МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Чувашский государственный аграрный университет » (ФГБОУ ВО Чувашский ГАУ) Кафедра эпизоотологии, паразитологии и ветеринарно-санитарной экспертизы КУРСОВАЯ РАБОТА По дисциплине: «Ветеринарная микробиология и микология» На тему: «Характеристика и лабораторная диагностика возбудителя анаэробной дизентерии ягнят» Выполнил: студент 3 курса, 3п/гр. Архипова Татьяна Ивановна Ветеринарной медицины и зоотехнии Руководитель: доцент Кандидат ветеринарных наук Тихонова Галина Петровна Чебоксары 2020 План курсовой работы Введение ................................................................................................................... 3 1. Обзор литературы. ................................................................................................ 4 2. Краткая характеристика государственной ветеринарной лаборатории. ..... 11 3. Результаты собственных исследований (специальная часть): ...................... 14 3.1. Материалы и методы исследований ............................................................. 14 3.2. Результаты исследований ............................................................................... 20 Выводы. .................................................................................................................. 27 Список использованной литературы. .................................................................. 28 Приложение. .......................................................................................................... 29 2 Введение Курсовая работа посвящена изучению возбудителя анаэробной дизентерии ягнят – микроорганизму Clostridium perfringens, семейства Clostridiaceae. Анаэробная neanatorum дизентерия anaerobica) новорожденных ягнят острая - животных в (Disenteria agnorum, токсикоинфекция, первые пять дней Dysenteria поражающая жизни. Болезнь характеризуется геморрагической энтеротоксемией, воспалением кишечника и диареей. Вызывается сероваром B C. perfringens (Lamb dysentery bacillus). В России массовые заболевания ягнят диареей, наблюдаемые на крупных овцеводческих фермах, впервые были описаны как «повальный понос ягнят» в конце XIX века. Так, П.Н. Кулешов, П. Никольский и Березов описали дизентерию ягнят, как кровавый понос, в 1885 году. Описанная болезнь повторялась ежегодно в течение нескольких лет в период массового ягнения, когда ежедневно, в период массового ягнения, из рождавшихся 100 особей, диареей болели около 70; от 30 до 50 из них погибли. Деллинг и Гайгер (1922 году), при изучении этиологии диареи, выделили возбудителя и дали название болезни. Дизентерия ягнят широко распространена в районах овцеводства тонкорунных пород и наносит значительный экономический ущерб по причине высокой смертности (до 80—100%). Объектом данной работы является возбудитель анаэробной дизентерии ягнят, предметом которого является характеристика заболевания; характеристики возбудителя, биопрепараты и иммунитет. Целью и задачами данной работы является изучение характеристики заболевания, вызванного патогеном, и его лабораторной диагностики. 3 1. Обзор литературы. Возбудителя клостридиозов – Clostridium perfringens, открыли и описали в 1892 г. Уэлч и Неттал. Он широко распространен в природе и встречается повсеместно, особенно на почвах, богатых гумусом. Патогенные штаммы микроба выделяют из земли, загрязненной фекалиями животных. Основным резервуаром микроба являются здоровые животные, в ЖКТ которых C. perfringens размножается и выводится в окружающею среду с фекалиями. Таким образом происходит контаминация кормов, пастбищ, почвы вегетативными формами, а после спорами: микроб быстро спорулирует. C. perfringens – самый нетребовательный, очень биохимически активный и весьма патогенный анаэроб. Морфология. Возбудитель– C. Perfringens типа В, представляет из себя неподвижную, без жгутиков, короткую, толстую палочку с обрубленными или слегка закругленными концами, длиной 4-8 и шириной (0,6-0,5) 1,5 мкм. В мазках палочки обычно располагаются одиночно, попарно, иногда в виде цепочки. При воздействии различных факторов (антибиотики, состав среды и др.) форма бактерий может сильно изменяться: в культуре наряду с типичными клетками обнаруживают короткие толстые палочки, иногда кокковидной формы, или же длинные нити до 100-145 мкм. Палочки нередко бывают изогнутыми.[ Колычев Н.М.] C. Perfringes в организме животных образует капсулу, которая окружает тело микроба в виде светлого ободка, что хорошо видно при микроскопировании мазка окрашенного простым способом. C. perfringens хорошо окрашивается всеми анилиновыми красками, стоит отметить, что в мазки молодых культур по Грамму окрашиваются положительно, старых – слабо или отрицательно. Возбудитель является 4 спорообразующим микробом. Споры располагаются центрально или субтерминально. Форма спор овальная, диаметр их несколько шире диаметра палочки. Вегетативные клетки малоустойчивы, резистентность же спор, напротив, очень высокая. Споровые формы микроба в почве сохранят свою жизнеспособность до 4-х лет, выдерживают кипячение в течение 5-9 минут. При температуре 90°С -30минут. В навозе сохраняется в течение 3-5 дней. Креолин 5% убивает микроб менее чем за 3 минуты, известковое молоко (1020%), 1-2%-ный раствор едкого натрия и 3%-ный лизол уничтожают возбудителя в течение одной минуты, 2-3% -ная карболовая кислота и 96° спирт – в течение 3 минут. [Госманов Р.