиксину не чувствителен, классический холерный вибрион – чувствителен; гемолитические свойства. Вибрион Эль-Тор лизирует эритроциты; классический холерный вибрион, как правило, нет (демонстрация); определение серовара холерного вибриона. Учесть развернутую реакцию агглютинации c сыворотками Инаба и Огава (демонстрация). 3. Изучить биопрепараты, используемые для диагностики, лечения и профилактики бактериальной дизентерии и холеры: люминесцирующая холерная сыворотка для постановки реакции иммунофлюоресценции с целью выявления вибрионов; агглютинирующие холерные сыворотки Инаба и Огава (для постановки реакции агглютинации при идентификации холерного вибриона); холерные фаги: классический (фаг С) и Эль-Тор. Используются для фагодиагностики; поливалентный холерный бактериофаг для лечения и профилактики; 56 холерная вакцина. Создано 3 вакцины против холеры (убитая Эль-Тор; холероген- анатоксин, обогащенный О-антигеном холерного вибриона для подкожных инъекций; холерогенанатоксин, обогащенный О-антигеном холерного вибриона таблетированный). Используются для специфической профилактики холеры. ПИЩЕВЫЕ ИНТОКСИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ Лабораторная диагностика ботулизма Ботулизм - острая пищевая интоксикация, протекающая с преимущественным поражением центральной и вегетативной нервной системы ботулиническим токсином - сильнейшим биологическим ядом, вырабатываемым палочкой ботулизма (Clostridium botulinum) и относящемся к особо опасным патогенным биологическим агентам. Ботулизм может быть связан также с вегетацией возбудителя в ране или кишечнике. Материалом для исследования являются кровь, моча, испражнения, промывные воды желудка, остатки пищи (мясные, рыбные, фруктовые, овощные, грибные консервы, колбасы и др.). Обычно у больного с подозрением на ботулизм исследуют на наличие токсина кровь, а на наличие возбудителя - испражнения. Биопроба. Проводится реакция нейтрализации на белых мышах с целью обнаружения ботулотоксина в исследуемом материале. Обнаружение токсина палочки ботулизма и его типа имеет важное значение для назначения пациенту антитоксической противоботулинистической сыворотки - единственного эффективного средства специфической терапии и экстренной профилактики ботулизма. Реакцию ставят со смесью антитоксических противоботулинистических сывороток, а также с моновалентными сыворотками типов А, В, Е. При наличии в исследуемом материале ботулотоксина мыши контрольной группы погибают с явлениями параличей (парез конечностей, осиная талия и т.д.). При нейтрализации токсина антитоксической сывороткой мыши остаются живыми. Экспресс-диагностика ботулизма проводится с помощью РНГА с антительными эритроцитарными диагностикумами для обнаружения ботулотоксина в исследуемом материале. Бактериологический метод. Исследуемый материал засевают в 4 флакона со средой Китта –Тароцци; один флакон прогревают при температуре 600 С в течение 15 мин (для селекции С. botulinum типа Е), другой - при 800 С в течение 20 мин. Накопление культур клостридий ботулизма типов Е и F происходит при 28 °С, а клостридий типа А и В - при 35 °С в течение 48 ч. Для активации токсина Е к питательной среде добавляют трипсин. Через 24 — 48 ч инкубирования учитывают характер роста посевов (помутнение и газообразование), готовят мазки в окраске по Граму. При наличии типичных бактерий в виде «теннисных ракеток» со спорами (рис.15) делают пересев на кровяной сахарный МПА, на котором С. botulinum образует колонии неправильной формы с гладкой или шероховатой поверхностью и зоной гемолиза. В глубине столбика сахарного МПА колонии палочки ботулизма имеют вид пушинок или чечевичек. 57 Рис. 15. Палочка ботулизма - Clostridium botulinum. Окраска по Граму. Грамположительные спорообразующие палочки в виде «теннисной» ракетки. х900 Идентификация чистой культуры проводится на основании изучения биохимических свойств (посев в среды «пестрого» ряда), изучают другие дифференциальные признаки (см. табл.). Антигенные свойства культуры изучают с помощью РА с типовыми сыворотками. Выявляют также ботулинический токсин в фильтрате бульонной культуры и его тип с помощью реакции нейтрализации на белых мышах. Самостоятельная работа студентов 1. Изучить морфологические свойства С. botulinum в демонстрационном микропрепарате, окрашенном по Граму. Возбудитель ботулизма представляет собой крупную палочку со спорами, расположенными субтерминально (вид «теннисной ракетки»). 2. Бактериологический метод. Изучить культуральные свойства ферментативную активность возбудителя ботулизма (демонстрация). 3. Экспресс-метод. Ознакомиться с выявлением ботулотоксина в сыворотке крови больного: РНГА с эритроцитами, нагруженными антителами моновалентных антитоксических противоботулинистических сывороток типов А, В, Е. 4. Биопроба. Обнаружение ботулотоксина в пище, послужившей причиной пищевого отравления: реакция нейтрализации на белых мышах. Одну группу мышей (контроль) заражают подкожным введением фильтрата пищи, послужившей причиной отравления. Другой мыши (опыт) вводят смесь исследуемого материала и типовых противоботулинических сывороток. При наличии ботулотоксина мыши контрольной группы погибают с явлениями параличей (осиная талия и т.д.), животные в контрольной группе выживают. 5. Изучить биопрепараты, используемые для диагностики, лечения и профилактики ботулизма: - противоботулинистические сыворотки типов А, В, Е, F, полученные из сыворотки крови гипериммунизированных ботулинистическим анатоксином лошадей; применяются для лечения и постановки реакции нейтрализации на животных при диагностике ботулизма; - ботулинистический трианатоксин адсорбированный, очищенный. Получают обезвреживанием ботулинистического токсина формалином, применяют для активной иммунизации. Лабораторная диагностика пищевых интоксикаций стафилококковой этиологии Материалом для исследования служат рвотные массы, промывные воды желудка, пищевые продукты, послужившие причиной отравления. Экспресс-методы предназначены для обнаружения энтеротоксина стафилококка в исследуемом материале с помощью РП в геле, латекс-агглютинации, ИФА с сыворотками против энтеротоксинов стафилококка. Бактериологический метод направлен на выделение чистой культуры стафилококка с последующей постановкой проб на наличие энтеротоксина. Биопроба. Ставится путем скармливания исследуемого материала или выделенной культуры стафилококка котятам-сосункам, у которых стафилококковый энтеротоксин вызывает через 30-60 минут рвоту и понос. Пищевые интоксикации бактериальной этиологии способны также вызывать: C.perfringens типаА, Bacillus cereus, Proteus vulgaris и другие виды бактерий Для лабораторной диагностики этих интоксикаций используются методы экспрессдиагностики (ИФА) с целью поиска бактериальных токсинов, а также бактериологические методы 58 Педиатрические аспекты темы. I. При диагностике дизентерии у детей большое значение имеет серологическое исследование. Используется реакция агглютинации по типу реакции Видаля. При постановке реакции агглютинации с целью диагностики дизентерии у детей следует учитывать, что процент положительных реакций агглютинации изменяется в зависимости от возраста. У детей от 0 до 6 месяцев – 45%, а у детей от 6 месяцев до 2 лет и старше – 84%. Следует иметь в виду, что у детей при острой дизентерии агглютинины появляются уже в первые пять дней болезни и достигают своего максимума l 15 дав. Диагностическим титром в реакции агглютинации является разведение сыворотки при дизентерии Флекснера у детей 1:100, у взрослых - 1:200; дом дизентерии Зонне у детей 1:50, у взрослых 1:100. После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей дизентерии, холеры, пищевых интоксикаций бактериальной природы, а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: ставить РА на стекле для идентификации шигелл, оценивать результаты микробиологических анализов при дизентерии, холере, пищевых интоксикациях бактериальной природы Тема 8. ВОЗБУДИТЕЛИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВОЗДУШНО-КАПЕЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ: ДИФТЕРИИ, КОКЛЮША, ГЕМОФИЛЬНОЙ И ПНЕВМОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей бактериальных воздушно-капельных инфекций - дифтерии, коклюша, гемофильной инфекции, методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1.Коринебактерии.Таксономия. Экология. 2. Возбудитель дифтерии. Морфологические, культуральные, биохимические и антигенные свойства. Резистентность. Биовары. Дифференциация возбудителя дифтерии и условнопатогенных коринебактерий. Факторы патогенности, дифтерийный токсин. Патогенез дифтерии. Антитоксический иммунитет. Бактерионосительство. Лабораторная диагностика. Специфическое лечение и профилактика. 3. Бордетеллы. Таксономия. Характеристика основных свойств бордетелл. 4. Возбудитель коклюша. Морфологические, культуральные, антигенные свойства. Патогенность для человека и локализация в организме. Патогенез заболевания у человека. Иммунитет. Лабораторная диагностика. Дифференциация возбудителей коклюша, паракоклюша и бронхосептикоза. Специфическая профилактика. Этиотропная терапия. 5. Гемофильная палочка. Таксономия. Биологические свойства. Роль в патологии человека. Микробиологическая диагностика. 6. Биологические свойства возбудителей пневмоний и ОРЗ. Факторы патогенности, экология. Особенности инфекции, эпидемиология бактериальных пневмоний и ОРЗ. 7. Лабораторная диагностика бактериальных пневмоний и ОРЗ. 8. Легионеллы. Таксономия. Характеристика основных свойств легионелл. Экология. Распространение легионелл во внешней среде. Возбудитель болезни легионеров. Морфологические, культуральные, биохимические признаки. Антигенное строение. Патогенность для человека. Патогенез заболевания. Микробиологическая диагностика. Профилактика. Лечение. Диагностические, профилактические и лечебные препараты. Лабораторная диагностика дифтерии Дифтерия - острое инфекционное заболевание, вызываемое дифтерийной палочкой (Corynebacterium diphtheriae), характеризующееся местным фибринозным поражением слизистых оболочек рото- и носоглотки (diphthera – пленка), а также тяжелой интоксикацией с пора59 жением сердечно-сосудистой, нервной системы и надпочечников. Лабораторная диагностика дифтерии осуществляется в соответствии со схемой 14. Схема 14. Микробиологическая диагностика дифтерии Материал для исследования: отделяемое со слизистой оболочки зева и носа, пленки с поверхности миндалин. Бактериологический метод 1 день. Посев материала на среду Клауберга. Культивирование в течение суток при 370 С. 2 день. Учет характера роста колоний на среде Клауберга (серовато-черного цвета колонии с радиальной исчерченностью в виде цветка маргаритки или розетки биовар gravis; черные, круглые, выпуклые колонии за счет восстановления теллурита - биовар mitis). В мазке из типичной для дифтерийной палочки колонии (окраска по Нейссеру) палочки булавовидной формы, расположенные в виде римских цифр V или Х, содержащие зерна волютина. Пересев оставшейся части колонии на кровяной МПА для выделения чистой культуры; посев на сывороточный МПА для определения токсигенности, Серологический метод постановка пробы на цистиназу. 3 день. Учет Постановка проб на токсигенность, Формулировка ответа. Пересевы с палочке и ее РА, РНГА цистиназу. с целью выявления антител к дифтерийной кровяного МПА на специальные среды с целью полной идентификации дифтерийной токсину, а также динамики антител (исследование парных сывороток) в процессе палочки и ее дифференциации от сходных непатогенных коринебактерий. инфекции. 4 день. Окончательный ответ. Микроскопический метод в настоящее время фактически не применяется из-за его низкой информативности в связи с субъективизмом учета и выполняется только по требованию лечащего врача. Микроскопии подвергают мазки, окрашенные по Граму, метиленовым синим, по Нейссеру (для выявления включений волютина). Дифтерийные палочки (Corynebacterium diphtheriae) при окраске по Нейссеру содержат полярно расположенные темно-синие, почти черные, включения волютина и располагаются в виде римских цифр V или Х, тогда как сходные с ними дифтероиды и ложнодифтерийные бактерии (Corynebacterium pseudodiphtheriae) зерен волютина не имеют и располагаются в виде частокола. Разработан также метод прямого флюорохромирования дифтерийных палочек корифосфином, окрашивающим включения волютина в красно-коричневый цвет, а цитоплазму в зеленый или желтый цвет, что позволяет повысить эффективность бактериоскопического метода. Бактериологический метод - основной метод диагностики дифтерии. Исследуемый материал засевают на одну из специальных питательных сред для культивирования дифт ерийных палочек, наиболее часто на среду Клауберга (МПА с глицерином, дефибринированной кровью и теллуритом натрия, задерживающим рост сопутствующей непатогенной микрофлоры). На среде Клауберга Corynebacterium diphtheriae образует 2 типа колоний: а) серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающие цветок маргаритки или розетку (биовар gravis); б) черные, круглые, выпуклые колонии колонии за счет восстановления теллурита (биовар mitis). В мазке из типичной для дифтерийной палочки колонии обнаруживают грамположительные палочки булавовидной формы, расположенные в виде римских цифр V или Х, содержащие зерна волютина (рис. 16). Оставшуюся часть колонии пересевают на кровяной МПА для выделения чистой культуры. 60 Рис. 16. Возбудитель дифтерии - Corynebacterium diphtheriae. Окраска по Нейссеру. Расположение в виде римских цифр V или Х, включения волютина по полюсам. х900 Гемолиз сахарозы глюкозы крахмала токсин цистиназа уреаза РА с ПДС C. diphtheriae биовар биовар C.xerosis C. pseudodiphtheriae Волютин Идентификацию выделенной культуры проводят с учетом, прежде всего, ключевых свойств (токсигенность, наличие цистиназы). Токсигенность обычно определяют с помощью реакции преципитации в геле («чашечный» метод). Для этого в чашку Петри с питательной средой (МПА, 15—20 % лошадиной сыворотки, 0,3 % мальтозы, 0,03 % цистина) накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой (5000 АЕ/мл), чашку подсушивают 30 минут в термостате, после чего засевают штрихами исследуемые культуры перпендикулярно полоске бумаги. В качестве контроля используют токсигенную культуру. Посевы инкубируют в термостате при 37 0 С в течение 1820 часов. При наличии токсигенности в местах соединения токсина с антитоксическими антителами в питательной среде образуются белые линии преципитата, напоминающие усики. Для определения токсигенности дифтерийных бактерий также разработаны ИФА и ПЦР. Цистиназу у выделенных культур (проба Пизу) определяют путем посева методом укола петли исследуемой культуры на цистиновый МПА с азотнокислым свинцом. Посевы помещают на сутки в термостат при 37 0 С. При наличии цистиназы в среде образуется почернение (образование сульфида свинца) по ходу укола, вокруг которого появляется коричневое облачко. Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по биологическим свойствам (табл. 16). Для определения уреазы петлю исследуемой культуры вносят в пробирку, содержащую спиртовый раствор мочевины и индикатор феноловый красный. Пробирку выдерживают 30 минут в термостате при 37 0 С, при наличии уреазы содержимое пробирки окрашивается в красный цвет. При выделении нетоксигенной культуры ставят реакцию агглютинации с противодифтерийной сывороткой для выявления видового антигена Corynebacterium diphtheriae. Серологический метод – РА, РНГА с целью определения антител в парных сыворотках крови больных дифтерией. Таблица 16. Биологические свойства коринебактерий Вид ферментация + + ± ± + - - + + + - + - ± ± - + + - + + + - + - 61 Самостоятельная работа студентов 1. Морфологические свойства возбудителя дифтерии – Corynebacterium diphtheriae (мазок из чистой культуры, окраска по Нейссеру). Дифтерийные коринебактерии в препарате расположены в виде римской цифры V или X, по полюсам содержат темно-синие включения волютина. 2. Бактериологический метод. Изучение культуральных, ферментативных и антигенных свойств дифтерийной культуры: учет роста дифтерийной палочки на среде Клауберга (МПА с теллуритом натрия, глицерином и дефибринированной кровью). Колонии мелкие, круглые с уплотнением в центре, при сплошном росте поверхность культуры выглядит в виде шагреневой кожи. Колонии биовара gravis серые, радиально исчерчены, напоминающие розетку, колонии биовара mitis - черные, круглые, выпуклые. Демонстрацию описать, зарисовать; биохимические свойства коринебактерий представлены демонстрацией в соответствии с таблицей. Описать, зарисовать; определение токсигенности культур дифтерийных бактерий с помощью реакции преципитации в геле. На цистиновый МПА в чашке Петри нанесена полоска фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой, перепендикулярно которой засеяны исследуемые культуры. Если культура токсигенна, в местах соединения токсина с антитоксином образуется преципитат в виде белых линий (усы); цистиназная активность (проба Пизу) на столбике МПА с цистином посевом в виде укола. При наличии фермента отмечается почернение среды по ходу укола (образование сульфида свинца) и коричневое облако вокруг. Учесть демонстрационную реакцию; наличие уреазы определяют в растворе с мочевиной и индикатором феноловым красным. При наличии фермента среда приобретает красный цвет. Учесть демонстрацию. 3. Серологический метод. Учесть демонстрационную РНГА для определения напряженности антитоксического иммунитета при дифтерии. 4. Биопрепараты для диагностики, профилактики и лечения дифтерии. дифтерийный анатоксин - АД (токсин, обезвреженный формалином, очищенный от балластных веществ и адсорбированный с целью повышения иммуногенности на гидроксиде алюминия). Применяется для проведения активной иммунизации против дифтерии, входит в состав АДС (адсорбированного дифтерийно-столбнячного) анатоксина или АКДС (адсорбированной коклюшно-дифтерийно-столбнячной) вакцины. противодифтерийная антитоксическая сыворотка, получаемая яз крови лошадей гипериммунизированных дифтерийным анатоксином, очищенная и концентрированная методом Диаферм-3 (диализ и ферментирование - для снижения молекулярной массы и удаления балластных веществ). Применяют для профилактики и лечения дифтерии. агглютинирующие противодифтерийные сыворотки (поливалентные и типовые). Применяются в диагностических целях для дифференциации дифтерийных бактерий от дифтероидов и для установления типа. Микробиологическая диагностика коклюша и паракоклюша Методы, применяемые для лабораторной диагностики коклюша, представлены в схеме 14. Схема 14. Микробиологическая диагностика коклюша Бактериологический метод Материал для исследования: мокрота, слизь из носоглотки 1 день. Посев материала на среду КУА или Борде-Жангу. Культивирование в течение 48-72 часов при 370 С. 2 день. Учет характера роста колоний на средах КУА или Борде-Жангу. Рост в виде мелких, выпуклых, блестящих колоний (капельки ртути). Мазок в окраске по Граму, постановка РА с агглютинирующими коклюшыми сыворотками, определение биологических свойств. 3 день. Учет проб на токсигенность, цистиназу. Формулировка ответа. Пересевы с кровяного МПА на специальные среды с целью полной идентификации дифтерийной палочки и ее дифференциации от сходных непатогенных коринебактерий. 4 день. Окончательный ответ. 62 Серологический метод - РА и РСК с парными сыворотками больных для констатации нарастания титра антител с целью ретроспективного подтверждения коклюша и диагностики его атипичных форм. Генодиагностика - ПЦР для обнаружения специфических фрагментов ДНК возбудителя коклюша. Микроскопический метод для диагностики коклюша и паракоклюша не применяется. В качестве экспресс-метода можно использовать ИФМ. Бактериологический метод является основным в лабораторной диагностике коклюша и паракоклюша. Материал для исследования берут с помощью стерильного носоглоточного ватного тампона, у маленьких детей – тампоном на тонкой эластичной проволоке, а также методом «кашлевых пластинок» (в момент приступа кашля открытую чашку Петри с питательной средой подносят ко рту ребенка и держат в течение 6-8 кашлевых толчков). Для посева чаще всего используют казеиново-угольный агар (КУА), а также кровяной или картофельно-глицериновый кровяной агар (среда Борде-Жангу), содержащие пенициллин для подавления роста сопутствующей микрофлоры. Бордетеллы вырастают при температуре 370 С через 48-72 часа в виде мелких (около 1 мм в диаметре), выпуклых, блестящих колоний, напоминая капельки ртути (рис. 17). Из колоний готовят мазки и окрашивают их по Граму. При наличии в препаратах мелких овоидных грамотрицательных палочек ставят реакцию агглютинации с коклюшной и паракоклюшной сыворотками и делают пересев для выделения чистой культуры. Чистую культуру идентифицируют на основании изучения комплекса биологических свойств (табл. 17). Bordetella pertussis не растет на простых питательных средах, не меняет цвета специальных сред. Серотипирование проводится с помощью РА на стекле с адсорбированным факторными сыворотками. Фактор (антиген) 7 является родовым, общим для всех бордетелл, фактор 1 специфичен для Bordetella pertussis, фактор 14 – для Bordetella parapertussis фактор 12 – для Bordetella bronchiseptica. Рис. 17. Колонии Bordetella pertussis на КУА (выпуклые, блестящие в виде капелек ртути) Таблица 17. Биологические свойства некоторых представителей рода Bordetella Свойства B. pertussis Рост на МПА Рост на МПА с тирозином - B. parapertussis + (коричневая окраска) + (коричневая окраска) B. bronchiseptica + + 63 Подвижность Цвет на кровяном МПА Цвет на КУА Уреаза Оксидаза Утилизация цитрата Родовой антиген Видовой антиген + 7 1 Буро-коричневый Потемнение + 7 14 + + + + 7 12 Обозначения: (+)- наличие признака, (-) – отсутствие признака. Серодиагностика. Применяется РА и РСК (как правило, с парными сыворотками больных для констатации нарастания титра антител) с целью ретроспективного подтверждения диагноза и диагностики атипичных форм коклюша. Диагностический титр 1:20. Генодиагностика. Разработана ПЦР для обнаружения ДНК возбудителя коклюша. Самостоятельная работа студентов 1. Изучить морфологические и тинкториальные свойства возбудителя коклюша (Bordetella pertussis) в демонстрационных препаратах из чистой культуры 2. Бактериологический метод. Изучить культуральные свойства возбудителя коклюша культивируются на казеиново-угольном агаре КУА или на среде Борде-Жангу (картофельноглицериновый МПА с кровью) - демонстрация. Колонии Bordetella pertussis мелкие, выпуклые, блестящие в виде капелек ртути. При микроскопии обнаруживают мелкие овоидные грамотрицательные палочки. Изучение ферментативных и антигенных свойств палочки коклюша (демонстрация в соответствии с табл. 17). 3. Серологический метод. Учесть демонстрационные РА и РСК, поставленные с парными сыворотками крови детей (10 и 21 дни болезни) с диагнозом «подозрение на коклюш». Диагностический титр 1:20 4. Биопрепараты для диагностики, профилактики и лечения коклюша: АКДС-вакцина (адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина) содержит взвесь убитых коклюшных бактерий, дифтерийный и столбнячный анатоксины, адсорбированные на гидроокиси алюминия. Применяется для активной иммунизации детей против перечисленных инфекций; Тетракокк – комбинированная вакцина для профилактики дифтерии, коклюша, столбняка и полиомиелита производства фирмы Пастер Мерье Коннот (Франция). агглютинирующие сыворотки - для серологической идентификации коклюшных бактерий; иммуноглобулин донорский. Получен из венозной крови человека, содержит антитела против ряда патогенных микроорганизмов (включая бордетеллы), применяется для профилактики и лечения коклюша, создает пассивный иммунитет; агглютинирующие адсорбированные факторные сыворотки. Диагностические сыворотки, подвергнутые адсорбции родственными микробами с целью удаления групповых антител. Применяются для постановки РА при антигенной идентификации бордетелл. Педиатрические аспекты темы 1. Коклюш - заболевание детского возраста. Бактериологическая диагностика коклюша в ранний период заболевания основана на выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации. Для забора материала у детей используется метод кашлевых пластинок и применяются носоглоточные тампоны (у грудных детей). Серологическая диагностика коклюша, проводимая на 3 - 4 неделях заболевания (РСК) имеет эпидемиологическое значение. В настоящее время увеличился удельный вес заболеваний, вызванных Bordetella parapertussis, что обусловливает необходимость разграничения между этими микроорганизмами. 2. Пневмококки у детей могут вызвать сепсис, менингит. Дети первого года жизни не болеют крупозной пневмонией. Трудности при диагностике пневмонии у детей раннего возраста 64 связаны с отсутствием спонтанного отделения мокроты. Микробиологическая диагностика гемофильной инфекции Возбудитель гемофильной инфекции - Haemophilus influenzae, способен вызывать гнойный менингит, острое воспаление верхних дыхательных путей, бронхит, пневмонию, эмпиему, конъюнктивит, отит и другие оппортунистические заболевания. Уровень носительства гемофильной палочки среди здоровых лиц высокий (до 90 %). Гемофильная инфекция у детей в возрасте до 3 лет протекает исключительно тяжело, особенно в случае возникновения острого эпиглоттита (воспаления надгортанника). Бактериоскопический метод может быть использован при исследовании спинномозговой жидкости при подозрении на гнойный менингит (рис.18а). а б Рис. 18. Гемофильная палочка - Haemophilus influenzae. а – мазок из спинно-мозговой жидкости, б - мазок из чистой культуры. Окраска по Граму. мелкие грамотрицательные палочки. х900 Бактериологический метод является основным в лабораторной диагностике гемофильной инфекции. Исследуемый материал (мокрота, кровь, спинномозговая жидкость, серозную жидкость) засевают на МПА с 6 - 10 % нативной крови или на «шоколадный» агар с прогретой или кипяченой кровью. Если возможности немедленно посеять материал на среды нет, используют транспортную полужидкую среду с активированным углем и ниацином. Серозную и спинномозговую жидкости центрифугируют, осадок засевают бактериальной петлей на шоколадный агар (МПА с 5% дефибринированной крови человека, лошади или кролика выдерживают 2-3 минуты при температуре 800 С, повторно добавляют 5% крови и вновь выдерживают при той же температуре 2-3 минуты) или среду Филдса (МПА с добавлением пептического перевара крови лошади или барана). Параллельно делают посев на обычный МПА, на котором гемофильная палочка не растет. Колонии Haemophilus influenzae мелкие, прозрачные или полупрозрачные, вырастают через 18-24 часа; в мазках из этих колоний обнаруживаются мелкие капсулообразующие или капсулонеобразующие грамотрицательные палочки (рис. 17б). Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный шоколадный МПА для выделения чистой культуры. Идентификацию гемофильных бактерий проводят на основании изучения биохимических (каталазная, оксидазная активность, ферментация углеводов, гемолитическая активность, питательные потребности) и антигенных (постановка РА на стекле с групповыми сыворотками а,b,с, d, e, f к капсульному антигену) свойств. Для идентификации Haemophilus influenzae применяют также тест сателлитных колоний, для чего на поверхность шоколадного МПА наносят исследуемую культуру и в некоторые участки среды - штамм Staphylococcus aureus. Гемофильная палочка вырастает в виде мелких сателлит- 65 ных колоний, окружающих колонии S. aureus, так как стафилококк, гемолизируя кровь, высвобождает X и V факторы – стимуляторы роста Haemophilus influenzae. Каталазу гемофильной палочки определяют по пенообразованию в капле 10% перекиси водорода на предметном стекле при внесении в нее исследуемой культуры. Оксидазу выявляют путем нанесения на диск фильтровальной бумаги, диаметром 5-7 см , 2-3 капель 1% раствора тетраметилпарафенилендиамина и исследуемой культуры, в результате чего через 10-15 сек. появляется фиолетовое окрашивание. Уреазу определяют общепринятым методом по разложению мочевины с образованием щелочных продуктов в присутствии индикатора фенолового красного; при наличии уреазы среда приобретает ярко-малиновый цвет. Порфириновый тест выявляет способность Н. influence к синтезу Δ-аминолевуленовой кислоты (АЛК) - потребности в факторе X. При внесении АЛК в среду только АЛК-независимые гемофильные бактерии синтезируют и секретируют порфобилиноген и порфирины (промежуточные соединения биосинтеза гема), тогда как АЛК-зависимые гемофильные палочки, нуждающиеся в факторе X, не способны к образованию указанных продуктов. Исследуемые бактерии засевают на шоколадный МПА, наносят на поверхность среды диски, пропитанные АЛК, и после 24-часовой выращивания в термостате при 370 С облучают УФ-лучами. При наличии Х-независимых микроорганизмов наблюдают кирпично-красную флюоресценцию. Для специфической профилактики гемофильной инфекции в России лицензирована полисахаридная вакцина, конъюгированная со столбнячным анатоксином (вакцина Act-HIB) фирмы Пастер Мерье Коннот, которая не содержит консервантов и антибиотиков. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПНЕВМОНИЙ И ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ (ОРЗ) Основным возбудителем (около 60%) бактериальных пневмоний в настоящее время является пневмококк (Streptococcus pneumoniae), реже (30-40%) – клебсиеллы (Klebsiella pneumoniae), хламидии (Chlamydophila pneumoniae), микоплазмы (Mycoplasma pneumoniae), стафилококк (Staphylococcus aureus), гемофильные палочки (Haemophilus influenzae), легионеллы (Legionella pneumophila). Подходы к лабораторной диагностике бактериальных пневмоний и ОРЗ, независимо от вида возбудителя, принципиально, одинаковы. Материалом для исследования являются мокрота, отделяемое слизистой оболочки трахеи и бронхов, промывные воды бронхов, экссудат из плевральной полости, кровь, спинномозговая жидкость при менингите, отделяемое зева и носа при ОРЗ. Микроскопический метод (микроскопия мазков из исследуемого материала, окрашенных по Граму) имеет ориентировочное значение. Наличие в препаратах значительного количества удлиненных ланцетовидных, грамположительных диплококков, окруженных капсулой (Streptococcus pneumoniae – рис. 19), скоплений грамположительных кокков в виде гроздьев (S.aureus) или грамотрицательных коккобактерий (H.influenzae) позволяет поставить предварительный диагноз бактериальной пневмонии и служить ориентиром для назначения антибактериальной терапии. 66 Рис. 19. Пневмококк (Streptococcus pneumoniae). Окраска по Граму. х 900 Бактериологическое исследование является ведущим методом диагностики пневмоний и ОРЗ бактериальной этиологии, которое дает возможность не только выделить возбудителя инфекции, но и определить его чувствительность к антибиотикам. Для выделения пневмококка (Streptococcus pneumoniae) осуществляют посев исследуемого материала на МПБ с глюкозой и на кровяной МПА. Посевы выращивают в термостате при 370 С в течение суток. Выросшие на кровяном МПА нежные колонии окружены зеленоватой зоной гемолиза. Из колоний готовят мазок, изучают морфологические и тинкториальные свойства, после чего остаток колонии пересевают на скошенный кровяной МПА или сахарный (или сывороточный) МПБ с целью выделения чистой культуры и ее идентификации на основании комплекса биологических свойств. Дифференциация S.pneumoniae и S.pyogenes основывается на проверке чувствительности выделенной культуры к желчи и оптохину, а также способности ферментировать инулин. Серотипирование пневмококка проводится с помощью РА на стекле с использованием типоспецифических пневмококковых сывороток (известно около 90 сероваров пневмококка, из которых 23 играют важную роль в патологии человека). Для серотипирования пневмококков может использоваться реакция Нейфельда (феномен набухания капсулы стрептококка в присутствии типоспецифической сыворотки). Для изоляции клебсиелл выполняют посев исследуемого материала на МПА с пенициллином (для подавления сопутствующей микрофоры) в чашках Петри или на дифференциальнодиагностические среды с лактозой и индикатором бром-тимоловым синим, на которых спустя сутки культивирования при 370 С образуются блестящие выпуклые слизистые колонии (на дифференциально-диагностической среде колонии имеют желтый цвет в результате разложения лактозы). На 2 день колонии исследуют визуально и с помощью микроскопического метода (окраска по Граму и Гинсу-Бурри для выявления капсул), после чего пересевают типичные колонии на среду Ресселя или скошенный МПА для выделения чистой культуры возбудителя. На 3 день учитывают рост на указанных средах (окрашивание столбика и скошенной части среды Ресселя в желтый цвет с разрывами агара в результате расщепления глюкозы и лактозы с образованием газа) и проводят идентификацию культуры клебсиелл по основным биологическим свойствам (образование капсулы, отсутствие подвижности, биохимические и антигенные свойства). Для выделения микоплазм производят посев на специальные питательные среды с добавлением сыворотки, на которых они не ранее чем через месяц после образуют характерные микроскопические колонии с ровными краями и зернистой структурой. Выделенную чистую культуру микоплазм идентифицируют по биохимическим и антигенным свойствам. 67 Выделение легионелл, являющихся медленно растущими микроорганизмами, осуществляют с применением селективных питательных сред сложного состава, содержащих дрожжевой экстракт и другие факторы роста, а также различные антибиотики для подавления роста сопутствующей микрофлоры. Легионеллы относятся к медленно растущим микроорганизмам, однако микроколонии, видимые под микроскопом, появляются на 2-е сутки роста, тогда как макроскопически видимые мелкие колонии (2-4 мм) правильной округлой формы, с ровными краями и блестящей поверхностью с характерным розовым или сине-зеленым ободком и опалесцирующим центром - через 3-5 суток. Идентификацию выделенной чистой культуры до уровня рода проводят на основании изучения биологических свойств. Для видовой идентификации разработаны ИФМ, газожидкостная хроматография, генодиагностика (рестрикционный анализ, метод ДНК-зондов). Серологический метод диагностики пневмоний, вызванных пневмококками, микоплазмами, хламидиями и легионеллами при исследовании парных сывороток крови больных (в остром периоде и в стадию реконвалесценции) с помощью РСК, РНГА, ИФА не является клинически обязательным и имеет эпидемиологическое значение. Для определения антител к легионеллам используют, кроме того, непрямой ИФМ с антигеном из легионелл (диагностический титр 1:32 и более). Экспресс-методы. Разработан иммуноферментный тест для определения в моче специфичного антигена легионелл, а также иммунохроматографический тест для выявления в моче пневмококкового антигена, однако широкое применение этих методов ограничено. Генодиагностика. Предложена ПЦР для диагностики хламидиозов и микоплазмозов, однако метод широко в клинической практике не используется. Биопроба. Исследуемый материал для выделения пневмококков вводят внутрибрюшинно белым мышам или морским свинкам. Культуру пневмококка выделяют из крови и органов погибшего или забитого животного, а также проводят бактериоскопию мазков-отпечатков, сделанных из его органов. В настоящее время метод практически не применяется. Самостоятельная работа студентов 1. Микроскопия мазков из мокроты больного с подозрением на бактериальную пневмонию и чистых культур Streptococcus pneumoniae и Klebsiella pneumoniae. 2. Знакомство с характером роста колоний S.pneumoniae на кровяном МПА и Klebsiella pneumoniae на обычном МПА (демонстрация). 3. Учет РСК с парными сыворотками крови больного с антигенами микоплазм и хламидий (демонстрация). 4. Знакомство с биопрепаратами для диагностики, профилактики и лечения ОРЗ и пневмоний бактериальной этиологии: диагностические сыворотки для типирования пневмококков; поливалентная полисахаридная пневмококковая вакцина из антигенов 23 наиболее распространенных сероваров S.pneumoniae; диагностикумы клебсиеллезные для РСК и РНГА; поливалентная полисахаридная клебсиеллезная вакцина из антигенов 24 наиболее распространенных сероваров K.pneumoniae; диагностикум из микоплазм для постановки РСК и РНГА полисахаридная вакцина Act-HIB фирмы Пастер Мерье Коннот против гемофильной инфекции, конъюгированная со столбнячным анатоксином. После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей дифтерии, коклюша, гемофильной и пневмококковой инфекции инфекции, а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: оценивать результаты микробиологических анализов при дифтерии, коклюше, гемофильной и пневмококковой инфекции. 68 Тема 9. ВОЗБУДИТЕЛИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВОЗДУШНО-КАПЕЛЬНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ: ТУБЕРКУЛЕЗА, МЕНИНГОКОКОВОЙ ИНФЕКЦИИ И АКТИНОМИКОЗА Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей бактериальных воздушно-капельных инфекций – туберкулеза, менингококковой инфекции и актиномикоза, методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Микобактерии. Таксономия. Экология. 2. Воз б уди т ель т уб ерк улез а. Морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и аллергенные свойства. Особенности химического состава и резистентность. Факторы патогенности. Патогенез туберкулеза, особенности иммунитета. Лабораторная диагностика. Специфическое лечение и профилактика. 3. Возбудители микобактериозов. 4. Воз б уди т ель леп ры. Морфология, культивирование. Патогенез заболевания, иммунитет. Лабораторная диагностика. Антимикробные препараты. 5. М ен и н гок окк и . Таксономия. Биологические свойства. Патогенез менингококковой инфекции. Микробиологическая диагностика. Препараты для специфической профилактики и этиотропного лечения. 6. Актиномицеты. Возбудитель актиномикоза. Экология. Резистентность. Морфологические и культуральные свойства. Патогенез заболевания. Иммунитет. Лабораторная диагностика. Антимикробные препараты. Иммунотерапия. Профилактика актиномикоза. Лабораторная диагностика туберкулеза и микобактериозов Легочные и внелегочные формы туберкулеза вызываются бактериями комплекса МТС (Mycobacterium tuberculosis complex), а также нетуберкулезными микобактериями комплекса MAC (M.avium complex, M.kansassii).Микобактерии комплекса МАС чаще поражают лиц с иммунодефицитами различной этиологии (прежде всего, больных СПИДом). Методы микробиологической диагностики туберкулеза представлены в схеме 15. Схема 15. Микробиологическая диагностика туберкулеза Материал для исследования: мокрота, промывные воды бронхов, желудка бронхоальвеолярная жидкость, плевральный эксудат, кровь, моча, испражнения, синовиальная жидкость, биоптаты различных тканей. Микроскопический метод: люминесцентная микроскопия препаратов, окрашенных аурамином; мазки в окраске по Цилю-Нильсену Бактериологический метод: посев на среду Левенштейна-Йенсена. Культивирование при температуре 370 С в течение 8 недель. Колонии М.tuberculosis крошкообразные или морщинистые, кремового цвета. Культивирование на кровяных средах по Прайсу в течение 7-14 дней, микроскопия микрокультур, окрашенных по Цилю-Нильсену. Идентификация выделенной культуры микобактерий до вида по общепринятой схеме на основании изучения биологических свойств (типичной морфологии, характерных культуральных свойств, пигментообразования, продукции никотиновой кислоты - ниациновая проба, восстановления нитратов и теллурит калия, гидролиза твина-80, уреазной, пиразинамидазной и каталазной активности и т.д.), а Серологический метод. РСК, РНГА и др. для определения антител в сыворотке кротакже с применением молекулярно-генетических (ДНК-гибридизация) и химических ви больных туберкулезом к микобактериям туберкулеза. Диагностического значеметодов ния метод не имеет. Биопроба на морских свинках или кроликах. Аллергодиагностика - внутрикожная аллергическая проба с туберкулином. Генодиагностика. ПЦР для обнаружения специфических фрагментов ДНК микобактерий комплекса МТС (М.tuberculosis, M.bovis/BCG, M.africanum) в материале от больного и дифференцировки туберкулезных микобактерий от нетуберкулезных (комплекс МАС - M. avium, M. kansassii). 69 Материалом для исследования является мокрота, промывные воды бронхов, желудка бронхоальвеолярная жидкость, плевральный эксудат, кровь, моча, испражнения, синовиальная жидкость, биоптаты различных тканей. Первичная обработка материала заключается в его обработке с целью деконтаминации при наличии посторонней микрофлоры, а также разжижения, гомогенизации и флотации при исследовании мокроты, бронхоальвеолярной жидкости и т.д. Для этого материал обрабатывают муколитическими (N-ацетил-β-цистеин) и антибактериальными (1-2% NaOH) веществами, центрифугируют 20 мин при 3000 g и супернатант удаляют. Осадок ресуспендируют в небольшом количестве ИР. Микроскопический метод заключается в микроскопическом исследовании мазков из исследуемого материала, окрашенных специальными методами с целью выявления кислотоустойчивых бактерий, что позволяет дать ориентировочное заключение. Отрицательный результат микроскопического исследования не является основанием для снятия диагноза «туберкулез». В настоящее время основным методом выявления микобактерий является люминесцентная микроскопия препаратов, окрашенных аурамином в концентрации 1:1000 в т ечение 15 минут с последующим обесцвечиванием 3% солянокислым спиртом в течение 30 сек, промывкой и докрашиванием мазка в течение 1 минуты водным раствором родамина 6ж в концентрации 1:5000. Микобактерии обладают ярким желтым свечением на темном фоне. Метод Циля-Нильсена применяется реже (рис. 20). Обычно по Цилю-Нильсену окрашивают мазки из чистых культур. Ограничением бактериоскопического метода является то, что он не позволяет дифференцировать микобактерии между собой и от других кислотоустойчивых микроорганизмов. Рис. 20. Туберкулезная палочка (Mycobacterium tuberculosis) в мокроте больного. Окраска по Цилю-Нильсену. Рубиново-красные палочки (одиночные или скоплениями) на голубом фоне. х 900 Бактериологический метод является основным методом диагностики туберкулеза, обладая высокой чувствительностью и специфичностью. Для культивирования микобактерий наиболее часто применяют среду ЛевенштейнаЙенсена, содержащую суспензию свежих яиц, крахмал, глицерин, аспарагин, КН3РО4, сульфат и цитрат магния, а также краситель малахитовый зеленый. Среду свертывают в наклонном положении при 850 С в течение 45 мин. Применяются также другие яичные среды (Финна, мордовского) и синтетические жидкие питательные среды.