ГБОУ ВПО Тверская ГМА Минздрава России Кафедра микробиологии и вирусологии курс иммунологии УДК 571.27 : 616-006.03-097 Моноклональные антитела. Использование в диагностике заболеваний и лечебные моноклональные антитела. [Текст]: Методические рекомендации для студентов лечебного, педиатрического, стоматологического и фармацевтического факультетов. / Ю.И.Будчанов. - Тверь. 2012г.- 22 с. Составитель: Ю.И.Будчанов, канд. мед. наук, доцент курса иммунологии кафедры микробиологии ГБОУ ВПО Тверская ГМА В учебно-методических рекомендациях представлены современные сведения о моноклональных антителах и их использовании в медицине. Освещены вопросы истории создания моноклональных антител, принципиальная схема получения моноклональных антител с метаболической селекцией гибридов, их свойства, области применения. Даны сведения о использовании моноклональных антител в реакциях основанных на взаимодействии антигена с антителом, вариантах их постановки, примеры. Особе внимание уделено наиболее важным терапевтическим моноклональным антителам, их видам. Методические рекомендации предназначены для самоподготовки к практическим занятиям студентов лечебного, педиатрического, стоматологического и фармацевтического факультетов, изучающих основы медицинской иммунологии. © Ю.И.Будчанов 2012 г. Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 2 Список сокращений Ig – иммуноглобулин IgG, IgA, IgM, IgE, IgE - классы сывороточных иммуноглобулинов АГ – антиген АОК – антитело образующие клетки АТ – антитело ГАТ - культуральная среда, содержащая гипоксантин - аминоптерин тимидин МкАТ (мАТ) (англ. mab) – моноклональные антитела ПЭГ - полиэтиленгликоль Предисловие Получение антител для нужд человека начинается с иммунизации животных. После нескольких инъекций антигена в присутствии стимуляторов иммунного ответа в сыворотке крови накапливаются специфические антитела. Такие сыворотки называются иммунные. Антитела выделяют из сыворотки в виде γ-глобулиновой фракции, осаждая их из сыворотки крови сульфатом аммония, спиртом, ПЭГ и другими веществами. Самое главное, полученные антитела содержат много антител с различной специфичностью, ко многим антигенным детерминантам, как антигена, которым проводилась иммунизация, так и другим антигенам, с которыми встречалось животное-донор. Стандартные препараты антител в иммунных сыворотках получить довольно сложно, так как их состав зависит от вида животного, его индивидуальных особенностей, цикла иммунизации, других малоконтролируемых факторов. В то же время, для современного анализа очень важна специфичность, то есть способность выделить Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 3 данное вещество из сложных многокомпонентных жидких сред, таких, как сыворотки крови, сок растений, ферментная среда, со стандартными свойствами. При проведении иммунохимических исследований, используются антитела, взаимодействующие узко специфично по принципу "антиген - антитело". Для проведения такого анализа необходимы абсолютно идентичные антитела, синтез которых обычными способами не приемлем. Г. Кёлер и К. Мильштейн Цезарь Мильштейн (Cesar Milstein) Георг Кёлер (George Kohler) Решение проблемы было предложено в 1975 году учеными Георгом Кёлером и Цезарем Мильштейном. Они разработали методику получения клеточных гибридов гибридом. Гибридомы (гибридные опухолевые клетки) образуются в результате слияния лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных, с клетками миеломы костного мозга, культивируемыми in vitro. В 1970-х годах молодой немецкий иммунолог Георг Кёлер изучал генетическую изменчивость антител. Для исследования надо было изолировать клон антителообразующих клеток (АОК) плазматических клеток (производных от В-лимфоцитов). Необходимо отметить, что В-лимфоциты могут жить только в организме хозяина, и в искусственной питательной среде они быстро гибнут. Их длительное культивирование вне организма невозможно. Наоборот, клетки опухоли из плазматических клеток, называющиеся плазмоцитомами или миеломами, хорошо культивируются и размножаются in vitro и их называют “бессмертными». Для реализации проекта Кёлер поехал в Англию, в лабораторию Цезаря Мильштейна, изучавшего клоны плазмоцитом, и они вместе разработали оригинальный подход к этой проблеме: решили получить гибрид нормальной АОК и опухолевой клетки. В случае успеха такой гибрид унаследовал бы от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой - бессмертие и способность к неограниченному и бесконтрольному росту. Это им удалось осуществить, создав гибридомную технологию. Метод гибридизации соматических клеток in vitro осуществляется путем слияния разнородных клеток. Разнородные клетки, у которых Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 4 слились