ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Основы световой микроскопии и цифровой макро- и микрофотографии Учебно-методическое пособие Составители: А.В. Лавлинский И.Э. Мазурова Воронеж 2010 2 Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного факультета 13.11.08 г., протокол № 3 Учебно-методическое пособие подготовлено на кафедре генетики, цитологии и биоинженерии биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета. Рекомендуется для студентов дневного и вечернего отделений биологопочвенного факультета Для специальности: 020201 Биология 3 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………... 1. Основы светомикроскопической техники…………………………………. 1.1. Классификация световых микроскопов……………………………….. 1.2. Основные элементы устройства микроскопа. Характеристика оптической и механической систем световых микроскопов………… 1.3. Определение увеличения и разрешающей способности микроскопа при разных комбинациях окуляра и объектива………………………. 1.4. Установка рационального освещения при микроскопических исследованиях и микрофотосъемке прозрачных объектов по методу светлого поля……………………………………………………………. 2. Техника измерения объектов под микроскопом с применением окулярмикрометра и объект-микрометра. Определение масштаба увеличения изображения………………………………………………………………… 3. Статистическая обработка результатов……………………………………. 4. Изучение числа и общей морфологии митотических хромосом в норме. Понятие кариотипа………………………………………………………….. 4.1. Общая морфология митотических хромосом………………………… 4.2. Основные морфометрические характеристики хромосом в кариотипах……………………………………………………………... 5. Микрофотосъемка на основе аналоговой фотографии…………………… 5.1.Техника аналоговой (галогенно-серебряной) фотографии…………… 5.2. Микрофотографирование………………………………………………. 6. Применение цифровой фотографии в медико-биологических исследованиях. Анализаторы изображения……………………………….. 6.1. Понятие цифровой фотографии, макро- и микрофотография……….. 6.2. Устройство и основные принципы работы цифровых фотоаппаратов…………………………………………………………... 6.3. Цифровая микрофотография в биологии. Основные принципы работы и особенности применения анализаторов изображения в медико-биологических исследованиях………………………………… 7. Техника микрофотографирования с применением цифровой камерыокуляра DCM………………………………………………………………... 7.1. Техническая характеристика цифровой камеры-окуляра DCM……... 7.2. Порядок работы с цифровой камерой-окуляром DCM при изучении микропрепаратов………………………………………………………... 7.3. Получение микрофотографий и их последующая обработка………... ЛИТЕРАТУРА ………………………………..………………........................... ПРИЛОЖЕНИЕ………………………………………………………………… 4 5 5 6 10 11 14 18 22 22 25 26 27 28 30 30 33 36 42 42 42 45 47 48 4 ВВЕДЕНИЕ Микроскоп (от лат. micros - малый и scopein - рассматривать, наблюдать) - прибор, позволяющий наблюдать увеличенное изображение объектов и структур. Несмотря на длительную историю применения при изучении живых объектов, микроскопия и в настоящее время один из наиболее широко используемых методов не только в практике медико-биологических, но и металлографических, минералогических и криминалистических исследований. Технический уровень современной микроскопии постоянно растет, в связи с чем решаются все более сложные научно-практические задачи медицины, наук биологического профиля. С помощью современных микроскопов объекты исследования размером от 0,5 мкм (с разрешением их элементов до 0,1 мкм) могут быть увеличены более чем в 3000 раз, при этом общее увеличение современных световых микроскопов может доходить до 6000Х. Фотодокументирование полученных материалов является неотъемлемой составляющей современного микроскопирования. Микрофотография служит незаменимым средством документации и регистрации различных явлений, процессов, событий. Она позволяет изучать недоступные для глаза объекты, анализировать быстропротекающие процессы, что особенно важно в медико-биологических исследованиях. Целью данного раздела большого практикума является ознакомление студентов с основами световой микроскопии и техникой выполнения цифровой макро- и микросъемки биологических объектов. Настоящее пособие создано на основе использования современной учебной и научной литературы, а также опыта работы преподавателей кафедры генетики, цитологии и биоинженерии ВГУ. Оно может использоваться студентами всех форм обучения при их самостоятельной работе в области цитологии, генетики (в частности, цитогенетики), гистологии и эмбриологии. 5 1. ОСНОВЫ СВЕТОМИКРОСКОПИЧЕСКОЙ ТЕХНИКИ Световая микроскопия – один из основных методов изучения биологических объектов на клеточном уровне. 1.1. Классификация световых микроскопов В основе классификации световых микроскопов положены геометрические параметры объекта и его изображения, а также физические явления, связанные с волновой природой света, которые реализуются в конструкции микроскопа. Световые микроскопы подразделяют на микроскопы плоского поля (двухмерное изображение объекта) и стереоскопические (объемное или трехмерное изображение объекта). И те, и другие, в свою очередь, подразделяются на микроскопы проходящего света и микроскопы отраженного света. Традиционно, в отечественной литературе микроскопы проходящего света плоского поля называют биологическими микроскопами, несмотря на то, что они давно нашли свое применение в других областях науки и техники. Микроскопы отраженного света предназначены для исследования полупрозрачных объектов и непрозрачных объектов с различными коэффициентами отражения. Традиционно, эти микроскопы носят название "металлографические микроскопы". По расположению объектива относительно препарата и источника света микроскопы бывают прямые и инвертированные. Инвертированные микроскопы проходящего света представляют собой «перевернутую» конструкцию обычного микроскопа: осветитель проходящего света расположен над объектом и имеет большое рабочее расстояние, что обеспечивает свободный доступ инструмента (манипулятора, палочки, пипетки) к препарату, который находится, например, в чашке Петри. По степени сложности каждая группа делится на микроскопы-игрушки, учебные, рабочие, лабораторные, исследовательские, универсальные. Класс сложности микроскопа определяют следующие показатели: габариты микроскопа, связанные с мощностью источника света, линейное поле окуляра, качество изображения, наличие дополнительных комплектующих принадлежностей и т. д. По типу объекта и методов исследования микроскопы делятся на: биологические микроскопы (прямые микроскопы проходящего света); металлографические микроскопы (микроскопы отраженного света); инвертированные металлографические микроскопы (микроскопы отраженного света); инвертированные биологические микроскопы (инвертированные микроскопы проходящего света); люминесцентные микроскопы; поляризационные микроскопы; стереоскопические микроскопы. 6 1.2. Основные элементы устройства микроскопа. Характеристика оптической и механической систем световых микроскопов Световой микроскоп включает в себя две конструктивнофункциональные части: оптическую и механическую. Структурная схема блоков и частей светового микроскопа представлена на рисунке 1. 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Рис. 1. Структурная схема блоков и частей тринокулярного светового микроскопа: 1. Узел крепления сменных насадок (визуальных, фотографических, телевизионных, различных передающих устройств). 2. Окуляры. 3. Визуализирующий блок. 4. Узел смены объективов (револьверное устройство). 5. Объективы (сменные). 6. Кронштейн для крепления или стойка (тубусодержатель). 7. Предметный столик. 8. Конденсор. 9. Узел крепления сменных предметных столиков. 10. Узел крепления конденсора, а также его фокусировочного и центровочного перемещения. 11. Узел крепления светоделительных элементов (блоков для отраженного света; блоков светофильтров, в т.ч. люминесцентного осветителя). 7 12. Фокусировочный механизм грубой и точной настройки микроскопа на резкость (макро- и микровинт). 13. Основание штатива микроскопа. Оптическая система микроскопа включает в себя три основных функциональных блока: осветительный, воспроизводящий, визуализирующий. Осветительный блок предназначен для создания равномерного светового потока, который проходит через объект (проходящий свет) или отражается от него (отраженный и падающий свет), а также для обеспечения условий точного воспроизведения объекта по цвету, форме и разрешению элементов в конечном увеличенном изображении. Осветительный блок включает: источник света (лампа и электрический блок питания); оптикомеханическую систему, расположенную за лампой. Для микроскопов проходящего света оптико-механическая часть состоит из коллектора, полевой ирисовой диаграммы, и конденсора со встроенной апертурной ирисовой диафрагмой. В микроскопах отраженного света роль конденсора играет объектив. В современных микроскопах отечественного и зарубежного производства применяются встроенные в основание микроскопа осветительные системы с галогенными, ксеноновыми или ртутными лампами. Мощность галогенных ламп 6 В 20 Вт, 12 В 30-40 Вт. В исследовательских и универсальных моделях лампы более мощные – 12 В 100 Вт. Для выравнивания света обычно применяются светофильтры. Коллектор. При встроенной осветительной системе проходящего света коллекторная часть линзы расположена вблизи источника света в основании микроскопа и предназначена для увеличения размера светящегося тела (лампы). Вблизи коллектора располагается полевая диафрагма микроскопа. Полевая ирисовая диафрагма регулирует интенсивность светового потока, направленного от источника света к объекту. Конденсор. Оптическая система конденсора предназначена для увеличения количества света, поступающего от осветителя на объект. В его состав входит несколько линз, основное назначение которых превратить параллельные лучи, идущие от осветителя, в сходящиеся. По сути, конденсор представляет собой светосильный короткофокусный объектив, который должен иметь апертуру (см. Апертура объектива, с. 9), равную апертуре объектива (условие Аббе). В микроскопах отраженного света проблема качества конденсора решена просто, за счет аберрационного качества объектива. Воспроизводящий блок предназначен для создания увеличенного изображения объекта в промежуточной плоскости — плоскости изображения. Воспроизводящий блок включает объектив и промежуточную оптическую систему. Современные микроскопы последнего поколения базируются на оптических системах объективов, скорректированных на "бесконечность". В отличие от микроскопов предыдущего поколения с 8 конечной длиной тубуса 160 мм, современные имеют дополнительную линзовую систему, называемую "тубусной", которая параллельные пучки света, выходящие из объектива, "собирает" в плоскости изображения микроскопа и обеспечивает, таким образом, само изображение. Объектив состоит из фронтальной и последующей частей. Фронтальная линза (или система линз) обращена к препарату и является основной при построении изображения соответствующего качества, определяет рабочее расстояние и числовую апертуру объектива. Последующая часть в сочетании с фронтальной обеспечивает требуемое увеличение, фокусное расстояние и качество изображения, а также определяет конструкцию объектива и микроскопа в целом (высоту объектива и длину тубуса микроскопа). Визуализирующий блок предназначен для получения изображения объекта на сетчатке глаза, фотоматериале, матрице цифровой камеры. Визуализирующий блок включает следующие элементы: визуальная насадка (монокулярная, бинокулярная или бинокулярная с фотовидеовыходом); окуляры для наблюдения; система дополнительного увеличения; проекционные насадки, в том числе дискуссионные для двух и более наблюдателей; рисовальные аппараты; адаптерные (согласующие) элементы систем анализа и документирования изображения, имеющие дополнительное увеличение. Микроскоп отраженного света (например, люминесцентный) имеет аналогичные воспроизводящую и визуализирующую части, но в качестве конденсора выступает объектив. Механическая система микроскопа. Основным конструктивномеханическим блоком микроскопа являются штатив, который включает в себя следующие основные части: основание и тубусодержатель (рис. 1). На основании крепится весь микроскоп. В простых микроскопах на нем устанавливают осветительные зеркала или самостоятельные осветители. В более сложных моделях осветительная система встроена в основание с блоком питания или без него. Одним из основных и точных элементов, входящих в механическую часть микроскопа, является предметный столик, предназначенный для крепления препарата и фиксации его в определенном положении под микроскопом. Форма столиков бывает округлой (в старых моделях) и прямоугольной. Они бывают неподвижные, координатные, поворотные (на ограниченный угол) и вращающиеся (центрируемые и не центрируемые). На стол устанавливаются препаратодержатели и препаратоводители. Последние практически не применяются в современных микроскопах, кроме поляризационных