Посевы инкубируют в термостате при температуре 370 С в атмосфере с повышенным содержанием СО2 (5-10 %) в течение не менее 8 недель, про70 сматривая посевы каждые 3 дня. Культуры М.tuberculosis растут в шероховатой R-форме в виде крошкообразных или морщинистых колоний кремового цвета (рис. 21). Отсутствие роста микобактерий спустя 8 недель после посева свидетельствует об отрицательном результате бактериологического метода диагностики туберкулеза. Для культивирования микобактерий применяется также метод микрокультур Прайса. Для этого на нескольких узких предметных стеклах делают толстые мазки, высушивают, обрабатывают несколько минут 2-6 % серной кислотой, после чего нейтрализуют. Затем стекла опускают в пробирки с гемолизированной цитратной кровью в разведении 1:4-1:8 и ставят в термостат. Через 714 стекла дней извлекают, препараты фиксируют, окрашивают по методу Циля-Нильсена и микроскопируют. Вирулентные штаммы микобактерий характеризуются ростом в виде жгутов или кос за счет образования корд-фактора. Рис. 21. Колонии туберкулезной палочки на среде Левенштейна-Иенсена Идентификация выделенной культуры микобактерий д о вида осуществляется по общепринятой схеме на основании изучения типичной морфологии, характерных культуральных свойств (по температурному оптимуму, скорости роста, пигментоообразованию в темноте и на свету), биохимической активности (наличие нитратредуктазы, каталазы, уреазы, пиразинамидазы, продукции никотиновой кислоты - ниациновая проба, восстановления нитратов и теллурита калия, гидролиза твина-80), а также с применением молекулярно-генетических (ДНК-гибридизация) и химических методов, что позволяет сократить время на лабораторную диагностику туберкулеза до 4-7 дней. Для определения ниацина к культуре микобактерий в жидкой питательной среде добавляют 1 мл раствора KCN и 1 мл 5 % раствора хлорамина; положительная реакция характеризуется появлением ярко-желтой окраски. После учета результатов реакции KCN нейтрализуют добавлением в пробирки 3-5 мл 10 % раствора гидрокарбоната натрия. Проводится также определение чувствительности микобактерий к антимикробным препаратам методом абсолютных концентраций ( наиболее часто на жидких питательных средах или методом микрокультур по Прайсу, занимая время от 3 недель до 3 месяцев или на плотной среде Левенштейна-Йенсена) с оценкой результатов по задержке роста или по нитратредуктазной активности, что имеет важное значение для назначения адекватной терапии. Границы устойчивости туберкулезной палочки составляют для стрептомицина 5 мкг/мл, ПАСК – 10 мкг/мл, тубазида – 1 мкг/мл, циклосерина и этионамида – 30 мкг/мл. Разработана также ПЦР для определения чувствительности микобактерий к химиопрепаратам и антибиотикам. К другим методам определения лекарственной устойчивости М.tuberculosis относятся биологический (LRP –LuciferaseReporter Phage – свечение резистентных микобактерий в присутствии генетически измененных бактериофагов, несущих ген люциферазы) и молекулярно-генетический, основанный на ПЦР. Биопроба ранее использовалась для выделения микобактерий путем подкожного заражения морской свинки (чувствительны к М.tuberculosis) и кролика (чувствительны к M.bovis) материалом от больного с последующим наблюдением за животными (до 4 месяцев). По исте71 чении этого срока или при гибели животных проводилось микроскопическое и бактериологическое исследование органов с целью обнаружения туберкулезных микобактерий. В настоящее время биопроба в реальной практике применяется редко в связи с утратой антибиотикорезистентных штаммов микобактерий вызывать типичную инфекцию и гибель животных. Генодиагностика. Разработана ПЦР, позволяющая обнаружить видоспецифические нуклеиновые кислоты микобактерий комплекса МТС (М.tuberculosis, M.bovis/BCG, M.africanum) непосредственно в клиническом материале от больного и дифференцировать туберкулезные микобактерии от нетуберкулезных – комплекс МАС (M. avium, M. kansassii). Метод ПЦР сопоставим с бактериологическим исследованием, однако выполняется быстро в течение 24 часов. При положительных результатах исследования методами бактериоскопии и ПЦР диагноз туберкулеза подтверждается и рекомендуется немедленное назначение противотуберкулезных препаратов по общепринятой схеме. Отрицательный результат ПЦР при обнаружении кислотоустойчивых микобактерии в мазках исключает наличие туберкулезных микобактерий комплекса МТС, поэтому в данной ситуации назначаются антимикробные препараты, активные в отношении нетуберкулезных микобактерии комплекса МАС. В других случаях необходимо ждать результатов бактериологического исследования. Серодиагностика. Разработаны РСК, РНГА и другие серологические реакции для определения антител в сыворотке крови больных туберкулезом к антигенам микобактерий туберкулеза, однако диагностического значения эти реакции не имеют. Аллергодиагностика. Ставится внутрикожная аллергическая проба (реакция Манту) с туберкулином - очищенной белковой фракцией, полученной из фильтрата убитой нагреванием бульонной культуры М.tuberculosis. Учет реакции производится через 24-48 часов. Проба используется для оценки течения туберкулезного процесса, определения эффективности вакцинации и отбора лиц для ревакцинации против туберкулеза. Самостоятельная работа студентов 1. Микроскопическое исследование мокроты больного туберкулезом (демонстрационный препарат, окраска по Цилю-Нильсену). В поле зрения микроскопа видны одиночные или в виде скоплений микобактерии, окрашенные в рубиново-красный цвет на голубом фоне препарата. 2. Изучение культуральных свойств возбудителя туберкулеза на среде ЛевенштейнаЙенсена. 3. Определение лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза к химиотерапевтическим средствам на среде Левенштейна-Йенсена. 4. Ознакомление с препаратами, применяемыми для диагностики, лечения и профилактики туберкулеза: туберкулин - фильтрат бульонной культуры микобактерий применяемый для постановки внутрикожной аллергической пробы Манту; вакцина БЦЖ (BCG – Bacterium Calmett – Geren); живая вакцина из авирулентного штамма M.bovis, разработанная французскими учеными Кальметтом и Гереном. Применяется внутрикожно для активной специфической профилактики туберкулеза. препараты для лечения туберкулеза (стрептомицин, ПАСК, тубазид, фтивазид, метазид, этионамид, этамбутол, пиразинамид, рифампицин, циклосерин, канамицин, фторхинолоны и т.д.) Микробиологическая диагностика проказы Материалом для исследования являются соскоб со слизистой оболочки носа, кожные лепрозные узлы, пунктат лимфатических узлов, мокрота и др. Микроскопический метод является основным в лабораторной диагностике проказы, так как доступных методов культивирования возбудителя проказы не разработано. Единственным методом культивирования возбудителя проказы является заражение экзотических животных – броненосцев. В мазках из патологического материала, взятого от больного прока- 72 зой, палочка проказы (Mycobacterium leprae) при окраске по методу Циля-Нильсена окрашивается в рубиново-красный цвет и располагается в виде пачек сигар. При проказе можно поставить кожную аллергическую пробу с лепромином (реакция Мицуды), однако диагностического значения эта реакция не имеет и применяется для характеристики клинического течения болезни. Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции Возбудителями менингококковой инфекции являются менингококки (Neisseria meningitidis). Методы лабораторной диагностики менингококковой инфекции представлены в схеме 16. Учитывая высокую нежизнеспособность менингококка во внешней среде, исследование на менингококк выполняют как можно быстрее. Схема 16. Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции Материал для исследования: спинномозговая жидкость, кровь, мазки со слизистой оболочки верхних отделов носоглотки, содержимое элементов сыпи Микроскопический метод. Мазок из спинномозговой жидкости в окраске по Граму с целью выявления гноя и грамотрицательных диплококков внутри лейкоцитов в виде «бобов» или «кофейных зерен», обращенных вогнутой стороной друг к другу Бактериологический метод. 1 день. Посев на сывороточный МПА с ристомицином. Культивирование при 37 0 С в течение 48 часов. 3 день. Учет характера роста на сывороточном МПА (мелкие, прозрачные, с голубоватым оттенком и ровными краями колонии; в мазках полиморфные грамотрицательные дипло- и тетракокки. Типичные для менингококка колонии пересевают на скошенный сывороточный МПА для выделения чистой культуры. 4-5 день. Идентификация выделенной чистой культуры менингококка и ее дифференциация от сапрофитных нейссерий на основании комплекса биологических свойств (рост на МПА, потребность в СО2, пигментообразование, ферментация углеводов, нитратредуктаза, антигенная структура - ОРА с менингококковыми сыворотками сероваров А, В, С). Окончательный ответ. Серологический метод РНГА с парными сыворотками с целью обнаружения антител к менингококку (ретроспективная диагностика). Генодиагностика - обнаружение специфических фрагментов ДНК менингококка с помощью ПЦР Экспресс-методы - РИФ, непрямая латекс-агглютинация и РНГА с антительными диагностикумами с целью выявления антигенов менингококков в материале от больного Микроскопический метод. Мазки из осадка спинномозговой жидкости окрашивают по методу Грама и микроскопируют. При наличии гноя и обнаружении внутри лейкоцитов грамотрицательных диплококков в виде «бобов» или «кофейных зерен», обращенных вогнутой стороной друг к другу, позволяет сделать положительное заключение о наличии у пациента менингококковой инфекции (рис. 22). 73 а б Рис. 22. Менингококк (Neisseria meningitides) в спинно-мозговой жидкости больного эпидемическим цереброспинальным менингитом (а) и в чистой культуре (б). Окраска по Граму. х630 Микроскопическое исследование мазков из носоглотки бактерионосителей дает возможность выявить наряду с менингококком стафилококки, стрептококки и непатогенные нейссерии (Moraxella spp. и др.), дифференцировать которые по морфологическим и тинкториальным свойствам практически невозможно. Бактериологический метод. Исследуемый материал засевают петлей на чашки с сывороточным МПА, содержащим антибиотики (ристомицин, ванкомицин, колистин и нистатин) для подавления роста сопутствующей микрофлоры (преимущественно кокков). Асцитическая жидкость в качестве добавки к питательным средам в настоящее вр емя не применяется, так как в результате лечения больных в ней накапливаются вещества, и нгибирующие рост микроорганизмов (в том числе менингококка). М енингококк на сывороточном МПА вырастает при температуре 37 0 С в атмосфере с повышенным содержанием СО 2 (используют СО 2 инкубатор, газогенераторные пакеты или эксикатор с зажженной свечой) через 48 часов, колонии величиной с булавочную головку, прозрачные, с голубоватым оттенком и ровными краями. В мазках из чистой культуры менингококка (рис.21) микрокартина иная (полиморфные дипло- и тетракокки), чем в мазках из спинномозговой жидкости. Типичные для менингококка колонии пересевают в пробирку со скошенным сывороточным МПА для выделения чистой культуры. Идентификацию чистой культуры менингококка, ее дифференциацию от сапрофитных нейссерий, обитающих в носоглотке, проводят на основании изучения комплекса биологических свойств (табл. 18). Таблица 18. Основные биологические свойства нейссерий 74 N.flava N.mucosa + К+ К+ + + + К+ К+ К± К± ± - + + + - + ± К+ К+ К+ К+ + + - N.sicca N.subflava Рост на МПА Потребность в СО2 Желтый пигмент Ферментация: глюкозы мальтозы сахарозы фруктозы лактозы Образование полисахарида из сахарозы Нитратредуктаза РА с менингококковыми сыворотками сероваров А., В, С Виды нейссерий N.meningitidis Свойства + ± К+ К+ К+ К+ + - Обозначения: (+) – наличие признака, (-) – отсутствие признака, (±) – непостоянный признак, К – образование кислоты Специфический полисахаридный менингококковый антиген можно выявить в спинномозговой жидкости с помощью метода встречного иммуноэлектрофореза в геле. С этой целью в агаровом геле на стеклянных пластинках, размером 9x12 см, вырезают два параллельных ряда лунок диаметром 3 мм. В лунки одного ряда вносят исследуемый ликвор, в лунки другого - преципитирующие сыворотки против менингококков разных серогрупп. Пластинки помещают в аппарат для иммуноэлектрофореза на 40-45 мин при комнатной температуре. Положительный результат характеризуется появлением 1-2 полосок преципитации между лунками со спинномозговой жидкостью и соответствующей антисывороткой. Г ен од и а гн о ст и к а. Исследуемый материал используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР, что дает основание в случае получения положительного результата поставить предварительный диагноз. Серодиагностика. Для ретроспективного подтверждения диагноза используют РНГА с парными сыворотками. Экспресс-методы диагностики. Для выявления антигенов менингококков в мазках из исследуемого материала используют ИФМ, а также непрямую латекс-агглютинацию и РНГА с антительными диагностикумами. Самостоятельная работа студентов 1. Микроскопический метод. Изучение морфологии менингококка в мазках из ликвора больного с подозрением на менингококковую инфекцию (демонстрация). Типично наличие грамотрицательных диплококков, располагающихся внутри лейкоцитов. 2. Бактериологический метод. Учет культуральных свойств менингококка на сывороточном МПА с ристомицином. Колонии менингококков прозрачные с голубым оттенком, ровные, мелкие (с булавочную головку). Изучить биохимические свойства менингококка в соответствии с таблицей . 3. Учесть демонстрационную РНГА с парными сыворотками больного (7 и 14 дни болезни) с подозрением на менингококковую инфекцию. 4. Биопрепараты для диагностики и профилактики менингококковой инфекции: отечественная химическая вакцина полисахаридная менингококковая вакцина групп А и С. Применяется по эпидемиологическим показаниям. В России зарегистрирована также кубин75 ская В+С менингококковая вакцина, состоящая из белков менингококков группы В и полисахаридов менингококка группы С, а также полисахаридная вакцина МенингоА+С фирмы Пастер Мерье Коннот; агглютинирующие и преципитирующие сыворотки против менингококка, применяются с диагностической целью для постановки РА с целью серологического типирования менингококка и встречного иммуноэлектрофореза для обнаружения менингококкового антигена в спинномозговой жидкости. эритроцитарные антительные менингококковые диагностикумы для обнаружения антигенов менингококка в спинномозговой жидкости с помощью РНГА. Микробиологическая диагностика актиномикоза Материал для исследования биоптаты ткани и пунктаты из очагов поражения, гнойное отделямое, экссудат, мокрота, промывные воды бронхов, моча. Микроскопический метод ориентирован на обнаружение в препаратах из исследуемого материала в нативных препаратах «раздавленной капли» или в окрашенных мазках друз актиномицетов – характерных зернистых образований с плотным гиалиновым центром, окруженным лучистыми нитевидными клетками или грамположительных ветвистых бактерий (рис. 22). Однако метод страдает субъективизмом и низкой чувствительностью, поэтому отрицательный результат микроскопического исследования не дает оснований отвергнуть диагноз актиномикоза. Рис. 23. Друзы актиномицета. Окраска гематоксилин-эозином. Х400 Бактериологический метод заключается в посеве исследуемого материала на несколько специальных питательных сред (тиогликолевая среда, кровяной МПА, сердечно-мозговой МПА, среда Сабуро и т.д.) с последующим культивированием осуществляют при 370 С 18-24 часа в аэробных условиях с 5% содержанием СО2. По периферии образующихся микроколоний имеются многочисленные ветвящиеся нити. Через 1-2 недели формируются плоские морщинистые или бугристые зрелые колонии. Идентификация выделенной культуры проводится по совокупности биологических свойств. Экспресс-методы диагностики актиномикоза – ИФМ с использованием для окраски мазков специфических флюоресцирующих сывороток к актиномицетам. Генодиагностика. Разработана ПЦР для обнаружения специфических фрагментов ДНК актиномицетов. Серологический метод. Применяется РСК для определения антител в сыворотке крови больных актиномикозом. Аллергодиагностика – постановка кожной аллергической пробы с актинолизатом экстрактом из инактивированных культур актиномицетов. Учет пробы через 24-48 часов. Педиатрические аспекты темы I. Подчеркнуть значение молока как возможного источника заражения детей туберкулезом 2. В связи с трудностью забора мокроты у детей производят исследование промывных вод 76 желудка. 3. Несмотря на успехи в борьбе с менингококковой инфекцией, в России ежегодно регистрируется заболеваемость этой инфекцией, имеются бактерионосители. В связи с этим важное практическое значение имеет обследование детей с подозрением на менингококковую инфекцию, контактировавших с ними лиц и возможных бактерионосителей с целью выделения чистой культуры и типирования менингококков. 4. При повышенной заболеваемости менингококковой инфекцией в регионе проводятся прививки по эпидемиологическим показаниям полисахаридной менингококковой вакциной. После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей туберкулеза, менингококковой инфекции, актиномикоза, а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: оценивать результаты микробиологических анализов при туберкулезе, менингококковой инфекции, актиномикозе. Тема 10. ВОЗБУДИТЕЛИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ПЕРЕДАЮЩИХСЯ ПОЛОВЫМ ПУТЕМ: ГОНОРЕИ, СИФИЛИСА, БАКТЕРИАЛЬНОГО ВАГИНОЗА, УРОГЕНИТАЛЬНОГО ХЛАМИДИОЗА И МИКОПЛАЗМОЗА. Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей бактериальных инфекций, передающихся половым путем – сифилиса, гонореи, бактериального вагиноза, методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Трепонемы. Возбудитель сифилиса. Морфологические, культуральные свойства. Патогенез и иммуногенез. Микробиологическая диагностика и этиотропная терапия. 2.Г он ок окк и . Таксономия. Биологические свойства. Патогенез гонококковой инфекции. Микробиологическая диагностика острой и хронической гонореи. Перспективы специфической профилактики. Этиотропное лечение гонореи и бленореи. 3. Хламидии. Таксономия. Биологические свойства возбудителей урогенитального хламидиоза и уреаплазмоза; их патогенность, экология, особенности инфекции и эпидемиология вызываемых заболеваний. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза. 4. Биологические свойства возбудителей урогенитального микоплазмоза; их патогенность, экология, особенности инфекции и эпидемиология вызываемых заболеваний. Роль микоплазм в патологии беременности и поражении плода. Лабораторная диагностика урогенитального микоплазмоза. 5. Бактериальный вагиноз – этиология, лабораторная диагностика заболевания. Микробиологическая диагностика бактериальных инфекций, передающихся половым путем Возбудителями заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП или урогенитальные инфекции), являются бактерии, хламидии, вирусы, грибы, простейшие. Главные возбудители ЗППП бактериальной природы представлены в таблице 19. Урогенитальные инфекции могут вызывать также М.tuberculosis, возбудители гнойно-воспалительных инфекций, энтеробактерии и другие микроорганизмы. Таблица 19. Бактерии - возбудители ЗППП и вызываемые ими инфекции Микроорганизмы Инфекции Сифилис Treponema palladium Neisseria gonorrhoeae Haemophilus ducreyi Chlamydia trachomatis Гонорея, бленнорея Мягкий шанкр Урогенитальный хламидиоз Венерическая лимфогранулема 77 Calymmatobacterium granulomatis Mycoplasma hominis Ureaplasma urealyticum Gardnerella vaginalis Mobiluncus spp. Паховая гранулема Урогенитальный микоплазмоз Уреаплазмоз Гарднереллез (вагиноз, вагинит) Бактериальный (анаэробный) вагиноз Микробиологическая диагностика сифилиса Возбудителем сифилиса - хронической инфекции со специфическим поражением кожи, внутренних органов и нервной системы, является бледная трепонема (Treponema palladium). Методы лабораторной диагностики этой инфекции зависят от ее стадии. Материалом для микроскопического исследования при сифилисе являются отделяемое твердого шанкра, пунктат лимфатических узлов, отделяемое слизистых оболочек и кожи при вторичном сифилисе, а также сыворотка крови и спинномозговая жидкость для серологической диагностики. Методы микробиологической диагностики сифилиса представлены в схеме 17. Микроскопический метод (темнопольная микроскопия с высокой разрешающей способностью) обычно применяется при первичном сифилисе при исследовании отделяемого твердого шанкра. Бледная трепонема имеет 8-12 равномерных мелких завитков правильной формы, обладает характерным плавным штопорообразным вращательно-поступательным, маятникообразным, сгибательным и контрактильным движением. На половых органах встречаются непатогенные Treponema refringens и Treponema balantidis, а в полости рта Treponema microdentium и Treponema buccalis, которые необходимо дифференцировать по морфологическим свойствам от бледной трепонемы. В силу этих обстоятельств темнопольной микроскопия желательно подвергнуть пунктат регионарных лимфатических узлов. Применяется также дифференциация Treponema palladium от непатогенных трепонем методом люминесцентной микроскопии с моноклональными или поликлональными антителами, который является одновременно экспресс-методом диагностики сифилиса (рис. 24). Схема 17. Методы микробиологической диагностики сифилиса Исследуемый материал: отделяемое твердого шанкра, пунктат лимфатических узлов, отделяемое слизистых оболочек и кожи при вторичном сифилисе, а также сыворотка крови и спинномозговая жидкость ( для серологической диагностики). Микроскопический метод - темнопольная микроскопия, окраска спирохеты по Романовскому-Гимзе, Бурри, импрегнацией серебром по Морозову Серологический метод – МР, ИФА, РНГА, РИФ, РИБТ, РСК для определения антител к бледной спирохете в крови больного Генодиагностика - ПЦР 78 Рис. 24. Бледная спирохета (Treponema palladum). Прямая РИФ. х900 Методы окраски бледной спирохеты (по Романовскому-Гимзе, при котором она окрашивается в бледно-розовый цвет, импрегнацией серебром по Морозову), а также метод Бурри (изготовление негативных препаратов в капле туши) с последующим исследованием препаратов в обычном световом микроскопе имеют низкую воспроизводимость и существенно уступают темнопольной микроскопии по степени разрешающей способности, поэтому в реальной практике эти методы не применяются. Бактериологический метод диагностики сифилиса не применяется в связи с трудностью культивирования бледных трепонем и отсутствием эффективных питательных сред. Серологический метод. Рекомендуется использование следующих методов серодиагностики сифилиса, направленных на обнаружение в крови больных специфических антител к бледной трепонеме: Для проведения отборочных исследований на сифилис ставят неспецифический тест микрореакцию преципитации (МР). В лунку полистироловой пластины вносят 3 капли исследуемой сыворотки и 1 каплю кардиолипинового антигена, смесь встряхивают и учитывают результаты. Положительная реакция характеризуется выпадением хлопьев. МР обладает высокой чувствительностью и специфичностью, хорошо сочетается с подтверждающими диагноз специфическими трепонемными тестами, позволяет объективно оценить эффективность лечения, однако необходимо ее подтверждение одним из специфических тестов (ИФА, РНГА, РИФ, РИБТ, РСК). ИФА применяется как для отборочных целей, так и для диагностики сифилиса. Разработаны тест-системы для определения антител к бледной спирохете классов G и M, что имеет важное значение для диагностики ранних форм сифилиса (в том числе врожденного), дифференциальной диагностики рецидивов, реинфекции, оценки эффективности лечения и т.д. РНГА также используется для целей отбора и диагностики. Обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, чем другие серологические реакции при сифилисе, отличается простотой в постановке. РИФ сопоставима по своим результатам с ИФА и РНГА. Сыворотку больного адсорбируют взвесью непатогенных трепонем или разводят 1:200, наносят на предметное стекло, содержащее фиксированные ацетоном бледные трепонемы из тестикул зараженного кролика, после чего на препарат наносят люминесцирующий иммуноглобулин кролика против глобулинов человека. Мазки исследуют с помощью люминесцентного микроскопа, отмечая при положительном результате наличие ярко-зеленого свечения трепонем. РИБТ. Сущность реакции заключается в способности антител к бледной трепонеме иммобилизировать (обездвиживать) их в присутствии комплемента. Подсчитывают процент иммобилизации, при этом при показателе 0-20% реакция считается отрицательной, от 21 до 50% - слабо положительной, от 51 до 100% - положительной. 79 РСК ставится по общепринятой методике с неспецифическим кардиолипиновым (экстракт липидных фракций из бычьего сердца – реакция Вассермана) и специфическим (из разрушенных ультразвуком трепонем) антигенами. Положительная реакция характеризуется задержкой гемолиза. Иммуноблотинг – вариант ИФА для определения антител в крови больного к антигенам бледной спирохеты. В настоящее время ставится вопрос о повсеместном введении более информативных, простых и экономичных ИФА и РНГА для диагностики сифилиса с одновременной отменой РСК и РИБТ. Генодиагностика. Разработана ПЦР и метод ДНК-зондов для диагностики сифилиса. Самостоятельная работа студентов 1. Микроскопическое исследование материала от больного с целью обнаружения бледной трепонемы: изучение препарата "раздавленная капля" (тканевой сок из твердого шанкра) методом темнопольной микроскопии (демонстрация). Обратить внимание на наличие в поле зрения микроскопа тонких, извитых спирохет с 10-12 равномерными завитками. Отметить типичные маятникообразные и поступательные движения бледной трепонемы. изучение тушевого препарата (по Бурри) из материала от больного (тканевой сок из твердого шанкра); 2. Серологическая диагностика сифилиса. Учет РСК с кардиолипиновым и специфическим трепонематозным антигеном (демонстрация). Постановка и учет реакции микропреципитации с инактивированной сывороткой крови больного с подозрением на сифилис. Компоненты реакции: - инактивированная сыворотка крови больного А - инактивированная сыворотка крови больного Б - инактивированная сыворотка крови больного В - контрольная положительная сыворотка крови - кардиолипиновый антиген - изотонический раствор хлорида натрия, Методика постановки микрореакции: В лунки планшета для иммунологических реакций внести по 3 капли сывороток крови больных А,Б,В и контрольной положительной. В каждую лунку добавить по I капле кардиолипинового антигена, для перемешивания ингредиентов встряхивать планшет 5 минут. Внести во все лунки по 3 капли изотонического раствора хлорида натрия. Перемешать, покачивая планшет, и оставить на столе на 5 минут. Учет результатов произвести после появления хлопьев в лунке с контрольной положительной сывороткой (планшет рассматривать над лампой на столе), учет результатов ИФА с сыворотками крови больных А, Б, В с подозрением на сифилис (демонстрация). В верхнем ряду лунок планшета поставлены контроли: - контроль положительной сыворотки (2 лунки, коричневое окрашивание), - контроль отрицательной сыворотки (2 лунки, светло-бежевое окрашивание), - контроль конъюгата (2 лунки, светло-бежевое окрашивание), - контроль субстратной смеси (4 лунки, коричневое окрашивание). Во 2-4 рядах лунок исследуются сыворотки крови больных А (2-й ряд), Б (3-й ряд) ,В (4-й ряд) в разведении 1:200. Результаты реакции оценивают по изменению цвета смеси со светлобежевого в коричневый. РИФ. На предметном стекле готовят мазок из культуральных трепонем, затем наносят исследуемую сыворотку больного в разведении I; 200 на 30 мин, промывают препарат забуференным физиологическим раствором и докрашивают мазок флюоресцирующей сывороткой против глобулинов человека. Препарат исследуют в люминесцентном микроскопе, отмечая интенсивность свечения трепонем. Реакция высокочувствительна и специфична. 80 РИТ. Сущность реакции состоит в подавлении движения бледных трепонем (иммобилизация) антителами сыворотки крови больного в присутствии комплемента. С этой целью к взвеси тканевых спирохет добавляют исследуемую сыворотку больного и свежий комплемент. Параллельно ставят 2 контрольные пробы, в одной вместо исследуемой сыворотки берут сыворотку крови здорового человека, в другой вместо свежего комплемента инактивированный. Выдерживают все пробы в анаэробных условиях, готовят препарат "раздавленной капли" и исследуют с помощью микроскопии в темном поле, определяя количество подвижных и неподвижных трепонем. Расчет процента иммобилизации трепонем (ПИТ) осуществляют по формуле: (А-B)х100 А где А - количество подвижных трепонем в контроле (с неактивным комплементом), B - число подвижных трепонем в опыте. Если процент иммобилизации выше 50, результат положителен. РНГА с эритроцитарным трепонемным антигеном (демонстрация) 3. Ознакомиться с препаратами для диагностики и лечения сифилиса: специфический антиген из тканевых трепонем, разрушенных ультразвуком, для РСК; неспецифический кардиолипиновый антиген - экстракт липидных фракций бычьего сердца для постановки реакции Вассермана (РСК); антибиотики: пенициллин, цефотаксим, тетрациклины, эритромицин. Микробиологическая диагностика мягкого шанкра Материалом для исследования является отделяемое язвы – мягкого шанкра. Микроскопический метод заключается в исследовании препаратов из отделяемого мягкого шанкра, окрашенных по Граму и метиленовым синим. Возбудитель мягкого шанкра (Haemophilus ducreyi) выглядит в виде длинных цепочек грамотрицательных палочек. Бактериоскопический метод осуществляют путем посева материала на кровяные питательные среды, на которых Haemophilus ducreyi через 48-72 часа образует мелкие круглые колонии, окруженные зоной гемолиза. Идентификацию выделенной культуры проводят на основании изучения биохимических (посев на среды «пестрого» ряда) и антигенных (постановка РА на стекле) свойств. Микробиологическая диагностика гонореи Возбудителем гонореи является Neisseria gonorrhoeaе, вызывающая острые и хронические воспалительные поражения мочеполовых органов, слизистой оболочки ротоглотки и конъюнктивы глаза. Материалом для исследования является гнойное отделяемое мочеполовых органов, прямой кишки или конъюнктивы глаз (при бленорее), суставной и перитонеальный экссудат. Строго регламентированными методами лабораторной диагностики гонореи являются микроскопическое и бактериологическое (культуральное) исследование. Методы микробиологической диагностики гонореи отражены в схеме 18 . Схема 18. Методы микробиологической диагностики гонореи Исследуемый материал: гнойное отделяемое мочеполовых органов, прямой кишки или конъюнктивы глаз (при бленорее), суставной и перитонеальный экссудат. Микроскопический метод – мазки, окрашенные по Граму и метиленовым синим Бактериологический метод – посев на специальные сывороточные питательные среды с антибиотиками. Через 24-72 часа культивирования учет характера роста (колонии в виде «росы»), пересев типичных колоний на сывороточный МПА и идентификация культуры по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, тест на оксидазу и антибиотикорезистентность Серологический метод - РСК, ИФА строго не регламентированы, диагностического значения не имеют Генодиагностика - ПЦР 81 Микроскопический метод заключается в исследовании мазков из исследуемого материала, окрашенных по Граму и метиленовым синим. При окрашивании препаратов на гонорею используют модификацию метода Грама (краситель генциан-виолет заменяют кристал-виолетом, а вместо фуксина применяют нейтральный красный; промывку препарата осуществляют после каждого этапа окраски). В мазках при острой гонорее обнаруживают большое количество полиморфноядерных лейкоцитов, внутри и вне которых расположены бобовидные грамотрицательные диплококки; сопутствующая микрофлора либо минимальна, либо отсутствует вовсе (рис. 25). При хронической гонорее в ряде случаев типичный гонококк в мазках не выявляется, либо выглядит нетипично в виде мелких пылевидных или крупных шарообразных образований, нередко 2 клетки гонококка располагаются под углом друг к другу, при этом обнаруживается обильная сопутствующая микрофлора, лейкоциты, эпителиальные и другие клетки. В качестве экспресс-метода диагностики может использоваться ИФМ. Рис. 25. Возбудитель гонореи (Neisseria gonorrhoeaе) в мазках из уретры больного острой гонореей. Внутри и внеклеточно расположенные грамотрцательные диплококки, обилие лейкоцитов. Бактериологический метод. Гонококк отличается высокой чувствительностью к различным неблагоприятным факторам, поэтому культуральное исследование необходимо проводить сразу после отбора материала. Посев производят на специальные питательные среды. Основой этих сред является МПА из кроличьего мяса с добавлением дрожжевого аутолизата, гидролизата казеина или гемогидрализата и сыворотки крупного рогатого скота. Асцитическая жидкость и яичный желток в качестве добавок к среде для культивирования гонококка в настоящее время не применяются. Второй тип питательных сред является селективным и включает в свой состав, помимо вышеуказанных компонентов, антибиотики (полимиксин, линкомицин, а для диагностики фарингеальной гонореи – оротовую кислоту). Посевы выращивают при 370 С в течение 24-72 часов в атмосфере с повышенным содержанием СО2. Колонии гонококков круглые, прозрачные, в виде капелек росы. Типичные для гонококков колонии пересевают в пробирки со средой для культивирования гонококка для получения чистых культур, которые идентифицируют по морфологическим и сахаролитическим свойствам на средах "пестрого" ряда (полужидкий агар с сывороткой и углеводом) или с помощью микротест-систем. В мазках из чистых культур гонококки располагаются не попарно, а отдельно. В биохимическом отношении гонококки малоактивны и ферментируют только глюкозу с образованием кислоты, вырабатывают оксидазу. Для выявления оксидазы применяют пробу с 1% водным раствором диметилпарафенилендиамина или диэтилпарафенилендиамина, которые окрашивают колонии гонококка сначала в розовый, затем в красный, а через несколько минут – в черный цвет. Исследуют также чувствительность гонококков к антибиотикам и его бета-лактамазную активность. 82 Серологический метод (определение антител к гонококку в крови пациентов с помощью РСК и ИФА) не является строго регламентированным, не представляет диагностической ценности, не является методом контроля эффективности проводимого лечения и в реальной практике в настоящее время не используется. Генодиагностика. Направлена на обнаружение специфических фрагментов ДНК гонококка с помощью ПЦР и может быть использована в качестве дополнительного высокоинформативного метода диагностики гонореи. Самостоятельная работа студентов 1. Микроскопический метод - исследование гнойного отделяемого из уретры больного с подозрением на гонорею (демонстрационный микропрепарат, окраска по Граму). 2. Бактериологический метод. Изучение культуральных. возбудителя гонореи на питательной среде для выделения гонококка, на которой гонококки образуют круглые, прозрачные колонии в виде капелек росы. В ферментативном отношении гонококк малоактивен и ферментирует лишь глюкозу с образованием кислоты. Учесть результаты посева гонококка на «пестрый» ряд (демонстрация). 3. Изучить препараты для диагностики и лечения гонореи. Гонококковая вакцина – взвесь убитых нагреванием Neisseria gonorrhoeae для лечения хронической гонореи. Микробиологическая диагностика урогенитального микоплазмоза Возбудителями урогенитального микоплазмоза и уреаплазмоза являются 3 вида микоплазм из 2 родов: Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, реже - Mycoplasma genitalium. Исследованию подвергают выделения из уретры, шейки матки и влагалища, сперму, мочу. Лабораторная диагностика микоплазмозов базируется, в основном, на бактериологических и иммунофлюоресцентных исследованиях, а также на ПЦР. Микроскопический метод заключается в исследовании мазков из исследуемого материала, окрашенных люминесцирующими сыворотками против микоплазм. При люминесцентной микроскопии микоплазмы выявляются в виде зеленого гранулярного свечения на мембранах эпителиальных клеток и во внеклеточном пространстве. Бактериологический метод. Микоплазмы относятся к прихотливым микроорганизмам и для их культивирования применяются специальные жидкие, полужидкие и плотные питательные среды. Для определения Ureaplasma urealyticum используется ее способность разлагать мочевину, находящуюся в составе специальной питательной среды (бульон PPLO – триптический перевар бычьего сердца или триптиказо-соевый бульон, дрожжевой экстракт, мочевина, Lцистеин, лошадиная сыворотка, пенициллин, амфотерицин, линкомицин, индикатор бромтимоловый синий). При наличии в материале уреаплазм цвет среды меняется с лимонно-желтого на изумрудный, а при наличии высоких концентраций уреаплазм на синий. Созданы тест-системы, позволяющие одновременно выявлять Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum. На плотных питательных средах Mycoplasma hominis растет в виде характерных колоний, напоминающих «яичницу-глазунью» (рис. 26). 83 Рис. 26. Колонии Mycoplasma hominis Идентификация и дифференциация различных видов микоплазм проводится по биохимическим и антигенным свойствам (табл. 20). Mycoplasma hominis, в отличие от других микоплазм, не ферментирует углеводы и разлагает аргинин. Таблица 20. Основные биологические свойства микоплазм, вызывающих урогенитальные инфекции Свойства Виды микоплазм Mycoplasma hominis Ureaplasma urealyticum Рост на МПА с метиленовым синим Устойчивость к ацетату таллия + Колонии в виде «яичницы-глазуньи» + Ферментация: глюкозы мочевины К аргинина К Гемолиз эритроцитов: барана γ α морской свинки γ β лошади αγ γ человека γ α Обозначения: (+) – наличие признака, (-) – отсутствие признака, К – кислота. Серологический метод. Имеются тест-системы для ИФА, применяющиеся с целью определения антител в сыворотке крови больных микоплазмозом. Генодиагностика. Для диагностики микоплазмозов разработана ПЦР. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза Возбудителем урогенитального хламидиоза – инфекции, вызывающей уретриты, цервициты, сальпингиты, эпидидимиты и конъюнктивиты, является Chlamydia trachomatis. Материалом для исследования при хламидиозе являются мазки со слизистой оболочки мочеиспускательного канала, выделения из шейки матки, соскобы, мазки-отпечатки и др. Микроскопический метод исследования мазков из исследуемого материала в окраске по методу Романовского-Гимзе в настоящее время практически не применяется. Распространенными методами исследования при хламидиозе являются прямая и непрямая, в основе которых лежит обработка мазков специфическими флюоресцирующими антителами антителами против хламидий (прямая РИФ), либо обработка мазка нелюминесцирующими антителами против хламидий, а затем антивидовой люминесцирующей сывороткой (непрямая РИФ). При исследовании препаратов в люминесцентный микроскоп антигены хламидий обнаруживаются в цитоплазме клеток в виде единичных ярко-зеленых элементарных или ретикулярных телец (рис. 27 ). Культуральный метод. Выделение хламидий осуществляется путем заражения исследуемым материалом культур клеток McCoy, HeLa и других линий. Через 48 часов культивирования в термостате при 370 С выявляют включения возбудителя в клетках иммунофлюоресцентным методом. Выделение хламидий в культуре клеток имеет важное диагностическое значение, позволяет выявить жизнеспособные хламидии и определить их чувствительность к антимикробным препаратам. Генодиагностика. Разработана ПЦР для определения специфических фрагментов ДНК хламидий. Серологический метод включает постановку РСК, РНГА и ИФА для определения антител различных классов (IgG, IgM, IgA) к хламидиям в сыворотке крови больных с подозрением на хламидиоз. С учетом низкой иммуногенности хламидий и возможности наличия специфических антител после перенесенной ранее хламидиозной инфекции рекомендуется исследование нескольких проб сыворотки крови в динамике заболевания с интервалом в 2-3 недели. Тест-системы для 84 ИФА дают возможность дифференцировать различные классы антител к хламидиям. При остром процессе в крови чаще выявляются антитела IgM, а также быстро нарастающие или быстро снижающиеся антитела IgG и IgA. При хронически протекающем хламидиозе чаще определяются стабильные концентрации антител IgG и IgA, титры которых снижаются в ходе эффективно проводимой терапии. Рис. 27. Элементарные и ретикулярные тельца Chlamydia trachomatis в мазках со слизистой оболочки уретры. Прямая РИФ. х630 Самостоятельная работа студентов 1. Демонстрация фотографий колоний Mycoplasma hominis на питательной среде. Обратить внимание на характерный вид колоний в виде «яичницы-глазуньи». 2. Выявление уреаплазм на среде с мочевиной. Отметить изменение цвета индикатора среды (бромтимоловый синий) с исходного лимонно-желтого на зеленый в результате расщепления мочевины с образованием щелочных продуктов. 3. Серологический метод диагностики урогенитальных инфекций - учет демонстрационной ИФА по выявлению специфических антител в сыворотках крови больных микоплазмозом и хламидиозом. 