оболочки, образовывали гибриды, которые сохраняли способность к клеточным делениям. Таким образом, возникал истинный гибрид, потомок двух соматических клеток, или гибридома. Кёлер и Мильштейн получили гибридому между нормальной АОК и опухолевой, миеломной клеткой. В системе in vitro слияние соматических клеток может быть индуцировано вирусами, например вирусом Сендай, электрическим воздействием - электрослиянием или химическим веществом полиэтиленгликолем (ПЭГ). Авторы использовали для слияния ПЕГ. Принципиальная схема получения моноклональных антител. Мышей интенсивно иммунизировали определенным антигеном - белком, бактериальными клетками или клетками животного происхождения. Когда в их крови появлялись антитела, у них брали селезенку, и из неё готовили взвесь клеток (с большим содержанием В-лимфоцитов). Если к суспензии В-лимфоцитов добавить клетки плазмоцитомы и полиэтиленгликоль, то после инкубации, требующейся для слияния клеток, в системе находились следующие клетки: - гибриды АОК и АОК (В-лимфоцитов и В-лимфоцитов), - гибриды АОК и плазмоцитомы, а также оставшиеся свободными - АОК и клетки плазмоцитомы (не слившиеся). Проблема заключалась в том, как отделить заданную гибридому от присутствующих в системе отдельных не слившихся клеток и от гибридов иной специфичности. Для достижения этой цели авторы разработали специальную схему, использующую отбор клеток в селективной питательной среде, т.е. в среде, с помощью которой можно выделять желаемый клон клеток. Метаболическая селекция гибридов основана на том, что нормальные соматические клетки (В-лимфоциты) могут использовать два метаболических пути синтеза нуклеотидов (пуринов и пиримидинов): основной путь и резервный путь. В случае основного пути синтеза de novo нуклеотидов они образуются из аминокислот и углеводных предшественников. При резервном пути синтез нуклеотидов осуществляется из гипоксантина (пурины) или из дезокситимидина (пиримидины). Если по каким-либо причинам основной метаболический путь синтеза нуклеотидов блокируется (например, аминоптерином), то в нормальных клетках используется резервный путь синтеза нуклеотидов. В таком случае включается в работу фермент гипоксантин-гуанидинфосфорибозилтрансфераза (Г/ГФРТ) и тимидинкиназа (ТК), что обеспечивает синтез нуклеотидов по запасному пути. Клетки миеломы, используемые для гибридизации с Влимфоцитами, были отобраны мутантные, у них не синтезируется Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 5 фермент Г/ГФРТ, т.е. у них имелся только основной путь синтеза нуклеотидов. Такие клетки способны синтезировать нуклеотиды только по основному метаболическому пути. Если в среду для культивирования внести вещество, блокирующее основной путь синтеза нуклеотидов в клетке - аминоптерин, то на данной среде миеломные клетки, у которых отсутствует фермент (Г/ГФРТ), не способны обеспечить синтез нуклеиновых кислот и будут погибать. Мутантные клетки гибридомы - лишены резервного пути синтеза нуклеотидов и в среде с гипоксантином они погибают. Задача селекции сводится к отделению гибридом от миеломных неслившихся клеток. Для решения этой задачи используют селективную среду ГАТ (культуральная среда, содержащая гипоксантин - аминоптерин - тимидин). В такой среде, содержащей аминоптерин, блокируется основной путь синтеза нуклеотидов, а наличие гипоксантина и тимидина обеспечивает синтез нуклеотидов по запасному пути. В таких условиях миеломные клетки погибают и остаются функционально активными только гибридомы. В-лимфоциты не адаптированы к росту in vitro, они достаточно быстро разрушаются, что облегчает процесс селекции. Основные этапы получения гибридомы представлены на схеме. Мыши вводят специфический антиген, который вызывает продукцию антител против этого антигена. Селезенка мышей удаляется и гомогенизируется для получения суспензии клеток. Эта суспензия содержит B клетки, которые продуцируют антитела против введенного антигена. Клетки селезенки затем смешивают с клетками миеломы, которые способны непрерывно расти в культуре, а так же отсутствует резервный путь синтеза нуклеотидов. Некоторые из антитело-продуцирующих клеток селезенки и клетки миеломы сливаются, образуя гибридные клетки. Эти гибридные клетки теперь способны непрерывно расти в культуре, а так же продуцировать антитела. Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 6 Смесь клеток помещают в селективную среду, которая позволяет расти только гибридным клеткам. Погибают не слившиеся миеломные клетки и Влимфоциты. Гибридные клетки пролиферируют, образуя клон гибридом. Гибридомы, проверяются на продукцию нужных антител. Выбранные гибридомы затем культивируют для получения больших количеств моноклональных антител. Для получения больших объемов жидкости, содержащей моноклональные антитела, гибридомы могут быть введены внутрибрюшинно мышам реципиентам. В результате в брюшной полости вырастает солидная опухоль и накапливается асцитическая жидкость, являющаяся источником моноклональных антител. Полученные клоны можно заморозить при -700С и длительно сохранять. Их можно культивировать и накапливать антитела в культуральной среде, а можно привить мышам, где они будут расти и накапливать колоссальные количества моноклональных антител. От одной мышки можно получить антител не меньше, чем от кролика. Эти антитела не содержат посторонних антител и настолько однородны, что могут рассматриваться как чистые химические реагенты. Таким образом, клоны-продуценты моноклональных антител (гибридомы) получают слиянием антителообразующих клеток лимфоидной ткани иммунизированного животного и клеток плазмацитомы. Полученные в результате клетки наследуют от лимфоцитов способность к секреции антител и от клеток миеломы способность к неограниченному росту in vitro. Гибридомы революционизировали иммунологию и создали в ней совершенно новые области. Благодаря гибридомам возникли новые методы диагностики многих заболеваний и открылись новые пути для изучения злокачественных опухолей и многих заболеваний. В связи с этим, ученые, получившие моноклональные антитела, отмечены в 1984 году Нобелевской премией, высшей научной наградой, присуждаемой за выдающиеся открытия. Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 7 Для закрепления знаний по получению моноклональных антител, хочется привести еще одну схему получения моноклональных антител опубликованную Г.И.Абелевым (1998) Схема получения гибридом (Г. И. Абелев, 1998). Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 8 А, В, С - многокомпонентная смесь антигенов, использованная для иммунизации (или сложные антигены с множеством антигенных детерминант); АОК - антителообразующие клетки селезенки; Пл - клетки плазмоцитомы, не растущие в селективной ГАТ- среде; ПЭГ - полиэтиленгликоль; ГАТ - среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин; анти-А, анти-В, анти-С - моноклональные антитела соответственно к А-, В-, С-антигенам (или антигенным детерминантам). После недолгого культивирования одиночные АОК, а также гибриды АОК и АОК погибали, так как нормальные В-лимфоциты (АОК) смертны и быстро погибают в культуре, они не способны длительно культивироватться. Плазмоцитомные клетки и их гибриды также погибали, так как аминоптерин блокировал основной путь синтеза предшественников нуклеиновых кислот, а гипоксантин и тимидин их не спасали. Выживали, следовательно, только гибриды АОК и плазматических клеток, так как бессмертие они унаследовали от плазмоцитомы, а резервный путь - от нормальной клетки. Такие гибриды, гибридомы, сохраняли способность синтезировать и секретировать антитела, а так же пролиферировать. Следующий этап после получения гибридом - клонирование и отбор нужных клонов. Выжившие в ГАТ клетки рассевали в пластиковые планшеты. В каждую лунку помещали в среднем по 10 гибридомных клеток. После нескольких дней культивирования содержимое каждой лунки проверяли на присутствие антител нужной специфичности. Клетки из лунок, содержащих нужные антитела, клонировали, то есть повторно рассевали по лункам, но из расчета 1 клетка на лунку, вновь культивировали и проверяли на присутствие нужных антител. Процедуру повторяли 1-2 раза. Таким образом, отбирали клоны, продуцирующие антитела только одной нужной специфичности, то есть моноклональные антитела. В отличие от поликлональных гетерогенных сывороток, содержащих большое разнообразие антител, отличающихся своей специфичностью, аффинитетом и физико-химическими свойствами, препараты моноклональных антител содержат продукт единственного клона плазматических клеток, направленный к строго определенной антигенной детерминанте и обладающий всегда одинаковыми физикохимическими характеристиками и сродством к антигену. Гибридомы сыграли и продолжают играть огромную роль в фундаментальной и прикладной иммунологии. Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 9 Моноклональные антитела оказались исключительно удобным и широко применяемым в настоящее время диагностическим средством. С их помощью определяют маркеры клеточных популяций (фенотипирование клеток крови и в частности лимфоцитов), гормоны, медиаторы, опухолевые маркеры и т.