Г. и др.] Биохимические свойства. Микроб обладает протеолитическими свойствами. Свернутую сыворотку и вареные кусочки мяса разжижает медленно – на 2-7-е сутки. Характерное свойство для C. perfringens – способность свертывать лакмусовое молоко с образованием сгустка кирпичного цвета и полным просветлением молочной сыворотки. Все штаммы C. perfringens сбраживают глюкозу, галактозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, левулезу с образованием кислоты и газа и не ферментируют маннит и дульцит. [Госманов Р.Г. и др.] Токсинообразование. Основными вирулентными факторами, участвующими в развитии гастроэнтерита и других инфекций, являются внеклеточные токсины, вырабатываемые бактериями. C. perfringens вырабатывает сложный экзотоксин, образующий свыше 15 токсических факторов. [ Колычев Н.М.] К основным токсическим факторам относят: α-токсинфосфолипаза (лецитиназа C) – один из главных факторов, обладающий летальным, некротическим, гемолитическим и цитопатогенным действиями; β-токсин – летальный некротический фактор; гамма-токсин – летальный, не обладающий гемолитической активностью, фактор; δ-токсин – 5 летальный и гемолитический яд; ε-токсин – летальный некротический протоксин, активирующийся трипсином; τ-токсин обладает резко выраженными гемолитическими и в слабой степени летальными и некротическими свойствами; йота-токсин – летальный, некротический протоксин, активирующийся трипсином; каппа-токсин представлен коллагеназой, действующей на нативный коллаген; λ-токсин – желатиназа, действующая на денатурированный коллаген и желатин; μ-токсин – гиалуронидаза; ни-токсин – дезоксирибонуклеаза. Сложный состав экзотоксинов бактерий этого вида определяет его разностороннее действие и спектр патогенности. [Бессарабов Б.Ф.] Антигенная структура. По антигенному составу токсических факторов различают шесть сероваров C. perfringens: А, В С, D, Е и F. Патогенность. Штаммы типа А вызывают наиболее разрушительное заболевание называемое газовой гангреной. Типы B, C, D и E в основном ответственны за ветеринарные специфические инфекционные болезни у животных различных видов: анаэробной дизентерии ягнят, энтеротоксемии овец, телят и др. [S. Skariyachan1 at all.] Серовар А (C. welchii) вызывает газовую гангрену (злокачественный отек) у людей и животных, а штаммы, образующие энтеротоксин, – пищевые токсикоинфекции. Является возбудителем энтеротоксемии телят и поросят, а также некротического мастита овец, коз и крупного рогатого скота. Синтезирует альфа-, тета- и каппа-токсины. Серовар В (Lamb dysentery bacillus) вызывает анаэробную дизентерию (некротический энтерит) ягнят, козлят, телят, поросят, жеребят и цыплят. Токсические компоненты: α-, β-, ε-токсины, протеиназа и гиалуронидаза. Серовар С (В. paludis) вызывает геморрагическую энтеротоксемию 6 овец, реже телят, ягнят, поросят, коз и верблюдов. Синтезирует α- и βтоксины. Серовар D (В. ovitoxicus) – возбудитель энтеротоксемии овец («мягкая почка»), выделен так же при энтеротоксемии коз, телят и при «травяной болезни» у лошадей. Образует α- и ε-токсины. Серовар Е (C.perfringens typ E) выделяют при энтеротоксемии телят и ягнят. Синтезирует α- и йота-токсины, а также активные коллагеназу и протеиназу. Серовар F (В. enterotoxicus) вызывает некротический энтерит людей, выделяет α- и β-токсины. [Госманов Р.Г. и др.] В эксперименте чувствительны к заражению голуби, воробьи, морские свинки, более устойчивы белые мыши, крысы, кролики. Этиология. Клостридии интенсивно размножаются в щелочной среде, продуцируя экзотоксин. Токсин вызывает изъязвление и некроз отдельных участков тонкого кишечника и в большом количестве проникает в кровоток, вызывая общую интоксикацию организма. Эпизоотологические данные. Анаэробной дизентерией болеют новорожденные ягнята в возрасте от нескольких часов до 10 дней, чаще 2-5 дней. В более старшем возрасте животные заражаются редко. Источник инфекции - больные животные, выделяющие возбудитель с калом, а также здоровые взрослые животные-бациллоносители, в кишечнике которых C. perfringens может размножаться и периодически выделяться с фекалиями во внешнюю среду, инфицируя почву, территорию хозяйства, подстилку, инвентарь и все предметы, с которыми могут контактировать новорожденные ягнята. Споры способны длительное время сохраняться в почве, что определяет стационарность 7 (энзоотичность) анаэробной дизентерии. Болезнь неконтагиозна. Инфицирование ягнят происходит алиментарно при сосании загрязненного вымени, при облизывании зараженных объектов (кормушка, подстилка и др.). Серьёзную опасность представляют собой неубранные своевременно трупы павших ягнят, оставленные непродезинфицированными места, где они лежали, и т.