микроскопов. Параметры микроскопа. К основным параметрам микроскопа и соответственно его оптических частей относятся: увеличение; разрешающая способность; линейное поле на предмете; степень исправления аберраций. Общее увеличение микроскопа зависит: а) от увеличения объектива; б) увеличения окуляра; в) промежуточных увеличивающих систем. Так, например, при оценке увеличения анализатора изображений (АИ) увеличение 9 окуляра не влияет на общее увеличение системы, т. к. он не участвует в формировании изображения. Увеличение АИ зависит от увеличения объектива, промежуточных линз и адаптера камеры (см. гл. 6). Общее увеличение микроскопа равно произведению значений увеличений всех оптических систем: ГМ =βоб • Гок • q1 • q2 •…, где ГМ общее увеличение микроскопа, βоб - увеличение объектива, Гок - увеличение окуляра, q1, q2 — увеличение дополнительных систем. Например, в отечественных микроскопах МИКМЕД-1, -6, а также БИОЛАМ-Р (С, Д) монокулярная насадка не имеет увеличения, следовательно, общее увеличение микроскопа с объективом 100Х и окуляром 10Х будет равно 100 х 10 = 1000Х. Бинокулярная насадка АУ-12, устанавливаемая на микроскопах МИКМЕД-2, БИОЛАМ-И, имеет собственное увеличение 1,5Х. Следовательно, общее увеличение микроскопа в этом случае будет: 100 х 10 х 1,5=1500Х. Одно и то же общее увеличение микроскопа можно получить с помощью разных комбинаций объектива и окуляра. Например, объектив 8Х и окуляр 15Х дают увеличение 120Х; объектив 40Х и окуляр 3Х также дают увеличение 120Х. Однако в первом случае разрешающая способность будет равна 1,68 мкм, а во втором – 0,52 мкм, то есть почти в три раза выше. Увеличение современного микроскопа может достигать и 4000Х - 6000 Х с учетом дополнительных насадок: бинокуляра 2,5Х, объектива 100Х и окуляра 16Х. Однако целесообразность подобного увеличения должна быть определена величиной полезного увеличения микроскопа. Апертура объектива. Угловая апертура объектива - это максимальный угол, под которым лучи, идущие от препарата, могут попадать во фронтальную плоскость объектива. Числовая (нумерическая) апертура объектива (А) - произведение синуса половины угловой апертуры на показатель преломления среды между предметом и фронтальной линзой объектива: А= n sin u/2, где n — показатель преломления среды, между объектом наблюдения и объективом, u — апертурный угол. Увеличение числовой апертуры повышает способность объектива воспроизводить мелкие детали объекта. Для увеличения апертуры объектива между фронтальной линзой объектива и препаратом помещают среду, имеющую более высокий показатель преломления, чем воздух (воду, глицерин или масляную иммерсию) (таблица 1). Объективы проходящего света (до 63Х) и отраженного света (до 200Х), работающие в воздухе, называются «сухими системами» и значение их числовой апертуры не превышает 0,95. Иммерсионные объективы имеют числовую апертуру до 1,45. Числовая апертура объективов всегда маркируется на корпусе. Например, надпись «40Х / 0,95» означает, что это объектив с увеличением 40Х и числовой апертурой 0,95. 10 Таблица 1 Значения предельной нумерической апертуры систем объективов в различных светопреломляющих средах Показатель Предельная нумерическая Система объектива преломления апертура Сухой 1,00 0,95 Водно-иммерсионный 1,33 1,24 Глицерин 1,45 ─ 1,515 1,40 Масляный масло) (кедровое 1.3. Определение увеличения и разрешающей способности микроскопа при разных комбинациях окуляра и объектива Световая микроскопия основывается на законах геометрической оптики и волновой теории образования изображения. Предел разрешения светового микроскопа задается длиной световой волны, которая в зависимости от области спектра лежит в пределах 0,4 – 0,7 мкм. Полезное увеличение микроскопа (ГМ) должно быть не более 1000 числовых апертур объектива и не менее 500: 500 Аоб < ГМ < 1000 Аоб, где Аоб - числовая апертура объектива. Более высокое увеличение или меньше меньшего не выявляет новых деталей объекта в изображении. Например, для объектива 100Х с числовой апертурой 1,25 полезное увеличение микроскопа лежит в диапазоне 625 – 1250Х. Разрешающая способность. Волновые свойства света определяют предел разрешения в оптических приборах. По дифракционной теории образования изображения Аббе в световом микроскопе нельзя видеть объекты меньше полудлины волны и нельзя получить изображение меньше полудлины волны: d ≥ 0,5 λ0 / Аоб, где d - разрешающая способность микроскопа, мкм; λ0 – длина волны, мкм; Аоб - числовая апертура объектива. Из этой формулы следует, что при одной длине волне разрешающая способность микроскопа возрастает с увеличением апертуры объектива. Широко известна формула Аббе для определения разрешения микроскопа: d = λ / (Аоб + Аосв), где: Аоб — числовая апертура объектива, Аосв - числовая апертура конденсора. Для малоконтрастных объектов известно еще одно правило: если апертурная диафрагма конденсора прикрыта на 1/3 числовой апертуры, то достигается наилучшее контрастирование объекта без потери разрешения в микроскопе. В таком случае правомочной становится формула: 0,61∙ λ d = 0,61 ∙ λ / Аоб = ———— , n ∙ sin u/2 11 где 0,61 – коэффициент, указывающий на половину длины волны света. По степени исправления аберраций объективы микроскопов можно разделить на несколько групп: Ахроматические объективы — наиболее простые по устройству системы, у которых хроматическая аберрация исправлена. Они применяются в основном для визуального наблюдения в желто-зеленой части спектра. Апохроматические объективы более сложные системы, хроматическая аберрация в которых почти полностью устранена для всех длин волны. Апохроматы дают несколько большее изображение в синих лучах. Полуапохроматические, или флюоритовые объективы занимают промежуточное положение между двумя описанными группами объективов. Эти объективы обычно короткофокусные и имеют аберрации несколько меньшие, чем ахроматы, но большие, чем апохроматы. Планахроматические и планапохроматические объективы. Эти объективы дают плоское изображение по всему полю. По спектральному составу света, в котором будет работать объектив, все объективы делятся на: а) обычные для видимой части спектра и б) на объективы для ультрафиолетовой части спектра. Последние могут быть не только линзовыми, но и зеркально-линзовыми. Основные рабочие характеристики объективов гравируют на их корпусе в виде отдельных букв и цифр: "АПО" — апохроматический объектив; "Планахромат" — планахроматический объектив; "МИ" или "ОИ" — объектив для масляной иммерсии; "ВИ" — объектив для водной иммерсии; "Уф" — объектив для ультрафиолетовых микроскопов; "Л" — объектив для люминесцентных микроскопов; "Ф" — объектив для фазового контраста; "П" — объектив для поляризационных микроскопов. "ДТ" или "тубус" — длина тубуса, на которую рассчитан объектив. Объективы, рассчитанные на тубус длиной 160 мм, обозначения длины тубуса на оправе не имеют. "F" и "А" — фокусное расстояние и апертура объективов для определенной длины тубуса. Задание 1. Изучить устройство и основные приемы работы с микроскопом. Ход работы: Рассмотреть основные рабочие узлы и системы микроскопа (см. п. 1.2.). Задание 2. Ознакомиться с особенностями работы световых микроскопов разных марок (МИКМЕД-6, Laboval – 4, Биолам, МБИ-6). 1.4. Установка рационального освещения при микроскопических исследованиях и микрофотосъемке прозрачных объектов по методу светлого поля При микроскопировании различных объектов большое значение имеет источник света. Удобнее пользоваться искусственным светом, т.к. он более 12 стабилен и позволяет добиваться лучшей освещенности изучаемого объекта. В качестве примера можно рассмотреть некоторые варианты искусственного освещения, применяемые в микроскопии. Так, равномерность освещения может обеспечиваться возможностью реализации настройки освещения по принципу Келера. Для этого осветительная система должна иметь подвижный по вертикали конденсор с возможностью центрировки и регулируемой апертурной диафрагмой, а также регулируемую полевую диафрагму, жестко закрепленную вместе с осветительной системой, включающей в т. ч. коллектор и источник света. В современных микроскопах галогенные лампы с мощностью до 35Вт выполняются с самоцентрирующимся патроном. Источники света 12В 100Вт, а также ртутные и ксеноновые лампы устанавливаются в специальные узлы, которые обеспечивают центрировку нити или светящегося тела относительно оптической оси. Принцип Келера заключается в том, что осветительная система микроскопа (источник света, коллектор, конденсор) устанавливается на одну оптическую ось с собственно оптикой микроскопа (объективом, окуляром). Для работы также часто используют автономный осветитель ОИ-19. Он имеет низковольтную лампу накаливания (9 В, 20 Вт). Лампу включают в сеть через понижающий трансформатор. В корпусе трансформатора помещен реостат с рукояткой, регулирующий накал лампы. Патрон с лампочкой может свободно передвигаться в корпусе осветителя. Перед лампой в корпусе осветителя расположен двухлинзовый конденсор с диафрагмой. Корпус осветителя крепится на штативе на нужной высоте. Осветитель с помощью металлической планки располагается на определенном расстоянии (250 мм) от зеркала микроскопа. Настройка осветительной системы с ОИ-19 также осуществляется по Келеру. Она позволяет получить в высокой степени равномерную освещенность по всему полю зрения, а количество рассеянного света свести до минимума. Если поле зрения будет освещено неравномерно, это может привести к плохому качеству фотографии, а иногда даже к ложному толкованию объекта. Рассеянный свет снижает контраст и тем самым также приводит к ухудшению качества снимка. Настройка по Келеру производится следующим образом: 1. Установить объектив по ходу лучей. 2. Фокусировочной настройкой микроскопа получить изображение объекта при прикрытой полевой диафрагме. 3. Получить резкое изображение края полевой диафрагмы с помощью фокусировочного движения конденсора. 4. Отцентрировать полевую диафрагму относительно поля с помощью центровочных винтов при конденсоре и открыть ее по полю видения. 5. Открыть апертурную диафрагму по выходному зрачку объектива, для чего вынуть окуляр из окулярной трубки бинокулярной насадки, и, двигая рукоятку апертурной диафрагмы конденсора, раскрыть ее по размеру светящегося диска. 13 6. Для увеличения контраста изображения и соблюдения условия Аббе прикрыть апертурную диафрагму конденсора, оставляя ее открытой на 2/3, выходного зрачка. Задание. Ознакомиться с правилами и приемами центрировки осветительной системы микроскопа со встроенным осветителем. Ход работы: 1. Осветитель ОИ-19 соединить с микроскопом при помощи соединительной пленки. 2. Удалить матовое стекло под конденсором. Поместить конденсор в верхнее положение на уровне столика микроскопа. 3. На предметный столик поместить препарат. При открытых диафрагмах осветителя и конденсатора, пользуясь объективом 8Х, сфокусировать препарат. 4. Закрыть полевую диафрагму осветителя (или уменьшить диафрагму до 5 мм), наклонить зеркало так, чтобы в нем отчетливо была видна апертурная диафрагма. 5. Перемещая патрон лампочки вдоль оси осветителя, добиться четкого изображения спирали в центре закрытой апертурной диафрагмы конденсора. (Четкость спирали можно проверить, приложив к зеркалу белую бумагу). Пользуясь реостатом, уменьшить яркость лампы осветителя, чтобы при дальнейшей работе не повредить глаза. 6. Открыв апертурную диафрагму, поворотом зеркала добиться, чтобы при наблюдении в окуляр в центре поля зрения появилось изображение краев диафрагмы осветителя. Это изображение будет в виде пятна с нечеткими краями. 7. Перемещением конденсора добиться резкого изображения полевой диафрагмы в поле зрения микроскопа. Изображение полевой диафрагмы вследствие неизбежных отражений от поверхности стекла может иметь вид четырех точек (кругов). 8. Осторожно поворачивая зеркало, установить изображение полевой диафрагмы (самой яркой из точек) в центре поля зрения микроскопа. Если при этом нить лампы сойдет с апертурной диафрагмы, то поворотом всего осветителя её следует снова установить на апертурной диафрагме. 9. Открыть полевую диафрагму так, чтобы освещенный круг немного выходил за пределы поля зрения микроскопа. Это не удается сделать при малом увеличении микроскопа, если конденсор не заменен на низкоапертурный. Уменьшить апертуру конденсора можно удалением верхней линзы. 10. Вынуть окуляр, закрыть диафрагму конденсора, и глядя в тубус микроскопа, подобрать отверстие апертурой диафрагмы конденсора, равное задней линзе объектива. Для этого диафрагму открывать до тех пор, пока её отверстие не совпадет с границами выходного зрачка объектива. Для повышения контрастности изображения диафрагму можно открыть до 2/3 выходного зрачка объектива. Затем поместить окуляр в тубус. Светофильтр 14 вставить в прорезь осветителя. Степень освещенности препарата отрегулировать реостатом осветителя или нейтральным светофильтром. 