д. Области применения моноклональных антител: идентификация субпопуляций лимфоцитов человека истощение клеточных популяций выделение клеток установление функций молекул клеточной поверхности определение группы крови диагностика опухолей и локализация опухолей иммунорадиометрический анализ анализ сложных смесей антигенов анализ эмбрионального развития квадромы анализ иммунного ответа искусственные ферменты. С помощью гибридом можно обнаружить антигены, характерные для опухолей определенных тканей, получить к ним антитела и использовать их для диагностики и типирования опухолей. Для клеток в определенной стадии развития или функционирования характерно наличие на поверхности определенных молекулы. На определении этих CD антигенов основана идентификация субпопуляций лимфоцитов человека. С помощью моноклональных антител в опухоль и ее метастазы можно доставить радиоактивные вещества, позволяющие обнаружить небольшие узелки опухоли по локализации в них радиоактивности если их связать с изотопом. Именно применение моноклональных антител в диагностике позволило значительно увеличить специфичность и чувствительность тест-систем основанных на реакции антиген-антитело. Подробно реакции, основанные на взаимодействии антигена с антителом, изложены в предыдущей методической рекомендации. Обязательно используйте методическую рекомендацию «Методы основанные на взаимодействии антигена с антителом». Ниже приводятся лишь некоторые важные реакции и уточнения использования в них МкАТ. Напомним, моноклональные антитела широко применяются в целом ряде методов: Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 10 Реакция агглютинации. Моноклональные антитела (цоликлоны анти-А и анти-В) применяют для определения агглютиногенов эритроцитов. Они обладают высокой стандартностью, высокой чувствительностью, характеризуются быстротой наступления и четкостью агглютинации. За счет своего качества реагенты обеспечивают достоверный результат даже при слабой экспрессии антигенов. Методика определения группы крови с помощью цоликлонов позволяет отказаться от услуг доноров, кровь которых используют для приготовления изогемагглютинирующих сывороток. Главное циклоны применяются для типирования эритроцитов всех специфичностей, включая редкие. Реакция иммунофлуоресценции. Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) - лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов и антител. В основе ИФА лежит принцип специфического взаимодействия между антигеном и соответствующим ему моноклональным антителом. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием так называемого конъюгата, который представляет собой анти-антитело, соединённое с ферментной меткой (обычно используют пероксидазу хрена). Конъюгат может быть получен с использованием моноклональных антител, направленных против человеческих иммуноглобулинов определённого класса (M, G, А). В зависимости от того, какие антитела использованы, тест-система будет выявлять в исследуемом образце или специфические антитела независимо от их класса, или антитела лишь определённого класса (например, только иммуноглобулин G или только иммуноглобулин M). Метод проточной цитометрии предназначен для быстрого оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов. Регистрируют свет лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, при этом степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 11 клетки. Клеточную суспензию метят флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями и подают в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Фиксирующие флуореценцию детекторы позволяют определить размеры клеток, судить о соотношении ядро/цитоплазма, а так же о неоднородности и гранулярности клеток, определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др. Наиболее часто используемые флуорохромы - Флуоресцеина изотиоцианат (FITC), Фикоэритрин (PE, RD1). Радиоиммунный анализ. Методы иммунохроматографии. Терапевтические моноклональные антитела Терапевтическое применение моноклональных антител, которые являлись мышиными антителами, было ограничено. Их введение человеку сопровождалось иммунным ответом на чужой (гетерогенный) мышиный белок. Это приводило к быстрому устранению желаемого терапевтического эффекта, а так же поражению почек и гиперчувствительности к чужеродному мышиному белку. Однако вскоре был разработан еще один подход, значительно увеличивший терапевтические возможности моноклональных антител. Пользуясь техникой рекомбинантных ДНК, ученые сумели принудить клетки грызунов к выработке антител с человеческими Fc-фрагментами. Дело в том, что провоцирующие процессы отторжения чужеродных антител антигены находятся именно в Fc-фрагментах. Полученные таким способом антитела принято называть химерными. Применение химерным антителам нашли при лечении, преимущественно, раковых (онкологических) и иммунных заболеваний. Появилось даже такое понятие - золотой век моноклональных антител (golden age for monoclonal antibodies). За последние 15 лет около 30 терапевтических моноклональных антител были утверждены. Большинство из них молекулы IgG1. Некоторые причины успеха этого класса Ig обусловлены тем, что они обладают долгим временем полу-жизни в сыворотке, а также эффекторными функциями их Fc регионов. Моноклональные антитела химерные - константная часть мышиных антител замещена соответствующей константной областью иммуноглобулина человека и в своей структуре имеют более 65% человеческого иммуноглобулина. Гуманизированные моноклональные антитела – до 95% состоят из человеческого иммуноглобулина. Кроме того, трансгенные технологии (фаговый дисплей) были использованы для создания полностью человеческих моноклональных антител (Fully human monoclonal antibodies) . Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 12 Названия всех моноклональных антител оканчиваются на «–mab» (от monoclonal antibody). Если антитело получено от мыши, добавляется буква «о», и окончание у таких антител «-omab». Химерные антитела получили окончание «-ximab». Гуманизированные антитела имеют окончание «-zumab», полностью человеческие – «-umab». Например, Herceptin (моноклональное антитело применяемое при раке молочной железы) имеет название «trastuzumab». То есть это полностью человеческое моноклональное антитело. Rituxan, используемый для лечения В-клеточных лимфом, называется «rituximab», так как является химерным моноклональным антителом. Моноклональные антитела, в отличие от традиционных препаратов, высокоспецифичны к определенным мишеням - антигенам. Поэтому, использование моноклональных антител в качестве терапевтических агентов стало для медицины стратегическим этапом в смене концепции лечения – от неспецифической к специфической (таргетной) терапии. Производство моноклональных антител является наиболее быстро развивающимся сегментом фармацевтической индустрии, составляющим третью часть всех биотехнологических продуктов. По итогам 2010 г. два моноклональных антитела - Rituxan/MabThera и Remicade - вошли в Toп-5 блокбастеров среди биотехнологических препаратов. В 2015 г. все существующие на рынке препараты (60 млрд. долл. ежегодных продаж) утратят патентную защиту, и рынок продаж подобных биотехнологических препаратов значимо увеличится. Наиболее изученными являются следующие противоопухолевые препараты на основе МкАТ: Трастузумаб (Trastuzumab, Герцептин) – рекомбинантное МкАТ, которое избирательно связывается с рецептором HER2 на поверхности Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 13 опухолевых клеток многих солидных опухолей. Препарат Herceptin (Trastuzumab) был разработан компанией Genentech и введен в клиническую практику в 1998 году. Применение Герцептина радикально изменило лечение рака молочной железы, в руках онкологов появилось новое эффективное лекарство, позволяющее вылечить или продлить жизни многочисленных пациентов. Рецептор HER2 - белковая молекула, расположенная на поверхности опухолевых клеток. Примерно в 25 процентов случаев рака молочной железы злокачественные клетки содержат повышенное количество данных рецепторов (HER2 - позитивный рак молочной железы). При HER2 - позитивном раке молочной железы происходит постоянная стимуляция злокачественного роста за счет присоединения выделяемого самой опухолью вещества, известного как эпидермальный фактор роста, к рецептору HER2. Герцептин блокирует рецептор HER2, что не позволяет эпидермальному фактору роста стимулировать процесс деления злокачественных клеток. Герцептин высокоэффективен при самостоятельном применении в лечении запущенного рака молочной железы. Следует подчеркнуть, что решение о назначении Герцептина всегда принимается после иммуногистохимического анализа экспрессии HER2 в ткани опухоли. Гиперэкспрессия HER2 на клетках опухоли является показанием к назначению трастузумаба и прогностически благоприятным фактором эффективности лечения. При раке молочной железы определение HER2 признано необходимым исследованием для каждой больной. К какой группе моноклональных антител относится трастузумаб? Окончание «-zumab» указывает, что это гуманизированные моноклональные антитела. Ритуксимаб (Ритуксан, Мабтера) представляет собой химерные моноклональные антитела мыши/человека специфически связывающиеся с CD20+ антигеном. Этот антиген локализуется на поверхности пре-В-лимфоцитов и зрелых B-лимфоцитов, но отсутствует на стволовых гемопоэтических клетках, нормальных плазматических клетках и здоровых клетках других тканей. Этот антиген экспрессируется более чем в 90% В-клеточных неходжкинских лимфом. Механизм действия Ритуксана связан с развитием опосредованной антитело– зависимой клеточной и комплемент–зависимой цитотоксичности, что вызывает гибель клеток лимфомы, положительных по CD20. Происходит снижение уровня циркулирующих CD20+ В–лимфоцитов, как лимфомных, так и нормальных. Мабтера имеет высокую самостоятельную (без химиотерапии) активность в лечении CD20–положительной В–клеточной неходжкинской лимфомы. Ритуксимаб был зарегистрирован в США в 1997 г. для лечения В-клеточных неходжкинских лимфом. В России препарат продается под названием Мабтера. Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 14 Ритуксимаб — это химерное моноклональное антитело, имеющее вариабельный мышиный и константный человеческий регион, специфически связанное с антигеном CD20 на В-лимфоцитах и инициирующее иммунологические реакции, которые опосредуют лизис В-клеток. В последние годы препарат зарегистрирован еще для лечения широкого круга аутоиммунных заболеваний с гиперфункцией В-клеток. Еще одним высокоэффективным препаратом для лечения хронического лимфолейкоза (наиболее частого вида лейкоза у взрослых) являются антитела против CD52 антигена. Препарат Алемтузумаб (Кампат, Кэмпас, Campath) – гуманизированное МКА, связывающееся с CD52. Антиген CD52 экспрессируется на мембране большинства зрелых нормальных и опухолевых Т- и Влимфоцитов с очень высокой плотностью — примерно 500 000 молекул на клетку (по сравнению с антигеном CD20, плотность экспрессии которого составляет около 8000 молекул на клетку). Этим объясняется чрезвычайно высокая активность алемтузумаба в отношении хронического лимфолейкоза и Тклеточных лимфом. Важно отметить данный антиген обнаружен на поверхности незначительной части (менее 5%) гранулоцитов и отсутствует на эритроцитах и тромбоцитах. Не повреждает стволовые кроветворные клетки и клетки-предшественники. Другое название препарата Лемтрада (Lemtrada). В последние годы Кэмпас используется для уменьшения реакции «трансплантат против хозяина» при аллогенной трансплантации стволовых кроветворных клеток (им предварительно очищают трансплантат). Бевацизумаб (Авастин) представляет собой рекомбинантные гуманизированные моноклональные антитела, которые избирательно связываются с фактором роста эндотелия сосудов (VEGF) и нейтрализуют его, что приводит к нарушению ангиогенеза, снижению васкуляризации и угнетению роста опухоли. В клинических исследованиях показано, что Авастин обладает цитостатическим и цитотоксическим эффектом при многих солидных Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 15 опухолях, что выражалось в регрессии опухоли, замедлении опухолевого роста или увеличении времени до прогрессии. В настоящее время проводится более 130 клинических исследований бевацизумаба при 25 разных типах злокачественных опухолей, включая рак молочной железы, ободочной кишки, светлоклеточный рак почки, немелкоклеточный рак легкого, меланому. Другой подход использования МкАТ - конъюгаты МкАТ к опухолевым антигенам с токсинами, которые получили название – иммунотоксины. К моноклональным антителам пришиваются (конъюгируются) токсины бактериального или растительного происхождения. Получается конструкция из структуры специфичной к опухолевому антигену (МкАТ) и вещества способного убить клетку процесса, причем как самой опухоли, так и ее метастазов. МкАТ стали применяться для доставки цитотоксических веществ непосредственно к опухолевым клеткам, что позволяет избежать повреждения здоровых тканей. Радиоиммунотоксины на основе анти–CD20 антител. Два препарата на основе МКА к CD20 антигену, меченные радиоактивными изотопами, разрешены к клиническому применению при неходжкинской лимфоме. Ибритумомаб (ibritumomab, Зевалин) является конъюгатом Мабтеры (МкАТ против CD20) с радиоактивным изотопом иттрия–90 (Y90). Показаниями к использованию Зевалина является рецидивирующая неходжкинская лимфома, в том числе и при прогрессировании после Мабтеры. Без сомнения, это должна быть В-клеточная лимфома. Сочетанное действие препарата обеспечивает большую эффективность по сравнению с терапией простым антителом к CD20. 90% эффективной энергии иттрия-90 — в том виде, в котором он используется в препарате Зевалин — действует на глубину 5 мм, в результате чего все возможные вредные воздействия на здоровые ткани сведены к минимуму. Иттрий-90 выделяет только β-излучение Бексар (J131Tositumomab, Bexxar) – конъюгат мышиного МкАТ против CD20 антигена с радиоактивным изотопом йода J131. Период полураспада данного изотопа составляет 8 дней. J 131-тозитумомаб обладает способностью к специфическому связыванию с CD20, тем самым обусловливая лизис клеток, экспрессирующих данный антиген, а также способствует гибели соседних клеток Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 16 В настоящее время указанные методы иммунотерапии с применением МкАТ должны комбинированно примяться с хирургическим и химиотерапевтическим лечением, особенно для профилактики возникновения рецидивов и метастазирования. Отдельную группу терапевтических моноклональных антител составляют препараты, действие которых направлено на воспалительный