д. Болезнь имеет сезонный характер и проявляется в период массового окота, который в овцеводческих хозяйствах обычно совпадает с началом весны. Одной из причин появления болезни может быть неполный охват вакцинацией поголовья овцематок, снижение резистентности и колострального иммунитета по причине низкой упитанности животных. В одних хозяйствах болезнь регистрируется каждый год, в других может не отмечаться в течение порядка лет. Это зависит от наличия факторов, способствующих внутриутробного развития заболеванию плода, (неблагоприятные переохлаждение условия новорождённых, антисанитарные условия содержания ягнят, теснота в кошарах, плохое кормление овцематок). Пик эпизоотической вспышки от единичных случаев до массового поражения ягнят приходится на 15-20-й день после появления первых случаев болезни. Вначале инфицируются животные с пониженной устойчивостью, в дальнейшем инфекция, пассажируясь, усиливает вирулентность и поражает здоровых ягнят. [Полыковский, М. Д.] В неблагополучных районах заболеваемость колеблется из года в год от единичных случаев до 15-30% ягнят неблагополучной отары, летальность может достигать 100%. Иммунитет. При анаэробной дизентерии ягнят формируется антитоксический иммунитет – переболевшие животные приобретают 8 стойкую невосприимчивость к повторному заражению. У ягнят, полученных от вакцинированных овцематок, формируется колостральный иммунитет, продолжающийся до 1,5 - 2 месяцев. Лечение. Применяют гипериммунную сыворотку, синтомицин, норсульфазол (интравенозно и с кормом) и др. сульфаниламиды. Палочка вырабатывает устойчивость к большинству обычных классов известных антибиотиков и изменяется как "супербактерия". [S. Skariyachan1 at all.] Больных животных к убою не допускают. При установлении болезни тушу и шкуру утилизируют. В профилактике дизентерии ягнят основное место занимает активная иммунизация маток перед окотом. Для этой цели используют поливалентный анатоксин против (концентрированную клостридиозов овец или гидроокисьалюминиевую) поливалентную вакцину. ГОА Вакцинация истощённых маток обычно даёт плохой эффект. [Бессарабов Б.Ф.] В неблагополучных районах вакцинации подвергают все поголовье овец, начиная с 3-месячного возраста, согласно правилам применения вакцины или полианатоксина. Профилактическую вакцинацию суягных маток проводят за 1,5(1)-2 мес до начала окота, так как после рождения ягнята получают материнские антитела с молозивом. По достижении 6месячного возраста ягнят ревакцинируют двукратно в дозах, предусмотренных для взрослых овец. Вынуждено вакцинируют в любые сроки в случае появления заболевания среди не привитого поголовья овец. В период проведения прививок кастрация и стрижка поголовья овец запрещены. [Полыковский, М. Д.] Кроме вакцин используют антитоксическую сыворотку против анаэробной дизентерии ягнят и инфекционной энтеротоксемии овец. В целях профилактики для пассивной иммунизации новорожденным через 1-2 ч 9 после окота вводят сыворотку подкожно в дозе 50-100 ИЕ, при лечении внутримышечно или внутривенно в дозе 100-200 ИЕ. В предупреждении дизентерии ягнят большую роль играет соблюдение вет.-сан. и зоогигиенических правил кормления и содержания животных. При появлении заболевших ягнят и маток отделяют и лечат. В кошаре проводят дезинфекцию 6—10%-ным р-ром хлорной извести, 5%-ным р-ром креолина. [Полыковский, М. Д.] Суягные овцематки, особенно в последней трети суягности, когда происходит наиболее интенсивный рост плода, должны быть обеспечены полноценным кормлением. В помещении кошары строго соблюдены ветеринарно-санитарные параметры, нельзя допускать сырости, сквозняков и грязи. Новорожденные ягнята (особенно мериносы), весьма чувствительны к низкой температуре, заболеваниям, легко приводящим подвергаются к простудным значительным потерям и другим молодняка. Следовательно, необходимо подготавливать подходящие помещения для суягных овец и молодняка. Перед постановкой овец на стойловое содержание помещения следует Объягнившихся тщательно овец с очистить ягнятами и необходимо продезинфицировать. размещать отдельно небольшими группами, не допуская скученности. Овчарни должны иметь достаточную световую площадь и быть оборудованы вентиляцией. На зимний период при овчарне должен быть необходимый запас подстилки, используемый для суягных и подсосных маток. За 2-3 недели до начала ягнения овчарни следует очистить продезинфицировать. 10 от навоза и тщательно 2. Краткая характеристика государственной ветеринарной лаборатории. БУ ЧР "Чувашская республиканская ветлаборатория" Госветслужбы Чувашии является современным республиканским ветеринарным лабораторно диагностическим центром. Находится по адресу 428020, Чувашская Республика - Чувашия, город Чебоксары, Базовый проезд, 19. Основным видом деятельности является "Ветеринарная деятельность". В настоящее время в БУ ЧР "Чувашская республиканская ветлаборатория" Госветслужбы Чувашии организовано 8 отделов: 1. Бактериологический отдел 2. Биохимический отдел 3. Отдел болезней птиц, рыб, мелких животных и паразитологии. 4. Отдел ветеринарно-санитарной экспертизы и молекулярной диагностики 5. Отдел вирусологии 6. Отдел приемки материала 7. Серологический отдел 8. Химико-токсикологический отдел Штат лаборатории в настоящее время состоит из 58 человек, в том числе 24 ветеринарных врача. Директором лаборатории является Трифонов В.