4. Генодиагностика хламидиоза – учет ПЦР (демонстрация). Микробиологическая диагностика бактериального вагиноза Бактериальный вагиноз связан с перераспределением микрофлоры влагалища, в результате чего при этом заболевании на фоне подавления лактобактерий наблюдается массивный рост широкого спектра микроорганизмов (гарднерелл – Gardnerella vaginalis, пептококков, стрептококков, мобилункуса, бактероидов, микоплазм и др.). Диагностическое значение при этом заболевании является наличие не менее 3 из 4 признаков: характер вагинальных выделений (серовато-белого цвета, пенистых, с неприятным запахом); рН вагинального отделяемого >4,5; положительный аминный тест (рыбный запах), усиливающийся при смешивании патологического материала с 10% раствором КОН; выявление «ключевых» клеток (эпителиальные клетки, с адгезированными на них мелкими грамвариабельными палочками) при микроскопическом исследовании вагинальных мазков. Лабораторная диагностика бактериального вагиноза основана на применении следующих методов. Микроскопический метод – исследование влагалищных мазков, окрашенных по Граму и метиленовым синим с целью выявления «ключевых клеток» (рис. 28). В мазках, помимо гард85 нерелл, часто обнаруживаются также дрожжеподобные грибы рода Кандида, грамотрицательная микрофлора, мобилункус. Бактериологический метод. Для выделения гарднерелл наиболее часто применяют колумбийский агар (панкреатический перевар казеина и тканей животных, дрожжевой экстракт, бычий экстракт, крахмал, NaCl) с 5% донорской крови и антибиотиками ( гентамицин, налидиксовая кислота, амфотерицин). Культивирование осуществляют в атмосфере 5-10% СО2. Колонии гарднерелл через 48-72 часа культивирования гладкие, круглые, сероватые, блестящие, диаметром 0,1-0,5 мм с зоной β-гемолиза. В морфологическом отношении гарднереллы сначала грамотрицательные, затем грамвариабельные коккобактерии, ферментирующие различные углеводы, гиппурат, крахмал. Генодиагностика. Разработана ПЦР для выявления специфических участков ДНК гарднерелл. Другие методы лабораторной диагностики бактериального вагиноза (газожидкостная хроматография с целью определения летучих жирных и нелетучих органических кислот, а также хромато-масс-спектрометрия для анализа липидов гарднерелл) практического распространения не получили из-за высокой стоимости исследований и оборудования. Рис. 28. Ключевые клетки во влагалищном мазке больной бактериальным вагинозом. Окраска метиленовым синим. х900 Самостоятельная работа студентов. 1. Микроскопическое исследование влагалищных мазков при бактериальном вагинозе (окраска по Граму, демонстрация). Обратить внимание на «ключевые» клетки (эпителиоциты, покрытые мелкими грамвариабельными коккобактериями на фоне отсутствия лактобактерий). После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей бактериальных инфекций, передающихся половым путем, а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: оценивать результаты микробиологических анализов при бактериальных инфекциях, передающихся половым путем. ТЕМА 11. ВОЗБУДИТЕЛИ РИККЕТСИОЗОВ. Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей риккетсиозов, методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Риккетсии, эрлихии, коксиеллы, их таксономическое положение. 2.Бартонеллы.Таксономия. Биологические свойства. Роль в патологии человека. Микробиологическая диагностика. Этиотропная терапия. 86 3. Классификация риккетсий и риккетсиозов. 4. Морфология, биологические свойства и методы культивирования риккетсий. 5. Возбудители эпидемического сыпного тифа и болезни Брилля–Цинссера, эндемического сыпного тифа, клещевого сыпного тифа (северо-азиатского риккетсиоза), лихорадки цуцугамуши. Возбудитель Ку-лихорадки. Возбудители эрлихиозов. Биологические свойства. Экология. Хозяева и переносчики. Резистентность. Культивирование. Внутриклеточный паразитизм. Антигенная структура. Факторы патогенности. Патогенность для человека и животных. Иммунитет. Лабораторная диагностика. Этиотропная терапия. Специфическая профилактика. Микробиологическая диагностика риккетсиозов Риккетсиозы у человека и животных (12 нозологических форм) вызываются риккетсиями, подразделяющимися на 5 групп в зависимости от особенностей возбудителей и переносчиков: I - группа сыпного тифа; II - группа клещевых риккетсиозов; III - группа лихорадки цуцугамуши; IV - эрлихиозы человека и животных; V - группа лихорадки Ку. Риккетсии относятся к прокариотам, представляя собой мелкие полиморфные, грамотрицательные палочки, коккобактерии или нитевидные формы. Риккетсии являются облигатными паразитами, на искусственных питательных средах не растут и размножаются только в живой клетке. Риккетсии удается выделить путем заражения кровью больных риккетсиозами культур ткани (Vero, HeLa и др.), куриных эмбрионов, насекомых-переносчиков или экспериментальных животных. Наиболее часто в настоящее время используется метод культивирования риккетсий на культуре ткани. Выделение риккетсий проводится обычно с научными целями в специализированных лабораториях. Культуральный метод. Исследуемый материал вносят в лунки пластиковых планшетов или пробирок с культурой ткани, инкубируют 48-72 часа при 340 С в атмосфере 5 % СО2, после чего клетки промывают, фиксируют и окрашивают люминесцирующими сыворотками (прямая РИФ) против риккетсий для обнаружения возбудителя в клетках. Идентификацию выделенных риккетсий проводят также методом ПЦР. Серологический метод является основным методом при лабораторной диагностике риккетсиозов. Его применяют с целью обнаружения антител к риккетсиям в крови больных с подозрением на риккетсиоз, используя РСК, РИФ, РА, ИФА, иммуноблотинг и другие иммунологические реакции. Генодиагностика. В последнее время для диагностики риккетсиозов применяют метод ПЦР для детекции специфических фрагментов ДНК непосредственно в клиническом материале (кожные биоптаты, лимфоциты периферической крови, ликвор, клетки эндотелия и др.). Микробиологическая диагностика эпидемического сыпного тифа. Возбудителем эпидемического сыпного тифа и болезни Брилля-Цинссера (рецидивного сыпного тифа) является риккетсия Провачека (Rickettsia prowazekii), вызывающая у человека острое заболевание с внезапным началом, тифозным статусом (высокая температура тела, бред) и характерной сосудистой розеолезно-петехиальной сыпью в результате развития васкулита. Культуральный метод - выделение риккетсий Провачека из крови больных или от насекомых-переносчиков - вшей путем заражения куриного эмбриона в желточный мешок, вшей или культур клеток связан с высоким риском лабораторного заражения и проводится в редких случаях в специальных лабораториях. Риккетсии можно обнаружить в ядре или цитоплазме инфицированных клеток микроскопическим методом при окраске по методу Романовского—Гимзе в виде полиморфных мелких микроорганизмов, окрашенных в пурпурно-фиолетовый цвет, а при окраске по Здродовскому — в ярко-красный. Обнаружить риккетсий в материале можно также с помощью РИФ (прямой вариант) и ПЦР. Серологический метод диагностики с целью определения уровня сыпнотифозных антител и динамики их нарастания в сыворотке крови больных с подозрением на сыпной тиф является ведущим в лабораторной диагностике этой инфекции. Применяется РСК (диагностический титр 87 1:20), РА с диагностикумами из риккетсий Провачека (диагностический титр 1:160) , РНГА, непрямая РИФ. Диагностическое значение имеет 4-кратное нарастание титра антител в парных сыворотках. РСК позволяет диагностировать как активную форму болезни, так и перенесенную в прошлом (ретроспективный диагноз), дифференцировать эпидемический и эндемический (крысиный) сыпной тиф, а также первичный сыпной тиф от болезни Брилля - Цинссера (рецидива). Микробиологическая диагностика эндемического сыпного тифа. Возбудитель эндемического (крысиного) сыпного тифа (Rickettsia typhi) вызывает заболевание, сходное по клиническим проявлениям с эпидемическим сыпным тифом, поэтому лабораторная дифференциация этих двух инфекций имеет важное значение для постановки точного диагноза и для целей эпидемиологии. Серологический метод играет важную роль в дифференциации эндемического и эпидемического сыпного тифа. Применяются РСК и РА с антигенами из Rickettsia prowazekii и Rickettsia typhi. При эндемическом сыпном тифе титр сывороточных антител к Rickettsia typhi в 3-4 раза превосходит титр к Rickettsia prowazekii. Биопроба. При отсутствии культуры ткани проводят внутрибрюшинное заражение кровью больных морских свинок-самцов. Появление скротальной реакции (периорхит), лихорадки и выявление риккетсий во влагалищных оболочках яичек подтверждает диагноз эндемического сыпного тифа. Микробиологическая диагностика Ку-лихорадка. Возбудитель Ку-лихорадки (Coxiella burnetii - риккетсии Бернета) вызывает острое (реже подострое или хроническое) инфекционное заболевание с полиморфной клинической картиной. Для лабораторной диагностики этого риккетсиоза применяют серологический метод (РА, РСК), в некоторых случаях - непрямую РИФ, биологическую и кожно-аллергическую пробы. Серологический метод является основным в лабораторной диагностике Ку-лихорадки. Серологические реакции (РА и РСК) для определения антител к Coxiella burnetii в парных пробах сыворотки крови больных Ку-лихорадкой ставят с антигенами I фазы (иммуногенный ЛПС) и II фазы (малоиммуногенный антиген) возбудителя. Диагностический титр 1:4. Аллергодиагностика. Кожную аллергическую пробу проводят по обычной методике (0,1 мл аллергена внутрикожно), используя в качестве аллергена растворимый антиген из риккетсий Бернета I фазы, автоклавированную культуру коксиелл или ЛПС I фазы. Результаты пробы учитывают через 24-48 ч по наличию и размерам инфильтрата, гиперемии, отека. Проба специфична, но пригодна только для ретроспективной диагностики. У переболевших она остается положительной в течение 10 лет. Биопроба - внутрибрюшинное или интратестикулярное (в толщу яичек) заражение исследуемым материалом морских свинок самцов, куриных эмбрионов в желточный мешок. Обнаружение риккетсий осуществляется в мазках-отпечатках внутренних органов, окрашенных по Романовскому-Гимзе или Здродовскому. В настоящее биопроба в реальной практике не используется в связи с внедрением культур тканей для культивирования и выделения риккетсий. Микробиологическая диагностика лихорадки цуцугамуши. Лихорадка цуцугамуши вызывается Orientia tsutsugamushi и характеризуется лихорадкой, поражением нервной системы и органов кровообращения в результате развития множественных васкулитов. Материалом для исследования служат кровь, взятая в период лихорадки, для выделения возбудителя, а также сыворотка крови для серологической диагностики. Культуральный метод. Возбудитель лихорадки цуцугамуши в материале от больного можно выделить путем заражения перевиваемой культуры клеток L и на клетках первичнотрипсинизированных фибробластов куриного эмбриона. Серологический метод. Проводится со второй недели болезни. Для определения специфических антител в крови больных используют ИФА, РА (с антигеном из культуры Proteus mirabilis OXk), непрямую РИФ, РСК. Биопроба. Кровью больного внутрибрюшинно заражают белых мышей, которые через 6-14 дней погибают. Риккетсии выявляют в мазках-отпечатках внутренних органов животного, окра88 шенных по Романовскому— Гимзе, Здродовскому или люминесцирующими сыворотками против Orientia tsutsugamushi. . Микробиологическая диагностика риккетсиозов группы пятнистой лихорадки Скалистых гор. К этой группе риккетсиозов относятся марсельская (Астраханская) лихорадка (возбудитель Rickettsia conorii), осповидный (везикулярный) риккетсиоз (возбудитель Rickettsia akari) пятнистая лихорадка Скалистых гор (возбудитель Rickeftsia rickettsii), клещевой сыпной тиф Сибири и Северной Азии (возбудитель Rickettsia sibirica). Биопроба – внутрибрюшинное заражение материалом от больного морских свинок самцов или белых мышей. Риккетсии этой группы вызывают у морских свинок через 6-14 дней после заражения скротальный феномен с некрозом мошонки, а у белых мышей (возбудитель везикулезного риккетсиоза) - перитонит. Серологический метод. Для обнаружения антител в сыворотках крови больных со 2 недели заболевания в динамике (исследование парных сывороток) используют непрямую РИФ, ИФА, РСК, РНГА. Нарастание титра антител в 4 и более раз в динамике болезни подтверждает диагноз риккетсиоза. Микробиологическая диагностика эрлихиозов Эрлихии (Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia equi, Ehrlichia sennetsu) поражают фагоциты (тканевые макрофаги, моноциты - Е. chqffeensis, гранулоциты - Е. phagocytophila ) животных и человека, вызывая острую трансмиссивную генерализованную инфекцию, сопровождающуюся лихорадкой, генерализованной лимфаденопатией, изменениями формулы крови и вторичным иммунодефицитом. При эрлихиозах, в отличие от других риккетсиозов, присасывание клеща не приводит к развитию первичного аффекта. Клиническая диагностика эрлихиозов затруднительна из-за отсутствия характерной симптоматики. Лабораторная диагностика эрлихиоза включает следующие методы. Микроскопический метод состоит в микроскопии мазков из крови больного, в которых при окраске по Романовскому—Гимзе компактные пурпурные скопления эрлихий (морулы) находятся в цитоплазме лейкоцитов в виде тутовой ягоды или малины. Культуральный метод Культуральный метод более чувствителен, чем микроскопический. Возбудитель выделяют из крови путем длительного культивирования (до 4 недель) на перевиваемых культурах ткани (Vero, ТНР-1, HeLa или др.), которые систематически (2 раза в неделю) проверяются на присутствие эрлихий в мазках, окрашенных по Романовскому—Гимзе, с помощью ИФМ или ПЦР. Генодиагностика заключается в постановке ПЦР, являющейся информативным методом выявления эрлихий. Серологический метод является ретроспективным; для определения специфических антител к эрлихиям применяется непрямая РИФ и иммуноблотинг. Микробиологическая диагностика бартонеллезов Бартонеллы, в отличие от риккетсий, растут на искусственных питательных средах. Бартонеллы поражают эндотелий сосудов и эритроциты, приводя к развитию ангиоматоза или анемии. У человека бартонеллы вызывают острые (волынская или окопная пятидневная лихорадка, возбудитель Bartonella quintana; болезнь Карриона или лихорадка Оройя с эндемическим распространением, возбудитель Bartonella bacilliformis), подострые (болезнь кошачьих царапин, возбудитель Bartonella henselae) и хронические (бациллярный ангиоматоз, перуанская бородавка, пурпурный гепатит, эндокардиты и др., возбудитель Bartonella bacilliformis) инфекции. Микроскопический метод. Бартонеллы могут быть обнаружены в исследуемом материале от больного с помощью РИФ. Бактериологический метод заключается в посеве крови от больного на специальные полужидкие и плотные питательные среды с гемином и 5-10% крови человека или животных (барана, кролика). Посевы выращивают при 370 С (В. bacillifomis — при 21-300 С) в атмосфере с 5-10% СО2 в течение длительного времени (45-60 дней). Идентификацию бартонелл осуществляют на ос- 89 новании изучения морфологических (подвижность) и биохимических (наличие каталазы, оксидазы, нитратредуктазы и др.) свойств. Серологический метод играет важную роль в постановке диагноза бартонеллеза. Для определения в крови больных антител к бартонеллам применяют ИФА, РНГА, РИФ. Самостоятельная работа студентов 1. Микроскопический метод. Изучение морфологии риккетсий Провачека, Музера и Бернета (демонстрационные микропрепарата). Окраска по Романовскому-Гимзе. Препараты описать, зарисовать. 2. Методы культивирования риккетсий. Для культивирования риккетсий применяют развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ). Заражение проводят в желточный мешок. Риккетсии также можно культивировать в первично-трипсинизированных и перевиваемых тканевых культурах, а также в организме чувствительных лабораторных животных. Морских свинок заражают внутрибрюшинно, риккетсии накапливается в мезотелии оболочек яичка и вызывают специфический периорхит. Морфологию выделенных риккетсий изучают в препаратах из содержимого РКЭ и культур тканей, окрашивают по Романовскому-Гимзе или по Здродовскому. Применяется также иммунофлюоресцентный метод. Для диагностики риккетсиозов в обычных лабораториях применяют серологический метод, а в клинике - кожные аллергические пробы. 3. Серологический метод диагностики сыпного тифа: Учет демонстрационной РА риккетсий с целью выявления антител в крови больных сыпным тифом. Диагностический титр I:I60. Учет РНГА с сывороткой крови больного сыпным тифом. В реакции используется растворимый риккетсиозный антиген, адсорбированный на эритроцитах. Диагностический титр 1/200. (Демонстрация). Учет РCK, поставленной с целью дифференцировки первичного сыпного тифа и болезни Брилля, основанную на том, что при первичном сыпном тифе формируются антитела иммуноглобулина класса М, а при рецидиве сыпного тифа (болезнь Брилля) - класса G. РСК ставят с цельной сывороткой крови и сывороткой, обработанной цистеином, который вызывает распад молекулы IgM. В результате реакции при первичном сыпном тифе антитела в обработанной цистеином сыворотке определяются в более низком титре, чем в цельной сыворотке. При болезни Брилля выше количество Ig G и поэтому титры антител в обработанной цистеином и необработанной сыворотках существенно не отличаются. 4. Диагностика Ку-лихорадки. Серологический метод: Учет демонстрационной РА с парными сыворотками больного сыпным тифом с целью определения нарастания титра сыпнотифозных антител. Диагностический титр 1:100. На 3 - 5 неделе заболевания титры антител увеличивается в 10 и более раз. Учет демонстрационной РСК, поставленной с парными сыворотками крови больного Ку-лихорадкой. Диагностический титр 1:100. 5. Изучение препаратов, используемых для диагностики, специфической профилактики и лечения риккетсиозов, хламидиозов, микоплазмозов. риккетсиозные диагностикумы (Провачека, Музера, Бернета) - взвесь убитых риккетсий, применяющиеся для постановки реакции агглютинации с целью выявления антител в сыворотке крови больных риккетсиозами. живая комбинированная сухая сыпнотифозная вакцина для специфической профилактики сыпного тифа. сухая живая вакцина для профилактики Ку-лихорадки. ку-аллерген - взвесь убитых нагреванием риккетсий для постановки кожной аллергической пробы. Вводится внутрикожно, учет реакции через 24-48 часов. Педиатрические аспекты темы 90 1. Сыпной тиф у детей протекает значительно легче, чем у взрослых. Типична кратковременная лихорадка (до I недели), сыпи часто не бывает. В связи со стертой клинической картиной микробиологическая диагностика приобретает большое практическое значение. 2. Дети заражаются Ку-лихорадкой через некипяченое молоко и молочные продукты, при купании в водоемах, загрязненных больными животными. Возможно заражение Кy-лихорадкой через молоко больной матери. 3. Кy-лихорадка у детей протекает по типу тифо-паратифозного заболевания у 50% больных или сходно с гриппом (у 30%). Иногда этот риккетсиоз протекает в виде пневмонии или в стертой форме. После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей риккетсиозов, а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: ставить РА при риккетсиозах, оценивать результаты микробиологических анализов при риккетсиозах. Тема 12. ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ: МОРФОЛОГИЯ И УЛЬТРАСТРУКТУРА ВИРУСОВ, МЕТОДЫ ИХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ. ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ. Цель занятия: разбор теоретических основ общей вирусологии (классификация, биологические свойства вирусов), освоение методов культивирования вирусов и экспрессдиагностики вирусных инфекций. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Вирусология, ее цели и задачи. Периоды развития вирусологии. 2. Классификация вирусов человека. Природа и происхождение вирусов. 3. Морфология вирусов. Форма и размеры вирусов. Принципы структурной организации вирусов. Понятие о простых и сложных вирусах. 4. Вирион и его компоненты. Нуклеиновая кислота, капсид, капсомеры, сердцевина, суперкапсидная оболочка, пепломеры. Типы симметрии нуклеокапсида. 5. Особенности биологии вирусов. Химический состав вирионов: нуклеиновые кислоты, белки, липиды, углеводы и их особенности. Ферменты вирусов. 6. Типы взаимодействия вирусов с клеткой: продуктивный, абортивный, интегративный. Вирогения. 7. Методы культивирования вирусов на клеточных культурах, эмбрионах птиц, в организме лабораторных животных. МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ Лабораторная диагностика вирусных инфекций базируется на 3 группах методов: Вирусологический метод - выделение вируса из исследуемого материала и его идентификация. Серологический метод - определение в сыворотке крови больных специфических противовирусных антител с помощью разнообразных иммунологических реакций. Генодиагностика - обнаружение в материале от больного специфичных для данного вируса фрагментов нуклеиновых кислот вирусов-возбудителей с помощью метода зондов (гибридизация НК) или ПЦР. Прямое вирусоскопическое исследование мазков из клинического материала, окрашенных анилиновыми красителями, с целью выявления вирусов в настоящее время в практике работы вирусологических лабораторий проводится редко. Чаще применяются с целью поиска антигенов вируса ИФМ или микроскопический вариант ИФА как экспресс-методы диагностики вирусных инфекций. Взятие и подготовка материала для вирусологической диагностики 91 Вирусологическому исследованию подвергают содержимое везикул, пустул, соскобы эпителия, спинномозговую жидкость, фекалии, мазки и смывы из верхних дыхательных путей, взятые у больного с соблюдением правил асептики в ранние стадии вирусной инфекции. Мазки из носоглотки и кожные соскобы помещают в ИРХН или раствор Хенкса с 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиками (для подавления сопутствующей микрофлоры). Исследуемый материал хранят и пересылают в вирусологическую лабораторию в специальных контейнерах с сухим льдом. Пробы можно сохранять в условиях глубокой заморозки (-700 С). Вирусологический метод Поскольку вирусы относятся к облигатным внутриклеточным паразитам и на искусственных питательных средах не растут, для их культивирования применяются живые системы (культуры клеток, развивающиеся куриные эмбрионы, чувствительные лабораторные животные). Выделение вирусов на культурах клеток В практике вирусологических лабораторий для выделения вирусов используют первичнотрипсинированные, полуперевиваемые (диплоидные) и перевиваемые клеточные культуры. Первично-трипсинированные культуры клеток можно получить из любых органов и тканей человека, животных, насекомых, растений, однако наиболее часто используются эмбриональные ткани (фибробласты куриного эмбриона, человека, и др.), обладающие повышенной способностью к росту и размножению. Для получения клеточной взвеси ткань отмывают от крови в растворе Хенкса, измельчают ножницами и несколько раз обрабатывают трипсином на магнитной мешалке или путем пипетирования. Затем взвесь клеток отмывают от трипсина раствором Хенкса путем центрифугирования при 600 об/мин в течение 5—10 мин, ресуспендируют в питательной среде и определяют концентрацию клеток в камере Горяева. Клеточную взвесь разводят питательной средой (обычно среда № 199 с добавлением сыворотки крупного рогатого скота) до концентрации 4-8х105 клеток в 1 мл, разливают в культуральные сосуды, закрывают резиновыми пробками. Пробирки укладывают под углом 50. Культивирование клеток осуществляют в термостате при 35-370 С 48-96 часов, в течение которых формируется монослой клеток, прикрепляющийся к поверхности стекла (или пластика). С помощью версена (натриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты - ЭДТА) (реже трипсина), клетки можно снять с поверхности культуральной емкости и перенести их в другую емкость (произвести пассаж). Для этого в сосуды с клетками после отсасывания питательной среды наливают 0,02% раствор версена или 0,25% трипсина и помещают их на 3-5 мин в термостат. Затем версен или трипсин удаляют, в культуральный сосуд добавляют небольшое количество питательной среды, в которой суспендируют клетки, подсчитывают их количество, доводят их до требуемой концентрации и разливают в новые флаконы. Однако первично-трипсинизированные клеточные культуры не выдерживают более 5-10 пассажей. Перевиваемые клеточные культуры, в отличие от первично-трипсинированных, переносят неограниченное число пассажей, так как обычно их получают из опухолевых клеток, и меющих высокие способности к росту. Широкое распространение в вирусологии получили культуры клеток карциномы шейки матки (HeLa), раковой опухоли гортани (НЕр-2), костного мозга больного раком легких (Detroit-б) и т.д. Созданы «банки» перевиваемых клеточных культур, в которых хранятся клетки, замороженные жидким азотом. Полуперевиваемые (диплоидные) культуры получают путем нескольких пассажей, в результате чего формируется популяция клеток, способных выдержать до 60 пассажей, быстро размножаться, быть высокочувствительными ко многим вирусам, сохраняя при этом исходный набор хромосом. Для культивирования клеток используются специальные стерильные питательные среды (например, среды 199, Игла, гидролизат лактальбумина и др.) с рН 7,2-7,6, содержащие полный набор аминокислот, витамины, факторы роста и набор минеральных веществ, к которым добавляют от 2 до 30 % сыворотки крови животных (сыворотка крупного рогатого скота, эмбриональная телячья сыворотка и др.), а также антибиотики для предотвращения роста бактериальной 92 флоры. Среды содержат индикатор феноловый красный, который имеет оранжево-желтый цвет при кислой реакции среды и красно-малиновый цвет в щелочной среде. Поддерживающие среды либо не содержат сыворотки, либо содержат ее в небольшом количестве. Их применяют для сохранения выросших клеток после заражения их вирусами. Для выделения вирусов питательную среду из пробирок с культурой клеток удаляют, промывают монослой клеток раствором Хенкса для удаления сывороточных антител и ингибиторов, после чего в пробирку вносят 0,1-0,2 мл обработанного вируссодержащего материала. Через 3060 мин после заражения материал из пробирки удаляют, вносят 1 мл поддерживающей среды и пробирки помещают в термостат при 370 С для культивирования. Выделение вирусов на развивающихся куриных эмбрионах Для культивирования вирусов используют 6-15-дневные куриные эмбрионы. Заражение осуществляют на хорион-аллантоисную оболочку (ХАО), в желточный мешок, полость амниона и аллантоиса. При заражении на ХАО скорлупу обрабатывают спиртом, йодом и снова спиртом. Скорлупу прокалывают над воздушным мешком, а сбоку в скорлупе делают отверстие размером 7x2 мм. Не повреждая оболочку под скорлупой, короткой тонкой иглой шприца наносят на ХАО 0,1—0,2 мл вирусосодержащего материала. Заражение в полость аллантоиса осуществляют путем введения исследуемого материала шприцем на глубину 10—15 мм через боковое отверстие в скорлупе. В полость амниона вирусосодержащий материал вводят через отверстие на тупом конце яйца, при этом игла шприца должна быть направлена к телу эмбриона. Дефекты скорлупы заливают стерильным парафином и эмбрионы помещают в термостат. Выделение вирусов на экспериментальных животных. Экспериментальные животные в вирусологии применяются для диагностики вирусных инфекций, получения иммунных противовирусных сывороток и компонентов крови (эритроцитов, лейкоцитов, плазмы и т.д.), моделирования вирусных инфекций с научными целями для изучения патогенеза, иммунитета, патоморфологии и т.д., а также для разработки способов специфической и неспецифической профилактики и лечения вирусных инфекций. В вирусологии в качестве экспериментальных животных наиболее часто используются белые мыши, морские свинки, кролики, хомячки, хлопковые крысы, обезьяны. Чувствительной моделью при ряде вирусных инфекций являются новорожденные грызуны. Правила заражения и вскрытия экспериментальных животных при вирусных и бактериальных инфекциях идентичны. Экспресс-диагностика вирусных инфекций Экспресс-диагностика вирусных инфекций применяется для выявления вирусов или их антигенов в различных видах клинического материал с помощью методов, характеризующихся высокой специфичностью, чувствительностью, информативностью и быстротой исполнения. Реакция иммунофлюоресценции (прямой и непрямой методы РИФ) применяется для выявления вируса в материале, полученном от больных, в инфицированных культурах клеток и в организме чувствительных животных. Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ) отличается возможностью одновременной концентрации вируса и его идентификации с помощью специфической противовирусной сыворотки. Для этого вируссодержащий материал обрабатывают противовирусной сывороткой, затем добавляют фосфорно-вольфрамовую кислоту или уранилацетат, смесь наносят на пленку (подложку) и высушивают. При электронной микроскопии при положительном результате находят скопления вирусных частиц. ИЭМ применяют для выявления в исследуемом материале полиовирусов, цитомегаловирусов, вирусов гепатита А и В, некультивируемых вирусов (аденовирусов в ткани миндалин, энтеро- и ротавирусов в фекалиях, вирусов оспы в оспенном детрите). Встречный иммуноэлектрофорез обычно применяется для обнаружения в сыворотках крови больных вирусных антигенов (например, HBsAg у больных гепатитом В). Реакцию ставят на стеклянных пластинах в слое агаре, в котором вырезают два параллельных ряда лунок. Сыворотки крови, содержащие антигены помещают в лунки, расположенные ближе к катоду, а соответствующие противовирусные сыворотки (антитела) - в лунки, находящиеся ближе к аноду, после 93 чего проводят электрофорез, при котором HBsAg, с отрицательным зарядом передвигается к аноду, а антитела — к катоду. Учет реакции осуществляется через 12-24 часа, положительные результаты реакции характеризуются образованием линий преципитации между определяемым антигеном (HBsAg) и специфическим антителом. Реакция гемадсорбции на твердой основе (РгадТО). Лунки полистироловых планшетов обрабатывают иммуноглобулином или иммунной сывороткой (например, против ротавирусов), вносят в них исследуемый вируссодержащий материал, через 30-60 мин лунки промывают буферным раствором, после чего добавляют взвесь сенсибилизированных специфическим иммуноглобулином эритроцитов и спустя 30-60 мин производят учет по наличию гемагглютинации. Если в исследуемом материале содержится специфический вирусный антиген, он соединяется с антителами иммуноглобулина (или сыворотки), адсорбированными на поверхности лунок, а затем с иммуноглобулинами на поверхности эритроцитов, в результате чего происходит гемагглютинация. В описанной модификации реакция применяется для выявления антигенов ротавирусов и других вирусов в фекалиях больных. Самостоятельная работа студентов 1. Изучение морфологии вирусов по электронограммам. 2. Освоение методов обработки материалов для вирусологического исследования, взятых от больных (носоглоточные смывы, испражнения и т.д.). Обязательными этапами этой обработки являются эмульгирование материала в растворе Хэнкса с последующим центрифугированием, отсасыванием надосадочной жидкости и добавлением к ней различных антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, нистатин) для угнетения сопутствующей микрофлоры. 3. Освоение этапов приготовления первично-трипсинизированной культуры ткани. Изучить этапы приготовления однослойной. трипсинизированной культуры клеток фибробластов человека. Кусочки эмбриональной ткани измельчить ножницами, пропипетировать в растворе Хенкса, поместить в пробирку, профильтровать. К осадку добавить раствор Хэнкса с трипсином. Перемешать осевшие дезагрегированные клетки, перенести на предметное стекло, изучить морфологию живых клеток в препарате "раздавленная капля", подсчитать их количество в камере Горяева и внести в пробирку со средой 199 для получения монослоя клеток. Пробирки помещаются в термостат при 370 С на сутки для выращивания. Изучение клеточных культур производится микроскопическим методом. Для этого пробирка помещается на предметный столик микроскопа; монослой клеток должен быть обращен вверх. Микроскопия проводится с вогнутым зеркалом под малым увеличением микроскопа, конденсор опускается вниз. В пробирке виден сплошной рост одноядерннх клеток в виде одного слоя. 4. Освоение методов культивирования вирусов на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) - заражение РКЭ в амниотическую, аллантоисную полости, на хорион-аллантоисиую оболочку. Заражение в хорион-аллантоисную полость. Над отмеченным при овоскопии воздушным мешком производят обработку скорлупы спиртом, водой, затем снова спиртом. При закрытом способе заражения в аллантоисную полость в скорлупе над воздушным мешком делают отверстие стерильной иглой. В него вводят иглу шприца, при этом прокалывается хорионаллантоисная оболочка и игла погружается в аллантоисную полость на I - 2 мм (от поверхности скорлупы расстояние около 1,5 см), после чего вводят 0,2 мл исследуемого материала. Отверстие в скорлупной оболочке закрывают стерильным парафином. Заражение на хорион-аллантоисную оболочку. После дезинфекции скорлупы последняя отрезается по краю воздушного мешка, дно которого выстлано белой кожистой подскорлупной оболочкой. Ее удаляют стерильным пинцетом, соблюдая осторожность, т.к. под ней расположена прозрачная, влажная, с развитыми сосудами хорион-аллантоисная оболочка, на которую наносят исследуемый материал. Дефект в скорлупе закрывают стеклянным колпачком или пластинкой, края которых предварительно погружаются в расплавленный парафин. После заражения обоими способами эмбрион маркируют и помещают в термостат. 5. Экспресс-диагностика вирусных инфекций (обнаружение вируса или его компонен94 тов в клиническом материале, взятом от больного – демонстрация). исследование мазков-отпечатков с целью обнаружения внутриклеточных включений. Микроскопия мазков-отпечатков с поверхности герпетических язв (окраска по РомановскомуГимза). Обратить внимание на наличие гигантских многоядерных клеток с внутриклеточными включениями. исследование мазков-отпечатков со слизистой оболочки верхних дыхательных путей у больного гриппом иммунофлюоресцентным методом. Обратить внимание на светящиеся частицы, располагающиеся внутри клеток. обнаружение антигенов вируса герпеса в клиническом материале твердофазным иммуноферментным методом. молекулярная гибридизация (выявление вирусов, не размножающихся в культуре клеток или персистирующих вирусов - цитомегаловирусов, вирусов герпеса, энтеровирусов, ротавирусов и т.д.). Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей вирусов с формированием двунитчатых структур. Наличие комплементарных нитей выявляют с помощью зондов, которыми являются ДНК и РНК, меченые ферментом. При добавления субстрата к зонду с ферментом происходит цветная реакция. После изучения темы студент должен знать: классификацию вирусов, их основные свойства, методы культивирования вирусов и экспресс-диагностики вирусных инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: заражать и вскрывать куриные эмбрионы, трактовать данные экспресс-диагностики вирусных инфекций. Тема 13. ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ: ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ. ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. ИНДИКАЦИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ. СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ. Цель занятия: разбор теоретических основ общей вирусологии (репродукция и генетика вирусов, особенности вирусных инфекций и противовирусного иммунитета); знакомство с методами индикации и идентификации вирусов, серологическими реакциями, применяемыми для диагностики вирусных инфекций. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Репродукция вирусов. Основные стадии взаимодействия вирусов с клеткой: адсорбция, характеристика вирусных лигандов и клеточных рецепторов; проникновение в клетку, механизмы; депротеинизация; синтез вирусных макромолекул; сборка вирионов; выход из клетки, пути выхода. 2. Интерференция. Дефектные интерферирующие частицы и их значение в развитии вирусной инфекции. Вирусы-сателлиты. Интегративная инфекция. 3. Генетика вирусов. Значение вирусологии в развитии генетики. Организация генетического аппарата вирусов. ДНК и РНК – носители генетической информации. 4. Генетическая изменчивость вирусов: мутации и рекомбинации. Мутации, причины возникновения. Фенотипические проявления. Генетические взаимодействия между вирусами. Рекомбинация. Генетическая реактивация. Модификационная изменчивость вирусов: комплементация и фенотипическое смешивание. 5. Патогенетические особенности вирусных инфекций. Инфекционность вирусных нуклеиновых кислот. Острая и персистирующая вирусная инфекция. 6. Индикация вирусов на биологических моделях. Характеристика цитопатогенного действия вирусов в культурах клеток. Вирусные включения. Бляшкообразование под агаровым покрытием. Гемадсорбция. 7. Идентификация вирусов с помощью реакций иммунитета – РН, РСК, РТГА, РП, ИФА, РИА, РИФ и др. 8. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций: микроскопический, вирусологический, серологический, молекулярно-генетические (ПЦР, молекулярная гибридизация). 9. Особенности противовирусного иммунитета. 95 Методы выявления (индикация) и идентификации вирусов Перед выявлением вируса в клетках его обычно отделяют от клеток хозяина путем их разрушения с помощью многократного замораживания и оттаивания или растирания со стерильным песком. Полученный вирусосодержащий материал центрифугируют или пропускают через бактериальный фильтр, обрабатывают антибиотиками для деконтаминации и предотвращения бактериального загрязнения. Индикация вирусов Для выявления (индикации) вирусов применяются следующие методы. Индикация вирусов в культуре клеток осуществляется, прежде всего, по цитопатическому действию (ЦПД) вирусов, сроки и характер которого зависят от свойств вируса, проявляясь дегенеративными изменениями клеток с последующей их гибелью и отслаиванием от стекла (рис. 29). Полная дегенерация клеток сопровождается значительными изменениями в виде пикноза ядра и цитоплазмы, отслаиванием клеточного монослоя от стекла. Частичная дегенерация культур клеток может протекать по следующим типам: гроздеобразования (округление, увеличение и слияние клеток с образованием гроздевидных скоплений, типично для аденовирусов), очаговой деструкции (очаги пораженных клеток на фоне в целом сохранившегося монослоя), характерной для вирусов гриппа; симпластообразования (слияние клеток с образованием гигантских многоядерных клеток в виде симпластов или синцитиев, характерных для вирусов кори, паротита, парагриппа, респираторно-синцитиального, герпеса, иммунодефицита человека). Пролиферативный тип ЦПД с трансформацией клеток в злокачественные, обладающие неограниченными потенциями к росту, способны вызывать онкогенные вирусы. Сроки, в течение которых наступает ЦПД, вариабельны (например, 1-2 дня у полиовирусов, 7-14 суток у аденовирусов). Если в инфицированных культурах клеток ЦПД отсутствует или слабо выражено, проводят «слепые пассажи», т.е. заражают культуральной жидкостью новые культуры клеток. а б Рис. 29. Культура клеток почек обезьян (а – незараженная, б – цитопатическое действие вируса) х200 Индикация вирусов с помощью реакции гемадсорбции (РГад). Сущность этой реакции заключается в способности эритроцитов человека или животных адсорбироваться на поверхности 96 клеток, инфицированных рядом вирусов (например, орто и парамиксовирусов и др.) в ранние сроки их репродукции (до развития ЦПД) в результате действия гемагглютининов – гликопротеидов, входящих в состав суперкапсида вируса. Для постановки РГад в культуру клеток добавляют 0,2 мл 0,5%-й взвеси эритроцитов, выдерживают 15-20 мин при температуре 40, 200 или 370 С в зависимости от свойств вируса, после чего взвесь эритроцитов удаляют и производят учет реакции под малым увеличением микроскопа по скоплению эритроцитов на отдельных клетках или на всем монослое. Индикация вирусов по цветной пробе. Принцип метода основан на определении кислых продуктов метаболизма, накаливающихся в клетке в процессе ее жизнедеятельности с помощью индикатора фенолового красного, меняющего свой цвет с красного в щелочной среде на оранжево-желтый в кислой среде. При заражении культуры клеток вирусами, вызывающими ЦПД (например, аденовирусы, энтеровирусы и др.), метаболизм клеток подавляется, рН среды не меняется и она остается окрашенной в красный цвет. Индикация вирусов по внутриклеточным включениям. Репродукция некоторых вирусов (оспы, герпеса, бешенства) приводит к образованию внутриклеточных включений, локализующихся в цитоплазме или в ядре клеток и представляющих собой скопления вируса (или его антигенов). Включения выявляют путем световой микроскопии культур клеток, окрашенных по Романовскому- Гимзе или другими методами, а также с помощью прямого флюорохромирования (например акридиновым оранжевым) с последующей микроскопией препаратов в люминесцентном микроскопе. Индикация вирусов с помощью прямой РИФ – выявление вирусных антигенов, находящихся в инфицированной клетке культуры ткани, с помощью антител диагностической иммунной сыворотки, специфических иммуноглобулинов или моноклональных антител, меченых флюорохромом, обычно флюоресцеином (рис. 30). Индикация вирусов с помощью электронно-микроскопического метода (ЭММ) применяется, в основном, в научных исследованиях. Материал для ЭММ концентрируют различными методами (ультрацентрифугирование, хроматография на колонках, адсорбцией с помощью специальных сорбентов или антител – для метода иммунной электронной микроскопии). ЭММ позволяет обнаружить в ядре или цитоплазме клеток отдельные вирионы, а также их скопления. В практических целях ЭММ может быть полезен для индикации и идентификации вирусов с типичной морфологией (оспенные вирусы, ротавирусы, коронавирусы, ВИЧ и т.д.). Рис. 30. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – выявление вирус-специфических антигенов. х900 Индикация вирусов по образованию бляшек - очагов разрушенных вирусом монослоя культуры клеток под агаровым покрытием. Количество бляшек отражает инфекционную активность вируса. Для постановки этой пробы вирусную суспензию в разных разведениях вносят в культуры ткани, находящиеся в плоских сосудах, после чего монослой клеток заливают гелем (слой агара или бентонита с индикатором нейтральным красным). Время бляшкообразования для большин97 ства вирусов, обладающих ЦПД, варьирует от 36 до 48 ч. Бляшки выглядят в виде неокрашенных светлых пятен на розово-красном фоне окрашенного монослоя. В бентонитовом методе монослой клеток молочного цвета, бляшки прозрачные. Индикация вирусов в куриных эмбрионах. Зараженные РКЭ инкубируют в термостате при 35370 С в течение 48 -72 ч., после чего производят их вскрытие, амниотическую и аллантоисную жидкость отсасывают шприцем, а оболочки и эмбрион извлекают и помещают в стерильные чашки Петри. При репродукции некоторых вирусов (натуральной оспы, осповакцины, простого герпеса) на ХАО куриных эмбрионах появляются характерные бляшки - беловатые пятна диаметром 1-2 мм, количество которых соответствует числу инфекционных частиц. В аллантоисной и амниотической жидкости зараженных эмбрионов ряд вирусов (например, ортомиксовирусы, парамиксовирусы, аденовирусы и т.д.) может быть выявлен с помощью реакция гемагглютинации (РГА). Принцип реакции состоит в способности гемагглютининов поверхностных вирусных структур гликопротеидной природы этих вирусов склеивать (агглютинировать) эритроциты определенных видов животных, птиц или человека. РГА не относится к иммунологическим реакциям, поскольку в ее основе отсутствует взаимодействие АГ и AT. РГА ставят обычно в пробирках или в специальных полистироловых планшетах. Для этого готовят двукратные разведения вирусосодержащего материала на ФР в объеме 0,5 мл. Во все пробирки добавляют 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов. В контроле к 0,5 мл ФР добавляют аналогичный объем взвеси эритроцитов. Пробы учитывают через 30-60 мин инкубации при комнатной температуре, в термостате при 370 С или в холодильнике при 40 С. Положительная реакция характеризуется выпадением осадка эритроцитов в виде «зонтика» с фестончатыми краями; при отрицательном результате эритроциты оседают в виде компактного осадка («пуговки» - рис. 31). Гемагглютинационный титр (максимальное разведение вирусосодержащей жидкости, вызывающее агглютинацию эритроцитов - одна гемагглютинирующая единица вируса,1 ГЕ) соответствует концентрации вируса. Агглютинацию эритроцитов могут вызывать также некоторые бактерии (стафилококки, эшерихии, сальмонеллы, шигеллы, холерный вибрион Эль-Тор), что необходимо учитывать при трактовке результатов РГА при исследовании вирус-содержащего материала, загрязненного бактериальной микрофлорой. Определение титра вирусов можно проводить также на хорионаллантоисной оболочке. Для этого в лунки стерильных полистироловых пластин помещают кусочки скорлупы 11-12-дневного куриного эмбриона с неповрежденной ХАО, добавляют вирусосодержащую жидкость в десятикратных разведениях на буфере, накрывают пластины фольгой и инкубируют при 35-37 0 С в течение 2472 часов. После этого скорлупу удаляют, добавляют 0,5% взвесь куриных эритроцитов и производят учет реакции по эффекту гемагглютинации, который свидетельствует о репродукции вируса. 98 Рис. 31. Реакция гемагглютинации для выявления вируса гриппа в хорион-аллантоисной жидкости куриного эмбриона. Индикация вирусов в организме лабораторных животных находится в зависимости от вируса и вида чувствительного лабораторного животного, будет описана в лабораторной диагностике конкретных вирусных инфекций. Идентификация вирусов Проводится с помощью следующих методов. Учет вирусиндуцированных патологических изменений в чувствительных живых системах. Изучение антигенных свойств вирусов в серологических реакциях с противовирусными сыворотками является основным методом идентификации вирусов. Для этого используют ряд иммунологических реакций. Реакция нейтрализации основана на способности антител нейтрализовать инфекционную активность вирусов в культурах ткани, РКЭ, чувствительных лабораторных животных. Из вируссодержащего материала готовят десятикратные разведения и добавляют к ним специфическую сыворотку в разведении в соответствии с титром, указанным на этикетке ампулы. Смеси вируссыворотка инкубируют 30 — 60 мин при 37 °С для обеспечения связывания антигенов с антителами, после чего смесью заражают культуру ткани, куриные эмбрионы или лабораторных животных. Контролем является чувствительная биосистема, зараженная вирусом без сыворотки. Реакция считается положительной в случае нейтрализации ЦПД в культуре клеток, а также при отсутствии патологических изменений в куриных эмбрионах или в организме животных. По результатам РН высчитывается индекс нейтрализации (ИН - отношение титра вируса в контроле к титру вируса в опыте). При ИН менее 10 реакция расценивается как отрицательная, от 11 до 49 — сомнительная, от 50 и выше — положительная. РН может быть поставлена в наиболее чувствительном варианте - подавления вирусного бляшкообразования под действием вирусспецифической антисыворотки. Для этого к вируссодержащему материалу добавляют соответствующую искомому вирусу антисыворотку и после инкубации в термостате при 370 С течение 30-60 мин смесь вносят в культуру чувствительных клеток. Бляшкообразование выявляют в слое агара или бентонита. Идентичность вируса антителам сыворотки проявляется подавлением бляшкообразования. Другим вариантом РН является цветная проба. Положительный результат пробы в случае соответствия вируса противовирусным антителам проявляется блокадой репродукции вируса, клетка при этом остается жизнеспособной, вырабатывая кислые продукты метаболизма, под влиянием которых цвет индикатора (фенолового красного) меняется с красного на желтый. Для постановки пробы в пробирки вносят по 0,25 мл рабочего разведения вируса и соответствующую антисыворотку. Смесь выдерживают при комнатной температуре 30-60 мин, добавляют в каждую пробирку по 0,25 мл клеточной суспензии и закрывают их резиновыми пробками. Пробирки инкубируют в термостате при 370 С 6-8 дней, результаты реакции учитывают по изменению цвета индикатора (красный цвет индикатора соответствует щелочному характеру рН - 7,4 указывая на репродукцию вируса и подавление метаболизма клеток; желтый цвет свидетельствует о кислом рН ниже 7,2 в результате нейтрализации вируса антителами и активном метаболизме клеток с выработкой кислых продуктов обмена). Реакция торможения гемаггяютинации (РТГА) является одним из вариантов РН и основана на нейтрализации гемагглютинирующих свойств вирусов специфическими антителами, что проявляется отсутствием агглютинации чувствительных эритроцитов с формированием на дне пробирки или лунки полистиролового планшета компактного осадка вместо «зонтика». РТГА используется как для определения антител в качестве метода серологической диагностики, так и для идентификации вирусов, обладающих гемагглютининами. Феномен РТГА проявляется в образовании компактного осадка эритроцитов вместо «зонтика» гемагглютинации. Перед постановкой РТГА сыворотки обрабатывают периодатом калия, каолином, бентонитом, ацетоном или другими веществами для удаления неспецифических ингибиторов гемагглютинации. После этого к дву99 кратным разведениям сыворотки добавляют равное количество вируссодержащей жидкости с активностью 4 ГЕ, смесь инкубируют 30-60 мин при оптимальной для данного вируса температуре (40, 200, 370 С), а затем добавляют равный объем 0,5-1,0% взвеси эритроцитов. Смесь снова инкубируют 30-45 мин и производят учет результатов реакции. Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, которое вызывает торможение гемагглютинации. Реакция торможения гемадсорбции (РТГадс) основана на нейтрализации эффекта адсорбции эритроцитов на поверхности клеток, инфицированных вирусами, способными вызывать гемадсорбцию. Для постановки реакции по 0,2 мл специфической сыворотки, разведенной 1:5, вносят в пробирки, инкубируют 30-60 мин в термостате при оптимальной для данного вируса температуре, затем добавляют по 0,2 мл 0,5% взвеси эритроцитов. Контрольные пробы содержат неиммунную сыворотку и эритроциты. Пробирки снова инкубируют 20-30 мин, после чего производят учет реакции. Идентификация вируса основывается на признаке отсутствия адсорбции эритроцитов на клетках в присутствии иммунной сыворотки при наличии гемадсорбции в контрольных пробирках. Для антигенной идентификации вирусов в клетках культур тканей используются также РПГ, РСК, РИФ, РОПГА ИФА, РИА со специфическими иммунными противовирусными сыворотками или моноклональными AT. выявление вирусной НК методами генодиагностики с помощью метода молекулярной гибридизации и ПЦР; электронно-микроскопическое изучение вирусов (см. выше). Серологический метод диагностики вирусных инфекций Основан на определении в крови больного противовирусных антител в серологических реакциях с использованием специфических вирусных антигенов - диагностикумов или специальных тест-систем. Серологические реакции при вирусных инфекциях ставят в жидкой среде (РСК, РТГА, РНГА, РОНГА, РТОНГА, РИА), в геле (РПГ, РРГ, РВИЭФ) или на твердофазном носителе (например, на стенках лунки полистиролового планшета с фиксацией на них одного из компонентов иммунной реакции – антигена или антитела). Известны такие твердофазные методы как ИФА, ИЭМ, РГадсТО, РИФ, РГадс, РТГадс. Нередко, вследствие наличия в крови большинства здоровых людей естественных противовирусных антител, серологическая диагностика вирусных инфекций основывается на исследовании парных сывороток, взятых в начале и в разгаре болезни или в периоде реконвалесценции с целью определения нарастания титра антител. Диагностически значимым считается нарастание титра антител в четыре раза и более. Повышение чувствительности серологических методов достигается адсорбцией антигенов или антител на эритроцитах (РНГА, РОНГА, РТОНГА, РГадсТО, РРГ), меткой ферментами (ИФА), радиоактивными изотопами (РИА, РПГ) или флюорохромами (РИФ), Используется также принцип лизиса эритроцитов (как индикаторной системы) при взаимодействии антигенов и антител в присутствии комплемента (РСК, РРГ). Реакция связывания комплемента (РСК) в виде варианта связывания комплемента на холоде (в течение ночи при температуре +40 С) часто применяется в вирусологии для ретроспективной диагностики ряда вирусных инфекций и для определения вирус-специфических антигенов в материалах от больных. Реакция радиального гемолиза (РРГ) в агарозном геле основана на явлении гемолиза эритроцитов, сенсибилизированных антигеном, под влиянием вирусспецифических антител в присутствии комплемента и применяется для серологической диагностики гриппа, ОРВИ, краснухи, паротита, тогавирусных инфекций. Для постановки реакции к бараньим эритроцитам (0,3 мл 10%-й суспензии) добавляют 0,1 мл неразведенного вирусного антигена и смесь выдерживают 10 мин при комнатной температуре. К 1,2% агарозе при температуре 42 0 С добавляют 0,3 мл сенсибилизированных эритроцитов и 0,1 мл комплемента, смесь разливают на предметные стекла или в лунки полистироловых планшетов, в застывшем геле агарозы с помощью пробойника вырезают отверстия и заполняют их исследуемыми и контрольной сыворотками. Стекла или панели закрывают крышкой и помещают 100 их во влажной камере на 16-18 часов в термостат. Учет реакции осуществляют по диаметру зоны гемолиза вокруг отверстий, заполненных сывороткой. В контроле гемолиз отсутствует. Самостоятельная работа студентов 1. Выделение вирусов на культуре ткани. Изучение особенностей цитопатического действия(ЦЦД) вирусов при различных вирусных инфекциях: синцитиальный тип (вирус кори, парагриппа) - образование гигантских многоядерных клеток и синцития в клетках культуры ткани с формированием цитоплазматических включений (демонстрация); аденовирусный тип - образование внутриядерных включений, агрегация клеток (демонстрация); деструктивный тип (пикорнавирусы) - дегенерация клеток с отторжением их от поверхности стекла (демонстрация); герпетический тип - образование гигантских клеток с внутриядерными включениями (вирусы герпеса, цитомегаловирусы – демонстрация)). 2. Индикация вирусов в клетках культуры ткани: гемадсорбция - адсорбция на клетках эритроцитов, добавленных к культуре ткани, инфицированной вирусом парагриппа (демонстрация); подавление метаболизма клеток вирусом полиомиелита (цветная проба – демонстрация). Клетки культуры ткани в процессе их культивирования вырабатывают кислые продукты метаболизма, при этом цвет среды, в которую добавлен индикатор метиловый красный, изменяется с красного на желтый. Клетки, инфицированные вирусом, разрушаются и цвет среды не меняется, оставаясь красным; интерференция вирусов - отсутствие репродукции вируса в культуре ткани, инфицированной другим вирусом, не обладающим цитопатическим эффектом (демонстрация). 3. Выделение и индикация вирусов на РКЭ. обнаружение вирусов на хорион-аллантоисной оболочке РКЭ, зараженного вирусом герпеса (микроскопия мазков-отпечатков, окрашенных по Романовскому-Гимза – демонстрация)); выявление вируса гриппа в аллантоисной жидкости зараженного РКЭ с помощью реакции гемагглютинации (РГА) с эритроцитами кур. Куриные эмбрионы вскрывают, аллантоисную жидкость отсасывают пастеровской пипеткой, титруя ее в лунках пластикового планшета в разведениях от 1:10 до 1:512 в объеме 0,5 мл. В каждую лунку добавляют 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов кур, выдерживают при комнатной температуре в течение 40 минут, после чего производят учет. Контролями служат незараженная аллантоисная жидкость и физиологический раствор. Наличие гемагглютинации в опыте при отсутствии ее в контролях указывает на наличие вируса в исследуемой жидкости. 4. Идентификация вирусов: выявление типа вируса гриппа в хорион-аллантоисной жидкости РКЭ с помощью РТГА. (нейтрализация гемагглютинирующей активности различных типов вируса гриппа А, В, С соответствующими противогриппозными диагностическими сыворотками). Отсутствие гемагглютинации с одной из противогриппозных сывороток указывает на тип вируса гриппа; выявление вирусов с помощью реакции преципитации в геле (демонстрация). В одну из лунок в агаровом геле вносят исследуемый материал от больного, а в другую – диагностическую сыворотку, содержащую соответствующие антитела. В месте встречи вируса и антитела формируется преципитат в виде белых линий; реакция нейтрализации (демонстрация). Производят заражение РКЭ, культур клеток или экспериментальных животных (в зависимости от свойств вируса) смесью вируссодержащего материала (материал от больного, хорион-аллантоисная жидкость РКЭ, надосадочная жидкость зараженной культуры ткани) и соответствующих диагностических противовирусных сывороток. В качестве контроля используется биологический объект (РКЭ, культура ткани, экспериментальное животное), зараженный только вируссодержащим материалом. Контрольное 101 животное, в организме которого вирус не нейтрализуется антителами сыворотки, погибает. Опытное животное выживает, так как антитела сыворотки нейтрализуют вирус. 5. Серологический метод диагностики вирусных инфекций (выявление антител в сыворотке крови больных - ретроспективная диагностика) РСК при аденовирусной инфекции. Ставится с целью определения антител и их титра в сыворотке крови больных на 2 и 8 день болезни. Цветная проба при полиомиелите (демонстрация). Сущность реакции состоит в изменении цвета среды, на которой культивируется культура ткани, в результате выделения кислых продуктов метаболизма, что приводит к изменению исходного красного цвета индикатора среды (феноловый красный) на желтый. У зараженных вирусом клеток выделения метаболитов не происходит, поэтому изменения цвета среды не происходит. Схема опыта: к разным разведениям исследуемой сыворотки добавлено 0,1 мл вакцинного штамма вируса полиомиелита, смесь внесена в пробирки с культурой ткани. После 8-10-дневной инкубации в термостате проводят учет реакции по наибольшему разведению сыворотки, при котором наблюдается изменение цвета среды с красного на желтый. РНГА (демонстрация) - определение антител к вирусу гепатита В. PТГA (демонстрация) - определение антител в сыворотке крови больного клещевым энцефалитом. Реакция основана на способности некоторых вирусов склеивать эритроциты птиц, морских свинок, I (0) группы крови человека. К известному гемагглютинирующему вирусу добавляют исследуемую сыворотку крови. Если в исследуемой крови содержатся антитела, они нейтрализуют гемагглютинирующую активность вируса и агглютинации вирусов не наступает. Схема опыта: к разным разведениям сыворотки крови больного добавляют антиген вируса клещевого энцефалита и взвесь эритроцитов. После экспозиции в течение 40 мин проводят учет реакции по наибольшему разведению сыворотки крови больного, вызвавшему торможение агглютинации эритроцитов. ИФА (демонстрация) – определение антител к ВИЧ. После изучения темы студент должен знать: теоретические основы общей вирусологии (репродукция, генетика вирусов, особенности вирусных инфекций и противовирусного иммунитета), методы культивирования, индикации и идентификации вирусов, серологический метод диагностики вирусных инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: выполнять основные методы индикации и идентификации вирусов, трактовать результаты серологических исследований при вирусных инфекциях. Тема 14. ВИРУСЫ - ВОЗБУДИТЕЛИ ГРИППА И ОРВИ. ПАРАМИКСОВИРУСЫ ВОЗБУДИТЕЛИ КОРИ И ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ПАРОТИТА. ВИРУСЫ, ПОРАЖАЮЩИЕ КОЖУ И СЛИЗИСТЫЕ ОБОЛОЧКИ (ПОКСВИРУСЫ, ГЕРПЕСВИРУСЫ). КОРОНАВИРУСЫ Цель занятия: разбор биологических свойств возбудителей гриппа, ОРВИ, кори и эпидемического паротита, покс- и герпесвирусов, освоение методов лабораторной диагностики, профилактики и лечения указанных инфекций. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Характеристика и классификация вирусов – возбудителей острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ). 2. Аденовирусы (семейство Adenoviridae). Общая характеристика и классификация. Структура вириона, антигены, методы культивирования. Резистентность к действию физических и химических факторов. Патогенез заболеваний. Персистенция аденовирусов. Онкогенные серотипы аденовирусов. Лабораторная диагностика. 3. Ортомиксовирусы (семейство Orthomyxoviridae). Общая характеристика и классификация. Вирусы гриппа человека, их классификация и биологические свойства (структура, химический состав вириона, особенности генома, характеристика антигенов, виды и механизмы антигенной изменчивости,, методы культивирования, чувствительность к физическим и химическим факторам; гемагглютинин, нейраминидаза, их локализация, строение, классификация, функци102 ональная активность). Роль персистенции вирусов гриппа в организме человека и животных в сохранении эпидемиологически значимых штаммов. Особенности иммунитета, лабораторная диагностика, специфическая профилактика и лечение гриппа. Вирус парагриппа. 4. Вирус эпидемического паротита, его роль в патологии человека, особенности иммунитета; методы специфической профилактики эпидемического паротита. 5. Вирус кори и его биологические свойства. Патогенез заболевания. Иммунитет и специфическая профилактика кори. Респираторно-синцитиальный вирус. Биологические свойства, классификация. Патогенез заболевания. Иммунитет. Специфическая профилактика. 6. Герпесвирусы (семейство Herpesviridae). Общая характеристика и классификация, структура вириона, антигены, методы культивирования. Резистентность к физическим и химическим факторам. Вирусы герпеса, патогенные для человека, их биологические свойства. Механизмы персистенции герпесвирусов. Лабораторная диагностика, специфическая профилактика и лечение герпетических инфекций. Вопросы для самостоятельного изучения 1. Поксвирусы (семейство Poxviridae). Общая характеристика и классификация. Вирус натуральной оспы, его структура, антигены, методы культивирования. Чувствительность к действию химических и физических факторов. Патогенетические особенности заболевания. Лабораторная диагностика. Внутриклеточные включения (тельца Гварниери). Специфическая профилактика оспы и ее роль в глобальной ликвидации инфекции. Вирус осповакцины, его происхождение и использование в генной инженерии. 2. Коронавирусы (семейство Coronaviridae). Общая характеристика. Роль в патологии человека. Лабораторная диагностика. Вирусологическая диагностика острых респираторных вирусных инфекций и гриппа Грипп – это острое инфекционное заболевание, протекающее с выраженной общей интоксикацией и поражением респираторного тракта, возбудителями которого являются РНКсодержащие вирусы семейства Ortho-myxoviridae (род Influenzavirus, типы А, В и С). Возбудителями ОРВИ являются разнообразные многочисленные вирусы (более 200), вызывающие у людей катар верхних дыхательных путей с различной степенью интоксикации. Наиболее часто ОРВИ вызывают вирусы парагриппа, аденовирусы, реовирусы, коронавирусы, риновирусы, энтеровирусы,. Лабораторная диагностика гриппа и ОРВИ состоит из экспресс-методов, выделения вируса, серологического исследования и метода генодиагностики (ПЦР) - схема 19. Материалами для исследования при гриппе служат смывы из носоглотки, отделяемое слизистой оболочки носа, кровь, спинномозговая жидкость, трупный материал. При ОРВИ, вызванных вирусами парагриппа, РС вирусом, корона-, рео- и аденовирусами, исследуемым материалом являются носоглоточные смывы и отделяемое слизистой оболочки задней стенки глотки, взятое ватным тампоном. Адено-, энтеро- и реовирусы удается обнаружить в крови, моче, фекалиях, трупном материале, а энтеровирусы в спинномозговой жидкости. Схема 19. Вирусологическая диагностика гриппа и ОРВИ Материал для исследования: смывы из носоглотки, отделяемое слизистой оболочки носа, кровь, спинномозговая жидкость, трупный материал Вирусологический метод: заражение РКЭ, культур клеток. Индикация вирусов: РГА, ЦПД, РИФ, Р.гемадсорбции. Идентификация: РТГА, РСК, РН, ИФА, РТГадс Серологический метод: определение антител в парных сыворотках крови больных гриппом с помощью РСК, РТГА, ИФА, РРГ, РН. Генодиагностика: ПЦР. Экспресс-диагностикаРИФ, направлена выявление в исследуемом вирусов Экспресс-диагностика: РНОГА,наИФА – выявление вирусныхматериале антигеновантигенов в исследуемом материале 103 Экспресс-диагностика гриппа и ОРВИ основана на выявлении антигенов вирусов с помощью прямой и непрямой РИФ. Положительная реакция характеризуется наличием в клетках эпителия скоплений антигена вируса с ярким зеленым свечением. Реже применяются РОНГА и ИФА. Выделение вируса при гриппе проводится на РКЭ или на культуре клеток (почек обезьян, фибробластов эмбриона человека или кур; в последние годы используется культура клеток легких собаки - MDSK, обладающая высокой чувствительностью к вирусу гриппа). Поскольку с 4 дня болезни содержание вируса гриппа в организме резко снижается, вирусологическое исследование необходимо выполнять в первые дни инфекции. Исследуемый материал, обработанный антибиотиками, вводят по 0,2 мл 10—11-дневным куриным эмбрионам в полость амниона и аллантоиса. После инкубации эмбрионов в течение 3-4 дней при температуре 370 С, их вскрывают и аллантоисную жидкость отсасывают шприцем или пастеровской пипеткой, амниотическую — шприцем с короткой иглой. Индикацию вируса гриппа в указанных жидкостях проводят с помощью РГА с 1% взвесью куриных эритроцитов. Индикацию вируса в культуре клеток осуществляют по ЦПД, а также с помощью РИФ и РГадс с эритроцитами морской свинки. При ОРВИ выделение вирусов обычно проводится на первично-трипсинизированных и перевиваемых культурах ткани различного происхождения. Наличие вируса в клетках культуры ткани определяют по его цитопатическому действию, которое у вируса парагриппа и РС вируса проявляется образованием синцития, а у аденовирусов и реовирусов - появлением зернистости и включений в цитоплазме. Идентификацию вирусов гриппа и ОРВИ выполняют с помощью РТГА, РСК, РН, ИФА, РТГадс. Серологический метод заключается в определении антител в парных сыворотках крови больных гриппом с помощью РСК, РТГА, ИФА, РРГ, РН. Нарастание титра антител в 4 и более раз подтверждает диагноз гриппа. Генодиагностика. Для диагностики гриппа разработана ПЦР. Самостоятельная работа студентов Вирусологическая диагностика гриппа 1. Экспресс-диагностика - выявление антигена вируса гриппа в мазках-отпечатках со слизистой оболочки полости носа больного с подозрением на грипп (прямая РИФ, демонстрация). 2. Вирусологический метод : индикация вируса гриппа на культуре клеток с помощью реакции гемадсорбции (демонстрация); индикация вируса в аллантоисной жидкости РКЭ с помощью реакции гемагглютинации (самостоятельная работа); идентификация вируса с помощью РТГА, поставленной с аллантоисной жидкостью и гриппозными диагностическими сыворотками ( H1N1, H2N2, H3N2 - демонстрация). 3. Серологический метод. учет РТГА с парными сыворотками крови больного, определить нарастание титра антител . (демонстрация); учет РП в геле - с целью определения антител к М-полипептиду вируса гриппа (демонстрация); учет реакции радиального гемолиза с сывороткой крови больного гриппом (демонстрация). 4. Экспресс-диагностика аденовирусной инфекции (выявление специфического антигена аденовирусов в клетках эпителия слизистой оболочки носоглотки с помощью прямой РИФ демонстрация). Вирусологическая диагностика ОРВИ 1. Вирусологический метод: 104 изучение цитопатического действия аденовирусов на культуру диплоидных клеток фибробластов эмбриона человека (демонстрация). идентификация аденовируса в реакции нейтрализации на культуре ткани (демонстрация). Индикация и идентификация вируса парагриппа по ЦПД при культивировании его на на культуре диплоидных клеток. 2. Экспресс-диагностика - электронная микроскопия, РИФ, ИФА для обнаружения вируса с характерной морфологией или его антигенов в исследуемом материале. 3. Серологический метод: выявление антител в парных сыворотках крови больного аденовирусной инфекцией на 5 день и на 15 день заболевания с помощи РСК (демонстрация). Ретроспективная серодиагностика парагриппозной инфекции: РТГА с парными сыворотками больного парагриппом (демонстрация). 4. Изучить биопрепараты для диагностики, профилактики и лечения респираторных вирусных инфекций: противогриппозные вакцины (табл. 21) – цельновирионные (живые, убитые), сплит (расщепленные – из разрушенных вирусов), субъединичные (обычно из поверхностных антигенов – гемагглютинина и нейраминидазы). диагностические типоспецифические противогриппозные сыворотка для определения типа выделенного вируса с помощью РТГА и РСК. донорский противогриппозный гамма-глобулин - готовится из сыворотки многократно имунизированых доноров. Применяется с лечебной и с профилактической целью. человеческий лейкоцитарный интерферон - белок, полученный из лейкоцитов человека. Предназначен для лечения и профилактики ОРЗ. Применяется интраназально. оксолин - химиопрепарат, с выраженной противовирусной активностью в отношении вируса гриппа и ряда других вирусов. Применяется интраназально с лечебно-профилактической целью. ремантадин - химиопрепарат с противовирусной активностью в отношении вируса гриппа А. Таблица 21. Противогриппозные вакцины, рекомендованные для применения в РФ Виругиче- Вакцины Грипповак, убитая Убитая Живая для детей 2-14 лет Живая Бегривак. Сплит Ваксигрипп. Сплит Флюарикс. Сплит Гриппол. Субъединичная Агриппал. Субъединичная Инфлювак. Субъединичная Фирмы-производители НИИЭМ им. Пастера СПб, РФ Иммунопрепарат, УФА, РФ ФГУП МИБП, Иркутск, РФ ФГУП МИБП, Иркутск, РФ Кайрон Беринг ГмбХ и К, Германия Авентис Пастер, Франция ГлаксоСмитКляйн, Бельгия Иммунопрепарат, УФА, РФ Кайрон С.П., Италия Солвей Фармасьютикалз БВ, Нидерланды солоская диагностика натуральной оспы Вирус натуральной оспы (Variola virus) относится к семейству Poxviridae, роду Orthopoxvirus, который включает вирусы натуральной оспы, осповакцины, а также вирусы оспы животных (коров, буйволов, верблюдов, овец, обезьян, кроликов и мышей). Этот антропонозный вирус вызывает у человека острую инфекцию с явлениями тяжелой общей интоксикации, лихорадкой и появлением характерной папулезно-пустулезной сыпи на коже и слизистых оболочках. Натуральная оспа является особо-опасной, карантинной инфекцией. В 20 веке оспа была ликвидирована, однако существует угроза применения этого вируса как средства биологического терроризма. Человек может 105 также заразиться вирусом оспы обезьян, при этом клинические проявления сходны с таковыми при натуральной оспе, однако человек, зараженный вирусом оспы обезьян, неопасен для окружающих Материалом для исследования при натуральной оспе - соскоб с элементов сыпи - макул и папул, содержимое везикул и пустул, корочки оспенных пустул, слюна, носоглоточные смывы, трупный материал, кровь. Исследование на вирус натуральной оспы проводят в специальных лабораториях. Применяются следующие методы лабораторной диагностики. Экспресс-диагностика - прямое исследование материала от больного с помощью электронной микроскопии, РИФ, РОПГА, РПГ, ИФА. Сущность РОПГА состоит во взаимодействии антигена, находящегося в исследуемом материале, с бараньими эритроцитами, на поверхности которых фиксированы противооспенные антитела (антительный диагностикум), что приводит к агглютинации эритроцитов. Вирусологический метод заключается в заражении на ХАО 10-12-дневных РКЭ с последующей их инкубацией в течение 3-5 дней при температуре 350 С. Вирус натуральной оспы образует на ХАО мелкие белые бляшки. Для выделения вируса используют также первичнотрипсинизированные и перевиваемые культуры ткани. Индикацию и идентификацию оспенных вирусов в РКЭ обычно проводят с помощью РН, а в зараженных клеточных культурах - с помощью РИФ, РОПГА, РПГадс. Дифференциация оспенных вирусов от сходных с ними герпесвирусов основывается на обнаружении в клетках, пораженных герпесвирусами, внутриядерных включений, характерного цитопатического действия при отсутствии феномена гемадсорбции. Серологический метод - постановка РТГА, РСК, РН на куриных эмбрионах и в культурах клеток с парными сыворотками крови больных с целью констатации нарастания титра антител. Учет РН в культуре ткани проводится по ЦПД и РГадс, а на куриных эмбрионах - по образованию бляшек на ХАО и накоплению гемагглютининов, выявляемых с помощью РГА. Вирусологическая диагностика герпеса Герпес относится к распространенным рецидивирующим инфекциям с характерными пузырьковыми высыпаниями на коже и слизистых оболочках. Представители семейства Herpesviridae (табл. 22) способны также вызывать врожденные уродства, поражения различных органов и систем (нервной системы, органов дыхания, печени, слизистой оболочки полости рта и половых органов, глазного яблока), онкологические заболевания. Рецидивы герпеса возникают на фоне снижения антиинфекционной резистентности при простуде, гриппе, ОРВИ, других острых инфекционных заболеваниях и т.д.. Материалом для исследования являются содержимое элементов сыпи, корочки, слюна, спинномозговая жидкость, трупный материал (кусочки головного и спинного мозга, печени, лимфатические узлы), кровь и др. Лабораторная диагностика герпетической инфекции включает экспресс-методы, вирусологическое и серологическое исследование (схема 20). Вирусологический метод – заражение РКЭ на ХАО, культур ткани (почек кролика, фибробластов эмбриона человека или кур, HeLa и др.). При наличии цитомегаловируса в клеточных культурах через 4-7 дней появляются многоядерные гигантские клетки с признаками дегенерации и внутриядерными включениями, на ХАО РКЭ герпесвирусы вызывают появление характерных бляшек. Вирус ветряной оспы или опоясывающего лишая вызывает на 6-13 сутки очаговое ЦПД с появлением в клетках цитоплазматических и внутриядерных включений. Таблица 22. Герпесвирусы и вызываемые ими заболевания 106 Представители α-герпесвирусы Вирус простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) Вирус простого герпеса 2 типа (ВПГ-2) Вирус опоясывающего лишая Заболевания Лабиальный герпес, герпес кожи и слизистых оболочек, офтальмогерпес, генитальный герпес, герпетические менингиты и энцефалиты Генитальный и неонатальный (микроцефалия) герпес Ветряная оспа у детей, опоясывающий лишай у взрослых β-герпесвирусы Цитомегаловирус (ЦМВ) Врожденные поражения ц.н.с., ретинопатии, пневмонии, гепатиты γ-герпесвирусы Вирус Эпштейна-Барр (ЭБВ) Инфекционный мононуклеоз,назофарингеальная карцинома, лимфома Беркитта Нетипируемые герпесвирусы Вирус герпеса 6 и 7 типов (ВГ-6, ВГ-7) Вирус герпеса 8 типа (ВГ-8) В-клеточная лимфома, лимфома Ходжкина,синдром хронической усталости Саркома Капоши Схема 20. Вирусологическая диагностика герпеса Материал для исследования: содержимое элементов сыпи, корочки, слюна, спинномозговая жидкость, трупный материал (кусочки головного и спинного мозга, печени, лимфатические узлы), кровь и др. Экспресс-диагностика - электронная микроскопия, РИФ, ИФА - обнаружение вируса герпеса или его антигенов в исследуемом материале Вирусологический метод – заражение РКЭ на ХАО, культур ткани. Индикация вируса по ЦПД, идентификация с помощью РН на мышах, куриных эмбрионах, в культуре клеток Биопроба: заражение лабораторных животных. Индикация вируса в мазках-отпечатках с помощью РИФ, выделение - на культуре ткани или на ХАО куриного эмбриона Серологический метод - выявление нарастания титров антител в парных сыворотках больных с помощью РН, РСК, ИФА, РНГА, РТГадс Генодиагностика: ПЦР Идентификацию ВПГ проводят с помощью РН на мышах, куриных эмбрионах, в культуре клеток. Серологический метод - выявление нарастания титров антител в парных сыворотках больных с помощью РН, РСК, ИФА (реже РНГА, РТГадс) с дифференциацией антител по классам иммуноглобулинов. Первичная герпетическая инфекция характеризуется появлением антител класса IgM. Биопроба. С целью выделения вируса герпеса производится заражение лабораторных животных (новорожденных грызунов, белых мышей, кроликов, морских свинок, хомяков, хлопковых крыс - обычно в мозг), которые через несколько дней погибают. Вирус от павших животных можно обнаружить в мазках-отпечатках с помощью РИФ, а также выделить на культуре ткани или на ХАО куриного эмбриона. Генодиагностика. Разработана и широко применяется ПЦР, позволяющая в течение от 4 до 48 часов определить несколько вирусов герпеса. Вирусологическая диагностика кори Вирус кори относится к роду Morbillivirus семейства Paramyxoviridae. Вызывает острую инфекцию с высокой общей интоксикацией, характерной сыпью, типичным поражением слизистых оболочек (пятна Филатова-Коплика) и конъюнктивитом. Вирус от больного можно выделить в течение очень короткого промежутка времени (последние дни инкубационного периода и 1-2 дня после появления сыпи). В современных условиях лабораторное подтверждение кори является обязательным диагностическим мероприятием, особенно в случаях атипичного или 107 осложненного течения кори, при вспышках кори в организованных коллективах и при расследовании причин смерти от кори. Экспресс-метод (прямая РИФ) направлен на выявление антигена в клетках соскоба кожи или в клетках слизистой оболочки носоглотки. Вирусологический метод – выделение вируса кори на культуре клеток (L-41, Vero, культуре лимфобластов обезьян мармазетов В-95ф, трансформированных вирусом Эпштейн-Барра), вызывающего образование гигантских многоядерных клеток и синцития с включениями в цитоплазме. При развитии осложнения при кори в виде подострого склерозирующего энцефалита (ПСПЭ), вызывамого дефектным вирусом кори, обычные методы выделения вируса на культуре клеток оказываются неэффективными. Поэтому при ПСПЭ разработан метод совместного культивирования клеток мозга больного, полученных путем прижизненной биопсии, или лимфоцитов пациента с чувстительной культурой клеток. Идентификацию вируса проводят с помощью РН, РИФ, РТГА. Серологический метод применяется наиболее часто с целью определения нарастания титра антител в парных сыворотках больных с помощью ИФА (с дифференциацией антител по классам иммуноглобулинов M –маркера текущей инфекции и G) или РТГА. Реже применяются РН, РСК, РНГА. Генодиагностика. Разработаны методы молекулярной гибридизации и ПЦР для выявления специфических фрагментов РНК вируса кори. Вирусологическая диагностика краснухи. Вирус краснухи относится к роду Rubivirus семейства Rubiviridae и вызывает у детей инфекцию с пятнисто-папулезной сыпью, катаральным воспалением верхних дыхательных путей, увеличением шейных и затылочных лимфатических узлов. В некоторых случаях возникают тяжелые осложнения (серозный менингит, энцефалит, полиневрит, тромбоцитопения). У взрослых краснуха протекает более тяжело; вирус обладает тератогенным действием и у беременных женщин (особенно в первом триместре) вызывает врожденную краснуху с развитием пороков сердца, органов зрения (катаракта, глаукома и т.д.), органов слуха (глухонемота и т.д.). Лабораторная диагностика проводится только при осложнениях краснухи, при подозрении на инфекцию у беременных женщин и при расследовании причин гибели плода или новорожденного ребенка. Исследованию подвергают слизь из носоглотки, кровь, мочу, кал, органы трупа (селезенка, лимфатических узлы, костный мозг, головной мозг). Применяются следующие методы. Вирусологический метод - заражение культур клеток (Vero, PK-13 и др.) с последующей идентификацией вируса с помощью РТГА или реакции интерференции (сначала культуру клеток заражают вирусом краснухи, не вызывающим цитопатогенного действия, а затем цитопатогенным вирусом везикулярного стоматита (ВВС); при наличии искомого вируса краснухи возникает интерференция обоих вирусов и цитопатическое действие ВВС не проявляется). Серологический метод – обнаружение антител класса IgM к вирусу краснухи (показатель свежего инфицирования) в парных сыворотках больных с помощью метода ИФА; применяется также РТГА. Генодиагностика. Разработана ПЦР для выявления специфических фрагментов РНК вируса краснухи, оправданный для применения при диагностике краснухи у женщин. Вирусологическая диагностика эпидемического паротита. Возбудитель эпидемического паротита относится к роду Paramyxoviruses семейства Paramyxoviridae и вызывает преимущественно у детей в возрасте 5-15 лет поражение околоушных слюнных желез, иногда орхит, тиреоидит, панкреатит. Диагностика эпидемического паротита основывается на данных характерной клинической картины, поэтому лабораторная диагностика проводится при наличии осложнений и в сложных диагностических ситуациях для дифференциации эпидемического паротита с другими заболеваниями слюнных желез и других железистых органов. Материалом для исследования являются слюна, спинно-мозговая жидкость или моча. Применяются вирусологический и серологический методы исследования. 108 Вирусологический метод - заражение куриных эмбрионов или культур клеток (почек эмбриона человека, He-La и др.) с последующей идентификацией вируса на основании характерного ЦПД (образование гигантских многоядерных клеток и синцития с включениями в цитоплазме), а также с помощью РТГА, РИФ, РСК. Серологический метод применяется с целью определения нарастания титра антител в парных сыворотках больных с помощью ИФА (с дифференциацией антител по классам иммуноглобулинов M и G), РСК, РТГА; реже применяется РН. Генодиагностика. Разработана ПЦР для выявления специфических фрагментов РНК вируса эпидемического паротита. Самостоятельная работа студентов 1. Индикация и идентификация вируса кори по характеру ЦПД при культивировании вируса на культуре опухолевых клеток. 2. Серологическая диагностика кори. Выявление антител в сыворотке крови больного с помощью РНГА. 3. Изучить биопрепараты для диагностики, профилактики и лечения кори, краснухи, эпидемического паротита: вакцина коревая культуральная живая сухая отечественная; живая коревая культуральная сухая вакцина фирмы Пастер Мерье Коннот (Франция); MMR – живая тривакцина против кори, эпидемического паротита, краснухи фирмы Мерк Шарп Доум (США); Рудивакс – моновакцина против краснухи фирмы Пастер Мерье Коннот (Франция); SII - – моновакцина против краснухи института сывороток Индии Отечественная паротитная культуральная живая сухая вакцина Педиатрические аспекты темы. 1. Вирус гриппа вызывает у детей, особенно первого года жизни, тяжелую инфекцию со склонностью к осложнению в виде пневмонии. 2. Вследствие слабого иммунного ответа у детей с выраженной клинической картиной гриппа диагностическое значение имеет нарастание титра антител в 2 раза. После изучения темы студент должен знать: характеристику возбудителей гриппа, ОРВИ, герпеса, натуральной оспы, кори, эпидемического паротита, а также принципы лабораторной диагностики, профилактики и лечения упомянутых инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: трактовать результаты лабораторных исследований при гриппе, ОРВИ, герпесе, натуральной оспе, кори, эпидемическом паротите. Тема 15. ПИКОРНАВИРУСЫ. ВИРУСЫ ГЕПАТИТОВ. РОТАВИРУСЫ Цель занятия: разбор биологических свойств пикорнавирусов, вирусов гепатитов, ротавирусов, освоение методов лабораторной диагностики, профилактики и лечения указанных инфекций. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Пикорнавирусы (семейство Picornaviridae). Общая характеристика и классификация. Род Enterovirus. Классификация: вирусы полиомиелита, Коксаки, ЕСНО, энтеровирусы 68-71. Характеристика вирионов. Антигены. Культивирование. Патогенность для животных. Резистентность к действию физических и химических факторов. Механизм и пути передачи. Роль энтеровирусов в патологии человека. Патогенез полиомиелита и других энтеровирусных инфекций. Иммунитет. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика и терапия. 2. Род Hepatovirus. Вирус гепатита А – возбудитель инфекционного гепатита. Биологические свойства, классификация. Патогенез заболевания. Подходы к специфической профилактике. 