процесс. Наиболее важной “мишенью” для “антицитокиновой” терапии МкАТ является “провоспалительный” цитокин – фактор некроза опухоли (ФНО) –α. Полагают, что этот цитокин играет ведущую роль в развитии самых разнообразных проявлений, характерных для многих воспалительных заболеваний человека. РЕМИКЕЙД (инфликсимаб) - Infliximab (REMICADE®), представляет собой моноклональные антитела к одному из ключевых цитокинов, вовлеченных в развитие воспалительных процессов, фактору некроза опухоли (tumor necrosis factor alpha TNF-alpha). Как полагают исследователи, TNF также играет важную роль не только в развитии ревматоидного артрита, но и псориаза. Действие РЕМИКЕЙДА, как биологического агента, направлено на ключевую молекулу воспалительных и иммунологических процессов, лежащих в основе ревматоидного артита - на фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α ). Доказано, что РЕМИКЕЙД предотвращает деструкцию суставов. РЕМИКЕЙД, возможно, первый антиревматический препарат, приостанавливающий прогрессирование заболевания, при этой патологии он в большей степени изучен. Кроме того, РЕМИКЕЙД также показан для лечения другого хронического воспалительного заболевания - болезни Крона. Структура. РЕМИКЕЙД - это химерные IgG 1 моноклональные антитела, которые на 75% состоят из человеческого белка, на 25% из мышиного. (см. Рисунок ). РЕМИКЕЙД соединяется с растворимым и связанным с мембранами ФНО-α Эти антитела, полученные генноинженерным путем, с высокой аффинностью, авидностью и специфичностью связывают человеческий ФНО-a. Механизм действия. Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 17 РЕМИКЕЙД подавляет патологические эффекты ФНО-α при РА посредством различных механизмов. РЕМИКЕЙД специфически связывает и таким образом нейтрализует как трансмембранный ФНО-α, так и растворимый ФНО-α в жидких средах. Кроме того, в исследованиях in vitro было показано, что РЕМИКЕЙД вызывает лизис ФНОпродуцирующих клеток путем фиксации комплемента или за счет антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ). Другим представителем класса ингибиторов ФНО-а является адалимумаб (Хумира) - первый и пока единственный препарат, представляющий собой полностью человеческие рекомбинантные моноклональные антитела к ФНО-а. Результаты проведенного анализа, соответствующие критериям "медицины, основанной на доказательствах", свидетельствуют о том, что инфликсимаб и адалимумаб являются эффективным препаратами для лечения ревматоидного артрита (РА), резистентного к стандартной терапии. Этанерцепт (Etanercept, Энбрел) - Рекомбинантный белковый препарат который получают соединением ФHО-рецепторов с Fсфрагментом молекулы IgG1, действует как экзогенный растворимый ФНО-рецептор. Этанерцепт связывает и инактивирует молекулы ФНО-α. Зарегистрирован в США для лечения РА при средней и высокой активности заболевания и резистентности к обычной терапии. На ранних стадиях ревматоидного артрита применение этанерсепта замедляет прогрессирование заболевания. Anakinra (Kineret) рекомбинантный растворимый антагонист ИЛ–1, подавляющий функциональную активность ИЛ–1. Для лечения РА. Tysabri (natalizumab) – блокатор рецептора адгезии VLA-4 (α4β1integrin) предотвращает адгезию иммуновоспалительных клеток и их миграцию через гематоэнцефалический барьер и стенку кишечного тракта. Используется при лечении рассеянного склероза и болезни Крона. Цетуксимаб (Эрбитукс) — химерное МкАТ, блокирующее рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и лишающие опухоли необходимого для нее фактора роста. В 2003 г. Эрбитукс был зарегистрирован в США для лечения рака толстой кишки, а в 2006 г. — для лечения рака головы и шеи. В России препарат продается под названием Эрбитукс. Выше были приведены препараты терапевтических МкАТ, которые нашли широкое применение в медицине. И темой реферата студентами могут быть выбраны новые терапевтические моноклональные антитела. Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 18 Биофармацевтические компании также выделяют значительные ресурсы на разработку «нового поколения» инженерных антител. Это такие производные антител как «diabodies», «triabodies», «tetra bodies» – молекулы, состоящие из двух, трех или четырех одинаковых или различных фрагментов антител одинаковой или разной специфичности, соединенных между собой. Новое поколение МкАТ-технологий, объединяют в себе преимущества МкАТ и низкомолекулярных препаратов, обладающих высокой специфичностью и низкой токсичностью, возможностью воздействовать на объекты, нераспознаваемые современными МкАТ, в том числе на активные центры ферментов и рецепторов. Такие МкАТ обладают более высокой стабильностью, что допускает возможность их перорального, ингаляционного или местного применения. В литературе описано