Е. В настоящее время в лаборатории используются самые разнообразные методы диагностической работы, в том числе бактериологический, биологический, паразитологический, серологический, токсикологический, микологический, вирусологический с использованием люминисцентной микроскопии и флуорисцирующих антител. 11 Бактериологический отдел. Основная задача его - диагностика заболеваний животных бактериальной этиологии. Для этого используются различные методы диагностической работы: бактериологический, биологический, фаготипирование и микроскопия. Отдел оснащен всем необходимым современным оборудованием: термостатами, микроскопами, центрифугами, автоклавами, и др. Отдел имеет необходимые условия для работы с микроорганизмами 2-4 группы патогенности. Осуществляется четкое разделение помещений на "чистую" и "заразную" зоны. Сотрудники в полном объеме обеспечены спецодеждой и средствами индивидуальной защиты. Отдел ветеринарно-санитарной экспертизы и молекулярной диагностики. Отдел предназначен для организации контроля сырья и пищевых продуктов животного происхождения по микробиологическим показателям и пищевых продуктов, полученных путем использования сырья растительного происхождения. Деятельность отдела направлена на: - обеспечение ветсанконтроля над производством сырья и продуктов животного происхождения; - обеспечение микробиологическим безопасности в производства критериям вет-сан и отношении доброкачественным по критериям сырья по биохимической продуктов животного происхождения; - выдачу ответа о наличии в пробе специфических фрагментов ДНК или РНК, имеющих гомологию с определенным возбудителя того или иного инфекционного заболевания; 12 участком генома Биохимический отдел. Отдел занимается испытанием сырья и продуктов животного происхождения на соответствие гигиенических требований безопасности, оказывает методическую и практическую помощ ветеринарным специалистам хозяйств, производственным и государственным службам республики, курирует процесс подготовки специалистов биохимиков районного звена. Отдел ежегодно ведет оперативный контроль за качеством кормов. А так же диспенсеризацию сельскохозяйственных животных. Вирусологический предназначен отдел для организации вирусологической диагностики возбудителей 2-4 групп патогенности. Штат отдела полностью укомплектован, сотрудниками отдела освоены и успешно используются методы вирусологических исследований: световая и люминисцентная микроскопия, заражение чувствительных систем, методы серологических реакций, включая ИФА с последующей идентификацией выделенного вирусного АГ методами люминисцентной микроскопии и серологический реакций с позитивными сыворотками. Отдел оснащен необходимым оборудованием и средствами для проведения на высоком уровне диагностических исследований, включая особо опасные болезни. 13 3. Результаты собственных исследований (специальная часть): 3.1. Материалы и методы исследований Материалом для исследования служат свежий труп ягненка или перевязанный с обеих сторон отрезок пораженного кишечника с содержимым, кусочки паренхиматозных органов, брыжеечные лимфоузлы, трубчатая кость. Допускается пересылать не консервированный патологический материал. Содержимое желудка и кишечника направляют в лабораторию после консервирования хлороформом (одна капля на 10 мл патологического материала) или стерильным 30 - 40%-м раствором глицерина. Отобранные пробы должны быть доставлены в лабораторию не позднее 4 часов с момента гибели животного, а консервированные — в течение 1 - 2 сут. Лабораторная диагностика анаэробной дизентерии ягнят состоит из двух этапов: 1) обнаружения токсина возбудителя в содержимом кишечника; 2) выделения чистой культуры и идентификации возбудителя по культурально-морфологическим, патогенным и токсигенным свойствам. Для обнаружения токсина содержимое кишечника разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1 или (1:2), экстрагируют при комнатной температуре 1ч, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, центрифугируют при 3000 – 5000 об/ мин 20 мин. Надосадочную жидкость вводят внутривенно или внутрибрюшинно двум белым мышам по 0,5 мл или внутривенно кролику 1 - 1,5 мл. При наличии в исследуемом материале токсина животные погибают в течение 12 ч. В случае гибели в более поздние сроки (до 24 ч) проводят бактериологическое исследование, чтобы исключить любую другую инфекцию. 14 Второй этап исследования - бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методами световой микроскопии и биопробы, выделение чистой культуры посевом на питательные среды и методом биопробы, идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным, серологическим, токсигенным (в РН) и патогенным свойствам (в биопробе). Микроскопический метод. Микроскопия препаратов из исходного материала. Из отобранных проб патологического материала делают мазкиотпечатки, которые окрашивают по Грамму, по Муромцеву; При микроскопировании отмечают форму микробных клеток, их взаимное расположение, тинкториальные свойства, образование спор и капсул, ориентируясь многочисленных предположить толстые, на характеристики грамположительных наличие короткие возбудителей палочки, возбудителей. палочек и клостридиозов. расположенные Присутствие спор позволяет Микрокартина: одиночно, по Граму окрашиваются положительно; образуют споры, капсулу; неподвижны. Культуральный метод. Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбудители - облигатные анаэробы, температурный оптимум 37 - 38° C. Из отобранных проб патологического материала делают посевы в жидкую питательную среду, используемую для культивирования анаэробных микроорганизмов (среды Китта-Тароцци, Вильсона-Блера, МППБ и сахарный кровяной МПА (КМПА)), а также в МПБ и на МПА. Перед посевом пробирки и флаконы с МППБ выдерживают в кипящей водяной бане в течение 15—20 мин для удаления растворенного в среде воздуха, а после охлаждают их путем постепенного добавления холодной воды в водяную баню. Посевы культивируют в термостате в течение 18-20 (24 - 48)ч. Посевы на средах в чашках Петри инкубируют в анаэростате (крышкой вверх). В первичных посевах обычно вырастают смешанные культуры, для 15 того чтобы получить чистые культуры, из первичных посевов делают дробный рассев на глюкозо-кровяной агар Цейсслера ( мясо-пептонный печеночный агар, в который добавляют 0,5 % глюкозы и 5 % стерильной дефибринированной крови барана к объему среды) в чашках Петри. У выделенных культур изучают морфологические, тинкториальные, культуральные и ферментативные свойства, обращая внимание на данные по свойствам возбудителей. Культуральные свойства: - На сахарно-кровяном агаре бактерии через 12-18 ч образуются мелкие (до 2-4 мм) колонии, образуют гладкие, блестящие, округлой формы (S-колонии), либо колонии сероватого цвета, плоские, шероховатые с зазубренными краями (Rколонии). Вокруг колоний образуется зона гемолиза. При контакте с воздухом колонии приобретают зеленоватую окраску. Колонии в толще агара приобретают чечевицеобразную форму При росте в жидких средах (среда Китта-Тароцци) образуется помутнение с интенсивным газообразованием. Газообразование происходит за счет сбраживания глюкозы и изомальтозы при расщеплении гликогена мышц или печени, находящихся в среде. В последующем через 3-5 суток среда просветляется и на дно выпадает обильный беловатого цвета пластиноподобный осадок. Культура издает запах масляной кислоты. При росте на желчном агаре образуются зоны преципитации. При росте на молоке уже через 4 часа отмечается его интенсивное сворачивание, а сгусток в следствие газообразования приобретает дырчатую структуру и часто подпрыгивает вверх, молочная сыворотка прозрачная.. Подобная реакция используется в лабораториях для проведения экспрессдиагностики. При росте на среде Вильсона-Блера в результате восстановления железа уже через 6-8 ч вырастают черные колонии в толще среды, так как 16 среду заливали после посева слоем МПА для создания анаэробных условий. При этом в чашке отмечается сильное газообразование. Мозговая среда не чернеет. При росте на мясном бульоне бактерии образуют уксусную и масляную кислоты, а также большое количество таких газов, как H2S, NH3 и CО. Капсула сохраняется при выращивании культур на питательных средах, содержащих нативный белок. При длительном хранении или после частых пересевов на среды, бедные нативным белком, способность к образованию капсулы утрачивается. При выращивании на щелочных средах, богатых белками и не содержащих углеводы, бактерии образуют крупные овальные центральные или субтерминальные споры. Биохимические свойства: обладают сахаролитическими, протеолитическими и др. свойствами. При необходимости определяют, токсигенные свойства возбудителей и тип токсина в реакции нейтрализации. Биологический метод. Биопроба. Одновременно с посевом патологического материала на питательные среды, заражают внутривенно или внутрибрюшинно экстрактом патологического материала белых мышей, кроликов или морских свинок. Патологический материал измельчают, тщательно перетирают в стерильной ступке, добавляют небольшое количество МПБ. Полученную смесь вводят подкожно в область мышц живота двум морским свинкам весом 350 - 400 г по 0,5 - 1 мл. При наличии в исследуемом материале возбудителя дизентерии ягнят морские свинки погибают в течение 12 - 16 ч. При вскрытии у павших животных обнаруживают патологоанатомические определенного вида возбудителя. 17 изменения, характерные для Из ткани на месте введения патологического материала, а также крови из сердца, печени готовят мазки-отпечатки и делают посевы на среду КиттаТароцци, МПА и в МПБ. Для проверки вирулентности выделенных культур суточную культуру, выращенную на среде Китта-Тароцци, вводят подкожно в область брюшных мышц живота двум морским свинкам в дозе 0,5 - 1 мл. Срок наблюдение за экспериментальными животными составляет 8 дней. Серологическая диагностика: Если токсин обнаруживается в содержимом кишечника, приступают к определению типа токсина в реакции нейтрализации с антитоксическими сыворотками C. perfringens.. Реакцию проводят на белых мышах, морских свинках или кроликах. При постановке реакции на мышах результаты оценивают по гибели или выживанию животных, которым вводили смесь сывороток и токсина. При использовании морских свинок и кроликов результат учитывается по наличию или отсутствию некроза на