3. Гепаднавирусы (семейство Hepadnaviridae) – HBV. HBV – возбудитель гепатита В. История открытия. Структура вириона. Антигены: HBs, HBc, HBe, HBх, их характеристика. Резистентность к физическим и химическим факторам. Культивирование, механизм и пути передачи возбудителя. Особенности патогенеза заболевания. Персистенция. Иммунитет. Лабораторная 109 диагностика. Проблемы вакцинопрофилактики, лечения и неспецифической профилактики гепатита В. 4. Вирусы гепатитов C, D, G. Общая характеристика, структура вирионов, роль в патологии человека. Механизм передачи. Лабораторная диагностика. Лечение (этиотропное, иммуномодулирующее). Неспецифическая профилактика. 5. Ротавирусы. Классификация, общая характеристика. Морфология. Роль в патологии человека. Лабораторная диагностика. Вопросы для самостоятельного изучения 1. Калицивирусы (семейство Caliciviridae). Общая характеристика. Вирус гепатита Е. 2. Род Rhinovirus. Общая характеристика. Антигены и классификация. Патогенез риновирусной инфекции. Лабораторная диагностика, специфическая профилактика и лечение. 3. Род Aphtovirus. Вирусы ящура. Биологические свойства. 4. Реовирусы (семейство Reoviridae). Общая характеристика. Классификация. Роль в патологии человека. Вирусологическая диагностика пикорнавирусных инфекций Энтеровирусные инфекции К энтеровирусам человека (род Enterovirus, семейство Picornaviridae) относятся вирусы полиомиелита (3 серотипа), Коксаки А (23 серотипа), Коксаки В (6 серотипов), ECHO (31 серотип) и энтеровирусы человека 68-—71-го серотипов. Род Hepatovirus семейства Picornaviridae представлен вирусом гепатита А. Энтеровирусы вызывают у человека разнообразные поражения, в том числе центральной нервной системы (энцефалит, менингоэнцефалит, полиомиелит, менингит), желудочнокишечного тракта (диарея, гепатит, панкреатит), дыхательных путей (ринит, фарингит, пневмония новорожденных и др.), сердечно-сосудистой системы (миокардит, перикардит). В ряде случаев развиваются герпетическая ангина, экзантема, везикулярный стоматит. Материалом для исследования при энтеровирусных инфекциях являются фекалии, носоглоточные смывы, кровь, спинно-мозговая жидкость, моча, органы трупа. Применяются следующие методы лабораторной диагностики (схема 21). Схема 21. Вирусологическая диагностика энтеровирусных инфекций Материал для исследования: фекалии, носоглоточные смывы, кровь, спинно-мозговая жидкость, моча, органы трупа. Вирусологический метод: заражение культур клеток, мышей-сосунков. Индикация энтеровирусов по ЦПД и бляшкообразованию под слоем агара или бентонита в культуре клеток, характеру развитию параличей у мышей-сосунков. Идентификация энтеровирусов с помощью РН (в культуре клеток или на мышах-сосунках), РТГА (при наличии у вируса гемагглютинина), РСК, РПГ, РИФ с типоспецифическими сыворотками против соответствующих энтеровирусов. Серологический метод - РН на культуре ткани или на мышах-сосунках, РСК, РТГА с парными сыворотками больных. Вирусологический метод. Для выделения энтеровирусов, обладающих ЦПД (вирусы полиомиелита, ЕСНО, Коксаки В, некоторые вирусы Коксаки А), применяются культуры клеток почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека и др. Вирусы Коксаки А удается выделить только при подкожном, внутрибрюшинном или внутримозговом заражении однодневных мышей-сосунков. Вирусы Коксаки А после инкубационного периода в 2-3 дня вызывают вялые параличи конечностей в результате поражения скелетной мускулатуры с развитием общей миопатии. Вирусы Коксаки В вызывают через 6-8 дней после заражения спастические параличи за счет поражения центральной нервной системы. Характер параличей должен быть подтвержден гистологическими методами. 110 Индикацию энтеровирусов проводят по ЦПД и бляшкообразованию под слоем агара или бентонита в культуре клеток, характеру развитию параличей у мышей-сосунков. Идентификация энтеровирусов проводится с помощью РН (в культуре клеток или на мышах-сосунках), РТГА (при наличии у вируса гемагглютинина), РСК, РПГ, РИФ с типоспецифическими сыворотками против соответствующих энтеровирусов. Серологический метод - постановка РН (на культуре ткани – обычно вариант «цветной» пробы или на мышах-сосунках), РСК (как правило, для диагностики полиомиелита; диагностический титр 1:32), реже РТГА с целью констатации нарастания титра антител к энтеровирусам в парных сыворотках больных. Лабораторная диагностика ящура (вирус относится к роду Aphtovirus, семейству Picornaviridae), проявляющегося везикулезной сыпью на коже и слизистых оболочках в результате контакта с больными ящуром сельскохозяйственными животными, осуществляется с помощью экспресс-метода (РИФ для обнаружения специфического антигена вируса в содержимом везикул) и культурального метода. Вирус ящура выделяют в культуре клеток крупного рогатого скота, коз, хомяков, идентифицируя с помощью РН, РСК, РИФ. Для выделения вируса проводят также биопробу (заражение морских свинок внутрикожно или мышей-сосунков в мозг). Серологический метод диагностики ящура заключается в исследовании парных сывороток с целью определения наличия и нарастания титра специфических антител с помощью РН и РСК. Самостоятельная работа студентов Лабораторная диагностика полиомиелита 1. Вирусологический метод. Изучение ЦПД вируса полиомиелита. Фильтратом испражнений больного полиомиелитом, обработанных антибиотиками, заражена культура клеток ФЭЧ (фибробласты эмбриона человека). ЦПД вируса полиомиелита при микроскопии культуры ткани под малым увеличением проявляется мелкозернистой деструкцией клеток с образованием в них гранул, оттесняющих ядро к периферии. Микрокартину описать, зарисовать. 2. Серологический метод (ретроспективная диагностика). Выявление антител в парных сыворотках крови больного полиомиелитом с помощью цветной пробы. В пробирках, где не происходит репродукции вируса в результате нейтрализации его антителами, среда окрашивается в желтый цвет из-за образования клетками культуры ткани кислых продуктов метаболизма. Диагностическое значение имеет 4-кратное нарастание титра антител. 3. Дифференциация вирусов Коксаки А и В - биологический метод. Фильтрат испражнений больного, обработанный антибиотиками, вводят внутрибрюшинно 1-4 дневным мышам-сосункам. Мыши заболевают на 3 -7 день. Вирусы Коксаки А вызывают вялые параличи, Коксаки В – спастические. 4. Изучить биопрепараты для профилактики, диагностики и лечения: диагностические типоспецифические сыворотки для типирования вирусов полиомиелита, Коксаки и ECHO; отечественная живая вакцина против полиомиелита, содержащая вакцинные вирусы трех типов. В России зарегистрированы также 3 вакцины для профилактики полиомиелита фирмы Пастер Мерье Коннот (Франция): Полио Сэбин-ВЕРО – живая вакцина, Имовакс полио - инактивированная вакцина, Тетракокк – комбинированная вакцина для профилактики дифтерии, коклюша, столбняка и полиомиелита. иммуноглобулин нормальный человеческий. Лабораторная диагностика вирусных гепатитов В настоящее время известно 8 гепатотропных вирусов (A - HAV, B - HBV, C - HCV, D HDV, E - HEV, F - HFV, G – HGV, а также TTV - transfusion transmitted virus, передающийся при трансфузиях). Поражения печени могут вызывать и другие вирусы (например, цитомегаловирус, герпесвирусы и т.д.). В связи с трудностью культивирования вирусов гепатитов ведущая роль в лабораторной диагностике вирусных гепатитов отводится серологическим методам, а в последнее время - методам генодиагностики (ПЦР). Гепатит А 111 Вирус гепатита A (HAV) относится к семейству пикорнавирусов, роду Hepatovirus. Материалом для исследования являются фекалии больного. Вирус гепатита А интенсивно выделяется с фекалиями больных в течение нескольких дней в конце инкубационного периода до появления клинических проявлений инфекции, после чего его концентрация резко снижается. Экспресс-диагностика заключается в постановке ИЭМ, РИА, ИФА с целью выявления вируса или его антигенов в экстракте фекалий. Вирусологический метод состоит в заражении фильтратом фекалий чувствительных животных (шимпанзе и обезьян-мармозеток), а также культуры лимфоцитов человека. Индикацию и идентификацию вируса проводят с помощью РИФ или электронной микроскопии. Серологический метод – выявление антител класса IgM к вирусу гепатита А, появляющихся в ранние сроки инфекции и указывающих на свежее инфицирование, а также антител класса IgG (обычно с помощью ИФА или РСК, редко - ИЭМ, РИА). Генодиагностика. Для диагностики гепатита А разработана ПЦР, однако она широко не применяется, так как метод ИФА позволяет в уже ранние сроки инфекции обнаружить антитела класса IgM к данному вирусу. Гепатит В Вирус гепатита В (HBV) относится к роду Orthohepadnavirus семейства Hepadnaviridae, содержит поверхностный антиген HBsAg и два внутренних - HBcAg (cor -сердце) и HBeAg, (ДНКполимераза), к которым у больного образуются соответствующие антитела. Экспресс-диагностика гепатита В включает определение HbsAg, с помощью ИФА, РИА, РОНГА, РПГ, встречного иммуноэлектрофореза, РИМ, РОНГА. Антиген появляется в сыворотке крови больного в инкубационном периоде за несколько недель (до 8) до повышения активности аминотрансфераз. Серологическое исследование - выявление в сыворотках крови больных и носителей антител к антигенам HBV с помощью ИФА, РНГА РПГ, реже - РИА, РВИЭФ. Определение антигенов HBV и антител к ним имеет важное диагностическое и прогностическое значение. В инкубационном периоде в течение 2-5 месяцев выявляется HBsAg, а при хроническом течении более длительный промежуток времени. Острый период инфекции характеризуется появлением HBcAg и HbeAg (обнаруживается в крови в течение 1-7 недель; его появление на 1-3 неделе болезни является неблагоприятным прогностическим признаком). В стадию ранней реконвалесценции из крови исчезают HBcAg и HbeAg, но появляются и затем нарастают антитела к НВс и НВе антигенам. Стадия поздней реконвалесценции характеризуется наличием антител ко всем трем антигенам HBV. При хроническом агрессивном гепатите В в крови обнаруживаются HBsAg и HbeAg. Для этой формы гепатита характерно высокое содержание антител к НВс антигену класса IgM, что указывает на активную репродукцию вируса. У носителей вируса гепатита В в крови выявляются HbsAg, антитела к HbcAg и НВеAg класса IgM, редко – антитела к HbcAg и к HbsAg класса IgG. В крови больных гепатитом В могут быть обнаружены также дельта-частицы (или дельтаантиген), представляющие собой вирусы гепатита D, часто ассоциированные с вирусом гепатита В. Генодиагностика. Разработано несколько методов генодиагностики (методы гибридизации, лигазная цепная реакция, ПЦР и др.). Наибольшее распространение получила ПЦР, являющаяся информативным методом при бессимптомных, хронических и смешанных формах гепатитов. ПЦР используют также для оценки уровня вирусемии и эффективности проводимого лечения. Другие гепатиты Вирус гепатита С (HCV) РНК-геномный представитель рода семейства Flaviviridae. Выделяют 6 сероваров ЯСК, каждый из которых преимущественно встречается в определенной стране (например, 1-й тип — в США, 2-й тип — в Японии). Вирус гепатита D (HDV) - дефектный сателлитный РНК-содержащий вирус, осложняющий течение гепатита В, входит в род Deltavirus семейства Togaviridae,. Самостоятельную инфекцию не вызывает. 112 Вирус гепатита Е (HEV) - РНК-геномный представитель рода Calicivirus семейства Caliciviridae, Вирус гепатита G (HGV) условно относящийся к семейству Flaviviridae. Серологический метод является в реальной практике основным методом лабораторной диагностики указанных гепатитов, т.к. культивирование этих вирусов связано с большими трудностями. Антитела к вирусам гепатитов в парных сыворотках крови больных выявляют с помощью ИФА, РИА, ИЭМ, РИФ с дифференциацией антител по классам иммуноглобулинов (в частности по IgM - маркеру свежего инфицирования). Антитела класса IgM к вирусам гепатитов D, Е и G появляются через 10-15 дней после начала клинических проявлений инфекции, к вирусам гепатита С – через 3 месяца. Антитела класса IgG IgM к вирусу гепатита D можно выявить спустя от 2 до 11 недель, а к вирусам Е и G через 30 дней после перенесенной инфекции. Подтверждающим лабораторным методом является иммуноблотинг. Генодиагностика. Важным методом диагностики HCV инфекции является ПЦР, которая позволяет выявить виремию и ее уровень по содержанию РНК вируса в крови у бессимптомных носителей вируса, а также у больных уже в инкубационном периоде (задолго до появления антител) и в период разгара инфекции, что имеет важное значение для выбора обоснованной терапии и прогнозирования инфекции. ПЦР является единственным методом, позволяющим отличить перенесенный гепатит С от имеющейся инфекции у данного пациента в данный момент. ПЦР позволяет выявить также РНК вируса гепатита D при всех вариантах этой инфекции, подтверждая результаты определения антител к этому вирусу с помощью ИФА, т.к. результаты серологических исследований могут быть сомнительными или отрицательными в случаях связывания антител антигенами вируса. Самостоятельная работа студентов 1. Лабораторная диагностика вирусных гепатитов Учет результатов ИФА, поставленного с сывороткой крови больного (диагноз: подозрение на вирусный гепатит), для определения антител классов IgM и IgG к вирусу гепатита А (демонстрация; положительная реакция характеризуется окрашиванием содержимого лунки в коричневый цвет). Учет результатов РСК, поставленной с сывороткой крови больного (диагноз: подозрение на вирусный гепатит), для определения антител к вирусу гепатита А (демонстрация; положительная реакция характеризуется задержкой гемолиза). Учет результатов ИФА, поставленного с сывороткой крови больного (диагноз: подозрение на вирусный гепатит), для обнаружения антигенов вируса гепатита В (демонстрация). Учет результатов ИФА, поставленного с сывороткой крови больного (диагноз: подозрение на вирусный гепатит), для определения антител к HBsAg вируса гепатита В (демонстрация). Учет результатов РНГА, поставленной с сывороткой крови больного (диагноз: подозрение на вирусный гепатит), для определения антител к HBsAg вируса гепатита В (демонстрация; положительная реакция характеризуется склеиванием эритроцитов и выпадением их в осадок в виде «зонтика»). Диагностический титр 1:40. Учет демонстрационной ПЦР при гепатите В. Учет демонстрационной ПЦР при гепатите С. 3. Изучить биопрепараты для профилактики, диагностики и лечения вирусных гепатитов: вакцина против гепатита В рекомбинантная дрожжевая жидкая отечественной фирмы «Комбиотех»; Хебербиовак - вакцина против гепатита В рекомбинантная дрожжевая фирмы АО Эбер Биотек, Куба; Н-В-Вакс - вакцина против гепатита В рекомбинантная дрожжевая фирмы Мерк Шарп Доум (США); Энджерикс В - вакцина против гепатита В рекомбинантная дрожжевая фирмы Смит Кляйн Бичем (Бельгия); 113 ГЕП-А-ин-ВАК – отечественная (фирма «Вектор») культуральная инактивированная концентрированная очищенная адсорбированная жидкая вакцина против гепатита А; Хаврикс 1440 – инактивированная вакцина против гепатита А фирмы Смит Кляйн Бичем (Бельгия); Аваксим - инактивированная вакцина против гепатита А фирмы Авентис Пастер; иммуноглобулин нормальный человеческий. Вирусологическая диагностика ротавирусных гастроэнтеритов. Ротавирусы (рота – колесо) человека относятся к семейству Rheoviridae, имеют морфологию, напоминающую колесо, и являются причиной около 50% гастроэнтеритов у детей. Материалом для исследования являются испражнения больного ребенка. В связи с трудностями культивирования ротавирусов, в реальной практике применяются экспресс и серологические методы лабораторной диагностики. Экспресс-методы. Для определения ротавируса в фекалиях применяются электронная микроскопия, позволяющая обнаружить вирус с характерной морфологией в виде колеса, а также ИЭМ, РИФ, РОНГА. Наиболее чувствительным и доступным методом является ИФА, в меньшей мере - РИА. Серологический метод. С целью обнаружения антител к ротавирусам и нарастания их титра в парных сыворотках крови больных применяются РТГА, РСК, ИФА, РИФ, ИЭМ. После изучения темы студент должен знать: характеристику возбудителей энтеровирусных и ротавирусных инфекций, вирусов гепатитов, а также принципы лабораторной диагностики, профилактики и лечения упомянутых инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: трактовать результаты лабораторных исследований при энтеровирусных и ротавирусных инфекциях, вирусных гепатитах. Тема 16. АРБОВИРУСЫ. НЕЙРОВИРУСЫ. ОНКОГЕННЫЕ ВИРУСЫ. МЕДЛЕННЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ. РЕТРОВИРУСЫ Цель занятия: разбор биологических свойств арбовирусов, нейровирусов, онкогенных вирусов, ретровирусов, возбудителей медленных вирусных инфекций, освоение методов лабораторной диагностики, профилактики и лечения указанных инфекций. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Тогавирусы (семейство Togaviridae). Общая характеристика, классификация. Структура вириона, антигены, методы культивирования. Чувствительность к физическим и химическим факторам. Альфа-вирусы (вирус Синдбис, западного и восточного энцефаломиелита лошадей и др.) и их характеристика (структура вирионов, антигены, резистентность к физическим и химическим факторам, методы культивирования, механизмы передачи инфекции, природная очаговость, роль в патологии человека). 2. Род рубивирусов. Вирус краснухи и его характеристика. Роль в патологии человека. Лабораторная диагностика, специфическая профилактика и лечение тогавирусных инфекций. 3. Флавивирусы (семейство Flaviviridae), их характеристика, классификация, методы культивирования. Резистентность к физическим и химическим факторам. Основные представители, вызывающие заболевания у человека (вирусы желтой лихорадки, клещевого энцефалита, лихорадки денге, японского энцефалита, омской геморрагической лихорадки). Природная очаговость, механизмы передачи инфекции. Лабораторная диагностика, специфическая профилактика и лечение. 4. Буньявирусы (семейство Bunyaviridae). Общая характеристика и классификация. Морфология вириона, антигены, культивирование. Чувствительность к действию физических и химических факторов. Буньявирусы, распространенные на территории России (вирус крымской геморрагической лихорадки, вирусы москитных лихорадок, вирус геморрагической лихорадки с почечным синдромом, хантавирусы). Роль в патологии человека. Механизмы передачи инфекции. Лабораторная диагностика, проблемы специфической профилактики. 114 5. Рабдовирусы (семейство Rhabdoviridae). Общая характеристика и классификация. Вирус бешенства, его структура и методы культивирования. Внутриклеточные включения (тельца Бабеша–Негри) при бешенстве. Резистентность к физическим и химическим факторам. Механизм передачи инфекции. Лабораторная диагностика, специфическая профилактика бешенства. 6. Ретровирусы (семейство Retroviridae). Общая характеристика, классификация. Вирус иммунодефицита человека и его свойства (морфология, химический состав, особенности генома, изменчивость и ее механизмы, типовой состав и классификация, методы культивирования). Происхождение и эволюция ВИЧ. Резистентность к действию физико-химических факторов. Особенности инфекционного процесса и иммунологических нарушений при СПИДе. СПИДассоциированные инфекции. Лабораторная диагностика, лечение, меры борьбы с инфекцией и перспективы специфической профилактики ВИЧ-инфекции. Вопросы для самостоятельного изучения 1. Аренавирусы (семейство Arenaviridae). Общая характеристика и классификация. Основные представители, вызывающие заболевания у человека (вирусы лимфоцитарного хориоменингита, Ласса, Хунин, Мачупо). 2. Онкогенные РНК-содержащие вирусы семейства Retroviridae. Морфология, классификация, особенности взаимодействия с клеткой. Эндогенные и экзогенные ретровирусы. Механизм онкогенеза, вызываемого ретровирусами. Понятие об онкогене. Роль ретровирусов в канцерогенезе человека: HTLV-I- и HTLV-II-вирусы. 3. Онкогенные ДНК-содержащие вирусы. Семейство Papovaviridae. Морфология, классификация, особенности взаимодействия с клеткой. Вирусы папилломы и полиомы человека. Механизм вирусного канцерогенеза: роль белков р53 и Rb в развитии злокачественных новообразований, вызываемых паповавирусами. HBV-вирус. Роль НВх-антигена в развитии первичного рака печени. Представители семейства Herpesviridae, Adenoviridae, Poxviridae, способные вызвать трансформацию клетки и их характеристика. 4. Современные представления о возбудителях медленных вирусных инфекций. Персистенция вирусов и ее механизмы. Методы выявления персистирующих вирусов. 5. Прионы. Возбудители Куру, болезни Крейцфельда–Якоба. Патогенез прионных болезней человека и животных. 6. Парвовирусы (семейство Parvoviridae). Общая характеристика и классификация. Структура вириона. Антигены. Культивирование. Чувствительность к физическим и химическим факторам. Вирус В19, его значение в патологии человека. Вирусологическая диагностика нейровирусных инфекций Арбовирусные инфекции Термин арбовирусы (arthropod borne viruses – вирусы, передающиеся членистоногими) не является классификационным, а отражает одинаковый для этих вирусов путь передачи инфекции, характеризующейся природной очаговостью. Арбовирусы входят в состав нескольких семейств (Togaviridae, Flaviviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae, Picornaviridae, Iridoviridae, Poxviridae, Arenaviridae) и насчитывают более 500 патогенных для животных и человека вирусов, среди которых около 100 являются патогенными для человека. К арбовирусным инфекциям относятся: системные лихорадки (флеботомная, Денге); геморрагические лихорадки (желтая, Денге, Чикунгунья, крымская геморрагическая, омская геморрагическая, киассанурская лесная болезнь); энцефалиты и энцефаломиелиты (клещевой энцефалит, американские, западный, восточный и венесуэльский лошадиный энцефаломиелит, энцефалит Сан-Луи, долины Муррея, западно-нильский, японский, африканский) и др. Лабораторная диагностика арбовирусных инфекций имеет важное практическое значение, т.к. многие из них имеют одинаковые клинические проявления, нередко заболевание протекает в атипичной или стертой форме. Кроме того, сходные с арбовирусными инфекциями могут вызывать другие вирусы, бактерии, риккетсии, спирохеты. Исследование на арбовирусы проводится в специализированных лабораториях особо опасных инфекций. 115 Материалом для исследования являются кровь, спинномозговая жидкость, носоглоточные смывы, моча, плевральная жидкость, органы трупа (мозг, печень, селезенка, легкие, почки). Лабораторная диагностика арбовирусных инфекций у человека включает экспресс-методы, вирусологический и серологический методы (схема 22). Схема 22. Вирусологическая диагностика арбовирусных инфекций Материал для исследования: кровь, спинномозговая жидкость, носоглоточные смывы, моча, плевральная жидкость, органы трупа Экспресс-диагностика – обнаружение специфических вирусных антигенов в материале от больного с помощью РИФ Вирусологический метод: заражение РКЭ, культур клеток, белых мышей. Индикация вирусов с помощью РГА, учета ЦПД, по образованию бляшек, гибели мышей и куриных эмбрионов. Идентификация выделенных вирусов с помощью РН, РТГА, РСК, РИФ, РИА. Серологический метод - исследование парных сывороток крови для выявления нарастания титра антител к арбовирусу с помощью РТГА, РСК, РН, РИФ, РНГА, РОНГА, РРГ, ИФА, РИА. Экспресс-диагностика – обнаружение специфических вирусных антигенов в материале от больного с помощью РИФ (лихорадка Денге, крымская геморрагическая, колорадская лихорадка), РНГА или РОНГА с эритроцитарным антительным диагностикумом (крымская геморрагическая лихорадка, лимфоцитарный хориоменингит), ИФА (японский энцефалит). РИФ применяют также для обнаружения вирусного антигена в слюнных железах переносчиков и в гемолимфе клещей (клещевой энцефалит). Вирусологический метод в диагностическом отношении имеет ограничения, связанные с длительностью его выполнения (до 3 недель). Вирус выделяют путем заражения новорожденных или взрослых белых мышей в мозг, внутрибрюшинно или подкожно, первично-трипсинированных или перевиваемых культур клеток (куриные фибробласты, клетки почек эмбриона свиньи, перевиваемые линии ВНК-21, СПЭВ, ПЭС, Vero, а также культуры тканей членистоногих - клещей, комаров). Реже заражают куриные эмбрионы в тело, амнион, желточный мешок, на ХАО. Заболевших в течение 2-3 недель мышей исследуют на наличие арбовирусов. Индикацию вирусов проводят с помощью РГА (с гусиными эритроцитами), учета ЦПД, по образованию бляшек, гибели мышей и куриных эмбрионов. Идентификация выделенных вирусов осуществляется обычно с помощью РН, РТГА или РСК, реже - РИФ, РИА. Серологический метод - исследование парных сывороток крови для выявления нарастания титра антител (в 4 раза и более) с помощью РТГА при наличии у арбовируса гемагглютинина, а при его отсутствии – РСК, РН, а также РИФ, РНГА, РОНГА, РРГ, ИФА, РИА. Самостоятельная работа студентов 1. Учет РТГА, поставленной с сывороткой крови больного (диагноз: подозрение на клещевой энцефалит), для определения антител к вирусу клещевого энцефалита (демонстрация; положительная реакция характеризуется торможением гемагглютинации). 2. Учет РСК, поставленной с сывороткой крови больного (диагноз: подозрение на клещевой энцефалит), для определения антител к вирусу клещевого энцефалита (демонстрация; положительная реакция характеризуется задержкой гемолиза). 3. Изучить биопрепараты для профилактики, диагностики и лечения клещевого энцефалита: отечественная инактивированная культуральная сорбированная жидкая вакцина для профилактики клещевого энцефалита; 116 отечественная инактивированная культуральная очищенная концентрированная вакцина для профилактики клещевого энцефалита; FSME immun-inject - инактивированная культуральная вакцина для профилактики клещевого энцефалита фирмы Иммуно (Австрия); Энцепур - инактивированная культуральная вакцина для профилактики клещевого энцефалита фирмы Кайрон Беринг (Германия); гетерологичный противоэнцефалитный иммуноглобулин; противоэнцефалитный иммуноглобулин, полученный из сыворотки крови иммунизированных убитой вакциной против клещевого энцефалита доноров, для профилактики и лечения; диагностикум из вируса клещевого энцефалита; типоспецифические диагностические сыворотки против вируса клещевого энцефалита. Бешенство Вирус бешенства относится к РНК-содержащим вирусам рода Lyssavirus, семейства Rhabdoviridae и поражает центральную нервную систему с образованием в клетках головного мозга в области гиппокампа телец Бабеша-Негри, представляющих собой скопления вирусного антигена или самого вируса. Материалом для исследования являются спинномозговая жидкость, мокрота, моча, слюна, взятые на ранних стадиях болезни. Экспресс-диагностика - обнаружение методом световой микроскопии телец Бабеша-Негри (наиболее распространенный метод) в мазках-отпечатках ткани гиппокампа, коры мозга и мозжечка, окрашенных по Романовскому-Гимзе, Туревичу или Муромцеву. Тельца Бабеша-Негри представляют собой цитоплазматические включения в нейронах, сферической или продолговатой формы, розовато-фиолетового цвета и размерами от 2 до10 мкм. Вирусный антиген в мазках-отпечатках головного мозга, нижнечелюстных слюнных желез, слизистой оболочки полости рта выявляют обычно с помощью прямой РИФ. Вирус бешенства, имеющий характерную морфологию в виде пули можно выявить в препаратах мозга с помощью электронной микроскопии. Вирусологический метод. Вирус бешенства можно выделить путем заражения новорожденных или взрослых белых мышей взвесью ткани головного мозга и других органов, погибших от инфекции людей, а также ликвором и слюной больных. При наличии вируса в исследуемом материале у мышей появляются мышечный тремор, расстройства координации, возбуждение или параличи. Через 5 дней животные погибают. Мозг заболевших мышей исследуют на наличие телец Бабеша-Негри или антигена вируса бешенства с помощью РИФ. Идентификацию проводят с помощью РН на мышах. Серологический метод - выявление антител в сыворотке крови больных с помощью РН на мышах, РТГА, РСК, РИФ, ИФА. При исследовании животного, нанесшего укус, определяют наличие вируса или вирусного антигена в ткани слюнной железы с помощью РИФ и биологической пробы. Самостоятельная работа студентов 1. Выявление включений - телец Бабеша-Негри в ткани мозга животного, погибшего от бешенства (демонстрация). 2. Изучить биопрепараты, используемые для специфической профилактики и лечения бешенства: Рабивак – отечественная культуральная инактивированная сухая антирабическая вакцина; отечественная культуральная инактивированная очищенная концентрированная сухая антирабическая вакцина; культуральная инактивированная антирабическая вакцина фирмы Кайрон Беринг (Германия); отечественный гетерологичный антирабический иммуноглобулин; отечественный гомологичный антирабический иммуноглобулин; 117 Имогам Рабис гомологичный антирабический иммуноглобулин с консервантом фирмы Пастер Мерье Коннот (Франция); Имогам Раж -гомологичный антирабический иммуноглобулин без консерванта фирмы Пастер Мерье Коннот (Франция); Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции Возбудителями ВИЧ (Вирус Иммунодефицита Человека)-инфекции или СПИДа (Синдром Приобретенного ИммуноДефицита – обычно так обозначается терминальная стадия ВИЧинфекции) являются РНК-геномные вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1, ВИЧ-2, английская аббревиатура — HIV), входящие в семейство Retroviridae, подсемейство Lentivirinae. Материалом для исследования с целью выделения вируса является кровь (Т-лимфоциты), биоптаты костного мозга (лейкоциты), пунктаты лимфатических узлов, сперма, спинномозговая жидкость, секционный материал, реже слюна. Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции основана, прежде всего, на выявлении антител к ВИЧ в крови больных и ВИЧ-инфицированных, в последнее время – на методах генодиагностики, реже (в основном, в исследовательских целях) проводится вирусологическое исследование с целью выделения ВИЧ. Вирусологический метод имеет серьезные ограничения, связанные с применением специальных культур лимфоцитов, требующих особых трудоемких условий культивирования. ВИЧ в культуре лимфоцитов вызывает образование симпластов с последующей гибелью лимфоцитов. Идентификацию вируса проводят с помощью РИФ, электронной микроскопии и определения активности типичного для ретровирусов фермента - РНК-зависимой-ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). Серологический метод наиболее распространен для лабораторной диагностике ВИЧ-инфекции. Чаще всего используют ИФА, реже - РИА, РИФ. Подтверждающим высокоспецифичным методом серологической диагностики ВИЧинфекции является метод иммуноблотинга. Реакция выполняется в несколько этапов. Сначала проводится электрофоретическое разделение белков ВИЧ с последующим перенесением их на нитроцеллюлозную мембрану. Затем мембрана обрабатывается исследуемой сывороткой крови, после чего на нее наносят антивидовые меченые ферментом или радиоактивным изотопом сыворотки с целью выявления антител к различным белкам ВИЧ с помощью ИФА или РИА. Результаты иммуноблотинга считают положительными при обнаружении антител к антигенам ВИЧ p24, p31, gp41, gp120. Генодиагностика. Разработана качественная ПЦР для определения ДНК провируса с целью диагностики ВИЧ-инфекции, а также количественная ПЦР для выявления РНК вируса в крови как прогностический тест подтвержденной ВИЧ-инфекции. Самостоятельная работа студентов 1. Выявление антител к ВИЧ методом ИФА (демонстрация, положительная реакция характеризуется окрашиванием содержимого лунки в коричневый цвет). 2. Определение антител к ВИЧ с помощью иммуноблоттинга (демонстрация, положительная реакция характеризуется окрашиванием зон, соответствующих антигенам ВИЧ p24, p31, gp41, gp120). Вирусологическая диагностика парвовирусных инфекций Парвовирусы (parvus — маленький) - простые по строению ДНК-геномные вирусы, входящие семейство Parvoviridae, насчитывают более 50 вирусов, из которых только один - парвовирус 5-19 вызывает заболевание у человека. Клинические проявления парвовирусной инфекции весьма разнообразны. Вирус вызывает патологию и гибель плода, воспалительную инфекцию матки, инфекционную эритему кожи (нередко с петехиальным синдромом), острые артропатии, васкулиты, тромбоцитопению, гемофагоцитарный синдром, транзиторный апластический криз, хронические инфекции у пациентов с иммунодефицитами, поражения сердца (миокардиты, аритмию сердечных сокращений, перикардиты), нервной системы (невралгические амиотрофии, нейропатии плечевого сплетения), гепатиты. В 20-50% случаев парвовирусные инфекции проте118 кают бессимптомно. Выбор материала для исследования зависит от клинических проявлений парвовирусной инфекции. Во всех случаях исследуют сыворотку крови. Серологический метод во многих случаях является единственным лабораторным методом, позволяющим подтвердить диагноз парвовирусной инфекции. Для определения антител к парвовирусу классов IgM (появляются через 14 дней после инфицирования, показатель свежего инфицирования) и IgG (показатель защитного иммунитета) в парных сыворотках крови больных используется ИФА, а также иммуноблотинг, который позволяет установить давность инфекции, в частности, сроки инфицирования беременных (антитела к антигену VP2 появляются раньше, чем антител к антигену VP1). Вирусологический метод для практических целей лабораторной диагностики малоприменим, т.к. в обычных клеточных культурах парвовируса не культивируется. Вирус репродуцируется в очень низких титрах только в культурах клеток костного мозга человека, селезенки плода, пуповинной крови и культурах клеток периферической крови, стимулированных эритропоэтином. Идентификацию парвовируса в культуре клеток осуществляют с помощью РИФ (с целью выявления специфических антигенов) или более чувствительных методов генодиагностики (выявление вирусной ДНК с помощью ПЦР или ДНК-гибридизации). С помощью ПЦР удается выявить вирусную ДНК в сыворотке крови, мононуклеарных клетках периферийной крови, биоптатах синовиальной сумки и т.д. у больных, находящихся в инкубационном периоде и острой фазе инфекции. Вирусологическая диагностика аренавирусных инфекций Семейство аренавирусов представлено одним родом, который содержит около десяти антигенно родственных вирусов. К семейству аренавирусов относятся возбудители лимфоцитарного хориоменингита (вирус ЛХМ), лихорадки Ласса, боливийской геморрагической лихорадки (вирус Мачупо), аргентинской геморрагической лихорадки (вирус Хунин). Морфологически аренавирусы полиморфны, однако основная форма круглая, диаметр вириона 110-130 нм. Геном аренавирусов состоит из 5 фрагментов и представлен одноцепочечной РНК. Внутри вирусных частиц обнаружены характерные зернистые структуры, напоминающие песчаные вкрапления (arena – песок). Снаружи вирусы покрыты плотной оболочкой с асимметрично расположенными поверхностными отростками булавовидной формы. Аренавирусы размножаются в курином эмбрионе, в организме различных грызунов наличного возраста в зависимости от вида аренавируса, а также в культуре клеток. Лимфоцитарный хориоменингит – распространен повсеместно, являясь зоонозной инфекцией. Основной хозяин вирусов – дикие грызуны (серые мыши, хомячки, полевки). Человек заражается от животных аэрозольным, алиментарным путями, а также при укусах кровососущих насекомых (клещей). Инкубационный период 6-7 дней. Заболевание протекает по типу гриппа с поражением капилляров, кровоизлияниями, сопровождаясь лейко- и тромбоцитопенией. Возможен асептический менингит или менингоэнцефалит. Прогноз благоприятный. Лихорадка Ласса – эндемичная инфекция к югу от Сахары. Основной резервуар инфекции – многососковая крыса, выделяющая вирус с мочой. Вирус передается путем контакта больных и здоровых лиц, от животных аэрогенным, алиментарным путями, что обеспечивает высокий риск заражения медицинского персонала больниц, а также семейных вспышек. Инкубационный период 7-8 дней, иногда до 20 дней. Начало заболевания постепенное (интоксикация, геморрагический синдром, язвенный фарингит, желудочные боли, отек лица и шеи, выпот в плевральную полость и в перикард). Летальность 43-67%. Боливийская геморрагическая лихорадка (Мачупо) – природно-очаговая инфекция северно-восточных провинций Боливии. Резервуар инфекции мышевидные грызуны. Возбудитель передается человеку через воду и пищу, загрязненные мочой грызунов, а также воздушнокапельным путем от больного. Инкубационный период 7-14 дней. Характерен геморрагический синдром, дрожание конечностей и языка, протеинурия, поражение печени, выпадение волос и ломкость ногтей. Летальность свыше 30%. Аргентинская геморрагическая лихорадка (Хунин) встречается в центральной части Аргентины. Источник инфекции – мышевидные грызуны. Человек заражается при вдыхании 119 пыли или при употреблении продуктов, зараженных выделениями грызунов. Возможен трансмиссивный путь передачи инфекции. Заболевание протекает на фоне высокой интоксикации, с геморрагическим синдромом, поражениями почек печени, нервной и сердечнососудистой системы. Летальность 10-20%. Вирусологическая диагностика аренавирусных инфекций основана на выделении вирусов путем заражения культуры клеток (клетки Vero, амниона человека, эмбриона мышей) с последующей идентификацией в РСК, реакциях нейтрализации или непрямой иммунофлюоресценции. Возможна постановка биопробы (используют белых мышей, морских свинок, обезьян). Серологические методы диагностики (РСК, РНГА) предполагают определение антител к соответствующим аренавирусам и служат целям ретроспективной диагностики. Разработана ПЦР. Лечение и профилактика. Единственным эффективным методом лечения лихорадки Ласса является применение сыворотки от переболевших или иммунизированных лиц. Для профилактики лихорадки Ласса разработана вакцина. Вирусологическая диагностика филовирусных инфекций (Марбургская лихорадка и лихорадка Эбола) Филовирусы представляют собой прямые (вирус Эбола) или извитые (вирус Марбурга) нити с закругленным концами. Вирус Марбурга может выглядеть в виде спиральных или Vобразных нитей. Диаметр вириона – 70-100 нм, длина около 660 нм. Геном представлен молекулой одноцепочечной РНК. В центре вириона расположен спиральный рибонуклеопротеид, затем следует промежуточный слой. Вирус покрыт липопротеиновой мембраной, на поверхности которой обнаружены шипы. В составе вирионов выявлено 7 структурных белков. Оба вируса хорошо размножаются в культурах клеток обезьян, патогенны для обезьян и морских свинок. Марбургская лихорадка впервые была описана в 1967 г. во время вспышки геморрагической лихорадки в Югославии и Германии (г. Марбург) у лиц, имевших контакты с мартышками из Уганды. Вирус может передаваться при контактах здоровых лиц с больными. Инкубационный период 3-9 дней, начало болезни острое. Быстро наступает прострация, выраженная лихорадка. Выраженный геморрагический синдром.. Характерна везикулезная сыпь, поражения печени, почек, нервной системы (сонливость, адинамия. Летальность 30-50%. В первые дни вирус обнаруживается в крови, моче и отделяемом носоглотки. Вирус в сперме переболевших мужчин обнаруживается до 3 месяцев. Лихорадка Эбола (по названию реки в Заире).Вирус был впервые выделен в Судане и Заире в 1976 г. при вспышке тяжелейшей геморрагической лихорадки. (заболело 500 человек, умерло 350). Резервуаром вируса являются дикие грызуны или летучие мыши. Заболевают, как правило, взрослые, которые становятся источником инфекции в семьях и больницах. Болезнь передается при тесном контакте с больными, особенно с кровью или выделениями, содержащими кровь, а также с мокротой и спермой. Возможен воздушно-капельный (особенно среди персонала больниц) или половой пути заражения. Инкубационный период 3-16 дней. Начало болезни острое (сильная головная боль, лихорадка, миалгия, тошнота, боли в груди, сыпь, понос, тяжелый геморрагический синдром). Летальность – 90%. Лабораторная диагностика лихорадок Марбурга и Эбола сводится к выделению вируса на культуре клеток с последующей его идентификацией с помощью РСК, реакции нейтрализации, реакций иммунофлюоресценции и иммуноферментного анализа. С помощью указанных методов проводится также выявление антигенов вирусов в материалах от больных. В период реконвалесценции диагностическое значение имеет определение нарастания комплементсвязывающих или вируснейтрализующих антител. Разработана ПЦР. Лечение симптоматическое (поддержание водно-солевого баланса, функций печени и почек, борьба с геморрагическим синдромом). Рекомендуется переливание плазмы реконвалесцентов, интерферон. Профилактика. Изоляция выявленных больных, соблюдение особых мер предосторожности при работе с кровью, слюной, мокротой, мочой больных. Разработаны рекомендации по 120 предупреждению завоза инфекции с обезьянами и другими животными в неэндемичные регионы. После изучения темы студент должен знать: характеристику онкогенных вирусов, возбудителей арбовирусных, нейровирусных, медленных инфекций и СПИДа, а также принципы лабораторной диагностики, профилактики и лечения упомянутых инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: трактовать результаты лабораторных исследований при арбовирусных, нейровирусных, медленных инфекциях и СПИДе. ТЕМА 17. ПАТОГЕННЫЕ ГРИБЫ. ВОЗБУДИТЕЛИ ГЛУБОКИХ И СУБКУТАННЫХ МИКОЗОВ, ДЕРМАТОМИКОЗОВ, ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ МИКОЗОВ Цель занятия: разбор биологических свойств патогенных грибов, освоение методов лабораторной диагностики, профилактики и лечения микозов Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Классификация грибов и вызываемых ими заболеваний (микозов). 2. Морфология грибов. Основные формы грибов (овоидная, мицелярная) и их структура. Особенности строения цитоплазматической мембраны и клеточной стенки. Понятие о диморфности грибов. Споры (вегетативные, эндоспоры, экзоспоры, половые) и спорообразование у грибов. Методы изучения морфологии грибов (микроскопия нативных и окрашенных препаратов). 