11. Изучение препарата необходимо начинать с малого увеличения, постепенно переходя к сильному сухому объективу, а затем к иммерсионному. При замене объективов на оптически более сильные объективы, следует заново установить освещение, поскольку апертура у них иная. 2. ТЕХНИКА ИЗМЕРЕНИЯ ОБЪЕКТОВ ПОД МИКРОСКОПОМ С ПРИМЕНЕНИЕМ ОКУЛЯР-МИКРОМЕТРА И ОБЪЕКТМИКРОМЕТРА. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАСШТАБА УВЕЛИЧЕНИЯ ИЗОБРАЖЕНИЯ Одной из наиболее распространенных задач, стоящих в рамках цитогенетических и цитоэмбриологических исследований является измерение микрообъектов: хромосом, ядер, ядрышек, микроядер, пыльцевых трубок, клеток различных тканей и т.д. Такие измерения проводят под микроскопом при помощи шкалы окуляра-микрометра (рис. 2А). Рис. 2. Шкалы окуляра- (А) и объект-микрометра (Б) (по Паушевой, 1988) Окуляр-микрометр – это круглая стеклянная пластинка, на которую нанесена линейка со 100 делениями. Окуляр-микрометры могут быть представлены отдельными насадками, надеваемыми на тубус микроскопа, например, МОВ – 1 – 15 (рис. 3). Для того чтобы установить реальные размеры изучаемого объекта (т.е. перевести результаты полученных измерений в микрометры), используют объект-микрометр - линейку длиной 1 мм, нанесенную на стеклянную 15 пластинку. Ее шкала, общая длина которой 1 мм, также имеет 100 делений, размер одного деления – 10 мкм (0,01 мм) (рис. 2Б). а б Рис. 3. Окулярный винтовой микрометр МОВ-1-15 (а - внешний вид, б – вид шкалы): 1 – окуляр; 2 – корпус; 3 – барабан; 4 – основание; 5 – винт хомутика; 6 – биштрих (по Паушевой, 1988) Рис. 4. Окулярная сетка (по Паушевой, 1988) Задание 1. Изучить устройство окуляр- и объект – микрометров (рис. 2). Провести с их помощью измерение объектов под микроскопом. Определить цену деления окуляр-микрометра и установить истинные размеры объекта. Ход работы: 1. Окуляр-микрометр в виде круглой стеклянной пластинки с нанесенной на неё шкалой поместить внутрь окуляра на его диафрагму, предварительно отвинтив глазную линзу окуляра. 16 2. На столик микроскопа положить микропрепарат и, глядя в окуляр, перемещать объект препаратоводителем, а линейку окуляр-микрометра – поворотом окуляра так, чтобы можно было измерить объект в его делениях. 3. Глядя в микроскоп, переместить объект препаратоводителем, а окулярмикрометр – окуляром до их совмещения в поле зрения. 4. Измерить объект в делениях окуляр-микрометра не менее чем в 10 повторностях каждого варианта опыта. 5. Записать полученные данные в колонки 1-5 таблицы 2, отметить увеличение объектива и окуляра. 6. Измерив объект (объекты), снять препарат со столика и на его место поместить объект-микрометр (при условии работы в проходящем свете). 7. Совместить шкалы окуляр-микрометра и объект-микрометра при тех же комбинациях окуляра и объектива микроскопа, при которых измеряли объект на препарате. Для примера: при малом увеличении 100 делений объект-микрометра, т.е. вся шкала, совпали с 80 делениями окулярамикрометра. Цену одного деления окуляра-микрометра можно определить по следующей формуле: А , где А – число делений объекта-микрометра; •10 В В – число делений окуляр-микрометра; 10 – величина одного деления объекта-микрометра, мкм. Подставив значения в данную формулу можно получить: (100/80)∙10 =12,5. Т.о., получаем цену деления окуляр-микрометра: она равна 12,5 мкм. Для получения искомого размера объекта исследования следует умножить показатели его длины или ширины, определенные в делениях окуляра-микрометра, на цену деления окуляра-микрометра в микрометрах. Результаты измерений истинных размеров объекта занести в колонку 6 таблицы 2. Например, диаметр пыльцевого зерна кукурузы равен 8 делениям окуляра-микрометра. Значит, истинный диаметр пыльцевых зерен в мкм составит: 8 · 12,5 мкм = 100 мкм. Цена делений окуляра-микрометра, вычисленная для одного увеличения микроскопа, не подходит для работы с другими увеличениями. Перед началом измерений необходимо установить цену деления для каждой из используемых комбинаций объективов и окуляров. 8. Если необходимо определить площадь или подсчитать число клеток в единице площади, в окуляр микроскопа помещают сетчатый окулярмикрометр (окулярную сетку, рис. 4), который представляет собой нанесенный на стеклянную пластинку квадрат со стороной 10 мм. Каждая сторона разделена линиями на 20 частей. Интервал между ними – 0,5 мм. 9. Для определения масштаба увеличения изображения объекта на рисунке, фотографии или экране монитора необходимо, сняв препарат, положить на его место объект-микрометр (для проходящего света). Сфотографировать (зарисовать) при том же увеличении участок линейки объект-микрометра. Затем необходимо определить, во сколько раз увеличение на бумаге больше истинного размера препарата. Например, в поле зрения микроскопа поместилось 50 делений шкалы объект-микрометра. 17 Получив изображение делений на бумаге, фотографии, экране монитора замерить линейкой их общую длину. Предположим, она оказалось равной 200 мм. Истинная же величина 50 делений линейки, объект-микрометра 0,5 мм (0,01 мм × 50, где 0,01 мм – цена одного деления). Следовательно, увеличение объекта на фотографии, рисунке или экране будет равно 400 (200 : 0,5). Таблица 2 Результаты измерения объектов с помощью окуляр-микрометра Название Увеличеобъекта ние мик(варианта роскопа опыта) (комбинация увеличений объектива, окуляра, насадки) 1 2 Номер измерения (повторности) 3 Размер объекта в делениях окулярмикрометра 4 Цена деления окулярмикрометра, мкм. 5 Истинный размер объекта мкм. 6 Задание 2. Ознакомиться с особенностями работы винтового окулярмикрометра МОВ-1-15. Ход работы: 1. Окулярный винтовой микрометр МОВ-1-15 (рис. 3) надеть на тубус х микроскопа. Он состоит из окуляра с увеличением 15 , основания с хомутиком, отсчетного приспособления с микрометрическим винтом и барабана. В плоскости барабана находятся неподвижная шкала с восемью делениями по 1 мм, подвижное перекрестие и индекс в виде биштриха. Отсчеты проводят по шкале (в миллиметрах) и барабану (в сотых долях миллиметра). 2. Небольшим передвижением окуляра в винтовой нарезке окулярмикрометра добиться четкой видимости шкалы и двух штрихов. Совместить перекрестие шкалы и штрихов с начальной точкой измеряемой величины. Записать показания шкалы. На ней будет видно целое число делений, число сотых покажет риска на винтовом барабане. Винтом барабана переместить перекрестие в конечную точку измеряемой величины и снова записать показания линейки в поле зрения и сотых долей деления на барабане. Вычитанием меньшей величины из большей получают размеры измеряемого объекта в делениях шкалы окуляр-микрометра. 18 3. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ Вся группа объектов, у которых изучают данный признак, называется генеральной совокупностью – N. Обычно изменчивость какого-либо признака изучают не у всех представителей генеральной совокупности, а лишь у части их. Эта часть генеральной совокупности называется выборочной совокупностью или выборкой - n. Выборка должна быть репрезентативной, т.е. представлена большим числом особей (30-100 и более). Остановимся на характеристике основных показателей выборочной совокупности. Показателем, характеризующим проявление признака у представителей данной выборки, является средняя арифметическая X . Учитывая, что анализируют не генеральную совокупность, а только часть ее (выборочную совокупность), необходимо определить показатель ошибки вычисления выборочных параметров – ошибку средней арифметической S X . Но вычислению данного показателя предшествует расчет основных показателей, характеризующих степень изменчивости (варьирования) данного признака: 2 вариансы (дисперсии) S X и среднего квадратического отклонения SX. Для характеристики принадлежности значения признака у отдельного представителя группы (клетки или ее компонентов) к средней арифметической, служит нормированное отклонения t. Оно показывает, является ли данное значение признака достоверным отклонением от среднего арифметического или находится в пределах допустимого для данной выборочной совокупности значения. Показатель достоверности разницы td используют для сравнения средних арифметических различных выборок. При проведении биометрических измерений с последующей статистической обработкой используют следующие условные обозначения: 1. N – объем генеральной совокупности. 2. n – объем выборочной совокупности (выборка). 3. x – числовое значение признака. 4. xmin - минимальное значение признака в данной выборке. 5. xmax - максимальное значение признака в данной выборке. 6. f – частота (количество элементов выборки, имеющих одинаковое значение данного признака). 7. X (M) – средняя арифметическая. 2 2 8. S X (σ для генеральной совокупности) - варианса (дисперсия). 9. SX (σ для генеральной совокупности) - среднее квадратическое отклонение (стандартное отклонение). 10. СV (V для генеральной совокупности) – коэффициент вариации. 11. S X ( mх для генеральной совокупности) – ошибка средней арифметической. 12. Т – критерий Уилкоксона для независимых выборок. 19 13. t – нормированное отклонение, критерий Стьюдента. 14. td - показатель достоверности разности между средним арифметическим двух выборок (двух вариантов опытов и т.д.). 15. F – критерий соответствия Фишера. 16. U – критерий Уилкоксона (Манна-Уитни). 17. X – критерий Ван-дер-Вардена. 18. Н - критерий Краскелла-Уоллиса. В биометрии широко используют так называемую нулевую гипотезу (Н0), при которой допускается отсутствие достоверных различий между совокупностями, из которых взяты выборки. Т.е. допускается, что наиболее контрастные члены этих выборок получены все же из одного источника и разница между выборками равна нулю. Вычисление средней арифметической Её вычисляют по формуле: X = ∑ f x/n. Вычисление вариансы (дисперсии) и стандартного отклонения Выборки, имеющие одинаковое значение средней арифметической, могут различаться по степени проявления признака. Для характеристики степени изменчивости признака используют вариансу (дисперсию) и среднее квадратическое отклонение. Варианса и среднее квадратическое отклонение характеризуют фенотипическую изменчивость признака. Вариансу (дисперсию) вычисляют по формуле: S2X = ∑( x−x ) 2 n −1 Стандартное (среднее квадратическое отклонение) SX - число именованное и выражается в тех же единицах, что и среднее арифметическое. Стандартное отклонение вычисляется по формуле: SX =± ∑ (x − x) n −1 2 Проводить вычисления удобно, представив промежуточные результаты в виде таблицы (табл. 3). В области биометрии принято использовать два вида статистических критериев: параметрические и непараметрические. Параметрические 2 строятся на основе параметров данной совокупности (например, X и S X) и представляют функции этих параметров. Непараметрические критерии представляют собой функции, зависящие непосредственно от вариант данной совокупности с их частотами. Их применяют в тех случаях, когда изучаются не только количественные, но и качественные признаки, которые могут быть выражены в виде порядковых номеров, индексов или других условных знаков. Параметрические критерии служат для характеристики совокупностей, которые подчиняются закону нормального распределения, непараметрические – для проверки гипотез независимо от типа 20 совокупностей, из которых взяты сравниваемые выборки показателей. Таблица 3 Промежуточные этапы расчета среднего квадратического отклонения Значение признака измеряемого объекта, x 17 18 19 20 21 22 Частота встречаемосx· f ти значений измерений, f 8 136 17 306 26 494 28 560 14 294 7 154 n= ∑ f=100 ∑ x·f=1944 x- X -2,4 -1,4 -0,4 0,5 1,6 2,6 (x - 2 X) ( x − x) 2 ·f 5,76 46,08 1,96 33,32 0,16 4,16 0,36 10,08 2,56 35,84 6,76 47,30 2 2 ∑ ( x − x) = ∑ ( x − x) ·f =176,8 17,56 К параметрическим критериям, применяемым в биометрии, относят t – критерий Стьюдента и F – критерий Фишера. Первый применяют для сравнительной оценки средних показателей, а второй – для оценки дисперсий. Из непараметрических критериев для проверки нулевой гипотезы в биологических исследованиях наиболее часто применяют X – критерий Ван-дер-Вардена, U – критерий Уилкоксона (Манна-Уитни), T – критерий Уилкоксона и непараметрический критерий Краскелла-Уоллиса (Н). Вычисление нормированного отклонения Согласно математической статистике случайное распределение варианс не превышает среднюю арифметическую генеральной совокупности более чем на ± 3σ . В пределах X ± 1σ находится 68,28 % варианс выборочной совокупности, в пределах X ± 2σ − 95,4% , а в пределах X ± 3σ − 99,73% . Таким образом, зная значение X и σ (SX) для данного вариационного ряда, можно определить, относится ли данное значение признака (варианта) к нему или нет. Оно может относиться к данному ряду, т. е. быть типичным для сорта, если его отклонение от средней арифметической не превышает 3σ. Следовательно, пределы модификационной изменчивости в данной выборке определяются значением X ± 3σ . Вычисление ошибки средней арифметической Ошибка средней арифметической (S X ) показывает теоретические пределы соответствия средней арифметической выборочной и генеральной совокупностей. Её вычисляют по формуле: S X = Sx . n 21 Вычисление коэффициента вариации Для сравнения изменчивости разных признаков у растений одной выборки или изменчивости одного признака у разных сортов, а также для того, чтобы иметь возможность судить о степени выравненности изучаемого материала, вычисляют коэффициент вариации (СV) по формуле: СV = Sx ·100%. Условно принято, что коэффициент вариации меньше X 10% свидетельствует об относительно слабой изменчивости признака, 1020% - средней и более 20% - сильной изменчивости. Сравним изменчивость различных признаков у одного изучаемого объекта. Например, для трех признаков X , SX, и СV имеют следующие значения (табл. 4): Таблица 4 Изучаемые признаки Признак 1 Признак 2 Признак 3 X SX СV, % 3,2 41,0 19,4 1,4 8,0 1,3 43,8 19,5 6,9 В нашем примере значительней других варьирует первый признак (43,8%), меньше – второй (19,5%). Третий признак является наиболее устойчивым по степени вариабельности (6,9%). Вычисление нормированного отклонения разности двух средних арифметических td Во многих исследованиях возникает необходимость сравнить средние арифметические двух линий, сортов, вариантов опыта и определить степень достоверности разности средних величин, т.