месте внутрикожного введения смеси: у животных на боку удаляют шерсть, на следующий день в этот участок вводится смесь сыворотки и токсина. Биопрепараты. Для профилактики болезни в настоящее время используют вакцину и полианатоксин. Концентрированная вакцина широкого спектра против брадзота, инфекционной энтеротоксемии, злокачественного отека овец и дизентерии ягнят состоит из смеси нативных токсических бульонных культур, которые обезвреживаются под действием тепла и формалина. Содержит C. perfringens типов В и D, C. novyi и C. septicum. Активность контролируют на кроликах после двукратной иммунизации путем определения количества антител в реакции нейтрализации. Антитоксическую сыворотку для диагностики анаэробной дизентерии 18 ягнят и инфекционной энтеротоксемии овец получают путем гипериммунизации овец или волов-продуцентов очищенными анатоксинами C. perfringens типа C и D. Иммунная сыворотка проверяется на активность в реакции нейтрализации; В 1 мл препарата должно быть не менее 10АЕ антитоксинов каждого типа. Сыворотки предназначены для идентификации токсинов C. perfringens в РН. 19 Определение болезни и характеристика возбудителя Возбудитель– C. perfringens типа В, представляет из себя неподвижную короткую, толстую палочку с обрубленными или слегка закругленными концами, длиной 4-6µ и шириной 1,5µ. В мазках палочки располагаются обычно одиночно, попарно, иногда в виде цепочки. C. perfringens хорошо окрашивается анилиновыми красителями, при этом в мазках из молодых культур по Грамму красится положительно, из старых – слабо или отрицательно. Как все капсульные микроорганизмы, клостридия в организме животных образует капсулу. Споры, которые располагаются в центре палочки или вблизи ее конца. Форма спор овальная, диаметр их несколько шире диаметра палочки. Споровые формы микроба в почве сохранят свою жизнеспособность до 4-х лет, выдерживают кипячение в течение 5-9 минут. Патогенез. Заболевание развивается по типу кишечной интоксикации. В организм новорожденных ягнят инфекция проникает через загрязненные соски матери. В кишечнике он начинает размножаться, выделяя β- токсин, который приводит к некротическим изменениям слизистой оболочки кишечника, вплоть до образования язв. В большом количестве экзотоксин всасывается в кровь, поражая практически все органы (синдром острого токсикоза). Дистрофические процессы и расстройства кровообращения в паренхиматозных органах также являются следствием токсикоза. Клинические признаки. Дизентерия поражает ягнят в большинстве случаев в первые 3 дня после рождения. Значительно реже наблюдаются случаи заболевания на 5-6-й день. Инкубационный период 5-6 часов. Течение болезни может быть сверхострым, острым, подострым и изредка хроническим. При сверхостром течении смерть наступает внезапно, без достаточно выраженных клинических признаков болезни. У заболевших животных появляются признаки поражения нервной системы – судороги, нарушение координации движений. 20 При остром течении заболевания у больные ягнята угнетены, появляется понос, с примесью крови и пузырьков газа. Фекалии в дальнейшем становятся густыми, темными с примесью слизи. Больной ягненок стоит согнувшись, с взъерошенной шерстью, втянутым животом и слабо реагирует на окружающее. Шерсть вокруг анального отверстия и на хвосте запачкана испражнениями, склеена. Иногда в начале заболевания повышается температура тела до 40-43°C. Дыхание и пульс у учащены. Болезнь длится от нескольких часов до 1-3 дней. При подостром течении дизентерия ягнят принимает затяжной характер, с менее выраженными признаками болезни. У отдельных животных она может продолжаться до 3 недель. Клиническая картина: больной ягненок лежит в угнетенном состоянии, истощен из за диареи. Испражнения вначале жидкие, желтого или зеленого цвета, в последствие становятся более густыми, черного цвета, с примесью крови, пузырьков газа и слизи. Больные ягнята тужатся, отказываются сосать молоко, часто залеживаются, спина выгнута, живот втянут, шерсть взъерошена. Дыхание и пульс у них учащены. Температура тела в отдельных случаях в начале болезни может повышаться до 42°C. Далее отмечают истощение и смерть. Редко болезнь может принимать хроническую форму. При этом животные медленно выздоравливают, сильно отставая в росте и развитии. Впоследствии это может привести к падежу от осложнений связанных с изъязвлением кишечника. Патологоанатомические изменения в основном локализуются в кишечнике в виде геморрагического воспаления, очаговых некрозов. Содержимое кишечника кровянистое. Патологоанатомические изменения. Упитанность трупа ниже средней. Шерсть в области ягодиц и хвоста запачкана жидкими калловыми массами. Видимые слизистые анемичны. Поверхностные лимфатические узлы немного 21 увеличены. В брюшной, грудной и перикардиальной полостях скопление небольшого количества светлого серозного, иногда красноватого, транссудата. Серозная оболочка тонкой кишки диффузно либо очагово покрасневшая, местами покрыта серовато-желтоватыми пленками фибрина, которые легко снимаются. Слизистая оболочка, особенно подвздошной кишки, набухшая, отечная, покрасневшая, изъязвлена на протяжении всей длины или отдельных