3. Физиология грибов. Особенности питания, дыхания и размножения у грибов. Методы культивирования грибов и питательные среды, применяемые в микологии. Экология грибов. Грибы как продуценты биологически активных веществ. 4. Возбудители глубоких микозов: бластомикозов (северо- и южноамериканского), гистоплазмоза, криптококкоза, кокцидиоза. Экология. Особенности биологии. Роль в патологии человека. Препараты для лечения. 5. Дерматомицеты (дерматофиты) - возбудители дерматомикозов: эпидермофитии, трихофитии, микроспории. Экология. Роль в патологии человека. Лабораторная диагностика. Неспецифическая профилактика. Препараты для лечения. 6. Дрожжеподобные грибы рода Кандида. Экология. Роль в патологии человека. Факторы, способствующие возникновению кандидоза (дисбактериоз, иммунодефициты). Лабораторная диагностика. Препараты для лечения. 7. Возбудители плесневых микозов – аспергиллеза, пенициллеза, зигомикозов. Экология. Роль в патологии человека. Лабораторная диагностика. Препараты для лечения. ЭЛЕМЕНТЫ ОБЩЕЙ МИКОЛОГИИ И ПРИНЦИПЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ МИКОЗОВ Биологические свойства грибов Царство грибов (Mycota или Fungi) входит в состав надцарства Eucaryotae и содержит многочисленные виды грибов, среди которых 150-500 видов относится к отделу настоящих грибов (Eumycotae), вызывая у человека, вызывая разнообразные по клиническим проявлениям заболевания (микозы) - от легких, имеющих косметическое значение, до тяжелых системных инфекций с поражением различных органов, тканей и систем. Большинство патогенных для человека грибов являются представителями преимущественно класса Deuteromycetes (Fungi imperfecti или несовершенные грибы, не способные размножаться половым путем), а также классов Ascomycetes и Basidiomycetes. Выделяют 4 группы микозов (табл. 23). Некоторые микозы встречаются спорадически, другие имеют эпидемическое распространение, третьи характеризуются природной очаговостью. Патогенные для человека грибы могут быть одноклеточными и многоклеточными, одна часть из которых способна расти на искусственных средах, а другая не способная развиваться вне организма больного человека. 121 Таблица 23. Классификация микозов. Группы микозов Глубокие (системные микозы) Заболевания Кокцидиоидный микоз Гистоплазмоз Криптококкоз Бластомикоз Подкожные (субкутанные) ми- Споротрихоз Хромобластомикоз козы (хромомикоз) Мицетома (мадуромикоз) Эпидермофития Эпидермомикозы Рубромикоз Трихофития Возбудители Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum Criptococcus neoformans Blastomyces dermatitidis Sportrichum schenckii Fonsecaca pedrosai Грибы родов Acremonium, Aspergillus и т.д. Epidermophyton floccosum Trichophyton rubrum Trichophyton violaceum, Trichophyton mentagrophytes, Микроспория Microsporum canis, Microsporum ferrugineum Парша (фавус) Achorion schoenleini Кератомикозы (поверхностные Разноцветный лишай Malassezia furfur Черный микоз (кладо- Cladosporium werneskii микозы) споридиоз) Трихоспороз (белая Trichosporon beigelii пьедра) Черная пьедра Piedraia hortae Кандидозы Оппортунистические микозы Candida albicans, Candida tropicalis Candida pseudotropicalis и др. Мукороз Mucor spp Аспергиллез Aspergillus spp Пенициллиоз Penicillium spp Пневмоцистоз Pneumocystis carinii Размеры клеток гриба варьируют от нескольких (дрожжи, дерматофиты) до десятков и сотен микрометров (мукоровые). Грибы относятся к примитивным эукариотам, их клетки содержат гомогенную или зернистую цитоплазму, одно или несколько шарообразных ядер нуклеолями, вакуоли, митохондрии, аппарат Гольджи и ряд включений. Постоянными включениями в клетке грибов являются липиды, волютин, гликоген, реже — кристаллы солей, органических кислот и пигменты. Морфология грибов весьма разнообразна (рис. 32). Наиболее часто у молодых клеток грибов встречается яйцевидная форма или удлиненная в виде трубочки или нитей ветвящаяся структура - мицелий. Полиморфные, грушевидные, булавовидные, веретенообразные, амебовидные клетки встречаются в более зрелых культурах. Мицелий представляет собой круглую ветвящуюся трубку диаметром от 1 до 10 мк, разделенную поперечными перегородками на клетки длиной 5 до 70 мкм. Ветви мицелия возникают в виде боковых выростов, которые могут располагаться у некоторых грибов через правильные промежутки с той или другой стороны. Переплетаясь и анастомозируя друг с другом, нити мицелия создают рыхлую или густую грибницу, плотно спаянную с питательным субстратом или же легко от него отделяющуюся. На конце нитей у ряда грибов можно наблюдать своеобразные ветвления в виде рогов северного оленя, канделябров, гребешковых органов, завитков, тонких спиралей или же вздутий, напоминающих дубинку, посошок, булаву. 122 В культурах дрожжеподобных грибов рода Candida вместо истинного мицелия встречается псевдомицелий, состоящий из удлиненных клеток с боковыми ответвлениями, напоминающими нити истинного мицелия. В отличие от истинного мицелия, псевдомицелий представлен отдельными, не связанными друг с другом клетками, каждая из которых имеет собственную оболочку и вместо истинного ветвления в псевдомицелии имеется древовидное расположение клеток. Важнейшим элементом грибов являются споры или конидии, с помощью которых грибы размножаются и распространяются во внешней среде. Обычно споры образуются в большом количестве и возникают либо внутри мицелия (эндоспоры - тканевые формы возбудителей кокцидиоидного микоза, риноспоридиоза, развивающиеся в крупных круглых образованиях — сферулах), или непосредственно на мицелии, на его ветвях, либо на своеобразных спороносных гифах (экзоспоры). Выделяют следующие виды спор: артроспоры прямоугольной и округлой формы, размером 2-4х4-8 мкм, образующиеся путем расчленения мицелия; бластоспоры - круглые или яйцевидные споры, размером 1,5-8 мкм, образующиеся почкованием материнской клетки; хламидоспоры - округлые, крупные споры, диаметром 15-20 мк с выраженной шероховатой оболочкой, располагающиеся по ходу (интеркаларные, промежуточные) или на концах (терминальные, концевые)мицелия; микроконидии (алейроспоры) округлой или грушевидной формы размером 25х3-7 мкм, располагающиеся кучками или поодиночке; 123 Рис. 32. Морфология грибов. 1 - мицелий; 2 - разветвление мицелия в виде рогов северного оленя; 3 - гребешковые органы - окончания мицелия дерматофитов; 4 - канделябры - концевые ветвления мицелия; 5 - булавовидные окончания мицелия; 6 - окончания мицелия в виде дубинок; 7 - узловатые органы - сплетения мицелия дерматофитов; 8 - веретенообразные споры на концах мицелия; 9 - аскоспоры; 10-спорангиоспоры; 11 - артроспоры; 12 - бластоспоры; 13 - хламидоспоры концевые и интрекалярные; 14 - алейрии; 15 - макро- и микроконидии. конидии (конидиоспоры) круглой или яйцевидной формы с гладкой или шероховатой оболочкой, диаметром 3-5х5-8 мкм, образующиеся на специальных конидиеносцах по бокам либо на концах мицелия и прикрепляющиеся к нему непосредственно или тонкой ножкой. К конидиям также относят крупные веретенообразные формы длиной 6— 8—40 мк, шириной 3—12 мк с поперечными перегородками (макроконидии). В патологическом материале из очагов поражения от больных микозами обнаруживаются достаточно однообразные элементы гриба (споры, нити мицелия), не похожие на элементы гриба в культурах. 124 Культуральные признаки некоторых патогенных грибов, выращиваемых при разных температурах, могут быть различны. Так, например, возбудители кокцидиоидного микоза, бластомикозов, гистоплазмоза при температуре 30-330 С и ниже дают мицелиальные формы, а при температуре 35-37 0 С-дрожжевые формы, почти совсем лишенные мицелия. Культуры патогенных грибов отличаются большим разнообразием. Разнообразие колоний зависит от видовых и возрастных особенностей гриба, состава питательной среды и условий культивирования. Диаметр колоний колеблется от 0,5 до 3 см и более, цвет также варьирует - наряду с бесцветными колониями встречаются беловато-желтоватые, желтые, коричневые, розовые, красные, зеленоватые, оранжевые, фиолетовые, черные. Колонии одних грибов плоские и ровные, других - складчатые, бугристые, морщинистые, в некоторых случаях кратерообразные или куполовыпуклые. Поверхность колоний у одних грибов гладкая, кожистая, иногда блестяще-сального оттенка, у других пушистая, бархатистая или мучнистая.Консистенция культур тоже различна: у одних кожистая, плотная, у других мягкая, тестообразная, слизисто-тягучая, у некоторых крошковатая. Отношение грибов к субстрату также различное: одни глубоко внедряются в среду, другие легко отделяются от питательной среды. Патогенные грибы являются аэробами, использующими для своего питания различные белки, углеводы, липиды, кератин и т.д. Глубина разложения питательных субстратов различна у разных грибов. Так, одни грибы разлагают белки только до аминокислот, другие до аммиака и сероводорода. Разложение углеводов одними грибами сопровождается кислотообразованием, тогда как другие грибы расщепляют их до углекислоты и воды. Большинство патогенных грибов лучше развиваются в кислых средах (рН 6,0—6,5) при оптимальной температуре 28-33 0 С, однако они способны хорошо расти при комнатной температуре (16-200 С) и при температуре 35-37 0 С.Наиболее часто для культивирования грибов применяют плотную или жидкую среду Сабуро, содержащую пептон и мальтозу. Лабораторная диагностика микозов Материалом для исследования являются пораженные волосы, чешуйки кожи, кусочки ногтей, кожные и ногтевые соскобы, гной, мокрота, пунктаты лимфатических узлов, костного мозга, внутренних органов, кровь, спинномозговая жидкость, желудочный сок, желчь, испражнения, биоптаты и др. Материал берут стерильными инструментами (пинцетом, скальпелем, иглой, ножницами, ложечкой Фолькмана и т.д.); тампоны для взятия материала не используются. Патологический материал обрабатывают смесью едкого калия с диметисульфоксидом (20 г КОН + 100 мл 60%-го ДМСО). Препараты «раздавленной капли» исследуют под большим увеличением (х40) обычного или фазово-контрастного микроскопа. У больных микроспорией в лучах люминесцентной лампы пораженные волосы имеют изумрудно-зеленое свечение. Для диагностики микозов применяется широкий комплекс лабораторных исследований (микроскопический, микологический, аллергический, серологический, генетические методы, биопроба – схема 23). Схема 23. Лабораторные методы диагностики микозов Материал для исследования: пораженные волосы, чешуйки кожи, кусочки ногтей, кожные и ногтевые соскобы, гной, мокрота, пунктаты лимфатических узлов, костного мозга, внутренних органов, кровь, спинномозговая жидкость, желудочный сок, желчь, испражнения, биоптаты и др. 125 Микроскопический метод: исследование нативных и окрашенных препаратов с целью обнаружения элементов гриба (мицелия, спор) Микологический метод: посев на специальные питательные среды (Сабуро и др.). Идентификация выделенной культуры гриба на основании характеристики колоний, микроскопического строения гриба, а также по биохимическим и другим признакам. Серологический метод: определение антител к грибам или их антигенам в сыворотке крови больных микозами с помощью РА, РСК, РНГА, РИФ, ИФА, иммуноблотинга Аллергический метод: постановка внутрикожных аллергических проб с грибковыми аллергенами Биопроба: заражение чувствительных животных с последующим выделением чистой культуры гриба Экспресс-диагностика: РИФ, ПЦР Микроскопический метод играет важную роль в диагностике микозов, т.к. дает возможность быстро выявить в нативных и окрашенных препаратах наличие и расположение клеток, спор гриба и нитей мицелия в патологическом материале. Наиболее часто для окраски грибов применяют общепринятые методы Грама, Романовского-Гимза, Циля-Нильсена, Бурри. Разработан также широкий набор специальных методов окраски грибов. Экспресс-диагностика микозов осуществляется с помощью прямой РИФ. Микологический метод (выделение чистой культуры гриба и ее идентификация) является важнейшей составной частью лабораторного исследования при микозах. Посевы производят на специальные плотные и жидкие (неселективные и селективные) питательные среды (среды Сабуро – мальтозо-пептонная, сусло-агар, Чапека; кукурузный, рисовый, картофельный, кровяной, шоколадный, сердечно-мозговой, угольно-дрожжевой агар и т.д.). Селективные среды содержат антибиотики (левомицетин, стрептомицин, пенициллин и др.), красители (бенгальский розовый и др.) или дезинфицирующие вещества. В отличие от слабощелочных сред для выращивания большинства бактерий, среды для культивирования грибов имеют кислую или слабокислую рН (5,7-6,8). Для первичной дифференциации грибов разработан агар CHROM с хромогенными субстратами, расщепляющимися ферментами грибов с образованием окрашенных соединений, в результате чего колонии различных видов грибов окрашиваются в разные цвета – красный, желтый, белый, кремовый, коричневый, черный и т.д. Культивирование грибов осуществляют обычно при температуре 22-280 С в течение 2-4 недель. Идентификацию выделенной культуры гриба проводят на основании характеристики колоний (внешний вид, форма, консистенция, цвет), микроскопического строения гриба (строение мицелия, форма и расположение конидиеносцев и конидий – спор), а также по биохимическим и другим признакам. Серологический метод – определение антител к грибам или их антигенам в сыворотке крови больных микозами с помощью РА, РСК, РНГА, РИФ, ИФА, иммуноблотинга Аллергический метод – постановка внутрикожных аллергических проб. Проводят с грибковыми аллергенами, представляющих собой взвеси из убитых грибов, фильтраты обезвреженных нагреванием культур, полисахаридные и белковые фракции клеток гриба. Результаты аллергических проб учитывают через 20 мин (немедленные) и через 24-48 ч (замедленные реакции). 126 Для выявления грибковой сенсибилизации организма также применяют иммунологические тесты in vitro (дегрануляция базофилов как тест гиперчувствительности немедленного типа, а для выявления гиперчувствительности замедленного типа - реакцию торможения миграции лейкоцитов или бласттрансформации лимфоцитов). Биопроба - заражение чувствительных животных (мыши, крысы, хомяки, кролики, морские свинки, собаки, кошки) различными способами (накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутрисердечно, интрацеребрально, перорально, интратрахеально) для выделения чистой культуры гриба. Гистологический метод направлен на обнаружение гриба в тканях, полученных при биопсии и аутопсии. Генодиагностика. Разработана ПЦР для выявления в материале от больного специфических фрагментов ДНК грибов, позволяющая выявить около 40 видов грибов, в том числе Candida albicans и ее варианты, Т. rubrum и С. neoformans, различные виды Aspergillus, возбудителей паракокцидиоидомикоза (Paracoccidioides brasiliensis) и гистоплазмоза (Histoplasma capsulatum). ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ОТДЕЛЬНЫХ МИКОЗОВ Лабораторная диагностика глубоких (системных) микозов Возбудителями глубоких микозов, встречающихся в определенных природных очагах, являются почвенные грибы, вызывающие в ряде случаев развитие тяжелых системных форм инфекции. Криптокккоз Возбудителем криптококкоза (европейского бластомикоза) является Cryptococcum neoformans, поражающий преимущественно у лиц с иммунодефицитами (как правило, при СПИДе) ткань мозга, легкие, кожу, подкожную клетчатку и слизистые оболочки. Наиболее часто криптококкоз протекает в виде хронического менингита с частыми ремиссиями и обострениями, иногда переходящего в энцефалит. При генерализации процесса прогноз обычно неблагоприятный. Заболевание встречается редко, но распространено повсеместно. Возбудитель обитает в почве, в гнездах птиц, на растениях, в пищевых продуктах. Заражение происходит при вдыхании грибка с пылью. Материалом для исследования при криптококкозе являются мокрота, гной, спинномозговая жидкость, кусочки костей, биоптататов тканей из очагов поражения и секционный материал. Применяются следующие методы лабораторного исследования. Микроскопический метод - исследование неокрашенных препаратов из материала от больного, в которых возбудитель выглядит в виде округлых или яйцевидных дрожжевых клеток размером 2х5, реже -10-20 мкм, покрытых толстой слизистой капсулой желтоватого цвета, иногда с одной длинной почкой (рис 33 а). Иногда толщина капсулы (до 50мкм) значительно превосходит размеры самой клетки гриба. Капсулу можно выявить также методом Гинса-Бурри. Реже исследуют гистологические препараты, окрашенные гематоксилином. Тканевая форма криптококка морфологически мало отличается от культуральной. Микологический метод - посев исследуемого материала на среду Сабуро и другие среды для выращивания грибов. выращивают при 25 — 30 °С. Через 1-5 суток выращивания при температуре 25-300 С на среде Сабуро вырастают блестящие, слизисто-сальные, сметанообразной консистенции колонии беловатого, желтоватого или коричневого цвета с куполообразной гладкой поверхностью (рис. 33 б), реже — морщинистые или мелкозернистые. Идентификацию С. neoformans проводят по морфологическим, культуральным свойствам, способности расти при 37 °С, а также по биохимическим свойствам. Криптококки образовуют уреазу, фенолоксидазу, не растут в присутствии циклогексимида, неспособны ферментировать углеводы. 127 а б Рис. 33. Возбудитель криптококкоза (Cryptococcum neoformans). а – в исследуемом материале, б – колонии на питательной среде. Серологический метод - имеет вспомогательное значение, т.к. с помощью РА, РНГА, РП, РСК, РИФ антитела при криптококкозе обнаруживаются в невысоких титрах и непостоянно. Биопроба - внутрибрюшинное или внутримозговое заражение мышей материалом от больных. Через 2-4 недели животных забивают с целью выделения чистой культуры гриба из внутренних органов. Выделенные культуры идентифицируют по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам. Генодиагностика. Разработана ПЦР для диагностики криптококкоза. Североамериканский бластомикоз (болезнь Джилкрайста—Стокса) Возбудителем этого микоза является Blastomyces dermatitidis - диморфные грибы, вызывающие местное или системное хронически протекающее заболевание с гнойным поражением органов дыхания, кожи, подкожной клетчатки, костей, внутренних органов. Заболевание эндемично для США, Канады, встречается в странах Африки, реже - в Австралии, Индии, Латинской Америке, Европе. Возбудитель обитает в почве, заражение происходит при вдыхании спор гриба с пылью. Исследованию подвергают гной из свищей и абсцессов, спинномозговую жидкость, мокроту, мочу, пунктат лимфатических узлов и т.д. Возбудитель североамериканского бластомикоза является димор фным грибом, который в тканях развивается в виде дрожжеподобных почкующихся клеток, а в культурах при 200 С - в мицелиальной и дрожжевой формах. Микроскопический метод – выявление в нативном препарате из материала от больного (или в гистологических препаратах, окрашенных по Романовскому—Гимзе) дрожжеподобных почкующихся округлых или овальных клеток, размером 8—15 мкм, с двойной оболочкой и единственной почкой, располагающейся на широком основании. Вместо образования почки клетка может вытягиваться и принимать вид языка колокола. Микологический метод – посев на среду Сабуро, сахарный или сусло-агар с последующим выращиванием в течение 4-6 недель при температуре 20-250 С в результате чего образуется мицелиальная форма гриба. Колонии гриба сначала круглые и гладкие, складчатые, дрожжеподобные, затем они последовательно покрываются белым, желтым и бурым пушком с короткими шипами. При микроскопии культур обнаруживают круглые почкующиеся дрожжевые клетки, большое количество септированных нитей мицелия с многочисленными боковыми конидиями круглой, овальной, иногда грушевидной формы, диаметром 35мкм. В старых культурах можно найти хламидоспоры, диаметром 7-18мкм. . Мицелиальная форма легко превращается в дрожжеподобную при выращивании при 37 0 С, а дрожжевая при 20 0 С в мицелиальную. На кислых средах вырастает мицелиальная, а на щелочных — дрожжевая форма гриба Идентификация возбудителя североамериканского бластомикоза основывается на способности гриба трансформироваться в дрожжевую форму при температуре культивирования 370 С и вырабатывать экзоантиген мицелиальной формы гриба, определяемый с помощью реакции иммунодиффузии с диагностической сывороткой и концентрированным экстрактом 128 бульонной или агаровой культуры возбудителя. Для целей идентификации используют ся также методы генодиагностики. Серологическое исследование. Для серодиагностики применяют РСК и реакцию иммунодиффузии. Аллергологическое исследование - внутрикожные пробы с бластомицином – аллергеном, полученным из экстракта клеток возбудителя. Диагностическая ценность пробы невысока изза перекрестных реакций. Биопроба - заражение белых мышей с последующим посевом пораженных тканей на питательные среды с целью выделения чистой культуры гриба и ее идентификации. Генодиагностика - ПЦР для быстрого обнаружения ДНК возбудителя в исследуемом материале. Южноамериканский бластомикоз (паракокцидиоидоз) Встречается только в странах Южной Америки, возбудителем является двухфазный гриб Paracoccidioides brasiliensis, поражающий кожу, слизистую оболочку полости рта и носовой части глотки, внутренние органы, лимфатические узлы. Возбудитель заболевания обитает на растениях и в почве. Заражение происходит аэрогенным путем или при проникновении гриба через слизистую оболочку полости рта в результате ее травмировании при чистке зубов веточкой растения. Микроскопический метод – изучение нативных или окрашенных по Граму, Романовскому—Гимзе и другими методами мазков из гноя, мокроты, отделяемого свищей, биоптатов и т.д. Клетки гриба круглые или эллипсоидные, крупные (от 30 до 60 мкм), окруженные толстой оболочкой. Материнская клетка окружена мелкими (2—10 мкм) дочерними бластоконидиями, приобретая характерный вид короны или корабельного штурвала. В отличие от возбудителя бластомикоза место соединения дочерних клеток с материнской узкое. Окончательный диагноз устанавливают после выделения и идентификации возбудителя. Микологический метод. Гриб медленно растет на питательных средах, образуя через 3-4 недели культивирования при 370 С белые или кремовые колонии, в мазках из которых обнаруживают дрожжевые клетки, размером 40-50 мкм, окруженные большим числом бластоконидий на узком основании (вид «корабельного штурвала»). При более длительном культивировании появляются признаки мицелиального роста. Идентификация гриба проводится с помощью реакции иммунодиффузии с использованием диагностической иммунной сыворотки для определения типа экстрагируемого экзоантигена. Дрожжевая форма возникает при выращивании культуры гриба при 37 0 С, колонии в этой форме гладкие или складчатые, сходные с колониями дрожжеподобных грибов. В мазках из колоний видны овальные и круглые клетки крупного размера, с единичными или множественными почками или без них, напоминая тканевые формы гриба. Мицелиальная форма возникает при выращивании культуры при температуре до 250 С, характеризуется ростом складчатых колоний, покрытых в центре беловато-сероватым, а затем - желтоватым пушком. Под микроскопом видны ветвящийся мицелий и овальные конидии, диаметром 3,0-3,5мкм, которые располагаются по бокам мицелиальных клеток. Для лабораторной диагностики южноамериканского бластомикоза (паракокцидиоидоза) применяют также методы серологической и аллергической диагностики, биопробу, ПЦР. Гистоплазмоз Возбудитель гистоплазмоза - диморфный гриб Histoplasma capsulatum вызывает широко распространенный природно-очаговый микоз в регионах с теплым климатом. В России гистоплазмоз встречается в виде спорадических случаев. Совершенная стадия гриба является аскомицетом и имеет название Emmonsietla capsulata. Возбудитель гистоплазмоза может иметь дрожжевую (паразитарная форма, встречается в организме человека и животных или развивается на соответствующих искусственных средах), а также мицелиальную форму, свойственную природным и лабораторным штаммам. Дрожжевая форма в тканях и патологическом материале имеет вид одноядерных клеток округлой или грушевидной формы, размером 2-4мкм, с клеточной оболочкой, капсулой и почкой на более 129 узком конце клетки и ядром, которое вдвое меньше клетки. Характерным для тканевой формы является расположение внутри макрофагов, гигантских клеток и клеток ретикулоэндотелиальной системы; реже клетки гриба лежат свободно и напоминают тканевые формы лейшманий. Гистоплазма обитает в почве, загрязненной пометом птиц и летучих мышей, а также в гнездах птиц. Заражение происходит аэрогенным путем при вдыхании пыли со спорами гриба. Для гистоплазмоза типичны острая или хроническая пневмония, поражение кожных покровов и слизистых оболочек, внутренних органов, развитие анемии, перитонита, менингоэнцефалита и т.д. Гистоплазмы поражают мононуклеарные фагоциты с формированием очагов казеозного некроза, последующим фиброзом и кальцинацией. Материалом для исследования является отделяемое язвенных поражений кожи и слизистой оболочки, мокрота, кровь, моча, спинномозговая жидкость, пунктаты костного мозга, подкожной клетчатки. Применяются следующие методы лабораторной диагностики. Микроскопический метод - исследование мазков из патологического материала или гистологических срезов позволяет выявить овальные дрожжеподобные одиночные или почкующиеся клетки гриба, размером 10—15 мкм (рис. 34), а также микроконидии, размером 3-5 мкм. Результаты микроскопического исследования должны быть подтверждены выделением чистой культуры гриба. Рис. 34. Возбудитель гистоплазмоза (Histoplasma capsulatum) в исследуемом материале. Микологический метод. Исследуемый материал засевают на среду Сабуро, или другие питательные среды для грибов, посевы инкубируют при температуре 25-300 С и 370 С в течение 3-6 недель. Гистоплазмы образуют блестящие беловатые или коричневатые дрожжеподобные колонии мягкой консистенции, которые состоят из округлых клеток диаметром 4 — 5 мкм с мелкими почками на тонких ножках. При более низкой температуре инкубирования возбудитель образует белый волокнистый мицелий, образованный в зрелых колониях бугорчатыми макроконидиями и/или мелкими каплевидными конидиями. Выделенную культуру идентифицируют по морфологическим и культуральным признакам, а также по антигенной структуре (реакция иммунодиффузии с диагностической сывороткой к антигенам гриба). На среде Сабуро при температуре 25-300 С характерен рост аэробной мицелиальной формы в виде пушистых колоний, цвет которых варьирует от белого до коричневого. Мицелий в этих колониях септированный, ветвистый, многоядерный, диаметром до 5мкм. Макроконидии крупные, круглые или грушевидные, диаметром 10-25мкм, с шиловидными выростами, располагаются на концах воздушных нитей мицелия. Имеются хламидоспоры. Микроконидии гладкостенные, округлые, грушевидные или сигарообразные, размером 2-6мкм. Дрожжевая форма гистоплазмы относится к факультативным анаэробам или микроаэрофилам и вырастает на кровяных средах с глюкозой при температуре 35-370 С и рН 7,2-7,6. Коло130 нии дрожжевой формы мелкие, блестящие, выпуклые, иногда складчатые, плотной консистенции, окрашенные в белый, серый, желтый, коричневый цвет. Клетки гриба овальной формы, размером 1,5-3,5мкм, размножаются только почкованием; почки образуются на одном или на двух полюсах, иногда аполярно. Может образовываться псевдомицелий: почкующиеся дрожжеподобные клетки располагаются цепочками и нитями. Серологический метод - постановка РИФ, РА, РИД и РСК с сывороткой крови больного гистоплазмозом и антигенами возбудителя гистоплазмоза (гистоплазмином, полученным из гифов гриба, или антигенами дрожжевой формы гриба) с целью определения антител к Histoplasma capsulatum. Аллергический метод - постановка внутрикожной аллергической пробы с гистоплазмином. Методы иммунодиагностики имеют второстепенное значение в связи с наличием перекрестных реакций и позднего появления положительного результата. Биопроба - внутрибрюшинное заражение исследуемым материалом белых мышей или золотистых хомячков. Через 1 мес после заражения животных умерщвляют и внутренние органы исследуют микологическим методом с целью выделения и идентификации чистой культуры гриба Генодиагностика. Разработаны методы ПЦР-диагностики гистоплазмоза. Кокцидиомикоз Возбудителем эндемичного микоза - кокцидиоидоза является почвенный гриб Coccidioides immitis, который относится к диморфным грибам класса фикомицетов и встречается в тканевой, паразитарной форме в организме больных, а также в мицелиальной (весьма контагиозной форме) в почве и в чистых культурах на искусственных питательных средах. Заражение кокцидиоидозом происходит при вдыхании артроспор, находящихся в воздухе. Гриб вызывает тяжелые системные микозы у людей в виде гриппоподобного заболевания, кавернозного поражения легких, кожи, подкожной клетчатки, мозговых оболочек и других тканей организма. Исследуемым материалом являются гной, мокрота, кровь, спинномозговая жидкость, биопсийный (операционный) материал. Микроскопический метод - исследование нативных и окрашенных (по Романовскому-Гимзе и т.д.) препаратов с целью выявления шаровидных образований (сферул), размером 20-60 мкм, с двухконтурной оболочкой, наполненных мелкими (2-4 мкм) округлыми эндоспорами (рис. 35). Встречаются также разрушенные сферулы. В биопсийном материале обнаруживаются гранулемы, состоящие из полиморфноядерных лейкоцитов, лимфоцитов, эпителиоидных и гигантских клеток. Рис. 35. Возбудитель кокцидиомикоза (Coccidioides immitis) в исследуемом материале. 131 Микологический метод – выделение чистой культуры Coccidioides immitis проводят в специализированных лабораториях с соблюдением особых правил противоэпидемического режима безопасности. Посевы делают на среды Сабуро, МПА и МПБ с глюкозой. Через 1 неделю при температуре 370 С С. immitis образует кожистые дрожжеподобные колонии, желтовато-коричневого цвета, врастающие в субстрат. При температуре 250 С развивается мицелиальная форма гриба в виде пушистых, беловатых, на высоте спорообразования мучнистых колоний с характерными артроспорами. В некоторых колониях наблюдаются концентрические зоны пушистого мицелия. Мицелий септированный, артроконидии крупные толстостенные, размером 2-3x4-6 мкм, чередуются в гифах с тонкостенными клетками. В молодых культурах на плотных средах преобладает мицелий с интеркаларными хламидоспорами. Старые культуры богаты хламидоспорами, артроспорами, обрывками мицелия. При разрыве гифов артроспоры, обладающие высокой контагиозностью, освобождаются, легко переносятся током воздуха и при вдыхании людьми легко трансформируются в тканевые сферулы. Кокцидиоидный гриб является аэробом, ферментирует моно-, ди- и полисахара, обладает выраженной протеолитической активностью (разжижает желатин и казеин, свернутую лошадиную сыворотку, пептонизирует и коагулирует молоко). Не восстанавливает нитраты в нитриты, не образует индола и сероводорода. Для идентификации С. immitis применяют реакцию иммунодиффузии или прямую РИФ с сыворотками к антигенам кокцидий, а также методы генной идентификации. Биопроба – заражение белых мышей, хомяков и самцов морских свинок (интратестикулярно или интраперитонеально), у которых единичные артроконидии вызывают летальную инфекцию. Серологический метод - постановка РП, РСК, РИФ, ИФА, позволяющих выявить специфические антитела классов IgM и IgG в сыворотке крови больных кокцидиомикозом. При кокцидиоидном менингите антитела можно обнаружить в ликворе больных. Аллергический метод – постановка кожных аллергических проб с кокцидиоидными аллергенами кокцидиоидином (аллергеном мицелиальной формы) и сферулином (аллергеном тканевой формы). При положительной пробе через 24-48 часов отмечаются гиперемия, припухлость, папула в месте введения аллергена. Лабораторная диагностика подкожных (субкутанных) микозов Споротрихоз Встречается почти во всех странах мира (чаще во Франции и США), возбудитель - Sporotrichum schenckii обладает диморфизмом, относится к нитчатым грибам, гифомицетам. Споротрихоз регистрируется преимущественно в странах с тропическим и субтропическим климатом, а в зонах с умеренным климатом - в теплое время года. Гриб обитает в почве, вегетирует на растениях. Грибы проникают чаще всего в кожу конечностей при травме, реже - через слизистые оболочки дыхательных путей или желудочно-кишечного тракта. Как правило, заболевают лица, работающие с растениями и древесиной. В месте поражения грибом развивается поражение в виде пустулы, абсцесса или язвы, лимфатические сосуды утолщаются и уплотняются. Заболевание характеризуется поражением подкожной клетчатки и лимфатических узлов, образованием гумм в глотке, гортани, мышцах, синовиальных оболочках, костях, суставах, возникновением абсцессов в мышцах и внутренних органах, развитием пневмонии, пиелонефрита. Иногда может происходить диссеминация возбудителя с поражением внутренних органов и костей. Материалом для исследования служат гной из свищей и язвенных поражений, соскобы с краев язв, пунктаты закрытых воспалительных очагов, биоптаты пораженных тканей. Микроскопический метод. Тканевые формы в виде мелких грамположительных почкующихся клеток округлой или сигарообразной формы, напоминающих челнок, размерами 2— 5мкм и покрытых слоем слизи, обнаруживают обычно внутри макрофагов. Однако эти находки в срезах тканей и в патологическом материале встречаются сравнительно редко. Иногда встреча- 132 ются дрожжеподобные почкующиеся клетки, диаметром 2-8мкм, и так называемые «астроидные» тела — грибковые клетки, окруженные эозинофильными комплексами антиген-антитело. При микроскопическом исследовании обнаруживают также септированный мицелий, размером 10-50 мкм, с характерными конидиями споротриксов в виде гроздей, напоминающих цветки маргаритки, а также небольшие (2-5 мкм), заостренные на концах, овоидные или сигароподобные конидии, расположенные попарно или в виде розеток на концах мицелия. Для экспресс-диагностики споротрихоза также применяется РИФ. Микологическое исследование. Для выделения чистой культуры посевы производят на плотные и жидкие питательные среды, которые инкубируют при температуре 250 С или 370 С. В культурах споротрихум встречается в мицелиальной и дрожжевой формах. Дрожжевые формы вырастают при температуре 370 С на 4-6 день в виде гладких колоний желтого цвета, в которых при микроскопическом исследовании обнаруживают овал ьные и удлиненные толстостенные клетки, размером 1-2х4-8мкм; могут встречаться также круглые почкующиеся клетки, иногда связанные друг с другом длинной клеткой. Позднее колонии медленно увеличиваются в размерах, становятся серыми, складчатыми, редко сливаются. Колонии гриба вырастают на 20 —25-е сутки. При бактериоскопии обнаруживают ветвистый, септированный мицелий шириной 2 — 6 мкм коричневого цвета и овальные споры, расположенные на стеригмах размером 2 — 5 мкм. При 370 С споротрихумы растут в дрожжевой форме — в виде единичных овальных клеток. Мицелиальная форма гриба растет при температуре 250 С в течение 20-25 дней. Встречаются складчатые, крупнобугристые, многопетлистые, возвышающиеся колонии, окрашенные водонерастворимым пигментом сначала в кремовый, затем в желтый, коричневый и черный цвет. Мицелий гриба ветвистый, септированный, диаметром 1,0-2,5х10-30 мкм. Конидии овальные, круглые, грушевидные или цилиндрические, часть из них имеют заостренные концы, размеры конидий 2-8х1,5-З,0 мкм мкм. Конидии располагаются обычно попарно одна против другой по бокам мицелия или группами по 5-10 спор на конце, иногда в виде розетки. Встречаются также коремии - анастомозирующие нити мицелия в виде тонких усиков или завитков с микроконидиями на воздушных концах. В старых культурах обнаруживаются хламидоспоры. Биопроба – интратестикулярное заражение белых мышей. При микроскопии пораженных тканей отмечается трансформация мицелиальной формы гриба в дрожжевую. Мышей, крыс, морских свинок можно заражать также внутрикожно. Хороший результат дают аллергические пробы со споротрихином. Серологический метод - выявление антител в сыворотке крови больных к антигенам возбудителя споротрихоза с помощью РА, РСК и ИФА. Аллергический метод – постановка внутрикожной аллергической пробы с аллергеном гриба - споротрихином Хромомикоз Возбудителями хромомикоза являются «черные плесени», Phialophora verrucosa, Fonsecaea compacta, Fonsecaea pedrosoi, Exophiala jeanselmei - диморфные грибы, относящиеся к дейтеромицетам. Гриб обнаруживается в почве, а также на растениях. Заболевание у человека имеет хроническое течение (от10 до 30 лет), характеризуясь возникновением на конечностях бородавчатых и папилломатозных разрастаний (наподобие цветной капусты), покрытых корками, а также наличием мелких и крупных абсцессов, гранулематозных очагов. Заболевание спорадическое, встречается преимущественно в тропической и субтропической зонах. Материалом для исследования служат гной, соскобы пораженной ткани, биоптаты. Микроскопический метод. При исследовании нативных препаратов из материала от больного микроскопии обнаруживают золотисто-коричневые округлые клетки гриба с толстой двухконтурной оболочкой, размером 4-15 мкм, часто в окружении гигантских склероциев - клеток с продольными и поперечными перегородками. Между клетками можно обнаружить 133 нити мицелия. В препаратах, окрашенных по Романовскому—Гимзе стенки клеток окрашиваются в зеленый цвет, по Цилю—Нильсену — в красный. Микологический метод - выделение культур на среде Сабуро или других средах при температуре 25-280 С. Рост колоний появляется на 3-5-й день в виде темно-серых пушистых точек, к 10-17-му дню колонии становятся округлыми, конусовидными, ворсистыми или пушистыми, приобретая зеленовато-сероватый цвет. Колонии могут сливаться в сплошную массу, окруженную мелкими пушистыми разбросанными колониями темного цвета. В жидкой среде образуется складчатая пленка и рыхлый войлоко-подобный осадок в виде черного комка на дне пробирки. Выделенные культуры идентифицируют на основании морфологических свойств и характеру спорообразования. Мицелий гриба септирован мало, конидиеносцы более септированы и на их расширенных концах располагаются конидии. Скопления спор кистеподобные, встречаются также одиночные или расположенные группами желто-бурые хламидоспоры, диаметром 10-12мкм, с толстыми темными стенками. Выделяют следующие типы споруляции возбудителя хромомикоза: hormodendrum, acrotheca, phialophora. Тип hormodendrum имеет концевые конидиофоры с усеченными мелкими выпуклостями, к которым прикреплены яйцевидные, одно- или двухклеточные споры оливкового цвета, размерами 1,5-3,0x3,0-5,0 мкм, расположенные в виде цепочек. Тип acrotheca также представлен концевыми конидиофорами, однако они напоминают по форме дубинку и образуют латеральные конидии, диаметром 2-З мкм. Тип phialophora характеризуется овальными или удлиненными конидиями, расположенными в бокаловидных конидиеносцах. Культивирование гриба при температуре 370 С приводит к формированию на 5-6 сутки желтоватых колоний, состоящих из дрожжеподобных клеток гриба, размером 2-7 мкм. Другие методы исследования. Применяются также методы серологической диагностики (с сыворотками крови больных ставят РП и РСК, используя специфические антигены возбудителя хромомикоза); применяют также аллергические пробы. В ряде случаев используют биопробу - интратестикулярное заражение самцов морских свинок. Лабораторная диагностика эпидермомикозов Рубромикоз (руброфития). Возбудитель - Trichophyton rubrum поражает кожу стоп, ногтевые пластинки пальцев стоп и кистей, крупные складки, кожу туловища и конечностей. Руброфития относится к широко распространенным заболеваниям. Источником инфекции является больной человек. Нередко встречаются ассоциации красного трихофитона с плесневыми грибами, кандидами, бактериальной флорой. Исследованию при руброфитии подвергают чешуйки кожи, соскобы из глубоких слоев ногтя. Микроскопический метод позволяет найти в нативных препаратах споры и мицелий гриба, однако требует подтверждения выделением чистой культуры гриба. Микологический метод - посев на плотную среду Сабуро с целью выделения культуры руброфитона. Сначала на среде образуются белые пушистые (реже кожистые или мучнистые) колонии, которые через 1-2 недели приобретают ярко-красный цвет. При микроскопии культуры обнаруживают тонкий мицелий, микроконидии грушевидной, реже овальной и палочковидной формы. Эпидермофития паховая. Возбудитель - Epidermophyton floccosum. Паховая эпидермофития относится к широко распространенным и весьма контагиозным заболеваниям, которым чаще болеют мужчины. Поражается кожа паховых и межъягодичных складок, реже — подмышечных складок и под молочными железами, в ряде случаев – ногти. Диагностика проводится микроскопическим методом и выделением культуры гриба. При микроскопическом исследовании соскоба пораженных участков кожи обнаруживают переплетенные разветвляющиеся короткие (2-4мкм) нити мицелия и артроспоры прямоугольной формы в виде цепочек. 