е. проверить нулевую гипотезу (Н0) об отсутствии различий межу генеральными параметрами и выборочными. Критерий достоверности разности между средними арифметическими обозначают td и вычисляют по формуле td = d/Sd, где d – разность между двумя средними арифметическими вариационных рядов, которая определяется по формуле d= x 1 − x 2 ; Sd вычисляют по формуле: Sd = Sх 2 1 + S х 2 ,где 2 S x1 - ошибка средней арифметической первого вариационного ряда, S x2 - второго, возведённые в квадрат. Разность между двумя вариационными рядами статистически недостоверна, если td меньше 1,96 (при n≤100); от 1,97 до 2,85 – достоверна на уровне значимости P≤ 0,05, а при значении более 2,85 – достоверна на более высоком уровне значимости: P≤ 0,01. 22 Задание. Провести статистическую обработку результатов биометрических измерений клеток и их структурных компонентов (ядер, ядрышек, хромосом и др.) изучаемых объектов. Ход работы: 1. Проанализировать 30-50 клеток и их структурных компонентов по метрическим (мерным) и меристическим (счетным) признакам (числу, размерам, наличию структурных изменений и т.д.). Провести статистическую обработку полученных экспериментальных данных. Вычислить для каждого элемента продуктивности среднюю арифметическую X , среднее квадратическое отклонение (стандартное отклонение) SX, коэффициент вариации СV и ошибку средней арифметической S X . Данные, полученные в результате статистического анализа, внести в таблицу 5. Таблица 5 Изучаемые признаки Статистические показатели X ±S X SX СV, % xmin ÷ xmax (размах) 2. Сравнить степень изменчивости различных признаков и сделать вывод о размахе изменчивости каждого из них. 3. Проанализировать характер распределения изучаемых признаков на их нормальность. В соответствии с полученными результатами (нормальный или иной тип распределения) выбрать статистические критерии (параметрические или непараметрические) для сравнения средних величин признаков у проанализированных образцов с аналогичными объектами (видами, сортами), взятыми из других условий (выборочные совокупности) на предмет принадлежности их к одной генеральной совокупности. Вычисление статистических показателей, анализ типов распределения и достоверности различий средних величин выборок можно провести на компьютере с использованием соответствующих программ из пакетов Statistica, Stadia, предварительно создав электронные матрицы исходных данных. 4. ИЗУЧЕНИЕ ЧИСЛА И ОБЩЕЙ МОРФОЛОГИИ МИТОТИЧЕСКИХ ХРОМОСОМ В НОРМЕ. ПОНЯТИЕ КАРИОТИПА 4.1. Общая морфология митотических хромосом Хромосомы всех эукариотических клеток построены по одному плану. Они включают в себя три основных компонента: собственно тело 23 хромосомы (плечо), теломерный (конечный участок) и центромеру. Наиболее просто устроены хромосомы дрожжевых клеток: палочковидное тело хромосомы на одном конце имеет теломер, а на другом — центромеру. Хромосомы животных и растений также представляют собой палочковидные структуры разной длины с довольно постоянной толщиной, но обычно имеют два хромосомных плеча, соединенных в зоне центромеры. Эта зона называется первичной перетяжкой. Соответственно оба плеча хромосомы оканчиваются теломерами (рис. 5). Рис. 5. Схема морфологии метацентрических (а), субметацентрических (б), акроцентрических (телоцентрических) (в) и спутничных (ядрышковых) (г) хромосом. Т — теломеры; Ц - центромеры (первичные перетяжки); ЯОР — ядрышковый организатор (вторичная перетяжка) (по Ченцову, 2004) Хромосомы с равными или почти равными плечами называют метацентрическими, с плечами неодинаковой длины субметацентрическими, палочковидные хромосомы с очень коротким, почти незаметным вторым плечом — акроцентрическими. В области первичной перетяжки (центромеры) расположен кинетохор — пластинчатая структура, имеющая форму диска. К нему подходят пучки микротрубочек митотического веретена, идущие в направлении к центриолям. Эти пучки микротрубочек принимают участие в движении хромосом к полюсам клетки при митозе. Обычно каждая хромосома имеет только одну центромеру (моноцентрические хромосомы), но могут встречаться хромосомы дицентрические и полицентрические, т.е. обладающие множественными кинетохорами. Некоторые хромосомы имеют вторичную перетяжку. Последняя обычно расположена вблизи дистального конца хромосомы и отделяет маленький участок — спутник. Вторичные перетяжки называют еще и ядрышковыми организаторами (NOR), так как именно на этих участках хромосом в интерфазе происходит образование ядрышка. Здесь же локализована ДНК, ответственная за синтез рРНК. Плечи хромосом оканчиваются конечными участками - теломерами. Теломерные концы хромосом не способны соединяться с другими хромосомами или их фрагментами, в отличие от концов хромосом, лишенных теломерных участков (в результате разрывов), которые могут 24 присоединяться к таким же разорванным концам других хромосом. В теломерах локализована особая теломерная ДНК, защищающая хромосому от укорачивания в процессе синтеза ДНК. Размеры хромосом у разных организмов варьируют в широких пределах (рис. 6-7). в Рис. 6. Хромосомы разных видов животных а — речной рак (2п= 196); б — комар Culex (2п = 6); в — щука (2n = 18); г — курица; д — кошка (2n = 38); е — лошадь (2n = 66); ж — бык (2n = 60); з — саламандра (2n = 34); и — овца (2n = 54) (по Мюнцингу, 1963) Рис. 7. Хромосомные наборы аксолотля (а) и вики (б) (по Ченцову, 2004) 25 Число хромосом у различных объектов также значительно колеблется, но характерно для каждого вида животных и растений. У некоторых радиолярий число хромосом достигает 1000-1600. Рекордсменом среди растений по числу хромосом (около 500) является папоротник ужовник, а наименьшее количество хромосом (2 хромосомы на гаплоидный набор) наблюдается у одного из видов аскариды, у сложноцветного Haplopappus gracilis всего 4 хромосомы (2 пары). 4.2. Основные морфометрические характеристики хромосом в кариотипах Совокупность числа, величины и морфологии хромосом называется кариотипом данного вида. Даже у близких видов хромосомные наборы отличаются друг от друга или по числу или по величине хотя бы одной или нескольких хромосом, или по форме хромосом и по их структуре. Структура кариотипа вида не зависит ни от типа клеток, ни от возраста организма. Все клетки индивидуумов одного вида имеют идентичные наборы хромосом. Структура кариотипа может быть таксономическим (систематическим) признаком, который все чаще используется в систематике (рис. 6-7). Хромосомы, входящие в кариотип, можно расположить в виде кариограммы. Для этого метафазную пластинку с хромосомами рисуют или фотографируют. Хромосомы вырезают ножницами, разбивают на пары гомологов и в ранжирном порядке наклеивают на лист бумаги. Данную операцию можно выполнить на компьютере по специальной программе анализа хромосом. В отличие от кариограммы схематическое изображение хромосом называют идиограммой. Составление идиограммы основано на измерении каждой хромосомы, учете длин плеч, положении центромер, вторичных перетяжек и спутников. Это позволяет более точно идентифицировать хромосомы. Для идентификации хромосом применяют морфометрический метод. При этом вычисляются следующие показатели: 1. Абсолютная длина хромосомы ( La ), мкм. 2. Относительная длина хромосомы длина хромосомы , в %; (Lr )= длина всех хромосом ядра 3. Плечевой индекс (IB )= длина длинного плеча хромосомы ; длина короткого плеча хромосомы Определение IB позволяет разделить хромосомы на группы: метацентрические (отношение длин плеч 1-1,9); субметацентрические (2-4,9); акроцентрические ( ≥ 5). Хромосомы, у которых длина плеч более 8, а форма короткого плеча напоминает шаровидную форму, называют головчатыми. 26 4. Центромерный индекс (IС ) = длина короткого плеча хромосомы , в %. длина всей хромосомы 5. Индекс спирализации (IS ) = суммарная длина двух коротких хромосом , в %. суммарная длина двух длинных хромосом IS применяют для оценки степени конденсации хромосом при отборе метафазных пластинок. Степень конденсации хромосом в разных клетках оценивают и по общей длине хромосом набора. Измерения рекомендуется проводить не меньше чем на 10-30 хромосомных наборах. Полученные данные обрабатываются статистически, определяется достоверность средних величин. Морфометрический метод часто сочетают с составлением поликариограмм. При этом строят график, на оси абсцисс которого откладывают центромерный индекс, на оси ординат относительную длину хромосомы. На графике выявляется положение хромосом относительно друг друга в общем наборе. Задание 1. Изучить и зарисовать препараты с метафазными пластинками различных объектов. Ход работы: 1. Рассмотреть фотографии метафазных пластинок различных организмов. 2. Выполнить рисунок наблюдаемых хромосом. Задание 2. Составить кариограмму и идиограмму хромосом изучаемых объектов. Ход работы: 1. Из ранее выполненного рисунка метафазной пластинки вырезать отдельные хромосомы. 2. Составить кариограмму, используя подготовленные хромосомы. 3. Провести измерение каждой хромосомы и составить идиограмму кариотипа. 4. МИКРОФОТОСЪЕМКА НА ОСНОВЕ АНАЛОГОВОЙ ФОТОГРАФИИ Фотография находит самое широкое применение во всех областях науки. Многие значительные научно-технические открытия и достижения стали возможны благодаря использованию в той или иной мере фотографии и ее методов. В зависимости от характера фотографируемых объектов или от применения фотографии в определенной области науки и техники фотография разделяется на различные специальные виды, которые в настоящее время чрезвычайно разнообразны. Все более широкое применение находят различные специализированные фотографические процессы. 27 Некоторые виды специальной фотографии давно известны и достаточно хорошо разработаны как с теоретической, так и с технической стороны. Таковы, например, репродукционная фотография, макрои микрофотография. Такие виды фотографии, как электрофотография, термография и другие появились недавно и в настоящее время продолжают разрабатываться. Фотография широко применяется в различных областях деятельности человека с конца XIX в. и по настоящее время. Она служит необходимым инструментом, как для исследовательских, так и прикладных целей. В 90-е годы XX столетия в связи со стремительным развитием цифровых технологий все большее распространение получило новое направление в фотографии – цифровая фотография. Как классическая аналоговая, так и цифровая фотография является неотъемлемым средством научных исследований и производственной деятельности по следующим обстоятельствам: • обеспечивает документальность и объективность наблюдений; • дает возможность длительного хранения результатов (на различных носителях); • позволяет фиксировать чрезвычайно кратковременные события; • позволяет непрерывно фиксировать сложные процессы, разделяя их на отдельные этапы. 5.1. Техника аналоговой (галогенно-серебряной) фотографии Для получения аналоговых изображений фотографический процесс протекает в следующей последовательности: 1. С помощью фотоаппарата в плоскости светочувствительного слоя фотоматериала получают оптическое изображение фотографируемого предмета, в результате чего образуется скрытое изображение. Светочувствительный слой может быть нанесен на триацетатную или стеклянную основу. 2. Проявление светочувствительного слоя в растворе проявителя (метол, гидрохинон, амидол и др.), в результате чего скрытое изображение переходит в видимое негативное изображение. 3. Промывка фотоматериала для удаления с его поверхности остатков раствора проявителя. 4. Фиксирование проявленного изображения (удаление непроявленных кристаллов галогенного серебра, в основном AgBr), благодаря чему фотослой перестает быть светочувствительным. 