ее отрезков. Края язв бахромчатые. Дно – ярко или темно-красного цвета. Брыжеечные и воротные лимфатические узлы резко увеличены, на разрезе сочные, темно-красные, пронизаны мелкими геморрагиями (картина острого серозно-геморрагического лимфаденита). Брыжейка инфильтрирована серозным экссудатом. Селезенка без видимых изменений, может быть заметно небольшое ее набухание. Печень рыхлая, слегка увеличена, неравномерно окрашена: темно-красные участки чередуются со светло – серыми или серовато– желтоватыми участками, на фоне которых хорошо заметны мелкие кровоизлияния. В почках так же отмечают явления застойной гиперемии, зернистой и реже жировой дистрофии. Сердце несколько увеличено за счет правой стороны, сердечная мышца рыхлая, серо–красная, иногда с желтоватым оттенком. Легкие отечны, в состоянии острой застойной гиперемии. Диагноз на анаэробную дизентерию ягнят основан на анализе эпизоотологических, клинических данных, патологоанатомических изменений, наличие у павших особей геморрагического энтерита или некротических язв на стенке кишечника и результатов лабораторного исследования. 22 3.2. Результаты исследований Лабораторная диагностика возбудителя. Материалом для исследования служат свежий труп ягненка или перевязанный с обеих содержимым, кусочки сторон участок паренхиматозных пораженного органов, кишечника кровь из с сердца, брыжеечные лимфоузлы, трубчатая кость. Таблица 1. Биологические свойства C.perfringens. Свойства Бактерия C.perfringens Морфология Толстые палочки со слегка закругленными концами, расположены одиночно Подвижность - Капсула + Споры +, овальные, расположены субтерминально или центрально. В свежих мазках и молодых культур спор не обнаруживают Окраска по Граму + Ферментация углеводов + Свертывание молока +, быстро Продукция H2S - Продукция индола - Разжижение желатины + Редукция нитратов ± Гемолиз эритроцитов + 23 Образование токсина Патогенность лабораторных животных для + Морские свинки +, Кожа на месте инъекции легко отделяется, но не отслаивается. Мускулатура сухая, красного цвета различных оттенков. Кишечник вздут, геморрагически воспален, иногда образуются язвы Белые мыши +, Кролики Некроз на месте введения сыворотки и токсина Рост на МПБ + Рост на МПА + Рост в среде Китта-Тароцци +, Раннее помутнение и бурное интенсивное газообразование Рост на Цейсслера глюкозо-кровяном +, Колонии мелкие (до 2-4 мм), округлые, гладкие, выпуклые серовато-зеленые колонии. агаре Гемолиз сильный, грязно-коричневого цвета, имеет две зоны. Среда буро-коричневого цвета (I форма) +, Рост на молоке плотный губчатый сгусток, приподнятый газом до пробки, молочная сыворотка прозрачная. +, Рост на среде Вильсона-Блера через 6-8 ч вырастают черные колонии в толще среды Чувствительность к бензипенициллину + Чувствительность к метронидазолу + Оптимум разряжения воздуха, мм рт. 40 ст. 24 Обозначения:(+) - постоянный признак, (±) - непостоянный признак, (-) – отсутствие признака; Идентификация типов летальных вирусов. Типы основных летальных токсинов Cl. perfringens устанавливают в реакции нейтрализации с их типовыми антитоксическими сыворотками. Результаты реакции нейтрализации учитывают только в случае гибели контрольных белых мышей или образовании некроза в контроле у морской свинки (кролика). Животные, получившие смесь токсина с гомологичной сывороткой, остаются живыми, а у морских свинок и кроликов некроз не развивается. Таблица 2. Определение типа основного токсина Cl. perfringens Антитоксические сыворотки типа Тип культур C. Основной perfringens токсин А А С D Е Контроль Альфа — Н н н + С(В, F) Бета + — + + + D Эпсилон + + — + + Е Йота + + + — + Обозначения: (+) — белые мыши пали, у морских свинок и кроликов некрозы на месте введения; (-) — белые мыши живы, у морских свинок и кроликов некрозы отсутствуют; (Н) — результаты не учитывают. 25 Дифференциальный диагноз. Анаэробную дизентерию ягнят необходимо дифференцировать от кокцидиоза, сальмонеллеза и эшерихиоза ягнят. Колибактериозом болеют животные возрастом 1-5 дней, иногда и старше. Некротическое воспаление и язвы слизистой оболочки отсутствуют, селезенка увеличена в размере. При бактериологическом исследовании выделяют E. coli. Сальмонеллезом болеют более паталогоанатомического вскрытия – взрослые ягнята. Картина воспаление слизистой тонкого кишечника, без характерных для дизентерии язв. Селезенка сильно увеличена. Иногда сальмонеллез может сопровождаться поражением легких. При бактериологическом исследовании выделяют культуру паратифа из паренхиматозных органов, крови, сердца. Кокцидиоз в отличие от анаэробной дизентерии ягнят поражает ключевым образом молодняк старшего возраста. Инкубационный период при кокцидиозе более длительный – от 6 дней до 3 недель. Главный признак кокцидиоза – профузный понос – частые испражнения с примесью крови. При вскрытии павших патологии обнаруживают, главным образом, в толстом отделе кишечника. Характерный признак для кокцидиоза – утолщение стенки кишечника. В его содержимом всегда удается обнаружить большое количество кокцидий. 