134 Микологический метод - на среде Сабуро вырастают округлые, куполообразные или плоские колонии, часто с углублением в центре. Поверхность колоний мучнистая, отмечается их радиальная складчатость, цвет - серый или желтовато-зеленый. При микроскопии культуры обнаруживают септированный мицелий с характерными макроконидиями, напоминающими связки бананов или дубинки. Эпидермофития стоп. Микоз стоп может вызывать также Trichophyton interdigitale (T.mentagrophytes var. interdigitale). Заболевание весьма распространенное, передается от человека человеку чешуйками с пораженных участков кожи или ногтей больного. Микроскопический метод диагностики эпидермофитии позволяет определить в нативных препаратах из материала от больного нити мицелия и споры гриба (рис. 36). Микологический метод. Возбудитель эпидермофитии образует на среде Сабуро быстро растущие разнообразные по культуральным характеристикам колонии (бархатисто-мучнистые, пушистые, ровные, куполообразные, складчатые или бугристые). Цвет колоний обычно белый, однако встречаются желтые, розовые, красные, коричневые колонии. При микроскопичеком исследовании культур находят длинный ветвистый септированный мицелий, на концах которого Рис. 36. Элементы гриба (нити мицелия и споры гриба) в чешуйках кожи при эпидермофитии расположены длинные завитки и спирали, а также полиморфные хламидоспоры. Обильные Микроконидии, диаметром 2-Змкм, располагаются в обилии по бокам мицелия и на его концах, часто располагаясь гроздьями. Макроконидии выглядят характерно: размерами 20-З0х5-7 мкм, разделены поперечными перегородками на 5-6 клеток, средние из которых наиболее широкие. ТРИХОМИКОЗЫ Трихофития Повсеместно распространенное заболевание, вызываемое антропофильными и зоофильными трихофитонами различных видов. Инфицирование происходит через пораженные грибами волосы, чешуйки кожи и разрушающиеся ногтевые пластинки. Чаще болеют дети. При поверхностной трихофитии поражается гладкая кожа и волосистая часть головы, при хронической могут также поражаться ногти, глубокие слои кожи, внутренние органы. Пораженные трихофитонами волосы короткие (1-2мм и короче), беловатые, сухие, ломкие, выглядят в виде черной точки или запятой, находятся в мелкой чешуйке. Наиболее часто среди антропофильных трихофитонов встречаются Trichophyton tonsurans и T.violaceum, среди зофильных - T.mentagrophytes. 135 Микроскопический метод. При микроскопии нативных препаратов гриб в пораженном волосе встречается в виде спор и мицелия. Размеры и расположение спор является важным моментом в дифференциации различных видов гриба. По отношению к волосу трихофитоны подразделяют на 3 группы: endothrix (обычно антропофильные трихофитоны, вызывающие поверхностную трихофитию) - крупные круглые споры расположены только внутри волоса и не выходят за его пределы, напоминая пробирку, заполненную горохом; ectothrix (обычно зоофильные трихофитоны, вызывающие глубокую трихофитию) - крупные или мелкие споры несколькими слоями окружают волос и его основание, создавая широкий (у крупноспоровых) или более узкий (у мелкоспоровых) чехол; neoendothrix, когда гриб располагается и в волосе, и вне его. Наряду со спорами, в пораженном волосе встречаются цепочки из округлых спор, изредка – нити мицелия. Микроскопия соскоба пораженных участков кожи позволяет обнаружить нити мицелия, а также цепочки и кучки круглых или овальных спор диаметром 4-5мкм. В ногтевых пластинках элементы гриба имеют вид ветвящегося мицелия, цепочек из округлых и многогранных спор, а также крупных (5-8мкм) двухконтурных клеток. Микроскопический метод позволяет быстро поставить диагноз трихофитии и отдифференцировать зоофильные трихофитоны от антропофильных, что имеет важное практическое значение. При необходимости при трихофитии выполняется культуральное исследование. Микологический метод. На среде Сабуро рост T.tonsurans появляется на 4-5-й день, колонии гриба плотные, морщинистые, крупноскладчатые с пупкообразным или вдавленным центром (наподобие кратера вулкана) или же плоские, сухие, изрезанные. Поверхность колонии покрыта порошком наподобие пудры, колонии окрашены в различные цвета - от бело-серого до желтого и коричневого. При микроскопии культуры находят микроконидии, длиной 3-7мкм, реже макроконидии, мицелий. Колонии T.violaceum на среде Сабуро появляются только к 3-4 неделе. Поверхность колонии складчатая, кожистая, маслянистая или матовая с хорошо ограниченными краями, диаметр - 2,5-3,0 см, цвет от фиолетового до бледно-сиреневого, иногда окраска отсутствует. Микроскопия культуры гриба дает возможность выявить септированный мицелий длиной 24мкм, а также хламидоспоры. Из зоофильных трихофитонов наибольшее значение имеет вид T.mentagrophytes. Колонии на среде Сабуро появляются на 2-3 день после посева, колонии плоские, поверхность порошкообразная или изрезанная. Цвет колоний белый, кремовый, реже красно-коричневый. При микроскопии обнаруживают ветвящиеся нити септированного мицелия, закрученные в спирали или в виде штопора, округлые или реже грушевидные микроконидии, располагающиеся вдоль гиф в виде гроздьев. Макроконидии многокамерные (от 2 до 8 камер), размером от 8 до 4050мкм. В старых культурах обнаруживаются хламидоспоры. Методы генодиагностики. Разработаны методы ПЦР-диагностики трихофитии. Микроспория. Возбудителями микроспории чаще всего являются зоофильный гриб Microsporum canis, вызывающий заболевание у кошек, собак и человека, а также антропофильный гриб M.ferrugineum. Люди (чаще дети), заражаются от больных бродячих животных или больных людей. Поражаются кожа, волосы и очень редко ногти. При микроспории, вызванной зоонозными видами гриба, на волосистой части головы возникает крупный очаг, в котором волосы обломаны на высоте 5-8мм над поверхностью кожи. В очагах поражения имеются и непораженные волосы. Рядом с крупным очагом видны множественные мелкие очаги. Вокруг пеньков волос имеется чехол из спор гриба. При микроспории, вызванной антропонозными видами гриба, на гладкой коже появляются четко отграниченные множественные кольцевидные шелушащиеся очаги розового цвета. признаком Для микроспории характерно появление зеленого свечения пораженных волос при лю- 136 минесцентном освещении очага поражения в темном помещении. Лабораторная диагностика микроспории включает следующие методы исследования. Микроскопический метод. Пораженный при микроспории волос характеризуется наличием многочисленных мелких круглых спор гриба, диаметром 2-З мкм, сплошь окружающих волос в основании и тесно прилегающих друг к другу в виде мозаики. Внутри волоса можно обнаружить септированный мицелий. В чешуйках пораженной кожи или в ногте мицелий гриба выглядит в виде тонких ветвящихся септированных нитей. Споры гриба в пушковом волосе располагаются мозаично, вне волоса или же по типу эндотрикса, сплошь заполняя волос параллельными цепочками из мелких спор. Микологический метод состоит в посеве исследуемого материала на среду Сабуро или другие среды для грибов. Колонии М.canis крупные, серого цвета или белые, мучнистые или пушистые. Мицелий напоминает ствол бамбука, состоит из утолщенных на одном конце клеток ракетообразной формы. Имеются многоклеточные макроконидии в виде веретена, покрытые ворсистой оболочкой, небольшое количество микроконидий, округлые хламидоспоры; концы мицелия заканчиваются образованиями, напоминающими гребешки. Рост M.ferrugineum характеризуется появлением плоских, бугристых или кожистых куполообразных изрезанных на сектора колоний желтого, коричневого, реже красного цвета. Могут встречаться желтые строчковидные, восковидные, а также беловато-мучнистые мелкобугристые или складчатые колонии. В культурах обнаруживают широкий мицелий, хламидоспоры, цепочки из полиморфных клеток. Макроконидий, как правило, нет, микроконидии встречаются редко. Фавус (парша). В настоящее время этот микоз встречается крайне редко. Возбудителем в подавляющем большинстве случаев является гриб Trichophyton schonleini (Achorion schonleini). Источником заражения людей (чаще всего детей), является больной фавусом человек, пути заражения - прямой контакт или через загрязненные предметы (расчески, полотенца и т.д.). При фавусе поражаются гладкая кожа, волосы и ногти. Характерным элементом являются скутулы - круглые, плоские или в виде блюдечка образования желтого цвета, 2-3 см в диаметре, крошковидной консистенции, плотно спаянные с кожей и состоящие из элементов гриба, а также поврежденных клеток эпидермиса. Скутулы могут сливаться друг с другом, при этом образуются корки зеленовато-желтого или желто-бурого цвета. Характерным признаком фавозных скутул является их «амбарный», или «мышиный» запах. Пораженные грибом волосы сухие, мутные, серого цвета, спаяны в толще скутулы. Крайне редко поражаются при фавусе лимфатические узлы, легкие, слизистая кишечника, кости и мозг. Применяются следующие методы лабораторной диагностики фавуса. Микроскопический метод. При фавусе элементы гриба полиморфны - наряду с тонким (2-Змкм) септированным мицелием встречается более широкий (4-6мкм) мицелий, распадающийся на прямоугольные клетки с двухконтурной оболочкой, а также цепочки и кучки из круглых и многогранных спор, при этом волос никогда не заполняется элементами гриба сплошь. Наличие пузырьков воздуха и капелек жира не является характерным признаком микоза. В зрелой скутуле находят большое количество крупных многогранных и округлых спор, расположенных кучками или короткими цепочками; клеточных элементов кожи почти не видно. В пораженных ногтевых пластинках элементы гриба расположены неравномерно в виде одиночных клеток или нитей мицелия или в виде ветвящегося мицелия в большом количестве с цепочками или кучками полиморфных спор. Микологический метод – выделение чистой культуры гриба на среде Сабуро. Колонии Trichophyton schonleini на этой среде сначала гладкие, желтовато-белые, затем высокие, похожи на строчок или губку, коричневого цвета, крошковидной консистенции. Описаны также кратерообразные, гипсовидные, складчатые, бархатисто-мучнистые колонии. При микроскопии культур обнаруживают септированный мицелий с ветвлениями в виде рогов северного оленя или канделябров, на концах которого расположены крупные округлые хламидоспоры, а 137 также тупоконечные длинные и широкие веретенообразные образования. Кроме того, встречаются булавовидные вздутия и широкие сплющенные клетки, похожие на шляпку гвоздя («фавозные гвозди»), и крупные грушевидные микроконидии, располагающиеся кучками по бокам и на концах мицелия или вне его. Лабораторная диагностика поверхностных микозов При поверхностных микозах (кератомикозах) патологический процесс локализуется преимущественно в поверхностных слоях эпидермиса, не вызывая при этом видимой воспалительной реакции в дерме. В эту группу входят следующие микозы. Разноцветный лишай (отрубевидный лишай). Возбудителем является дрожжеподобный гриб Pityrosporum orbicutare (Malasseria furfur). Заболевание чаще возникает у лиц молодого возраста при чрезмерной потливости, при сахарном диабете, ожирении, длительной лихорадке. Очаги поражения локализуются на коже груди, спины, живота, шеи, плечах, проявляясь в виде коричнево-красных пятен, сопровождающихся шелушением. Диагностика проводится микроскопическим методом. В нативных препаратах соскоба кожи элементы гриба в чешуйках рогового слоя выглядят в виде коротких нитей мицелия, а также скоплений округлых почкующихся клеток с толстой стенкой, размером до 8мкм в диаметре. При посеве материала от больного на среду Сабуро при на 4 -8-й день культивирования при температуре 37 0 С появляются белые или кремовые колонии с блестящей поверхностью, состоящие из почкующихся дрожжеподобных клеток. Черный микоз (кладоспориоз). Возбудитель - Cladosporium werneckii вызывает появление на коже ладоней или подошв светло-коричневых или черных пятен, шелушение отсутствует. При микроскопии нативных препаратов элементы гриба обнаруживаются в роговом слое эпидермиса в виде коричневого ветвящегося септированного мицелия и почкующихся клеток. Пьедра. Заболевание кутикулы волоса, характеризующееся образованием на волосе узелков белого или черного цвета. Белая пьедра (трихоспороз), встречается в виде спорадических случаев в странах с умеренным климатом, возбудителем является Trichosporon beigelii (Trichosporon cutaneum). При микроскопии пораженных волос находят мицелий и артроспоры, прямоугольной, овальной или круглой формы, а также скопления спор. Узелки локализуются на волосах подмышечной и паховой областей, на бороде и волосистой части головы. Черная пьедра, наоборот, встречается в странах с жарким климатом. Возбудитель — Piedraia hortai — имеет аски, в которых находятся от 2 до 8 аскоспор размером от 5 до 80мкм. Лабораторная диагностика микозов, вызываемых условно-патогенными грибами (оппортунистические микозы) Условно-патогенные грибы обычно являются сапрофитами, обитающими во внешней среде, а также на коже и слизистых оболочках человека. Оппортунистические микозы возникают при длительном контакте человека с возбудителем, на фоне иммунодефицита, нерациональной антибиотико- и химиотерапии, приводящей к дисбактериозу и т. д. Некоторые грибы в благоприятных для них условиях способны размножаться в пищевых продуктах (например, в злаках) и накапливать сильнодействующие микотоксины, вызывающие тяжелые пищевые отравления (алиментарные микотоксикозы). Кандидоз (кандидамикоз) Возбудителями кандидоза – повсеместно распространенного заболевания являются дрожжеподобные грибы рода Candida (наиболее часто встречается вид Candida albicans, реже Candida tropicalis, Candida pseudotropicalis, Candida krusei, Candida glabrata и т.д.). Кандидоз относится к типичным аутоинфекциям, проявляясь избыточным ростом дрожжеподобных грибов, заселяющих кожу, ногти, слизистые оболочки, внутренние органы. Обычно это заболевание возникает при патологии, связанной с формированием иммунодефицита (сахарный диабет, другие эндокринные болезни, гипо- и авитаминозы, иммунодепрессивная и лучевая терапия, СПИД и т.д.), при дисбактериозе, обусловленном длительным приемом антибиотиков. Наиболее подвержены кандидозу дети и старики. 138 Выделяют поверхностный кандидоз слизистых оболочек, кожи, ногтевых валиков и ногтей. Кандидоз слизистых оболочек полости рта или влагалища (молочница) характеризуется появлением белого налета, напоминающего свернутое молоко Хронический генерализованный кандидоз обычно развивается у детей с иммунодефицитными состояниями, имеет медленно прогрессирующее течение с возникновением пневмоний, гастритов, гепатитов и др. При висцеральном кандидозе поражаются желудочно-кишечный тракт, органы дыхания, мочевыделительная система, ЦНС. Аллергические формы кандидоза развиваются на фоне имеющегося первичного очага кандидомикоза в результате сенсибилизация организма, при этом могут возникать новые очаги воспаления, в которых возбудитель отсутствует. Материалом для исследования при кандидозе являются чешуйки кожи и соскоб с ногтей, отделяемое и пленки со слизистой оболочки губ, полости рта, влагалища, мочеиспускательного канала, наружного слухового прохода, а также с конъюнктивы. При висцеральном кандидозе исследуют кровь, спинномозговую жидкость, мокроту, испражнения, мочу, желчь, мазки со слизистых оболочек, биоптаты тканей, пунктаты абсцессов, секционный материал. Лабораторная диагностика кандидоза включает микроскопию нативных препаратов, выделение чистой культуры гриба, обнаружение в материалах антигенов или нуклеиновых кислот, постановку серологических реакций, аллергических проб. Микроскопический метод - изучение неокрашенных и окрашенных по Граму, Романовскому-Гимзе, Цилю-Нильсену препаратов из исследуемого материала, в которых обнаруживают круглые или овальные почкующиеся дрожжеподобные клетки, размером от 3-6 мкм, и псевдомицелий в виде цепочек удлиненных клеток (рис. 37). Некоторые виды дрожжеподобных грибов (C.albicans) образуют терминальные хламидоспоры. По Граму грибы рода Candida окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, по Цилю-Нильсену - в синий с розово-желтыми включениями липидов, по Романовскому-Гимзе — в розовато-желтый цвет с темно-фиолетовыми включениями волютина и красным хроматиновым веществом. Микологическое исследование. Выделение чистой культуры дрожжеподобных грибов производят на плотных средах (обычно среде Сабуро, сусло-агаре, Кандида-агаре или др.) с добавлением антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и т.д.) для подавления роста сопутствующих бактерий. Через 2-3 дня культивирования при 30-370 С образуются круглые, диаметром до 1 см, выпуклые сметанообразные гладкие колонии белого цвета с ровными краями и глубоким врастанием в среду ветвистого древовидного псе вдомицелия. Выделенную чистую культуру пересевают в жидкие среды ( картофельную, кукурузную среды, морковно-картофельный отвар и др.) для выявления псевдомицелия, появляющегося обычно на 3-5 день культивирования (реже на 10-15 день и позже) В жидких питательных средах Candida образуют равномерное помутнение, осадок или пленку на поверхности среды. Наряду с псевдомицелием, у этих грибов можно найти истинный мицелий и хламидоспоры (крупные двухконтурные споры с зернистым содержимым) при посеве на рисовый или Хламидоспор-агар с последующим культивированием гриба в условиях пониженной температуры и концентрации кислорода.. 139 Рис. 37. Возбудитель кандидамикоза (Candida albicans) в исследуемом материале Бластоспоры (почки) у дрожжеподобных грибов рода Candida располагаются нерегулярно по обеим сторонам мицелия, хламидоспоры круглые, крупные (10-20мкм), двухконтурные. C.albicans сбраживает глюкозу, мальтозу, левулезу и частично галактозу; молоко не изменяет. Идентификация дрожжеподобных грибов рода Candida до уровня вида основывается на определении типа филаментации, наличия хламидоспор, ферментативной активности (табл. 24). Таблица 24. Сахаролитические свойства дрожжеподобных грибов рода Candida. Вид гриба Candida albicans Candida tropicalis Candida pseudotropicalis Candida krusei глюкоза кг кг кг мальтоза кн кг - Сахара лактоза кг кг - кг галактоза кг кг кг сахароза кг кг - - Обозначения: кг – расщепление субстрата с образованием кислоты и газа Характерным дифференциальным признаком, отличающим вид С. Albicans от других видов дрожжеподобных грибов рода Candida, является их способность образовывать ростовые трубки - трубкообразные выросты бластоспор (признак РТ). Для этого часть колонии грибов переносят в 0,5 мл стерильной сыворотки теленка, пробирки помещают в термостат при 370 С на 2,5-3,0 часа, после чего готовят препарат раздавленной капли и микроскопируют под большим увеличением микроскопа (объектив х40). У ростовых трубок отсутствует перемычка или сужение на месте соединения с бластоспорой, они тоньше, чем удлиненная бластоспора или псевдомицелий у С. tropicalis. Для дифференциации с другими грибами у культур дрожжеподобных грибов определяют наличие капсулы и уреазы (у кандид они отсутствуют), определяют способность ассимилировать и ферментировать углеводы (глюкозу, мальтозу, сахарозу, галактозу и др.). Для быстрой идентификации С. albicans разработаны специальные диски с хромогенными субстратами, позволяющие выявить специфичные для этого вида грибов ферменты Lпролинаминопептидазу и 3-галактозамидазу. На диск наносят суточную культуру гриба, инкубируют 30 мин при 35 °С, затем добавляют 1 каплю 0,3%-го раствора гидроксида натрия. Появление желтого окрашивания свидетельствует об активности L-пролинаминопептидазы. Затем добавляют 1 каплю коричного альдегида; развитие в течение 1 мин розово-красного окрашивания 140 свидетельствует о наличии 3-галактозамидазы. Положительный тест на оба фермента в сочетании с наличием ростовых трубок считаются достаточными для идентификации С. albicans. Серологический метод (постановка РСК, РА, ИФА. РНГА, ВИЭФ и др. с парными сыворотками крови больных с целью определения специфических антител) обычно проводится при висцеральных формах кандидоза. Результаты исследования считают положительными при нарастании титра антител более чем в 4 раза в динамике заболевания. Для РА используются корпускулярные антигены, для РСК очищенные полисахариды, лизаты или ультразвуковые дезинтеграты дрожжеподобных грибов. Аллергологический метод (преимущественно у больных висцеральным кандидозом) - постановка внутрикожной аллергической пробы со стандартным кандидозным аллергеном, представляющим взвесь клеток грибов, прогретую при 800 С в течение 2 ч. Результаты реакции (гиперемия, папула) учитывают через 24 — 48 ч. В связи с широким распространением сенсибилизации к антигенам грибов аллергопроба имеет ограниченное диагностическое значение. Генодиагностика - разработана ПЦР для инидикации видоспецифического фрагмента ДНК С. albicans. Другие оппортунистические микозы К возбудителям этих заболеваний относят условно-патогенные грибы родов Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Rhiiomucor, Pneumocystis и др. Они вызывают преимущественно у лиц с иммунодефицитом широкий спектр заболеваний, варьирующих по остроте, локализации, тяжести процесса и клиническим проявлениям, вплоть до системных инфекций, угрожающих жизни. Плесневые микозы наиболее часто встречаются у работников элеваторов, пивоваренных, мукомольных, комбикормовых заводов при контакте с заплесневелым зерном, у рабочих силикатной промышленности, ткацких и шпагатно-веревочных фабрик и др. Афлатоксикоз возникает в результате употребления в пищу зерна, орехов и других пищевых материалов, содержащих сильнодействующие афлатоксины в результате вегетации грибов рода Aspergillus. Материалом для исследования при оппортунистических микозах являются мокрота, гной, кусочки тканей из пораженных органов и др. Аспергиллез Грибы рода Aspergillus обитают и развиваются на органических субстратах в почве, а также на растениях. Споры аспергилл постоянно находятся в воздухе, а из него попадают на продукты питания, предметы обихода, наружные покровы и слизистые человека. Наиболее часто аспергиллеза вызывает вид A.fumigatus, реже - A.flavus, A.niger, A.nidulans. Некоторые виды аспергилл (Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus) продуцируют афлатоксины, обладающие высокой токсичностью и канцерогенностью. . Заражение происходит, как правило, аэрогенным, реже алиментарным и еще реже контактным путем в результате повреждения кожи или слизистых оболочек и попадания на них спор гриба. Аспергиллез может возникать как типичная аутоинфекция в результате активации аспергиллов, обитающих в организме человека. Больные аспергиллезом люди не заразны для окружающих. Аспергиллез обычно развивается вторично при каком-либо хроническом заболевании на фоне иммунодефицита; у здорового человека первичный аспергиллез возникает только при попадании в организм массивных доз плесени. Чаще всего при этом заболевании поражается бронхолегочная система (аспергиллома легких, трахеобронхит), реже - наружное ухо, слизистая оболочка и придаточные пазухи носа, а также миндалины. Иногда наблюдается гематогенное распространение инфекции с развитием генерализованной формы, при которой поражаются различные внутренние органы (головной мозг, печень и т.д.), а также глаза. При использовании пищевых продуктов или кормов, содержащих афлатоксины, продуцируемые некоторыми штаммами A.flavus и A.parasiticus, развиваются афлатоксикозы. Микроскопический метод – исследование нативных мазков из патологического материала, в которых находят характерный для гриба септированный мицелий, толщиной 4-6 мкм, а также типичные конидиальные головки (рис. 38). Основанием для постановки диагноза аспергиллеза является обнаружение мицелия и характерных органов спороношения гриба (кони141 диеносцев) в окрашенных срезах биоптатов тканей, особенно в тех случаях, когда они взяты из закрытых полостей или невскрывшихся абсцессов. Рис. 38. Возбудитель аспергиллеза (Aspergillus fumigatus) в исследуемом материале. Микологический метод. Является наиболее достоверным методом в лабораторной диагностике аспергиллеза, особенно при выделении культуры возбудителя в результате исследования биоптатов или пунктатов из закрытых очагов поражения (абсцессы, воспалительные участки тканей). Диагностическое значение имеет также повторное обнаружение одного и того же вида гриба в значительных концентрациях, сочетающееся с клинико-эпидемиологическими, патоморфологическими и иммунологическими данными. Аспергиллы являются аэробами, они хорошо растут на среде Сабуро при температуре 230 26 С. Морфология колоний зависит от вида аспергилл, обычно колонии бархатистые, пигментированные. При микроскопическом исследовании культуры обнаруживают септированный мицелий, от которого перпендикулярно отходят ответвления — конидиеносцы, на концах которых имеются вздутия с выростами (стеригмы) с гладкими или шероховатыми, округлой или овальной формы конидиями, окрашенными в светлые или темные тона, определяющими цвет колонии. У видов аспергилл, обладающих половым путем размножения, образуются аскоспоры, находящиеся в специальных сумках - асках. Серологический метод. Для выявления антител в сыворотке крови применяют РП, РСК, ИФА и др. Диагностическое значение имеет также резко повышенный титр IgE в сыворотке крови больного. Аллергический метод - постановка внутрикожной аллергической пробы с соответствующими аллергенами из аспергилл используется как вспомогательный метод диагностики аспергиллеза. Аспергиллы можно проверять на токсигенность путем заражения морских свинок или кроликов, но чаще афлатоксины идентифицируют в экстрактах хроматографическими методами. Разработаны методы ПЦР-диагностики оппортунистических микозов (аспергиллеза и др.). Пенициллиоз К возбудителям пенициллиоза относят Penicillium marneffei, реже — другие виды Penicillium. Возбудителями зигомикоза (мукороза, мукоромикоза) являются Absidia corymbifera, Rhizomucor pussillus, Rhizopus arrhizus, Rhizopus microsporus и другие грибы. Фикомикоз (мукороз) 142 Возбудителями фикомикоза (мукороза) являются различные виды грибов родов Rhizopus, Mucor, Absidia, входящих в семейство Мисоrасеае класса Phycomycetes (Zygomycetes). Они широко распространены в природе, обитая в почве, навозе, воздухе, на гниющих частях растений, плодов и др. Фикомикоз - сравнительно редкое заболевание. Описано более 200 видов семейства Мисоrасеае, однако лишь немногие из них вызывают фикомикоз. В организм человека споры проникают аэрогенным, реже — алиментарным путем, их можно обнаружить на слизистой носа, на коже. Фикомикоз не заразен и от человека человеку не передается. Заболевание, как правило, развивается вторично у лиц с иммунодефицитами, при сахарном диабете, обширных ожогах, лейкозах, лимфомах и т.д. Зигомицеты проникают через стенки кровеносных сосудов и размножаются внутри сосудов, вызывая развитие тромбоза. Это происходит чаще всего в легких, пазухах носа, желудочно-кишечном тракте и приводит к возникновению ишемического некроза в окружающих тканях с образованием интенсивного полиморфноядерного инфильтрата. При гематогенной диссеминации может развиваться менингоэнцефалит. Применяются следующие методы лабораторной диагностики. Микроскопический метод. В нативных препаратах из мокроты и гноя обнаруживаются элементы гриба - широкие несептированные нити мицелия неравномерной толщины, можно найти также спорангии. В гистологических препаратах также находят части гриба (мицелий, реже спорангии), располагающиеся в тромбированных сосудах или синусах, и окруженные скоплениями лейкоцитов и гигантских клеток (рис. 39). Микологический метод. Грибы этого семейства являются аэробами, хорошо растут при температуре 22-370 С на среде Сабуро. Колонии обычно пушистые, сначала белые, затем темно-серые или бурые. От хорошо развитого несептированного мицелия отходят длинные (до 5мм) спорангиеносцы и ризоиды (Rhizopus nigricans), с помощью которых мицелий прикрепляется к субстрату, а также сплетающиеся в виде войлока спорангиеносцы (Mucor mucedo). Спорообразование эндогенное, споры одноклеточные, шаровидные или овальные, образуются в шаровидных или грушевидных спорангиях, диаметром до 200 мкм. Спорангий находится на конце спорангиеносца (ножки), от которого отделяется перегородкой, от последней внутрь спорангия отходит выпячивание — столбик шаровидной, грушевидной или яйцевидной формы. У некоторых грибов этого семейства воздушный мицелий имеет вид дугообразно изогнутых пучков гиф — столонов. Рис. 39. Возбудитель мукороза (Mucor mucedo) в исследуемом материале 143 Пневмоцистоз Возбудитель пневмоцистоза (Pneumocystis carinii) является дрожжевым грибом, входящим в состав класса Blastomycetes. Пневмоцисты широко распространены в природе среди грызунов (крысы, мыши) и домашних животных (собаки), встречаются у чел овека, однако обычно у здоровых людей заболевания не вызывают. Непременным условием развития пневмоцистоза является иммунодефицит (в частности, СПИД), при котором в р езультате аэрогенного заражения гриб вызывает интерстициальную пневмонию. Типичной структурой гриба является «розетка» из 8 грушевидных спорозоитов, размерами 1-2мкм, в виде цистоподобной структуры диаметром 7-10мкм. Ранние стадии развития гриба представлены слизистыми шаровидными структурами с 1 -4 ядрами (пневмоцисты). Оболочка пневмоцист при окраске по Романовскому-Гимзе окрашивается в красно-фиолетовый цвет, цитоплазма – в голубой, а ядра - в красный. Пневмоцисты, окруженные пенистым веществом и скоплениями плазматических клеток с эозинофилами, в обилии находятся в легочных альвеолах и бронхиолах (рис. 40). Возбудитель пневмоцистоза не культивируется на искусственных питательных средах и в различных биосистемах (культуры клеток, куриные эмбрионы, лабораторные ж ивотные), что значительно сужает возможности лабораторного подтверждения этой и нфекции. В практической работе единственным методом лабораторной диагностики этой инфекции является микроскопический (исследование мокроты больного или секционн ого материала на наличие пневмоцист при окраске препаратов по Романовскому-Гимзе). Рис. 40. Возбудитель пневмоцистоза (Pneumocystis carinii) в исследуемом материале. Самостоятельная работ студентов Лабораторная диагностика эпидермомикозов. 1. Микроскопический метод – исследование материала от больного (пораженные волосы, ногти, чешуйки кожи) с целью обнаружения мицелия гриба и спор. Для более четкого выявления элементов гриба производят просветление материала. Для этого на предметное стекло наносят каплю 20% едкой щелочи, в которую помещают пинцетом патологический материал и слегка подогревают над пламенем спиртовки, не доводя до кипения. Затем каплю накрывают покровным стеклом и микроскопируют, используя малое и большое увеличение. При поверхностной и хронической трихофитии элементы гриба (в основном споры), цепочками располагаются внутри волоса по типу "эндотрикс". Границы волоса четкие, споры округлые, за пределы волоса не выходят, напоминая пробирку, заполненную горохом. При инфилътративно-нагноительной трихофатии споры грибов располагаются цепочками снаружи волоса - "экзотрикс". Контуры волоса нечеткие, смазанные. При микроспории волос 144 окружен чехлом из мозаично расположенных мелких спор, внутри волоса обнаруживаются фрагменты гриба в виде нитей мицелия и споры. При эпидермофитии и рубромикозе элементы гриба (септированные нити мицелия, споры) содержатся в чешуйках кожи. 2. Микологический метод. Исследование проводится для установления родовой и видовой принадлежности возбудителя путем выделения чистой культура гриба и его идентификации на основании макро- и микроскопического строения. Производен посев патологического материала на агар Сабуро с добавлением антибиотиков. Посевы инкубированы при температуре 280 С в течение 1-2 недель. Изучают культуральные свойства грибов, отмечая при описании внешнего вида колоний их вид, консистенцию, цвет. Колонии дерматофитов разнообразные: кожистые, пушистые, мучнистые, бугристо-складчатые в центре с радиальными бороздами по периферии у грибов рода Trichophyton, бархатисто-ворсистые у грибов рода Microsporum; сухие, порошковидные, бархатистоворсистые у грибов рода Epidermophyton. После осмотра колонии изучают при малом увеличении микроскопа или в стереомикроскопе. Отмечают наличие или отсутствие воздушного мицелия, расположение конидиеносцев, общее строение конидиеносного (спороносного) аппарата, расположнение спор. 3. Изучить препараты, используемые для лечения дерматомикозов: низорал, ламизил, гризеофульвин, препараты йода, миконазол, орунгал и др. Лабораторная диагностика кандидозов. 1. Микроскопический метод. Промикроскопировать мазки из пораженных участков слизистой оболочки полости рта, окрашенные метиленовым синим, обратить внимание на форму, окраску клеток гриба, на наличие псевдомицелия и бластоспор (клетки-почки, находящиеся на перетяжках псевдомицелия) хламидоспор (споры с двойной оболочкой), гломерул (скопления бластоспор по ходу мицелия в местах его сочленения), вертицилл (мутовок боковых ветвлений). 2. Микологический метод. изучить характер роста грибов рода Кандида на сусло-агаре (колонии гриба гладкие, блестящие, сметанообразной консистенции или морщинистые, матовые). Произвести учет сахаролитических свойств дрожжеподобных грибов. 3. Серологический метод (выявление специфических антител в парных сыворотках крови больного кандидозом). Диагностически значимым считают нарастание титров антител в 4 раза и более. учет РСК с парными сыворотками больного кандидозом (7 и 17 дни болезни). Диагностикум - полисахаридная фракция грибов рода Кандида. учет РА с парными сыворотками крови больного кандидозом. В качестве антигена используют взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия культуры гриба плотностью 2 млрд, микробных тел в 1 мл. 4. Изучить препараты, используемые для профилактики, диагностики и лечения кандидоза: кандидозный антиген 2-х суточной культуры грибов рода Candida в изотоническом расгворе хлорида натрия, кандидозный антиген - спиртовой экстракт из культуры грибов Candida, применяется для постановки РСК и кожной аллергической пробы, антибиотики: нистатин, леворин, клотримазол, маконазол. Лабораторная диагностика глубоких микозов. 1. Иммунофлюоресцентный метод. Срезы пораженных тканей обрабатывают люминесцирующей сывороткой, содержащей антитела против гриба, меченные флюорохромом. Положительный результат характеризуется наличием ярко люминесцирующего ободка по периферии клетки гриба (демонстрация). 2. Серологический метод (определение антител к возбудителям глубоких микозов в сыворотке крови больных с подозрением на глубокий микоз): учет реакции латекс-агглютанации при криптококкозе , учет РСК с парными сыворотками больного гистоплазмозом. (диагностический титр 1:8). 145 4. Изучить препараты, используемые для диагностики и лечения глубоких микозов: гистоплазмин, бластомицин, амфотерицин В, миконазол. Лабораторная диагностика плесневых микозов. 1. Микологический метод. Макро- и микроскопическое изучение культур плесневых грабов и на основании морфологических свойств определение их родовой принадлежности. При исследовании культуры мукоровой плесени обратить внимание на наличие несептированного мицелия, от которого отходит несептированный спорангиеносец с шаровидным расширением наверху - спорангием, который заполнен эндоспорами. У плесеней рода Aspergillus нити несептированного мицелия, переплетаясь друг с другом, образуют густую грибницу, от которой отходят одноклеточные конидиеносцы, заканчивающиеся веерообразным расширением (стеригмы со спорами - конидиями). У пеницилловых плесеней Penicillium от грибницы отходят септированные конидиеносцы, заканчивающиеся в виде кисточки из стеригм и конидий 2. Серологический метод: выявление антител с помощью РНГА в парных сыворотках крови больного аспергиллезом. Педиатрические аспекты темы У детей чаще, чем у взрослых встречается такие дерматомикозы как микроспория, трихофития, фавус (парша). Дети нередко заражаются от домашних животных (кошек и собак). У новорожденных детей часто встречается первичный кандидоз в виде молочницы. Обсеменение грибами рода Candida происходит при прохождении ребенка через родовые пути матери, а также через предметы окружающей среды. При наличии у детей молочницы и одновременно других инфекционных заболеваний антибактериальные антибиотики необходимо применять с большой осторожностью, комбинируя их с витаминами и антифунгальными препаратами (леворином, нистатином и т.д.). Кандидозы у детей старшего возраста являются, как правило, вторичным заболеванием. После изучения темы студент должен знать: характеристику возбудителей грибковых инфекций (микозов), а также принципы лабораторной диагностики, профилактики и лечения микозов. Изучив тему, студент должен уметь: трактовать результаты лабораторных исследований при микозах. Тема 18. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПРОТОЗОЙНЫХ ИНФЕКЦИЙ Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей протозойных инфекций - малярии, криптоспоридиоза, токсоплазмоза, трихомониаза, лямблиоза, амебиаза, балантидиоза, методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения. Перечень конкретных учебно-целевых вопросов 1. Плазмодии малярии. Морфология. Циклы развития. Патогенез малярии, иммунитет. Лабораторная диагностика. Профилактика. Препараты для лечения. 2. Токсоплазмы, бабезии, лямблии, лейшмании, трипаносомы, трихомонады, амебы, балантидии, микроспоридии. Морфология и культивирование. Патогенез. Лабораторная диагностика. Препараты для лечения. Профилактика. Основные методы лабораторной диагностики протозойных инфекций Микроскопический метод направлен на выявление паразитов в нативных и окрашенных препаратах. Материалом для исследования служат кровь, пунктаты грудины или лимфатических узлов, спинномозговая жидкость, соскоб с кожных элементов, фекалии, дуоденальное содержимое, отделяемое слизистой оболочки наружных половых органов или мочеиспускательного канала. Простейшие можно обнаружить как в мазках, так и в гистологических препаратах, изготовленных из пораженных тканей. Разработано значительное число методов окраски простейших, среди которых наиболее часто применяется метод Романовского-Гимза. Культуральный метод заключается в посеве исследуемого материала на среды, содержащие кровь или нативную сыворотку, яичный белок, углеводы, аминокислоты и другие вещества (рН сред 7,0-7,6). Культивирование большинства простейших осуществляют обычно при 370 146 С, лейшманий и трипаносом при 20-260 С. Результаты посевов учитывают визуально и микроскопическим методом ( препарат «раздавленная» капля) через 24, 48, 72, 120 часов. Дизентерийные амебы, балантидии, трихомонады, хиломастиксы проще выявить микроскопическими методами, однако при необходимости применяют культуральное исследование. Серологический метод при протозойных инфекциях имеет вспомогательное значение. Применяется РА (американский трипаносомоз), РП (американский трипаносомоз, амебиаз), РСК (американский трипаносомоз, токсоплазмоз, висцеральный лейшманиоз, амебиаз), РИФ (американский трипаносомоз, малярия, токсоплазмоз, висцеральный лейшманиоз, амебиаз), РНГА (токсоплазмоз), ИФА (токсоплазмоз, тропическая малярия, амебиаз, кожный и висцеральный лейшманиозы, американский трипаносомоз). Аллергический метод – кожные аллергические пробы применяются редко, обычно для подтверждения диагноза кожного лейшманиоза (проба с лейшманином, реакция Монтенегро) и токсоплазмоза (проба с токсоплазмином). Биологический метод (биопроба) применяется для подтверждения диагноза ряда протозоозов, а также в научных целях. Чувствительными животными для дизентерийных амеб и балантидий являются 2-3-недельные крысята, морские свинки, котята, щенки, золотистые хомячки; для лямблий — мыши; для лейшманий белые мыши и хомяки; для американских трипаносом - морские свинки; для африканских трипаносом – мартышки; для токсоплазм - белые мыши. Заражение животных осуществляют парентерально, в слепую кишку при лапаротомии, через длинный пластмассовый зонд или путем скармливания животным исследуемого материала. В течение 30 дней после заражения микроскопическому исследованию подвергают кровь животных, мазки-отпечатки из органов или гистологические препараты из пораженных тканей. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПРОТОЗОЙНЫХ ИНФЕКЦИЙ Малярия Возбудителями тропической малярии является Plasmodium falciparum, трехдневной малярии Plasmodium vivax, четырехдневной малярии - Plasmodium malariae и трехдневной или овалемалярии - Plasmodium ovale. Малярийные плазмодии претерпевают половой цикл развития в организме комара рода Anopheles и бесполый цикл (шизогония – рис.41) — в организме человека, поражая сначала клетки печени (тканевая шизогония), а затем эритроциты (эритроцитарная шизогония). Микроскопический метод. Кровь на наличие плазмодиев малярии исследуют на стадии эритроцитарной шизогонии путем микроскопии обычных мазков и толстой капли, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Плазмодии, цитоплазма которых окрашена в голубой цвет, а ядро в вишнево-красный, находят в эритроцитах. Бесполые (эритроцитарные) формы паразитов имеют некоторые морфологические особенности. В частности, мерозоит представляет собой круглую или овальную форму с небольшим участком цитоплазмы около ядра; кольцевидный трофозоит - одноядерную форма с узким ободком цитоплазмы, окружающим небольшую вакуоль; амебовидный трофозоит - одноядерную форму с различным количеством и величиной псевдоподий; шизонт содержит два или несколько ядер; морула характеризуется полным разделением ядра и цитоплазмы на мерозоиты. Половые формы плазмодиев (гаметоциты или гамонты) не содержат вакуолей и псевдоподий. Мужские (микрогаметоциты) и женские (макрогаметоциты) формы отличаются по величине и структуре ядра, интенсивности окраски цитоплазмы и размерам. При микроскопии тонкого мазка при малярии находят обычно кольцевидные трофозоиты. У P. vivax, P. malariae, P. оvale они имеют размеры от 2 до 4 мкм, занимают около 1/3 диаметра эритроцита. Ядра у трофозоитов P. vivax и P. malariae круглые, у P. ovale — неправильной формы, крупные; ободок цитоплазмы ровный, неширокий, суживается к ядру. Молодые кольцевидные трофозоиты P. falclparum мелкие (1,25-1,50 мкм), занимают примерно 1/6 часть диаметра эритроцита, имеют маленькое круглое ядро с тонким ободком цитоплазмы. Взрослые кольцевидные 147 трофозоиты более крупные, занимают 1/3 диаметра эритроцита, ободок цитоплазмы толстый, резко суживающийся к ядру. Амебовидные трофозоиты P. vivax отличаются разнообразием форм, размеров, наличием одной или нескольких псевдоподий, вакуолей, круглого или овального ядра, пигмента в виде темнокоричневых цитоплазматических зерен различной величины и формы. Амебовидные трофозоиты P. malariae округлые и овальные (нередко в виде ленты поперек эритроцита с продолговатым или вытянутым ядром), с короткими и широкими псевдоподиями, более темной цитоплазмой и пигментом, ядром неправильной формы.. Амебовидные трофозоиты P.falciparum в виде круглых или 148 Рис. 41. Основные стадии эритроцитарной шизогонии малярийных плазмодиев 205 овальных форм лишены вакуоли, имеют ядро круглой или неправильной формы, пигмент черного цвета, расположенный компактно, однако они, как правило, в периферической крови не обнаруживаются. Молодые трофозоиты P. ovale имеют кольцевидную форму, более взрослые сходны с P. malariae. Размеры шизонтов у возбудителей малярии увеличиваются по нарастающей в ряду P.vivax, P. ovale, P.falciparum. Морула P. vivax содержит обычно от 14 до 16 беспорядочно расположенных мерозоитов, между которыми лежат глыбки пигмента. В моруле P. malariae около 8 крупных мерозоитов, расположенных в виде розетки; в моруле P.falciparum 8-24 мелких мерозоитов, занимающих часть эритроцита; в моруле P. ovale около 8 крупных мерозоитов с ядром неправильной формы. Гаметоциты Р. vivax (крупные), P. malariae (мелкие) и Р. ovale округлой или овальной формы; глыбки пигмента крупные, равномерно расположены в цитоплазме гаметоцитов. В женских гаметоцитах у края цитоплазмы обнаруживают компактное ядро темно-голубого цвета. Расположенное центрально ядро мужских гаметоцитов розовато-фиолетового цвета, крупное, рыхлое. Гаметоциты этих видов плазмодиев появляются и исчезают из периферической крови вместе с трофозоитами. Гаметоциты P.falciparum имеют характерную полулунную форму с ядром, расположенным в средней части цитоплазмы (у женских форм оно небольшое и компактное, у мужских - крупное и рыхлое). Пигмент окружает ядро в виде коротких палочек. Стадия развития гаметоцитов P.falciparum в эритроците существенно превышает длительность шизогонии. Эти гаметоциты выявляются в периферической крови на 8-10 день после появления кольцевидных трофозоитов, продолжая поступать в кровь через несколько недель после их исчезновения на фоне отсутствия клинических симптомов малярии.. Эритроциты, пораженные P. vivax и P. ovale, увеличиваются в диаметре до 10-12 мкм, хуже окрашиваются по Романовскому —Гимзе; эритроциты, пораженные P. ovale, могут приобретать неправильную форму, иметь бахромчатый край. Морфология эритроцитов, содержащих P. malariae и P. falciparum, не меняется. В эритроцитах, содержащих P. vivax на различных стадиях развития, выявляются множественные мелкие азурофильные зерна (зернистость Шюффнера), при наличии в эритроцитах P. ovale зерна редкие и крупные (зернистость Джеймса), при обнаружении в эритроцитах кольцевидных трофозоитов P.falciparum можно выявить небольшое количество крупных азурофильных зерен (зернистость Маурера), а в тех случаях, когда возбудителем является P. malariae, в эритроцитах выявляют мелкую зернистость Циманна. Морфология возбудителей малярии в толстой капле. Кольцевидные трофозоиты P. vivax, P. ovale, P. malariae обычно имеют одинаковую величину, однако в толстой капле они часто дефор206 мируются, превращаясь в форму запятой или восклицательного знака; цитоплазма при этом концентрируется около ядра в виде округлого или треугольного комочка. Наряду с кольцевидными трофозоитами можно найти другие формы плазмодиев и определить вид возбудителя. Аналогичные превращения происходят и с кольцевидными трофозоитами P. falciparum, часть из которых сохраняет свою форму. Цитоплазма может разрываться, располагаясь с двух сторон от ядра в виде «крыльев ласточки», нередко находят раздвоенные ядра. На других стадиях развития плазмодии малярии в периферической крови обычно не выявляются. Для амебовидных трофозоитов P. vivax в толстой капле характерна деформация их цитоплазмы в виде двух или нескольких комочков, располагающихся около ядра. Трофозоиты P. malariae в мазке выглядят как компактные овальные или округлые образования с большим количеством пигмента. На стадии морулы различные виды плазмодиев имеют разное количество мерозоитов и форму морулы. У P. malariae в толстой капле морула сохраняет форму розетки, шизонты и морулы P. ovale напоминают аналогичные формы P. malariae, однако ядро более крупное, пигмента меньше, встречаются неразрушенные пораженные эритроциты. При малярии, вызванной P. vivax, пораженные эритроциты так же не всегда разрушаются, сохраняется зернистость Шюффнера. У P. ovale, в отличие от P. vivax, ядра крупные, неправильной формы, отсутствуют крупные «разорванные» амебовидные трофозоиты, мерозоиты крупные и их меньше в моруле. Женские гаметоциты (гамонты) P. vivax и P. malariae в толстой капле не удается отличить от взрослых трофозоитов. Мужские гаметоциты имеют крупное ядро, окруженное узким ободком бледно-голубой цитоплазмы с рассеянными по ней зернами пигмента. Гаметоциты P. falciparum имеют характерную полулунную форму. Серологический метод - определение антител к плазмодиям малярии с помощью РИА или ИФА с диагностическими целями проводится редко. Генодиагностика - ПЦР. Криптоспоридиоз Криптоспоридии (Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium muris) вызывают холероподобное заболевание или воспаление легких, преимущественно у лиц, страдающих иммунодефицитами, в частности, ВИЧ-инфекцией. Материалом для исследования являются испражнения, биоптаты слизистой оболочки кишечника, желчных протоков, желчного пузыря, мокрота и биоптаты легочной ткани. Основной метод диагностики - микроскопия исследуемого материала. Микроскопический метод направлен на обнаружение ооцист в мазках из материала от больного, окрашенных по Цилю-Нильсену. Ооцисты криптоспоридий представляют собой округлые образования диаметром около 5 мкм, они кислотоустойчивы и поэтому окрашиваются в красный цвет, тогда как другие микроорганизмы - в голубой. Ооцисты криптоспоридий или их антигены в исследуемом материале можно также выявить с помощью РИФ и ИФА. Токсоплазмоз Возбудитель токсоплазмоза (Toxoplasma gondii) является внутриклеточным паразитом, поражающим практически все органы и ткани теплокровных животных, птиц и человека. Исследованию на токсопламоз подвергают пунктат лимфатических узлов, спинномозговую жидкость, кровь, гистологические срезы лимфатических узлов, миндалин, кусочки органов трупа, головной мозг, печень, селезенку, легкие, плаценту и околоплодную жидкость. Микроскопический метод – обнаружение токсоплазм в мазках из материала от больного, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Токсоплазмы имеют полулунную или аркообразную форму, размеры 4-7х 2-4 мкм, один из концов простейшего заострен, другой закруглен. Цитоплазма токсоплазм голубого цвета, ядро рубиново-красного цвета располагается в центре паразита, занимая 1/3-1/4 цитоплазмы (рис. 42). Биопроба - заражение материалом от больных белых мышей, у которых развивается острая форма токсоплазмоза, при этом паразиты обнаруживаются в перитонеальном экссудате, реже во внутренних органах. Через 2-3 недели в головном мозге появляются цисты токсоплазм, которые можно обнаружить при микроскопии нативных или окрашенных по Романовскому-Гимзе препаратов. 208 Рис. 42. Возбудитель токсоплазмоза (Toxoplasma gondii) Серологический метод - постановка реакции с красителем Сэбина—Фельдмана (РСФ - антиген-нейтрализующая реакция, основанная на утрате токсоплазмами способности прижизненно воспринимать окраску после воздействия специфических антител), РИФ, РСК, РНГА с парными сыворотками крови больных с целью определения антител к токсоплазмам. Применяется также аллергическая проба с токсоплазмином. Аллергодиагностика – постановка внутрикожной аллергической пробы с токсоплазмином выявляет наличие сенсибилизации организма в результате инфицирования токсоплазмами. Результаты аллергической пробы учитывают в сочетании с данными серологического исследования. Положительная проба с токсоплазмином при отрицательных результатах серологических реакций указывает на давно перенесенную инвазию; положительная РИФ в низких титрах в сочетании с отрицательной РСК свидетельствует о затухании процесса; свежая инфекция характеризуется наличием антител, выявляемых с помощью РИФ при отрицательных РСК и аллергической пробе. Диагноз врожденного токсоплазмоза ставят при наличии типичных клинических проявлений и нарастания титра специфических антител у ребенка в сочетании с положительными результатами серологических реакций у матери. Трипаносомоз У человека трипаносомоз описан в 2 формах - африканской (сонная болезнь) и американской (болезнь Шагаса). Возбудителями сонной болезни являются Trypanosoma brucei вариант gambiense и Trypanosoma brucei вариант rhodesiense, болезни Шагаса - Trypanosoma cruzi. Морфологически эти три вида трипаносом сходны между собой. Материалом для исследования являются кровь, спинномозговая жидкость, пунктат лимфатических узлов, грудины, кусочки пораженных тканей. Микроскопический метод – выявление трипаносом в мазках из исследуемого материала, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Трипаносомы располагаются внеклеточно, имеют размеры 17-30х1,4-2,0 мкм, красно-фиолетовое ядро, расположенное в средней части тела простейшего; на заднем конце трипаносомы имеется блефаропласт, от которого отходит волнообразный жгутик, направляющийся к наружной оболочке трипаносомы и далее - до переднего конца трипаносомы. Между телом трипаносомы и жгутиком находится прозрачная ундулирующая мембрана. Сзади от блефаропласта расположен палочковидный или круглый кинетопласт (рис. 43). При острой стадии болезни Шагаса трипаносомы можно обнаружить в крови. При хронической форме заболевания микроскопическое исследование малоинформативно из-за небольшого количества трипаносом в крови. Серологический метод (РСК, РП, РА, РИФ, ИФА для определения антител в крови больных) применяется при болезни Шагаса. Биопроба – заражение морских свинок (Т. cruzi), белых мышей или крыс (Т.rhodesiense), мартышек (Т.gambiense) с последующим микроскопическим исследованием окрашенных по Романовскому-Гимзе мазков-отпечатков из внутренних органов с целью выявления трипаносом. 209 Рис. 43. Возбудитель трипаносомоза (Trypanosoma gambiense) Лейшманиоз Возбудителем кожного лейшманиоза является Leishmania tropica, висцерального лейшманиоза - Leishmania donovani. Лейшмании паразитируют у позвоночных животных и человека в лейшманиальной (внутриклеточной, амастиготной безжгутиковой) форме. Другим хозяином и переносчиком являются москиты, у которых паразиты находятся в лептомонадной (промастиготной, жгутиковой) форме. Жгутиковые формы образуются также при культивировании лейшманий на искусственных питательных средах. Микроскопический метод (микроскопия мазков костного мозга, пунктата лимфатических узлов и селезенки, окрашенных по Романовскому—Гимзе) является наиболее информативным в диагностике висцерального лейшманиоза. Амастиготы расположены в цитоплазме гистиоцитов, имеют овальную или круглую форму размером 3-5x1-3 мкм, цитоплазму серо-голубого цвета, центрально расположенное ядро красно-фиолетового цвета и лежащий рядом с ним ярко окрашенный кинетопласт. Культуральный метод – посев на среду NNN, культивирование при 22 °С в течение 8-40 дней. В препарате «раздавленной» капли лейшмании удлиненной формы (10-12 мкм), имеется жгутик (рис. 44). Биопроба – заражение лабораторных животных, микроскопия окрашенных по РомановскомуГимзе мазков-отпечатков из внутренних органов с целью поиска паразита. Серологический метод - постановка РИФ, РСК, ИФА с целью определения антител к лейшманиям с диагностическими и эпидемиологическими целями. Чувствительным, специфичным, экономичным и высокоинформативным является ИФА (диагностический титр 1:400). 210 Рис. 44. Возбудитель лейшманиоза - Leishmania donovani Лямблиоз Возбудитель лямблиоза — Giardia lamblia (Lamblia intestinalis) имеет грушевидную форму с билатеральной симметрией, встречаясь как в вегетативной форме в дуоденальном содержимом или жидком кале, так и в виде цист исключительно в кале. Материалом для исследования служат дуоденальное содержимое или фекалии. Микроскопический метод. В нативных препаратах лямблии обладают плавной поступательной и вращательной подвижностью вокруг продольной оси. Передний конец лямблий широкий, закругленный с присасывательным диском в виде светлого округлого участка; задний (хвостовой) - вытянутый, заостренный, загнутый на выпуклую дорсальную сторону; размеры паразита 10-28х 8-12 мкм . В окрашенных препаратах в цитоплазме вегетативных форм лямблий расположены 2 симметрично расположенных ядра, внутри тела по средней линии 2 аксостиля, отходящих от базальных зерен вблизи ядер и выходящих наружу в виде хвостовых жгутиков на заднем конце паразита (рис.45). От самостоятельных базальных зерен отходят передняя, средняя и вентральная пары жгутиков, а между задней и средней частями тела лямблий располагаются медиальные или парабазальные тела серповидной или треугольной формы. Цисты лямблий при окраске раствором Люголя имеют правильную овальную форму, размеры 7-17х 5-12 мкм, коричневый или желтый цвет, тонкую, гладкую, двуконтурную оболочку, в передней части - слабо очерченные ядра (2 в незрелых, 4 в зрелых цистах), внутри цитоплазмы нити аксонем и свернутые жгутики, а в задней части - серповидные парабазальные тела. Могут встречаться более мелкие погибшие или дегенеративные цисты серо-голубого цвета. Более четкая микрокартина наблюдается в препаратах, окрашенных железным гематоксилином. 211 Рис. 45. Возбудитель лямблиоза - Giardia lamblia Трихомониаз Трихомонады вызывают у человека кишечный трихомоноз (возбудитель Trichomonas hominis, паразитирует только в вегетативной форме и обнаруживается лишь в жидких фекалиях) и мочеполовой трихомониаз (возбудитель Trichomonas vaginalis). Трихомонады цист не образуют. Материалом для исследования являются жидкие фекалии, выделения из влагалища, шейки матки, мочеиспускательного канала, секрет предстательной железы. Микроскопический метод - исследование нативных или окрашенных по РомановскомуГимзе и по Граму препаратов. В нативных препаратах Trichomonas hominis имеют веретенообразную форму с передним закругленным и задним заостренным концом тела, размеры 5-10х5 мкм; движения толчкообразные поступательные и вокруг продольной оси за счет пучка из 3-5 жгутиков, отходящих от переднего конца тела, и ундулирующей мембраны (расположена продольно, окружена аксиальной нитью, заканчивается у заднего конца паразита в виде свободного концевого жгутика). Ундулирующая мембрана и концевой жгутик совершают периодические, волнообразные движения от переднего конца тела трихомонады к заднему. Ядро трихомонад в нативных препаратах обнаружить не удается. В цитоплазме трихомонад обнаруживают бактерии, реже — эритроциты. Аналогична морфология Trichomonas hominis в окрашенных препаратах. В передней части паразита расположен малозаметный цитостом и пузырьковидное ядро, впереди от него блефаропласты с отходящими от них жгутиками и аксиальной нитью c плохо заметной ундулирующей мембраны, с противоположной стороны от ядра - парабазальное тело. Жгутики трихомонад в окрашенных препаратах заметны мало. Сбоку от ядра вдоль тела трихомонады проходит аксостиль, заканчивающийся на заднем конце в виде длинного шиловидного выроста или хвоста. Т. vaginalis имеют грушевидную или веретеновидную форму, длину 10-30 мкм. Ядро расположено в передней части широкого конца тела паразита, спереди ядра от блефаропластов отходит 4 одинаковых жгутика длиной, равной длине тела трихомонады; ундулирующая мембрана занимает переднюю половину длины тела и не имеет свободной концевой нити. На заднем конце трихомонады тонкий аксостиль выглядит в виде шипика. Со стороны, противоположной аксостилю, ядро огибает удлиненная парабазальная фибрилла. В цитоплазме трихомонад находят многочисленные хроматоидные гранулы. Окрашенные трихомонады выглядят как округлые клетки с вытянутыми или треугольными ядрами (рис. 46). Культуральный метод. Кишечные трихомонады удается выделить путем посева испражнений на среду Рейса (сывороточный МПБ). Для культивирования Т. vaginalis используют среды Павловой (натрия хлорид, натрия фосфат, калия гидрофосфат, лошадиная сыворотка), Джонсона—Трассела (пептон, агар, цистеин солянокислый, мальтоза, печеночный экстракт, раствора Рингера, раствор метиленового синего, сыворотка человека или лошади, пенициллин и стрептомицин 212 для подавления роста сопутствующей микрофлоры; рН 5,8-6,0) или на среде, содержащей МПБ, 1 % глюкозы и 5-10 % инактивированной сыворотки крови человека или лошади, антибиотики (пенициллин и стрептомицин) для подавления роста посторонней микрофлоры. Рис. 46. Возбудитель трихомониаза - Trichomonas vaginalis Амебиаз Возбудителем амебиаза является дизентерийная амеба (Entamoeba histolytica), цикл развития которой состоит из вегетативной стадии и стадии покоя (цисты). Описано 4 формы амебы в вегетативной стадии: 1) тканевая; 2) большая вегетативная (magnum) 3) просветная - мелкая вегетативная (minuta) и 4) предцистная. Острый амебиаз характеризуется наличием тканевой и большой вегетативной форм; у реконвалесцентов и цистовыделителей обычно обнаруживают просветную и предцистную формы. Просветные формы в дистальном отделе кишечника превращаются в цисты, способные выживать в неблагоприятных условиях. Материалом для исследования являются испражнения, гной из пораженных органов, мокрота и др. Микроскопический метод. При исследовании нативного препарата тканевая форма дизентерийной амебы выглядит в виде крупных сильно преломляющих свет образований неправильной формы, размером 18-45 мкм, с разграничением цитоплазмы на внутреннюю зернистую темную часть (эндоплазма) с пищеварительными вакуолями и наружную светлую прозрачную (экзоплазма). При температуре 20 — 400 С амебы подвижны за счет выброса псевдоподий. В окрашенных препаратах тканевая форма дизентерийной амебы имеет вытянутое или округлое тело, размеры 12-45 мкм, светлую гомогенную эктоплазму и мелкозернистую темную эндоплазму, в которой видны темноокрашенные эритроциты, ядро размером 3-5 мкм с тонкой оболочкой, в центре которого расположена пятиугольная кариосома (рис. 47). 213 Рис. 47. Дизентерийная амеба (Entamoeba histolytlca) Просветная форма дизентерийной амебы обнаруживается в значительных количествах в начальной стадии кишечного амебиаза или в конце периода обострения, в небольшом количестве у здоровых носителей. Эта форма имеет размеры 7-25 мкм. Разграничение тела амебы на эндо- и эктоплазму можно выявить только при образовании псевдоподий. В пищеварительных вакуолях эритроциты отсутствуют. В окрашенных препаратах просветная форма дизентерийной амебы имеет те же размеры, выявляется ядро диаметром 2-5 мкм, зерна периферического хроматина образуют серповидное скопление под ядерной оболочкой, что позволяет дифференцировать тканевую и просветную форму. Цисты дизентерийной амебы при обработке раствором Люголя имеют правильную округлую или овальную форму, гладкую оболочку желтого или коричневого цвета, размеры 10-15 мкм; цитоплазма зрелых цист содержит 4 мелких ядра, незрелых – 1-2 крупных ядра правильной округлой формы с тонкой оболочкой и мелкую точечную или пятиугольную центрально расположенную кариосому. Цитоплазма незрелых цист содержит гликогеновые вакуоли светло-бурого цвета со смазанными контурами. В одном и том же препарате обнаруживают цисты различной степени зрелости. Культуральный метод - посев исследуемых материалов на среды Павловой, с печеночным экстрактом и др. Серологический метод - постановка РНГА, РА, РСК, РВИЭФ, ИФА для определения антител в крови больных, особенно для диагностики внекишечных форм амебиаза. Балантидиаз Возбудитель балантидиаза является Balantidium coli. Материалом для исследования при этой инвазии служит кал. Микроскопический метод – исследование нативных и окрашенных препаратов. Балантидии имеют большие размеры (30-200х20-55 мкм), яйцевидную форму, макронуклеус, цитостом, сократительную и пищеварительные вакуоли, в которых находят эритроциты, лейкоциты или бактерии на разных стадиях переваривания. На поверхности балантидий обычно видны реснички с прилипшим к ним питательным субстатом. Цисты В. coli, размером 40 — 65 мкм, в содержимом кишечника человека образуются редко, они имеют круглую форму, двухконтурную оболочку и бобовидное ядро. 214 Самостоятельная работ студентов 1. Изучение морфологии простейших (возбудителей малярии, криптоспоридиоза, токсоплазмоза, трихомониаза, лямблиоза, амебиаза, балантидиоза) в окрашенных препаратах, на слайдах и рисунках (демонстрация). 2. Демонстрация питательных сред (Павловой, Рейса и др.), применяемых для культивирования простейших. 3. Серодиагностика лейшманиоза – ИФА (демонстрация). 4. Серодиагностика токсопламоза – РСК, РНГА (демонстрация). Педиатрические аспекты темы Аллергическую пробу с токсоплазмином не ставят детям до двух лет, так как из-за возрастных особенностей реактивности возможны ложноотрицательные реакции. После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства патогенных простейших, а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления вызываемых ими заболеваний, особенности иммунитета; основные методы диагностики, профилактики и лечения протозойных инфекций. Изучив тему, студент должен уметь: оценивать результаты микробиологических анализов при заболеваниях, вызванных простейшими. 215 Приложение 1 ПРАВИЛА ВЗЯТИЯ И ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Взятие крови. Для посева следует брать, соблюдая правила асептики во избежание попадания микроорганизмов из внешней среды. Кожу над пунктируемой веной обрабатывают 70% спиртом, затем 5% настойкой йода, затем снова спиртом. Кровь для посева следует брать во время подъема температуры, в начале появления лихорадки до назначения специфического антибактериального химиотерапевтического лечения, или через 12—24 часа после последнего введения препарата больному (в зависимости от скорости выведения примененного препарата из организма). В случаях острого сепсиса исследуют 2-3 образца крови, взятых раздельными венопункциями с интервалом 30 минут, что увеличивает вероятность выделения микроорганизма. Если в предшествующие 1-2 недели проводилась антимикробная терапия, кровь исследуют 2 раза в сутки в течение 3 дней. Необходимо учитывать стадию заболевания для того, чтобы взять кровь для посева в момент бактериемии (например, при брюшном тифе в первые 10—15 дней от начала заболевания). Для результативного бактериологического исследования необходимо засевать не менее 10 мл крови у взрослых и 5 мл у детей в большой объем жидких питательных сред для того, чтобы путем разведения крови (соотношение крови и среды 1:10 – взрослые, 1:5 - дети) преодолеть естественные бактерицидные свойства крови. Для нейтрализации антибактериальных факторов крови, включая комплемент, рекомендуется, по возможности, применять полианитол-сульфонат натрия 0,025—0,03%. Кровь на посев берут у постели больного или в перевязочной стерильным шприцем или системой для взятия крови одноразового пользования с соблюдением всех правил асептики и засевают тут же у постели больного. Для этого снимают защитную плоскую крышку с флакона со средой, не снимая резиновой пробки флакона и протирают резиновую пробку спиртом. Сменив на шприце иглу, прокалывают иглой резиновую пробку, засевают по стенке флакона 10 мл крови, после чего протирают резиновую пробку спиртом и надевают защитную крышку; Необходимо следить за соблюдением правил асептики на всех этапах взятия и пос ева крови. Если возникает подозрение, что в посев крови могли попасть микроорганизмы из внешней среды (с кожи больного, с рук персонала, воздуха и т. п.) и нет возможности повторить посев, следует сделать специальную пометку на флаконе, чтобы впоследствии соответствующим образом оценить результаты посева. Взятие спинномозговой жидкости Для микробиологического анализа обычно используют спинномозговую жидкость, взятую врачом при люмбальной пункции или при пункции боковых желудочков мозга. Взятие спинномозговой жидкости проводят как можно раньше, желательно до начала антибактериального лечения. Проба отбирается со строгим соблюдением правил асептики. Свежевзятый ликвор из шприца без иглы над спиртовкой вносят в стерильную (желательно центрифужную пробирку) в количестве 1-2 мл и немедленно доставляют в лабораторию, т.к. некоторые микроорганизмы, (например, N. menigitidis, быстро погибают). Допускается хранение спинномозговой жидкости при 370 С в течение нескольких часов. Для пересылки ликвора используют изотермальные ящики, грелки, термос или любую другую упаковку, где поддерживается температура около 370 С. Взятие мочи Мочу для исследования следует брать до начала антибактериальной терапии или в интервалах между курсами лечения. Исследованию подлежит средняя порция свободно выпущенной мочи в объеме 3—5 мл, взятой в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Катетеризация мочевого пузыря для рутинного исследования не применяется, так как она может привести к инфицированию мочевых путей. Катетериза216 ция мочевого проводится в некоторых случаях для уточнения локализации инфекции (в мочевом пузыре или в почках). С э той целью мочевой пузырь опорожняют катетером и промывают раствором антибиотика, после чего с интервалом в 10 минут берут пробы мочи для исследования. Если инфекция локализуется в почках, микроорганизмы содержатся во всех порциях мочи. При инфекции мочевого пузыря моча остается стерильной. Нельзя собирать мочу из мочеприемника. При наличии постоянного катетера, протирают его наружное отверстие 70 % спиртом, затем шприцом с иглой через отверстие собирают мочу (желательно взять несколько проб с интервалом в 10 минут) и переносят ее в стерильную баночку или пробирку. Наиболее достоверные результаты получают при надлобковой пункции мочевого пузыря. При подозрении на простатит у мужчин забирают 4 пробы: «первую» и «среднюю» порции мочи при самопроизвольном мочеиспускании, секрет предстательной железы при ее массаже и «последнюю» порцию мочи через 5-10 минут после массажа. Содержащиеся в моче микробы быстро размножаются при комнатной температуре, что может дать ложные результаты при определении степени бактериурии. В связи с этим, от момента взятия пробы мочи до начала ее исследования в лаборатории должно пр оходить не более 1—2 часов при хранении при комнатной температуре и не более суток — при хранении в холодильнике. Взятие желчи. Желчь получают либо путем зондирования, собирая ее по порциям (A, B, C) в 3 стерильные пробирки, либо в одну пробирку шприцем во время операции с соблюдением правил асептики. Пробирки доставляют в лабораторию в течение 1-2 часов от момента взятия. Взятие материала из дыхательных путей Материалом для изучения этиологии заболеваний дыхательных путей служат отделяемое зева и носа, мокрота, содержимое бронхов, полученное при бронхоскопии или при отсасывании через трахеостому (у больных, находящихся на аппаратном дыхании), экссудаты, резецированные ткани и др. Материал собирают с соблюдением правил асептики в стерильные баночки или пробирки и доставляют в лабораторию. Хранение материала способствует размножению сапрофитной микрофлоры, искажая результаты анализа. Материал должен быть доставлен в лабораторию в течение 1-2 часов. Утреннюю мокроту, выделяющуюся во время приступа кашля, собирают в стерильную банку. Перед откашливанием больной должен почистить зубы и прополоскать рот кипяченой водой с целью удаления остатков пищи, клеток слущенного эпителия и микрофлоры полости рта. Промывные воды бронхов исследуют при отсутствии или скудном количестве мокроты, однако при этом микробиологическая ценность исследования снижается из-за разведения секрета и бактерицидного действия раствора на чувствительные микроорганизмы, поэтому нередко концентрация бактерий в бронхиальном содержимом во много раз ниже, чем в мокроте. Проведение повторных исследований в динамике заболевания ограничивается трудоемкостью эндоскопического взятия материала и тяжестью манипуляции для больного. При бронхоскопии вводят не более 5 мл физиологического раствора с последующим его отсасыванием в стерильную пробирку. Исследование пунктата из инфильтрата или абсцесса легкого наиболее эффективно до прорыва инфильтрата или абсцесса в дренирующий бронх. При трансторакальной пункции получают материал непосредственно из очага поражения, избегая его обсеменения посторонней микрофлорой. Материал из ротовой полости берут натощак или через 2 часа после еды стерильным ватным тампоном или ложечкой со слизистой оболочки (или ее пораженных участков), у выходов протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек. Пленки снимают стерильным пинцетом. Материал из зева забирают стерильным ватным тампоном натощак или через 2 часа после еды и полоскания горла дезинфицирующим раствором. Тампон вводят, не касаясь губ, щек, языка и миндалин, прижимая язык шпателем. Материал собирают тампоном с задней поверх217 ности глотки, миндалин, участков воспаления и налетов. Тампон помещают в пробирку (с транспортной средой или без нее) и в течение 2 часов доставляют в лабораторию. Материал из носовой полости (отдельно из правой и левой ноздри, избегая контакта тампона с кожей носа) забирают сухим стерильным ватным тампоном, который вводят в глубь полости носа. Если при этом начинается чихание, тампон не удаляют до его окончания. Материал из носоглотки берут стерильным заднеглоточным ватным тампоном, для чего его осторожно вводят через носовое отверстие в носоглотку. Если при этом начинается кашель, тампон не удаляют до его окончания. Для проведения анализов на дифтерию исследуют одновременно пленки и слизь из носа и глотки. Материал из носа и глотки берут разными тампонами. При подозрении на клебсиеллы, независимо от места локализации процесса, исследуют материал из носоглотки и обеих половин носовой полости. Взятие материала из уха. При поражении наружного уха проводят обработку стерильным физиологическим раствором, затем стерильный ватный тампон вводят в ушной канал и после пропитывания его секретом помещают в пробирку с транспортной средой. Исследуют также пунктаты их уха и материал, полученный во время оперативных вмешательств на ухе. Исследуемый материал собирают в стерильную пробирку или в пробирку с питательным бульоном. Взятие отделяемого из ран, язв, брюшной полости Взятие материала производит лечащий врач с соблюдением правил асептики. Кожу вокруг раны предварительно обрабатывают 70% спиртом или другим антисептиком, удаляя некротические массы, гной и детрит стерильной салфеткой. Материал берут двумя стерильными тампонами (один используют для приготовления мазка для микроскопии, др угой — для посева), осуществляя круговые вращательные движения от центра к периферии раны. При наличии в ране дренажей для активной аспирации отделяемого его отсасывают шприцем и в количестве 1-2 мл помещают в стерильную пробирку. Кусочки тканей, гной, промывную жидкость из дренажа также берут в стерильные пробирки при соблюдении всех правил асептики. Через 1 час после взятия материал должен быть доставлен в микробиологическую лабораторию для немедленного посева. При невозможности доставить материал в течение этого времени, он должен храниться в холодильнике не более двух часов. Взятие материала из глаз. Забор материала производит врач-окулист. Отделяемое конъюнктивы забирают предварительно прожженной в пламени спиртовки и остуженной платиновой петлей или стеклянными стерильными палочками. При наличии обильного гнойного отделяемого используют стерильные ватные тампоны, которыми берут гной с внутренней поверхности нижнего века движением к внутреннему углу глазной щели. При моргании ресницы не должны касаться тампона, для чего веки придерживают руками. Корочки гноя с краев век забирают пинцетом. Берут также материал из язвочек у основания ресниц. Материал при исследовании роговицы после ее обезболивания отбирают платиновой петлей или другим подходящим инструментом. Если больной применяет контактные линзы, исследуют их внутреннюю поверхность. Взятый влажным тампоном материал наносят на поверхность предметного стекла, обезжиренного и прокаленного над пламенем горелки. Мазки высушивают, стекло маркируют и на его обратной стороне обводят границы мазка. В кабинете врача производят посев на сывороточный бульон и тиогликолевый бульон. Мазок и посевы затем доставляются в лабораторию для исследования. Взятие материала из женских половых органов Взятие материала для микробиологического исследования проводит врач акушергинеколог. Отделяемое вульвы и преддверия влагалища берут стерильным ватным тампоном. При воспалении бартолиниевых желез производят их пункцию, при вскрытии абсцесса железы гной берут стерильным ватным тампоном. 218 Материал из влагалища для посева должен быть взят до проведения мануального исследования с помощью стерильного ватного тампона из заднего свода или с патологически измененных участков слизистой оболочки после введения зеркала и подъемника. Влагалищную часть шейки матки обнажают в зеркалах, тщательно обрабатывают ватным тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором или стерильной водой. Тонким ватным тампоном, осторожно введенным в цсрвикальный канал, берут материал для исследования, не касаясь стенок влагалища. Исследуется также соскоб слизистой оболочки шейки матки, полученный при диагностическом выскабливании стенок цервикального канала. Грамотное взятие материала из матки может быть выполнено только при использовании специальных инструментов типа шприца-аспиратора, имеющего на зонде покрытие. После прохождения зондом цервикального канала в полости матки раскрывают наружную оболочку зонда и набирают в шприц содержимое матки, после чего закрывают наружную оболочку и зонд выводят из матки. При воспалительном процессе в придатках матки получение материала из очага инфекции (гной, экссудат, кусочки органов) возможно только при оперативном вмешательстве или при проведении диагностической пункции опухолевидных образовании в малом тазу, проводимой через влагалищные своды. Если очаг инфекции в придатках матки сообщается с полостью матки, ценную информацию дают повторные исследования отделяемого цервикального канала. При подозрении на анаэробную инфекцию посев должен быть выполнен сразу же после взятия материала путем помещения тампона в пробирку с тиогликолевым полужидким агаром. Параллельно с взятием материала на посев врач акушер-гинеколог готовит не менее 2 мазков для микроскопии, используя для этого стерильные тампоны или стерильные гинекологические инструменты. При изготовлении мазков материал распределяют на предметном стекле равномерно, мягкими движениями, избегая грубого втирания и резких штриховых движений инструментом или тампоном. Мазок высушивают при комнатной температуре, покрывают чистым предметным стеклом или помещают в чашку Петри и отправляют в лаборат орию. Хранение влажного мазка, сдавленного между двумя стеклами, не допускается. Взятие материала при аутопсии Основным условием для получения достоверных результатов микробиологического исследования и их грамотной интерпретации является раннее (не позднее 12 часов после смерти больного) взятие материала (даже при хранении трупа при пониженной температ уре). Материал для микробиологического исследования берет персонал морга (врач и его помощник) с соблюдением правил асептики. Пробы крови получают из левого желудочка сердца шприцем или пастеровской пипеткой. Пункцию и биопсию проводят после обработки исследуемого участка 3% перекисью водорода с последующим удалением антисептика стерильным физиологическим раствором. 2—3 кусочка органов или тканей, величиной по 0,5—1 см3 , помещают с соблюдением правил асептики в стерильные чашки Петри или в пробирки. Гной из вскрытых полостей, спинномозговую жидкость и т.д. отсасывают шприцем и в количестве 1-5 мл помещают в стерильные пробирки. Поверхностные секреты собирают бактериологическим тампоном. Материал, взятый от трупа больного с гнойно-воспалительной патологией, вызванной условно-патогенными бактериями, должен быть доставлен в лабораторию в течение часа. В направлении дополнительно указывают дату и время смерти. Взятие, условия хранения и доставки венозной крови для проведения ИФА и ПЦР. Взятие венозной крови производится натощак, в утренние часы. Отбор производится в центрифужные одноразовые пробирки, для ПЦР - со специальными реагентами. Для ИФА берется 5 мл крови, для ПЦР - 2,5 мл. Пробирки с кровью должны быть промаркированы, упакованы, плотно закрыты и должны быть доставлены в лабораторию в течение 1 часа. Если доставка крови в лабораторию осуществляется в течение дня, то она хранится при температуре +4-+60 219 С, затем в специальных транспортных контейнерах (в ледяной бане) доставляется в лабораторию. Взятие материала для ПЦР исследований при урогенитальных инфекциях. Поскольку урогенитальные инфекции нередко вызываются внутриклеточными паразитами, размножающимися в клетках цилиндрического эпителия уретры или цервикального канала, в исследуемом материале должно быть значительное содержание этих клеток при минимальном количестве слизи и примеси крови. Неправильный отбор материала при этих инфекциях нередко приводит к ложноположительным и ложноотрицательным результатам. Отбор осуществляется специальным зондом, который вводится в уретру (на глубину 1,0 1,5 см у женщин и на 3-4 см у мужчин) или в цервикальный канал (на глубину 0,5 -1,5 см) после удаления слизи. При наличии эрозии цервикального канала необходима его обработка стерильным физиологическим раствором. Материал берут на границе здоровой и измененной ткани. При введении и извлечении зонда необходимо полностью исключить его касание стенок влагалища. Зонд опускают в пробирку с транспортной средой, где его несколько раз вращают, а затем удаляют из пробирки. Пробирку закрывают и маркируют. Транспортировку биологического материала для ПЦР производят только в сумке-холодильнике. Если пробирку с биологическим материалом невозможно доставить в лабораторию ПЦР в течение 2 часов, то ее следует заморозить при температуре -200 С. В замороженном виде проба для ПЦР может храниться не более 2 недель. Приложение 2 ПРАВИЛА ВЗЯТИЯ И ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Любые пробы (в том числе нестерильные, например, фекалии) для вирусологического исследования берут, соблюдая правила асептики, с целью предотвращения его дополнительного загрязнения посторонней микрофлорой. Взятые для исследования материалы рекомендуется помещать в стеклянные флаконы или посуду из нетоксичной пластмассы с завинчивающейся пробкой. Пробы следует сохранять влажными и на холоду, не замораживая, поскольку ряд вирусов (в частности, возбудители респираторных вирусных инфекций) характеризуется низкой выживаемостью во внешней среде. Для сохранения жизнеспособности вирусов некоторые пробы (мазки из носоглотки, соскобы кожных поражений) погружают в стабилизирующую среду, состоящую из нейтрального изотонического раствора, белка и антибиотиков. Можно также пользоваться раствором Хенкса или средами для тканевых культур (гидролизат лактальбумина, среды 199, Игла и т.д., содержащие 10% прогретой сыворотки крупного рогатого скота или бычьего альбумина) с антибиотиками (200-1000 ЕД пенициллина, 200-1000 мг стрептомицина и 50-100 ЕД нистатина), подавляющими рост бактерий и грибов, которые приводят к аутолизу белков и разрушению вирусов. КРОВЬ. Для выделения вирусов и серологического исследования берут 10 мл крови. Сыворотку крови, взятую для серологических исследований, в случае ее возможной нестерильности, можно заморозить, что предотвращает бактериальный рост и сохраняет ранние макроглобулиновые антитела. Первую пробу крови для серологического исследования берут на 3-4 дни болезни, вторую – на 1015. Так как при некоторых вирусных инфекциях антитела накапливаются медленно, целесообразно взять третью пробу на 25-30-й день. МАТЕРИАЛ ИЗ ВЕРХНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ. Мазки из глотки берут ватным тампоном, не касаясь языка и щек, тщательно протирая заднюю стенку глотки, после чего опускают тампон в стабилизирующую среду. У детей в возрасте до 2 лет вирусы можно выделять из носоглоточного секрета. Из него делают также мазки для исследования методом иммунофлюоресценции. СПИННОМОЗГОВАЯ ЖИДКОСТЬ. Вирусы из спинномозговой жидкости выделяют при при менингитах, реже при энцефалитах. 220 ФЕКАЛИИ. Кусочки кала, массой 4-8 г, помещают в сухой стерильный флакон. Можно также исследовать ректальные мазки, однако частота выделения вируса из них ниже, чем из кала. СОСКОБЫ И МАЗКИ С КОНЪЮНКТИВЫ. Соскоб с конъюнктивы снимают тонким стерильным шпателем после локальной легкой анестезии и делают мазок на предметном стекле. Для выделения вируса производят смыв с конъюнктивы стабилизирующей средой или берут пробу тампоном, помещая его затем во флакон со средой. КОЖНЫЕ ПОРАЖЕНИЯ. Исследованию подвергают поврежденные участки (везикулярная жидкость, корочки, кусочки опухоли и т.п.). ТРУПНЫЙ МАТЕРИАЛ. Желательно брать как можно скорее, так как содержание вируса в тканях после смерти резко снижается в результате их аутолиза, вызванного размножением бактерий. Образцы для выделения вируса берут, соблюдая правила асептики, одновременно помещая их в формалин для выполнения гистологических исследований. ТРАНСПОРТИРОВКА. Доставка проб в лабораторию должна осуществляться в максимально короткий срок, так как содержание вируса в отсутствие живых клеток быстро снижается. Повторное замораживание и оттаивание губительны для ряда вирусов (особенно возбудителей респираторных вирусных инфекций), поэтому при транспортировании образцы помещают в контейнеры с температурой 2-40 С. Если время доставки превышает 30-40 мин и пробы не могут быть тотчас исследованы, материал замораживают при -80°С в сухом льду или помещают в жидкий азот при –1800 С. 221 222 а б Рис. 1. Стафилококк - Staphylococcus aureus. а – мазок из исследуемого материала, б - мазок из чистой культуры. Окраска по Граму. Скопления кокков в виде гроздьев винограда. х900 а б Рис. 2. Стрептококк (Streptococcus pyogenes). а – мазок из исследуемого материала, б мазок из чистой культуры. Окраска по Граму. Грамположительные кокки, расположенные в виде цепочек. х900 224 225 Схема 3. Микробиологическая диагностика анаэробных инфекций 226