5. Промывка негатива для удаления с его поверхности раствора фиксажа и продуктов фотохимических реакций. 6. Сушка фотографического материала. 7. Печать негативного изображения на позитивный светочувствительный материал (фотобумагу) с последовательным повторением операций по проявлению, фиксированию и промыванию фотоснимков. 28 Задание 1. Ознакомиться с устройством фотоаппаратов "Зенит" и "Зоркий". Задание 2. Овладеть навыками зарядки фотопленки в кассету и фотоаппарат, наведением на резкость, установкой диафрагмы и выдержки в зависимости от снимаемого объекта. Задание 3. Ознакомиться с правилами обработки фотографических материалов для получения негативного и позитивного изображений. 5.2. Микрофотографирование Фотографирование препаратов, изображение которых увеличено микроскопом, важный, а порой и незаменимый способ в практике изучения микроскопических объектов. Микрофотографирование является не только средством для иллюстрации проводимой работы, документации и сохранения во времени изображения микрообъектов, но и научный метод исследования и анализа изображений. Качество микрофотоснимка зависит как от грамотного выбора и использования аппаратуры и фотографических материалов, так и от строения и физико-химических свойств исследуемого объекта. К препаратам, предназначенным для фотографирования, предъявляются повышенные требования. Не допускается разрывов, сморщивания срезов, а также нарушения технологии, связанной с фиксацией и приготовлением препаратов. Фотосъемка может производиться как на микроскопах, снабженных постоянной фотокамерой (МБИ-6, МБИ-15 и др.), а также без неё (Биолам, Микмед, Беломо, Laboval и др.). В последнем случае применяют или специальные опорные кольца или микрофотонасадку типа МФН. Микрофотонасадки МФН-1, МФН-2, МФН-7 дают возможность делать фотоснимки на фотопластинку, а МФН-2, МФН-12 – на фотопленку. Поле зрения микроскопа с камерой для фотопластинок больше, чем с пленочной. Фотографирование на пластинке предпочтительнее, когда, вопервых, производится разовая съемка одиночных объектов, а во-вторых, не предполагается дальнейшее увеличение при изготовлении позитивов. Пленка подходит для массовых съемок и дает возможность осуществить в определенных пределах любое последующее увеличение. Задание 1. Ознакомиться с методикой микрофотографирования на универсальном исследовательском микроскопе с постоянной фотокамерой (МБИ-6). Ход работы: 1. При помощи насадки установить фотокамеру и закрепить её винтом. 2. Открыть крышку фотоокуляров, вынуть салазки из корпуса. Вставить сменные окуляры. При фотографировании с объективом 40Х (планахромат) использовать специальный фотоокуляр 7Х, с объективом планахроматом 20Х применяют компенсационные фотоокуляры. 29 3. Установить апертуру панхроматического конденсора на апертуре объектива. 4. Поворотом винта по часовой стрелке до упора включить фотокамеру. 5. Ввести в ход лучей систему визуального наблюдения за объектом в процессе его съемки на пленку камеры 24 х 36 мм. Для этого нужно повернуть винт, расположенный сбоку микроскопа, против часовой стрелки. 6. Рукоятку зеркала выдвинуть из корпуса до упора. 7. При помощи диоптрийного механизма двух трубок бинокулярной насадки установить по глазу наблюдателя резкое изображение сетки коллективной линзы. Она соответствует размеру кадра фотокамеры. 8. Сфокусировать микроскоп на объект. 9. Включить нужный светофильтр. 10.Определить продолжительность экспозиции при фотосъемке стадий мейоза в зависимости от светофильтра и увеличения микроскопа. Задание 2. Получить на микроскопе МБИ-6 фотоснимки метафазных пластинок изучаемого объекта (например, скерды, сосны обыкновенной, политенных хромосом мотыля или др.). Определить масштаб увеличения. Задание 3. Ознакомиться с методикой микрофотосъемки малоформатным аппаратом без микрофотонасадки. Произвести съемку препарата и объект микрометра. Ход работы: 1. На тубус микроскопа надеть опорное кольцо для установки фотоаппарата, вставить окуляр 7Х и винтом закрепить кольцо на тубусе. 2. Зарядить аппарат фотопленкой (например, Микрат-200) и закрепить его на микроскопе. 3. Произвести установку и центрирование света. 4. На столик микроскопа положить объект-микрометр проходящего света и навести на резкость. 5. Произвести фотосъемку объект-микрометра с различными выдержками. 6. Обработав пленку, рассмотреть негативы для установления нужной выдержки. 7. Заменив на предметном столике микроскопа объект-микрометр микропрепаратом, произвести его фотосъемку. 8. Определить масштаб увеличения полученного снимка. 30 6. ПРИМЕНЕНИЕ ЦИФРОВОЙ ФОТОГРАФИИ В МЕДИКО БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ. АНАЛИЗАТОРЫ ИЗОБРАЖЕНИЯ 6.1. Понятие цифровой фотографии, макро- и микрофотография Стремительное развитие компьютерной техники и наукоемких технологий коснулось всех отраслей биологических исследований и, прежде всего, направлений, связанных с изучением микроскопических объектов. Цифровая фотография активно завоевывает популярность и начинает успешно конкурировать с традиционными методами фотодокументирования результатов микроскопических исследований – с бромосеребряной (аналоговой) фотографией. Цифровым называется изображение, которое закодировано в цифровой форме. В связи с этим появляется возможность отредактировать фотографию на компьютере, воспринимающем только цифровую информацию, отпечатать на принтере, записать на CD-ROM. Одним из основных преимуществ цифрового фото является его моментальная доступность. Многие модели цифровых камер имеют ряд дополнительных возможностей, например видеовыход для телевизора или видеомагнитофона. Это дает возможность просмотра фотографий на экране телевизора и проведения презентаций. Недавно появились камеры с функциями компьютера, позволяющие посылать снятое изображение по электронной почте, передавать файлы напрямую на удаленный компьютер и отправлять их по факсу, создавать на основе полученного цифрового изображения HTML-документы и публиковать их в Интернете. Еще одно преимущество цифровой фотографии – практически неограниченный потенциал редактирования. Появляется возможность удалить с цифрового изображения загрязнения, пыль, пятна и царапины, откорректировать цвета, яркость и контрастность, усилить резкость, изменить фон, вырезать фрагмент и выполнить многие другие операции. Однако, самое главное преимущество цифровой фотографии биологических объектов – простота и скорость получения фотографий исследуемых микроскопических объектов, поскольку в цифровых камерах не используется пленка и, следовательно, не теряется время на ее обработку, не требуются реактивы на ее проявление и печать снимков, не надо экономить кадры. Можно сделать множество дублей, подбирая яркость и контрастность изображения при необходимом увеличении с целью получения наиболее качественного микроснимка. Цифровая камера позволяет исследователю сразу увидеть результат на дисплее камеры или мониторе компьютера. По своей сути, цифровая фотография – это файл, записанный на электронном носителе компьютера. А т.к. компьютер может обрабатывать только цифровую информацию, процесс ввода изображения называется оцифровкой. В результате оцифровки и создается файл с изображением, который записывается на диске. После того, как изображение оцифровано, 31 его можно при необходимости редактировать с помощью графических программ. Прежде чем изображение появится на экране монитора, оно должно быть преобразовано в цифровую форму или закодировано. В свою очередь цифровая компьютерная графика по способу кодирования подразделяется на растровую (точечную) и векторную. В растровой графике, как на экране телевизора или монитора, любое изображение состоит из совокупности очень мелких элементов (точек), которые называются пикселями (pixel). Слово "пиксель" – это аббревиатура от английских слов picture element (элемент изображения). Каждый пиксель изображения отображается в определенном месте компьютерного экрана и имеет точные координаты по горизонтали и вертикали. Растровое изображение проще представить в виде картинки, созданной путем раскрашивания миниатюрных квадратиков на листе миллиметровой бумаги. Размер пикселей очень мал, обычно меньше 0,35 мм. При работе с растровой графикой наиболее популярны Adobe Photoshop, Corel Photo Paint. В векторной графике все изображения описываются в виде математических объектов – контуров. Каждый контур представляет собой независимый объект, который можно перемещать, масштабировать, изменять множество раз. Линии определяются начальными точками и формулами, описывающими сами линии. Векторную графику часто называют также объектно-ориентированной графикой, т.к. изображение состоит из отдельных объектов – прямых и кривых линий, замкнутых и разомкнутых фигур, прямоугольников, эллипсов и т.п. Каждый из них имеет свои характеристики цвета, толщины контура, стиля линии и т.д. К достоинствам векторной графики относится то, что она экономна в плане объемов дискового пространства, необходимого для хранения изображений. Сохраняется не само изображение, а только некоторые основные данные, используя которые, программа всякий раз воссоздает изображение заново. Объекты векторной графики легко трансформируются, что не оказывает практически никакого влияния на качество изображения. Наиболее популярными программами векторной графики являются Corel DRAW, Adobe Illustrator, Macromedia Free Hand. Графическое разрешение. Разрешение изображения или графическое изображение определяет плотность пикселов в изображении и измеряется в пикселях на дюйм (ppi). Чем выше разрешение, тем больше пикселов содержится в изображении, и тем меньше размер этих пикселов. При фотографировании цифровой фотооптикой разрешение изображения определяется разрешающей способностью фотокамеры. Основные форматы растровой графики. Любая компьютерная информация, в т.ч. и фотографическая, может храниться только в определенном формате. Каждый вид информации имеет собственные форматы. Для текста используются одни форматы, для электронных таблиц другие, для графики – третьи. Без формата информацию нельзя ни сохранить, ни передать. Формат графической информации обычно определяется 32 программой, в которой она создана. Существует большое количество форматов хранения цифровых изображений. Наиболее распространенные из них – PSD, BMP, TGA, TIFF. Для Web-графики стандартными считаются форматы JPEG, PNG, GIF и Flashpix (FPX). Все эти форматы – растровые. Формат PSD (расширение файлов .psd) является собственным форматом программы Adobe Photoshop – самого популярного приложения для создания и редактирования изображений. Он поддерживает все цветовые модели, слои и альфа-каналы. Теоретически файлы этого формата могут содержать неограниченное количество слоев, а каждый слой может содержать до 24 каналов. Формат BMP (расширение файлов .bmp) предназначен для Windows и поэтому поддерживается всеми приложениями, работающими в этой операционной системе. Формат позволяет использовать палитры из 2, 16, 256 цветов, а также полную палитру из 16 миллионов цветов. Существует несколько разновидностей этого формата: • обычный, с расширением .bmp; • сжатый, с расширением .rle (сжатие происходит без потерь, но поддерживается только 4- и 8-битный цвет); • формат, не зависящий от устройства (Device Independent Bitmap) с расширением .dib. Формат TGA (расширение файлов .tga) был разработан преимущественно для видеоизображений и максимально приспособлен к телевизионным стандартам, хотя также получил распространение в качестве стандарта сохранения графики. Он поддерживается большинством программ обработки цвета, созданных для операционной системы MS DOS. Формат TGA поддерживает 32-битный цвет. Формат TIFF (Tagged Image File Format – универсальный формат графических файлов, расширение файлов .tif) создан в качестве универсального формата хранения цифровых изображений и имеет самый широкий диапазон передачи цветовой гаммы от монохромного до 24-битной модели RGB и 32-битной модели CMYK. Важным достоинством данного формата является его переносимость на разные платформы, т.