26 Выводы. Возбудитель дизентерии ягнят — спорообразующий облигатный анаэробный микроб Clostridium perfringens типа В. Неподвижен, в организме животного образует капсулу. Окрашивается по Грамму, хорошо растет на различных питательных средах, в том числе на МПА и МПБ. Вегетативные формы слабоустойчивы. Споры могут длительное время сохраняться в почве, что определяет стационарность (энзоотичность) анаэробной дизентерии. Заболевают ягнята первых десяти дней жизни. Чаще болезнь протекает в острой форме и имеет практически 100% - ый летальный исход. При появлении в хозяйстве случаев заболевания зараженных ягнят вместе с овцематками изолируют. Лечение эффективно только в начале болезни. Трупы не могут быть использованы и подлежат утилизации. В данной работе были изучены характеристика и лабораторная диагностика анаэробной дизентерии ягнят. Тяжелое течение болезни с интоксикацией, массовость заболевания, повторяющиеся сезонные вспышки анаэробной дизентерии ягнят в зимневесенний период, высокая смертность наносят существенный экономический ущерб овцеводческим хозяйствам и объясняют актуальность болезни в настоящее время. 27 Список использованной литературы. 1. ГОСТ 26503 - 85. Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики клостридиозов. – Москва: Издательство стандартов, 1986. – 3 с. 2. Skariyachan, S. Selection of herbal therapeutics against deltatoxin mediated Clostridial infections/ S. Skariyachan1, A. B. Mahajanakatti, M. Sevanan, N. Sharma// Biomedical Informatics. – 2011. – № 6. – PP. 376-378. 3. White, Penyebab diare pada pedet/ G. White // The Great Plains Beef Cattle Handbook. – Nebraska: CRL Press, 2019. – PP. 5-11. 4. Бакулов И.А. Эпизоотология с микробиологией/ И.А. Бакулов. – Москва: "Агропромиздат", 1987. - 415с. 5. Бессарабов Б.Ф., Инфекционные болезни животных / Б.Ф. Бессарабов, А.А. Вашутин, Е.С. Воронин // Под ред. А.А. Сидорчука. - М.: КолосС, 2007. - 671 с. 6. Канашкова, Т. А., Методы исследования в микробиологии: Учебнометодическое пособие/ Т. А. Канашкова, Ю. В. Киселёва. – Минск: БГМУ, 2010. – 28 с. 7. Кузнецов А.Ф. Справочник ветеринарного врача / А.Ф. Кузнецов. – Москва: "Лань", 2002. - 896с. 8. Мельников В. Н. Анаэробные инфекции/ В. Н. Мельников, Н. И. Мельников, - Москва: Медицина, 1973. – 171 с. 9. Полыковский, М. Д. Анаэробная дизентерия ягнят/ Д. М. Полыковский // Болезни овец и коз. – 3 изд., М., 1973. – 112 с. 28 Приложение. Рисунок 1. Ягненок заболевший анаэробной дизентерией. Рисунок 2. Патологоанатомическая картина вскрытия при анаэробной дизентерии ягнят. 29 Рисунок 3. C. Perfringes. Окраска по Граму. Рисунок 4. Колонии Clostridium perfringens на кровяном агаре окруженные «двойной зоной» гемолиза. 30 Рисунок 5. Культивирование C. Perfringes. А) на рост указывает образование черных окрашенных колоний на селективной среде. Б) энтеротоксины организма, характеризуются активностью лецитиназы, непрозрачностью и ореолом вокруг колоний в яично-желточном молочном агаре. С) характер множественной лекарственной устойчивости изолированного организма к Амфотерицину в (20 мкг/диск), Полимиксину в (50 мкг/диск) и стрептомицину (25 мкг/диск). 31 Рисунок 6. Определение лецитиназной активности. Вокруг колоний отчетливо видны зоны мутного ореола, состоящие из преципитированных липидов. Рисунок 7. В левой пробирке культура Clostridium perfringens на сахарном агаре. В результате интенсивного газообразования в гелиевоподобной среде образовались зоны разрывов. 32 Рисунок 8. Схема лабораторной диагностики инфекционной энтеротоксемии овец и анаэробной дизентерии ягнят. Рисунок 9. Споры бактерий рода Clostridium. 33 Сопроводительный документ В Чувашскую республиканскую ветеринарную лабораторию Государственной ветеринарной службы ЧР Адрес 428020, Чувашская Республика, г.Чебоксары, Базовый проезд, д.19 Для бактериологического исследования направляется материал: труп ягненка, возраста 3-х дней, владелец Грачев Сергей Геннадьевич, ЛПХ. Дата заболевания животного 10.11.2020 Дата падежа 11.11.2019 Клиническая картина: понос, фекалии с примесью крови и пузырьков газа, угнетенное состояние, слабость, отсутствие аппетита, истощение. Данные патологического вскрытия: Упитанность трупа ниже средней. Видимые слизистые оболочки анемичны. Картина геморрагического воспаления в тонком кишечнике. Слизистая оболочка подвздошной кишки набухшая, отечная, покрасневшая, местами изъязвлена. Брыжеечные лимфатические узлы резко увеличены, на разрезе сочные, темно-красного цвета, пронизаны кровоизлияниями (картина острого серозно – геморрагического лимфаденита). Печень дряблой консистенции, несколько увеличена, неравномерно окрашена, с мелкими кровоизлияниями. В почках явления застойной гиперемии, зернистой дистрофии. Сердце несколько расширено, сердечная мышца дряблая, серо- красного цвета. Легкие отечны, в состоянии острой застойной гиперемии. Эпизоотические данные: ежегодные вспышки заболевания в хозяйстве в зимне-осенний период. Предположительный диагноз: анаэробная дизентерия ягнят Прошу исследовать на: анаэробную дизентерию ягнят Просим исключить: колибактериоз, сальмонеллез, кокцидиоз, эшерихиоз ягнят. Дата: 11.11.2020 Должность: ветеринарный врач Подпись: _____________(Архипова Т. И.) Обратный адрес: г.Чебоксары, ул.Карла Маркса, 29 34