е. при сохранении информации можно создать документ, доступный для чтения на компьютерах, совместимых с IBM PC или Macintosh. Файлы этого формата импортируются во все программы настольных издательских систем, с ними можно работать практически в любой программе растровой графики и во многих программах векторной графики, а также в программах видеомонтажа. Формат TIFF поддерживает LZW-уплотнение – алгоритм, позволяющий выполнять сжатие файла без потерь информации. Это – тот же алгоритм, который используется в программах-архиваторах. Следует учитывать, что возможность сжатия является немаловажным достоинством формата при работе с полноцветными изображениями большого размера. Формат JPEG (Joint Photographic Experts Group – объединенная группа экспертов фотографии, расширение файлов .jpg) – самый распространенный формат для хранения фотографических изображений. JPEG является 33 стандартом в Интернете и служит для сохранения растровых изображений со сжатием, уменьшающим размер файла от десятых долей процента до 100 раз за счет сбрасывания избыточной информации, не влияющей на отображение документа. Но практически диапазон сжатия значительно уже: от 5 до 15 раз. При этом алгоритм сжатия может быть настроен на минимальные, практически незаметные для человеческого глаза, потери качества изображения. Следует подчеркнуть, что качество изображения и степень уплотнения обратно зависимы между собой: чем большая степень сжатия задана для результирующего изображения, тем соответственно хуже будет его качество. Формат GIF (Graphics Interchange Format – формат для обмена графической информацией, расширение .gif) характеризуется малым размером файлов и до сих пор рассматривается в качестве одного из основных графических форматов World Wide Web. Из распространенных графических форматов GIF однозначно уступает по степени сжатия только формату JPEG. При этом преимущество JPEG по сравнению с GIF заключается в возможности хранить полноцветные изображения с 16 миллионами цветов, тогда как GIF ограничен лишь 256-цветной палитрой и следовательно малопригоден для хранения фотографических изображений. Однако, если речь идет о монохромном (черно-белом) изображении, данный формат также можно с успехом использовать в работе без очевидной потери в качестве изображения. Формат PNG (Portable Network Graphics – переносимая сетевая графика, расширение файлов .png) делает возможным сжатие растровых изображений и по горизонтали и по вертикали (в отличии от GIF). Это обеспечивает высокую степень сжатия практически без потерь качества изображения. Формат PNG поддерживает цветные графические изображения с глубиной цвета до 48 бит включительно. Формат Flashpix (FPX) – это графический формат, позволяющий сохранять изображения с несколькими разрешениями для презентаций на CD-ROM или в Интернете. Можно просматривать на мониторе изображения этого формата с одним разрешением, а затем при необходимости увеличивать разрешение, чтобы различить детали. Данный формат позволяет работать с высококачественными изображениями без использования большого количества памяти и дискового пространства. Наиболее часто для сохранения изображения применяют форматы TIFF и JPEG. 6.2. Устройство фотоаппаратов и основные принципы работы цифровых Электроника заменила пленку в фотокамерах сравнительно недавно – первые модели цифровых фотокамер появились на рынке в середине 1996 года. Цифровая камера во многом похожа на традиционный пленочный фотоаппарат. Она имеет сходную оптическую систему, но свет, проходящий 34 через объектив, попадает не на светочувствительную пленку, а на специальную светочувствительную CCD-матрицу (CCD – Charge Coupled Device – прибор с зарядовой связью (ПЗС)), состоящую из миллионов электронных датчиков, фиксирующих изображение. CCD-матрица – это фоточувствительный кристалл полупроводника, размером с почтовую марку, который служит для преобразования воспринимаемого изображения в пиксели – элементы изображения. ПЗС содержит сотни тысяч или миллионы резисторов, или элементов выборки. Чем больше элементов-ячеек в ПЗС, тем выше разрешение и качество изображения. Конструкция цифровых фотоаппаратов. Любой фотоаппарат, в том числе и цифровой, можно условно разделить на три части: оптическую систему, состоящую из объектива (иногда с насадками) и затвора; регистратор изображения; устройство хранения отснятых кадров. В обычном (аналоговом) фотоаппарате функции второй и третьей частей выполняет пленка, в цифровом для этого используются два разных устройства. Для регистрации изображения используется электроннооптический преобразователь (ЭОП), а для хранения – флэш-память. Оптическая система. Одной из составляющих фотоаппарата является его объектив. Как правило, фокусное расстояние для цифровой фотокамеры указывается двумя цифрами, например, 6-15 мм (28-72 мм). Это вызвано тем, что размер ЭОП меньше кадра обычной пленки, поэтому линейные размеры оптики тоже меньше. Для обозначения объективов с переменным фокусным расстоянием в англоязычной литературе применяется термин "zoom" ("зум"). Это неправильно, т.к. для объективов такого типа давно существует название вариообъективов. Объективы, фокусное расстояние которых не изменяется, в англоязычной литературе называются fixed focus. Сменная оптика сохранилась в так называемых зеркальных камерах. Зеркальной (SLR-single lens reflex) называется камера, в которой изображение, попадающее в объектив, с помощью специальной оптической системы (зеркала и поворотных призм) проецируется на поверхность экрана фокусировки. Это изображение пользователь наблюдает в видоискателе и визуально контролирует кадрирование и фокусировку. В цифровой фотокамере светочувствительным элементом является ПЗСматрица. От экспозиции, сообщенной матрице, во многом зависит качество снимка – недостаточная экспозиция (называемая недодержкой) приводит к плохой проработке деталей в тенях, избыточная экспозиция (передержка) – к плохой переработке светлых участков. Для управления экспозицией используются диафрагма и выдержка. Диафрагма представляет собой светонепроницаемую преграду с центральным отверстием изменяемого диаметра. Наибольшее распространение получила ирисовая диафрагма. Количественно диафрагма может быть описана относительным отверстием объектива, равным отношению диаметра входного зрачка объектива к его фокусному расстоянию. Для обозначения диафрагмы используется диафрагменное число – величина, обратная относительному отверстию. Ряд 35 численных значений диафрагменного числа выбирается так, что он образует геометрическую прогрессию со знаменателем, равным корню квадратному из двух (например, 1; 1,4; 2; 2,8; 4; 5,6 и т.д.). При данной яркости съемки освещенность его оптического изображения на ПЗС-матрице обратно пропорциональна квадрату диафрагменного числа. Другими словами, чем меньше число, тем больше света попадает на матрицу. Если минимальное значение диафрагменного числа 2,8 и ниже, то объектив считается светосильным. Одну и ту же экспозицию можно обеспечить при различных сочетаниях значений диафрагменного числа и выдержки, называемых экспозиционными параметрами (экспопараметрами). Еще одна важная характеристика ПЗС-матрицы – светочувствительность. Чем выше светочувствительность, тем меньшее количество света требуется для реакции материала. Количественная ее мера – светочувствительное число. Выражается в единицах ISO (International Standards Organization – Международная организация стандартов). С увеличением чувствительности цифровой камеры растет зернистость изображения и его неоднородность. Электронно-оптические преобразователи. После прохождения через оптическую систему световой поток попадает на регистрирующий элемент. В качестве ЭОП используется два типа устройств – ПЗС-матрицы (матрицы приборов с зарядовой связью) и КМОП-матрицы. По конкуренции данные устройства примерно похожи и основное отличие заключается в разрешении. Эта же характеристика является одной из основных при описании цифровой камеры. Если для любительской видеокамеры достаточно матрицы из 300 тысяч элементов, то для фотографии размером 9х12 см необходимо наличие как минимум мегапиксела. Мегапиксельные ПЗС-матрицы с разрешением 1280-960 появились в цифровых фотокамерах только в конце 1997 года. Устройство хранения информации. Для промежуточного хранения и обработки изображения используется буферная память. Она аналогична ОЗУ, используемому в персональных компьютерах. Основное отличие только в том, что при выборе тех или иных микросхем основное внимание уделяется не столько быстродействию, сколько надежности и малому энергопотреблению. Кроме того, если АЦП матрицы обеспечивает высокую пропускную способность, то возможен режим видеосъемки – затвор при этом остается открытым на все время съемки. Характеристики получаемого видеоролика сводятся к следующему: разрешение 640х480, частота 15-30 кадров в секунду, продолжительность зависит от емкости карты памяти. После того, как программное обеспечение камеры создало на основе данных с ПЗС-матрицы полноцветное изображение, возникает задача его сохранения. Графические файлы очень велики и поэтому требуется их дополнительная обработка – сжатие (JPEG). В качестве альтернативы JPEG в некоторых камерах используется формат TIFF. Он тоже позволяет производить сжатие кадра, но в отличие от JPEG потери информации при этом не происходит. Но даже с минимальным сжатием JPEG в несколько раз меньше файла TIFF. Это обстоятельство 36 привело к появлению так называемого формата RAW, когда в долговременную память записывается отпечаток ПЗС-матрицы. При этом размер изображения в десятки раз больше кадра JPEG, и для его просмотра требуется специальная программа. В последнее время этот формат широко внедряется. Появляется различное программное обеспечение с поддержкой формата RAW и для него. К устройствам долговременного хранения предъявляется ряд жестких требований. Во-первых, необходима возможность продолжительного хранения без источников питания. Во-вторых, требуется минимальное энергопотребление при операциях записи/считывания/стирания. В-третьих, время записи/считывания/стирания должно быть как можно меньше. Перечисленным требованиям в наиболее полной мере удовлетворяют конструкции, использующие так называемую флэш-память. Этот тип памяти является промежуточным между ПЗУ (постоянное запоминающее устройство), которое хранит информацию без источников питания, но не позволяет ее модифицировать, и ОЗУ, которое допускает информацию модифицировать, но хранить ее не может. Флэш-память использует питание только при считывании данных и их модификации, причем для считывания необходимо менее высокое напряжение, а для записи – повышенное. Кроме того, в настоящее время создан целый ряд и других устройств хранения информации. 6.3. Цифровая микрофотография в биологии. Основные принципы работы и особенности применения анализаторов изображения в медико-биологических исследованиях Цифровая микроскопия - новейшее направление микроскопии, которая широко применяется в современных биологических и медицинских исследованиях и базируется на анализе изображений, получаемых с помощью цифровых комплексов. Цифровой комплекс или анализатор изображений состоит из цифрового микроскопа и компьютера, со специальным программным обеспечением. Его общая структурно-функциональная схема представлена на рисунке 8. Анализатор изображений (АИ) представляет собой программноаппаратный комплекс, предназначенный для получения, преобразования, количественной обработки изображений и хранения полученной информации. Соединение в единую систему отдельных приборов (микроскопа, цифровой фото- или видеокамеры и компьютера) позволяет получить новые возможности, которыми не обладает ни одна из составляющих сама по себе. Например, ни микроскоп, ни камера, ни компьютер взятые в отдельности не могут измерять оптические параметры объекта, в то время как анализатор изображения, собранный на их основе, способен проводить разнообразные фотометрические измерения различного назначения и степени сложности. 37 Среди специализированных анализаторов изображения наиболее известны томографы, приборы ультразвуковых исследований (УЗИ) и др. Рис. 8. Компьютерная система анализа изображения в микроскопии: 1 – микроскоп; 2 - видеокамера; 3 - адаптер для камеры; 4 - программное обеспечение; 5 - персональный компьютер; 6 - принтер АИ, применяемые в световой микроскопии, представляют собой особый технический комплекс, предназначенный для работы с микрообъектами в световой области спектра 360-770 нм, т.е. в области видимого света. АИ для световой микроскопии, как правило, имеет модульное строение и включает в себя систему ввода изображения (микроскоп, камера), компьютер (ПК) и принтер для документирования на бумажном носителе полученных в ходе исследования результатов. Компьютер обеспечивает в данном модуле управление и контроль вводом и выводом информации, производит измерения и анализ накопленных результатов обработки изображения. Изображение из камеры в виде сигнала поступает в ПК и затем визуализируется на экране монитора. Модульность режима АИ обеспечивает гибкость системы анализа изображений и может быть легко адаптирована к потребностям исследователя в зависимости от стоящих перед ним научных задач не только путем модернизации или замены модуля, но и посредством установки специального программного обеспечения по обработке изображений. Система ввода изображений состоит из светового микроскопа и камеры. Микроскоп обеспечивает выбор поля наблюдения при разных увеличениях и условиях освещения. Таким образом, он формирует изображение на матрице камеры, которая, в свою очередь, передает изображение в виде телевизионного или цифрового сигнала в компьютер. Камера для АИ может быть как черно-белая, так и с цветным изображением и в значительной степени определяет качество изображения и общую скорость работы с АИ. Микроскоп и камера – это единый модуль, в котором отдельные части 38 подбираются по совместимости оптических свойств и соединяются специализированным адаптером. В микроскопе может производиться автоматическая смена светофильтров и объективов, настройка освещения по Келеру и автофокус, перемещение объекта по трем осям XYZ. В этом случае ПК управляет микроскопом в реальном времени, его программное обеспечение (ПО) определяет способ анализа конкретного объекта и является достаточно сложным. Для примера можно привести систему под названием "ночной сторож", который используется в анализаторах изображений для цитогенетических исследований. В частности, при кариотипировании необходимо сначала просмотреть препарат на малом увеличении (объектив х8, х10), найти метафазные пластинки, а уже затем на большом увеличении (объектив х90, х100) провести их анализ. АИ согласно заданной программе автоматически сканирует всю площадь препарата, выявляет участки с метафазными пластинками и запоминает их координаты. После этого ПО, установленное на компьютере, дает команду исполнительному блоку микроскопа сменить поисковый объектив с малого на большое увеличение, перемещает моторизованный предметный столик микроскопа в область с отмеченными координатами, производит настройку на наиболее качественное (резкое) изображение по оси Z и вводит изображение в компьютер. При этом вся работа по поиску и вводу изображений проводится без контроля со стороны человека. Утром, включив компьютер, исследователь просматривает все зафиксированные изображения и отбирает наиболее качественные, подходящие для анализа, метафазы. При необходимости можно дать компьютеру команду вернуться в интересующий сектор препарата с известными координатами. Свойством анализатора является универсальность подхода к анализу, вне зависимости от типа исследуемого объекта. Изображения, полученные с прозрачного или люминесцентного биологического препарата, полированного непрозрачного шлифа горной породы или металла, обрабатываются схожим набором функций. При этом в зависимости от решаемой задачи, меняется набор и порядок применяемых операций. АИ можно систематизировать по функциональному назначению и области применения. По функциональному назначению различают два основных типа АИ – исследовательский и специализированный. Исследовательский АИ предоставляет широкие возможности разностороннего изучения структуры изображений в какой-либо области, например, в биологии, медицине, криминалистике или материаловедении. Специализированные АИ работают на одном конкретном типе препаратов, приготовленных под одной технологии, и решают узкий круг задач, относящийся к данной области (например, в какой-либо отрасли диагностической медицины). В специализированных АИ большое значение придается отчетности и скорости обработки изображений, т.к. они часто используются для контроля в клинических и промышленных лабораториях, где существуют нормативы времени и скорости получения результатов. 39 Медико-биологические анализаторы предназначены для работы с различными объектами живой природы: препаратами с живыми объектами, срезами тканей, цитологическими мазками, флуоресцирующими объектами, препаратами микроорганизмов и т.д. Технология приготовления и окраски препаратов имеет в этом случае ключевое значение. Это один из наиболее важных этапов исследовательской работы с использованием АИ, поскольку зачастую необходимо применение автоматического режима анализа препаратов и успешность данного этапа во многом определяется качеством препарата. Здесь имеется в виду способность клеточных структур и тканей воспринимать различные типы красителей, равномерная толщина среза, отсутствие многослойности при распределении клеток (т.е. наложений). Исследовательские (или универсальные) системы используются в научно-исследовательских или практических лабораториях с широким кругом задач: от поиска наиболее информативных морфометрических критериев для цитологической и гистологической диагностики, до мультипараметрического анализа изучаемого объекта, от самых простых задач (например, подсчет количества клеток) до сложных (например, вычисление морфологических и оптических параметров ядра и цитоплазмы и классификации клеток по структуре ядра и цитоплазмы). В области биологии и медицины можно назвать следующие наиболее распространенные задачи, решаемые с помощью исследовательских АИ: архивирование, которое используется при накоплении материала для дальнейшего исследования, а также для создания информационных и обучающих атласов; улучшение качества изображения – проведение над изображением ряда операций (повышение яркости-контраста, резкости, корректировка цвета, фона и т.д.), совершенствующих визуализацию деталей для получения наиболее качественного изображения; ручные измерения – проведение измерений на изображениях, на которых невозможно автоматическое выделение объектов (например, срезы тканей); распределение по параметру – измерение набора параметров (размера, формы, оптической плотности, цвета, положения и т.п.) для объектов одного типа с получением гистограммы распределения и статистических характеристик проанализированной выборки по любому из параметров; процент количества – определение процентного состава объектов (например, клеток) разных типов (это одна из наиболее распространенных задач в цитологии, цитохимии, гематологии, микробиологии); объемная доля – выделение, измерение и оценка процентного отношения площадей различных участков препарата, что часто применяется морфологами; анализ сложных объектов – измерение комплекса параметров объектов, имеющих внутренние элементы: например, исследование клеток и их структурных элементов – ядер, цитоплазмы, ядрышек. Среди специализированных методик, осуществляемых с помощью исследовательских АИ можно привести следующие: плоидометрию – методику определения содержания ДНК в клетках и тканях, окрашенных по методу Фельгена; иммуногистохимию – оценку результатов 40 иммуногистохимического выявления ферментов в клетках опухолей. В зависимости от количества анализируемого агента меняется интенсивность окраски клеток – от светло- до темно-коричневого цвета (эта методика широко применяется в онкологии). Специализированные комплексы АИ также активно применяются в области биологии и медицины. В частности, компьютерный анализ получил широкое распространение в цитогенетике – разделе генетики, изучающем закономерности наследственности и изменчивости на уровне клетки и субклеточных структур (главным образом хромосом). С помощью методов цитогенетики изучают геном человека, животных, растений, а также преобразования хромосом в ходе эволюции. В медицине анализ хромосом человека проводят с целью выявления врожденных или приобретенных патологий, которые необходимо принимать во внимание при рождении детей и планировании семьи, диагностике и прогнозировании течения заболеваний и т.п. Исследование хромосом животных и растений используется при проведении селекционных работ в растениеводстве и животноводстве. Цитогенетический анализ хромосом заключается в изучении их морфофункциональных особенностей с помощью микроскопа. Цитогенетика использует набор методов микроскопического анализа (например, кариотипирование, FISH-анализ, метод CGH) при активном применении АИ. Кариотипирование – наиболее распространенный в практике метод, заключающийся в исследовании количества и строения хромосом. С помощью специальной пробоподготовки из клеток (лимфоцитов крови, клеток опухолей, ворсинок хориона, клеток, содержащихся в амниотической жидкости, корешках проростков семян и т.д.) получают препарат, на котором можно наблюдать полный набор хромосом. На сегодняшний день существует целый комплекс различных способов дифференциального окрашивания, которые позволяют получить на каждой хромосоме уникальный рисунок чередования темных и светлых полос (исчерченность или бендинг). Размеры и количество сегментов неодинаковые. Морфология хромосом сильно варьирует во время клеточного цикла и наиболее объективную информацию о ней можно получить на стадиях прометафазы и метафазы. По исчерченности проводят идентификацию хромосом, т.е. присваивают им соответствующий номер. Каждый биологический вид имеет уникальный набор хромосом, т.е. кариотип. Например, нормальный набор хромосом человека согласно международной классификации (ISCN, 1981) в соматических клетках содержит 22 пары аутосом и одну пару половых хромосом (у женщин – XX, у мужчин - XY). У животных количество хромосом определяется видовой принадлежностью. Каждая гомологичная пара хромосом имеет свой уникальный рисунок (исчерченность). FISH-анализ (fluorescent in situ hybridization) – современный цитогенетический метод, в основе которого лежат различные варианты нерадиоактивной гибридизации на хромосомных или цитологических препаратах. Гибридизация in situ – метод определения местоположения ДНК в клетке или хромосоме прямо в местах их реального местоположения (in situ 41 – непосредственно на месте). Метод используется для картирования хромосом животных, растений и человека; определения расположения ДНК непосредственно в определенных участках хромосом; идентификации хромосомных перестроек с помощью специфических ДНК-проб; определения дозы ионизирующей радиации с использованием хромосом специфических проб; визуализация местоположения отдельных сегментов хромосом в интерфазных ядрах – на стадии митотического цикла, когда эти ядерные структуры не распознаются микроскопически. Принцип in situ гибридизации состоит в следующем: меченая флуорохромами (красителями, не вызывающими сильной окраски в обычном свете, но флуоресцирующими при облучении лучами определенной длины, что можно наблюдать в люминесцентном микроскопе) и денатурированная нуклеокислота (зонд) наносится на исследуемый цитологический препарат, предварительно прошедший специальную предобработку. При этом создаются условия для формирования дуплекса меченой ДНК и ДНК цитологического препарата. Несвязанная меченая ДНК отмывается, а затем проводится детекция (обнаружение) гибридизованного (встроенного) ДНК-зонда с помощью люминесцентного микроскопа. АИ позволяет автоматизировать работу исследователя при анализе FISHпрепарата, а использование камер с большим временем накопления светового сигнала позволяет регистрировать очень слабые световые сигналы, ранее недоступные исследователю. В отечественной цитогенетической практике FISH-анализ, как правило, ограничивается использованием 2-3 флуорохромов. При этом все большее распространение получают методы многоцветного FISH (более 3-х цветов) анализа. Например, метод 24цветного FISH использует 5 и более флуорохромов. Применение их уникальных комбинаций позволяет получать в результате гибридизаций каждую хромосому, окрашенную в свой псевдоцвет. Это позволяет выявлять транслокации в негомологичных хромосомах. Метод CGH – сравнительная геномная гибридизация (comparative genomic hybridization) – молекулярная цитогенетическая технология, объединяющая стандартную методику кариотипирования и FISH-анализ. Данный метод позволяет провести полный анализ структурных хромосомных аномалий всего генома в пределах одного эксперимента. Метод CGH основан на сравнении тестируемой и контрольной ДНК, меченных разными флуорохромами, которые смешиваются в соотношении 1:1 и гибридизируют на метафазных кариотипически здоровых хромосомах. Хромосомный дисбаланс в исследуемом образце оценивают по разнице в интенсивности флуоресценции. Метод CGH нашел широкое применение в клинической генетике. Специализированные комплексы АИ также активно используют в прикладных медико-биологических направлениях, например, в сперматологии и гематологии, позволяя решать самый широкий круг практических задач. 42 7. ТЕХНИКА МИКРОФОТОГРАФИРОВАНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЦИФРОВОЙ КАМЕРЫ-ОКУЛЯРА DCM 7.1. Техническая характеристика цифровой камеры DCM DCM-300 – это цифровая камера-окуляр (Digital Camera Microscopy), специально созданная для работы с микроскопом. Она хорошо функционирует со всеми видами оптических микроскопов – биологическими, инструментальными, моно- и стереоскопами. Изображение наблюдаемого объекта может быть в точности передано на экран компьютера. В комплект цифровой камеры входит программное обеспечение – программа Mini See (Scope Photo), что дает возможность делать фотографии и видеозаписи, а также проводить их последующую обработку. Цифровая камера DCM-300 – оптическая система с полным многослойным просветлением и функцией улучшения частотно-контрастной характеристики изображения для получения большей яркости и контраста. Даже на периферийных участках поля зрения на выходе формируется яркое и четкое изображение объектов. Это является прекрасной характеристикой для использования с системой планахроматических объективов. Камера имеет широкое поле зрения, совпадающее с полем зрения микроскопа (18 мм). Для микроскопов с монокулярной, бинокулярной или тринокулярной головкой объектив камеры DCM-300 просто вставляется в окулярную трубку вместо окуляра и фиксируется штатным крепежом. Камера спроектирована с упором на максимально возможную правильную передачу, благодаря чему можно наблюдать изображение в реальном цвете. Среди технических характеристик данной модели следует отметить следующие: чувствительный элемент – 3 000 000 пикселей, максимальное разрешение – 2048x1536; выход – USB 2.0, 480 Мб/с; питание – через USB 2.0 кабель; программные возможности позволяют регулировать размер изображения, яркость, время выдержки; поле зрения – вписанный квадрат в Ø 18 мм; форматы применяемых файлов – bmp, tif, jpg, ict, sftl и т.п.; системные требования – Windows 2000 / XP, USB порт; программное обеспечение – специальный драйвер, Scope Photo, Mini See. Примеры микрофотографий картин митоза в норме и при патологиях у лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), полученных с помощью цифровой фотокамеры-окуляра DCM-130, представлены в приложении. 7.2. Порядок работы с цифровой камерой-окуляром DCM при изучении микропрепаратов Задание 1. Изучить особенности работы с цифровой фотокамерой-окуляром DСМ (130, 300, 500) 43 Оборудование: 1. Микроскоп (бинокулярный или тринокулярный) со съемными окулярами; 2. Цифровая фотокамера-окуляр DСМ (130, 300, 500); 3. Персональный компьютер с установленными программами Scope Photo или Mini See. Ход работы: 1. Включить источник освещения микроскопа. 2. Установить препарат на предметный столик микроскопа. 3. Изучить препарат и выбрать поля для фотосъемки. 4. Осторожно вынуть один из окуляров микроскопа (предпочтительнее правый) и на его место установить фотонасадку, предварительно удалив с нее защитный чехол. 5. Подключить кабель фотонасадки к USB-порту компьютера. 6. Включить компьютер и войти в программу Scope Photo. На экране монитора появится общий вид окна программы. 1-я строка – строка заголовка окна, на которой высветится название программы. 2-я строка – полоса Меню, на которой расположены 4 группы команд: File (Файл), View (Просмотр), Options (Опции), Help (Помощь). 3-я строка представлена панелью инструментов, которая содержит кнопки для быстрого доступа к наиболее часто используемым командам Меню программы. Каждая из этих команд содержит опции, доступные при обращении к ней. 7. На панели инструментов выбрать кнопку с изображением видеокамеры (Direct Show Capture) и нажать на нее левой клавишей мыши. При этом на экране появится черное поле с названием в строке заголовка Video, ограниченное измерительными шкалами. Далее, в строке меню выбрать команду Devices (Приспособления) и нажать не нее левой кнопкой мыши. Откроется список обращений для разных моделей фотокамерокуляров: DCM – 130, 300 или 500. Выбрать необходимое обращение в соответствии с установленной в данный момент моделью фотонасадки. Например: Scope Tex DCM 300. При этом открывается большое окно, в котором отражено текущее изображение препарата (микроскоп при этом должен быть включен). Размеры данного окна, как правило, превышают размеры экрана монитора. Это окно можно использовать для рабочего просмотра микропрепарата. Следует принять во внимание, что для наиболее удобной работы исследователя с полученной видеосистемой (микроскоп, фотонасадка, компьютер) следует так разместить (повернуть) корпус камеры в тубусе окуляра, чтобы направление перемещения изображения в микроскопе совпадало с направлением перемещения изображения на экране монитора. Другими словами, расположение изображения объекта в микроскопе должно четко соответствовать расположению его изображения на экране монитора. Для уменьшения размеров окна с видеоизображением препарата можно воспользоваться кнопкой масштаба 2 : 1, расположенной на панели 44 инструментов. При необходимости, на этом этапе можно отрегулировать яркость освещения препарата системой регулировки осветителя микроскопа. 8. Программа Scope Photo позволяет не только проводить просмотр препарата в экранном режиме (на мониторе компьютера), но и осуществлять фотографирование объекта исследования. Для этого на панели инструментов следует выбрать кнопку с изображением фотоаппарата. На экране появится новое окно со шкалой меньшего размера. Мышью можно регулировать размер данного окна и осуществлять выбор необходимого участка поля в соответствии со стоящими задачами исследования. Масштаб этого окна при желании можно изменить, растягивая или сокращая рамку шкалы. Установив нужный размер экрана и, выделив изучаемый участок, можно провести фотографирование. Для сохранения изображения (фотографирования) закрыть текущее (малое) окно и на вопрос системы "Сохранить изображение?" кликнуть кнопку "Да". После этого в предложенном окне сфотографированному файлу необходимо выбрать путь сохранения, присвоить имя и установить тип расширения. Для оптимизации размера файла лучше всего сохранять изображение в формате JPEG, хотя возможно сохранение и в других распространенных форматах (TIFF, BMP) В программе имеется возможность регулировать глубину разрешения изображения. Для этого в команде Setup выбрать подкоманду Video Stream Format. В появившемся окне Свойства следует установить необходимое разрешение изображения: от 800 : 600 pin до 2048 : 1536 pin (для DCM 300). При этом следует иметь ввиду, что просмотр препарата можно осуществлять при меньшем разрешении (оптимально: при 1280 : 1024 pin), а фотографировать объект лучше при наибольшем разрешении: 2048 : 1536 pin. 9. Микрофотографирование можно провести и с помощью программы Mini See. Общий вид окна программы: также как и в Scope Photo сверху располагаются 3 строки (строка заголовка, строка меню, строка панели инструментов). В строке панели инструментов выбирается команда Folders. В открывшемся проводнике следует выбрать папку, в которую будут сохранены сделанные фотографии. Далее на панели инструментов выбирается команда Video. В появившемся окне в строке меню следует активировать команду Divices и по аналогии с программой Scope Photo выбрать необходимое обращение, например, Scope Tek DCM 300. Как правило, цитологические микрофотографии принято представлять в монохромном варианте, если спецификой методик исследования или стоящими задачами не предусмотрено изображение объекта, выполненное в более широкой цветовой гамме (например, при люминесцентном исследовании, при применении флуоресцентной гибридизации in situ и др.). Для того, чтобы перевести цветное изображение в черно-белое, следует выбрать в строке меню команду Options, а затем из меню данной группы команд выбрать команду Video Capture Filter. При этом открывается окно Свойства. В нем следует обратиться к команде Misc и активировать 45 функцию Black / White. Если необходимо отменить черно-белое изображение, используют тот же путь, но с отменой выбранной функции. В меню Options имеется функция установки разрешения изображения на экране. Для этого следует выбрать подкоманду Video Capture Pin и установить необходимое разрешение: от минимального (800 х 600 pin) до максимального (для данной модели 2048 х 1536 pin). В просмотровом режиме рекомендуется выбрать минимальное разрешение, а для режима фотографирования лучше установить максимальное в целях повышения качества снимка. После того, как определено необходимое для съемки изображение, следует в строке панели инструментов выбрать команду Capture. Отснятая фотография будет отправлена в предварительно открытую папку. 10. Дальнейшая обработка полученных фотоизображений (изменение цветовой гаммы, четкость, контрастность, насыщенность освещения) может быть осуществлена с помощью специальных программ по работе с цифровыми изображениями (Adobe Photoshop, Microsoft Photo Editor и др.). 7.3. Получение микрофотографий и их последующая обработка Задание 1. Получить микрофотографии изучаемых объектов (метафазных пластинок и т.д.) с помощью микрофотонасадки DCM. Ход работы: 1. Рассмотреть препараты при малом увеличении. Выбрать пластинки с хромосомами, лежащими в одной плоскости, не налегающими друг на друга. 2. При увеличении окуляра 15Х и объектива 90Х (100Х) используя микровинт рассмотреть каждую хромосому. 3. Сфотографировать поле зрения с хромосомами, используя цифровую видеонасадку DCM и компьютер с соответствующим программным обеспечением (Scop Photo, Mini See). 4. Распечатать на принтере фотографию с изучаемыми хромосомами. Задание 2. Идентифицировать хромосомы морфометрическим методом на полученных фотографиях. Ход работы: 1. На фотораспечатке обвести контуры каждой хромосомы. Уточнить расположение первичных и вторичных перетяжек (сравнить микропрепарат с полученным фотоизображением на бумаге). 2. Определить масштаб увеличения, используя линейку объект-микрометра. 3. Перерисовать хромосомы на кальку и составить кариограмму. 4. Измерить длину каждого плеча хромосом, результаты нанести на миллиметровую бумагу. Для составления идиограммы определить абсолютную и относительную длину хромосом, плечевой и центромерный индекс (см. гл. 4). 46 Для определения масштаба увеличения изучаемых объектов, проводимого посредством окуляр-микрометров (см. гл. 2), также можно применять видеонасадку DCM и компьютер. Задание 1. Определить масштаб увеличения изучаемого объекта с помощью объект-микрометра на экране монитора. Ход работы: 1. Убрать препарат из-под объектива микроскопа и на его место установить линейку объект-микрометра. 2. С помощью установленной видеонасадки вывести изображение линейки оъект-микрометра на экран монитора. 3. Измерить ученической линейкой общую длину делений объектмикрометра, видимых на экране. 4. Произвести расчет увеличенного изображения объекта. 5. Аналогичную работу провести с фотографиями изучаемого объекта. 47 ЛИТЕРАТУРА 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Агапова Н.Д. О хромосомной терминологии / Н.Д. Агапова, В.Г. Гриф // Ботанический журнал. – 1982. – Т. 67, № 9. – С. 1280-1284. Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза / И.А. Алов. – М. : Медицина, 1972. – 264 с. Алов И.А. Проблемы патологии митоза / И.А. Алов // Цитология. Итоги науки и техники. ВИНИТИ. – М., 1976. – Т. 3. – С. 40-66. Боровиков В.П. Statistica: Статистический анализ и обработка данных в среде Windows / В.П. Боровиков, И.П. Боровиков. – 2-е изд., стер. – М. : Информационно-издательский дом Филинъ, 1998. – 592 с. Воронин Н.С. Руководство к лабораторным занятиям по анатомии и морфологии растений / Н.С. Воронин. – М. : Просвещение, 1981. – 160 с. Гриф В.Г. К методике описания кариотипов растений / В.Г. Гриф, Н.Д. Агапова // Ботанический журнал. – 1986. – Т. 71, № 4. – С. 550-553. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика: учебное пособие / И.Ф. Жимулев. – Новосибирск : Сиб. унив. изд-во, 2003. – 479 с. Кулаичев А.П. Методы и средства анализа данных в среде Windows. STADIA 6.0 / А.П. Кулаичев.— М. : Информатика и компьютеры, 1996.— 257с. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. – М. : Высш. шк., 1990. – 352 с. Литвинов Н.Н. Я люблю цифровую фотографию. 20 программ для хранения, обработки, печати и демонстрации цифровых фотографий. Учебное пособие / Н.Н. Литвинов. – М. : Только для взрослых, 2002. – 448 с. Овсянников Н.А. Специальная фотография / Н.А. Овсянников. – М. : Недра, 1966. – 292 с. Пантелеев В.Г. Компьютерная микроскопия / В.Г. Пантелеев, О.В. Егорова, Е.И. Клыкова ; рец. Г.Г. Автандилов. – М. : Техносфера, 2005. – 304 с. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений / З.П. Паушева. – М. : Колос, 1998. – 271 с. Практикум по цитогенетике / С.А. Гостимский [и др.]. – М. : Изд-во Московск. ун-та, 1974. – 172 с. Стародуб Д.О. Азбука фотографии / Д.О. Стародуб. – М. : Искусство, 1990. – 304 с. Федин Л.А. Микрофотография / Л.А. Федин, И.Я. Барский ; под ред. Н.И. Полякова. – Л. : Наука, 1971. – 220 с. Ченцов Ю.С. Введение в клеточную биологию: учебник для вузов / Ю.С. Ченцов. – М. : ИКЦ Академкнига, 2004. – 495 с. 48 ПРИЛОЖЕНИЕ Микрофотографии картин митоза в норме и при патологиях у некоторых видов хвойных древесных (сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) и лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.)), выполненные с помощью цифровой фотокамеры-окуляра DCM. а б в г Рис. 1. Протекание фаз митоза у Larix sibirica Ledeb. в норме: а – профаза, б – метафаза, в – анафаза, г – телофаза. 49 а б в д г е Рис. 2. Типы патологий митоза у Larix sibirica Ledeb. (указаны стрелками): аб – мосты в анафазе; в-г – мосты в телофазе; д – агглютинация (слипание) хроматина в прометафазе; е – цитомиксис. 50 ж з и Рис. 2 (продолжение). Типы патологий митоза у Larix sibirica Ledeb. (указаны стрелками): ж – цитомиксис и подготовка ядер к цитомиксису в нескольких соседних клетках; з – микроядро; и – двуядерные клетки. 51 а б в г д Рис. 3. Протекание митоза у Pinus sylvestris L. в норме (указано стрелками): а - профаза; б – метафаза; в-г – анафаза; д –указано телофаза. 52 а б в г д Рис. 4. Наиболее часто встречающиеся типы патологий митоза у Pinus sylvestris L. (указано стрелками): а-б – мосты в анафазе; в – мосты в телофазе; г – микроядро в интерфазной клетке; д - микроядро в метафазе.