получение нескольких различных типов рекомбинантных фрагментов антител: Fv – вариабельный фрагмент антитела (variable fragment), scFv (single chain Fv) – вариабельный фрагмент антитела, у которого фрагменты легкой и тяжелой цепи связаны полипептидным линкером, (scFv)2 – фрагмент, соcтоящий из двух молекул scFv, соединенных дисульфидной связью, dsFv – вариабельный фрагмент, стабилизированный дополнительной внутримолекулярной дисульфидной связью, Fab- и (Fab)2 фрагменты (идентичные по своей структуре фрагментам, образующимся в результате протеолиза полноразмерных антител IgG типа под действием папаина и пепсина, соответственно), VH – вариабельный домен HC. УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ЗАНЯТИЯ Цель занятия Изучить основы получения, свойства и применение в медицине моноклональных антител; принципы постановки основных реакций основанных на взаимодействии антигена с антителом с использованием МкАТ: реакции агглютинации, иммунофлуоресценции, иммуногистохимический, иммуноферментный, радиоиммунный методы, иммуноблот; значение методов иммуноанализа для клинической медицины. Терапевтические МкАТ, виды, специфичность, области применения. Учебные элементы темы 1. Моноклональные антитела – Г.Келлер и Ц.Мильштейн разработчики получения первых МкАТ. 2. Гибридомная технология, создание гибридом, методы слияния клеток. 3. МкАТ – основы получения, принципиальная схема их создания. Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 19 4. Отличие моноклональных антител от поликлональных антител, свойства. 5. Гуманизация МкАТ, их виды. 6. Применение МкАТ в диагностических целях. Использование в ИФА, в реакциях ИФ, проточной цитометрии, радиоиммунном анализе, иммунохроматографии. 7. Цоликлоны. 8. Терапевтические моноклональные антитела применяемые в онкологии. 9. Радиоиммунотоксины меченные радиоактивными изотопами (Зевалин, Бексар). 10. Антицитокиновые МкАТ (Ремикейд, Хумира, Этанерцепт,). 11. Новое поколение фрагментов антител. Студент должен знать: 1. Основы получения, виды и свойства моноклональных антител. 2. Диагностические МкАТ – использование в реакциях основанных на взаимодействии АГ с АТ. 3. Терапевтические МкАТ, виды, специфичность, области применения. Студент должен уметь: 1. Применить полученные знания в оценке иммунитета, в диагностических и терапевтических целях. 2. По названию терапевтического МкАТ определить тип моноклональных антител, оценить его иммуногенность. Контрольные вопросы по теме занятия: 1. Кто из ученых разработал методику получения моноклональных антител с помощью гибридомной технологии? 2. Какие клетки используются для получения гибридом? 3. Какие животные иммунизируются и являются источником АОК? 4. Из каких органов получают АОК? 5. Для слияния клеток применяются …….. ……… ………….. …….…… . 6. ПЕГ – сокращенное название ………. ……. …………… ……………... . 7. Какая селективная питательная среда применяется для выделения гибридом? 8. Какая имеется особенность гибридомных клеток, применяемых для гибридизации с В-лимфоцитами? 9. Укажите пути синтеза нуклеотидов в клетке? 10. Укажите при какой температуре длительно сохраняются клоны клеток? 11. В чем отличие поликлональных антител от моноклональных? Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 20 12. В каких областях медицины используются моноклональные антитела? 13. В каких реакциях основанных на взаимодействии АГ-АТ применяются МкАТ? 14. Как называются диагностические моноклональные антитела применяемые для определения групп крови? 15. Назовите флуорохромы используемые для метки МкАТ в реакции иммунофлуоресценции и проточной цитометрии. 16. В ИФА наиболее часто для метки МкАТ используется фермент …. . 17. Что такое химерные МкАТ? 18. Что такое гуманизированные МкАТ? 18. Перечислить окончания названий разных типов терапевтических МкАТ. 19. МкАТ к рецептору HER2 - ……………………………………… 20. Назовите терапевтическое МкАТ связывающиеся с CD20? …...…… . На каких клетках экспрессируется CD20 антиген? ……………….……..… . 21. Назовите препараты МкАТ конъюгированные с изотопами? ……. …… СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ: Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. Норма и патология: Учебник. – 3-е изд., перераб. и доп. – М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2010. с 637 – 639. Абелев Г.И. Моноклональные антитела. Соросовский Образовательный журнал, 1998, №1, с. 16-20. Никитин Е. А., Глазкова О. И. «Волшебные пули»: моноклональные антитела в онкологии Лечащий врач, 2007, 06/07/ Лекционный материал). Иванов А.А., Белецкий И.П. Терапия моноклональными антителами – панацея или паллиатив? Ремедиум, 2011, № 3, с.12-16. http://remedium-journal.ru/ Лекции Примеры тестов и эталоны ответов 1. Учеными, разработавшими методику получения моноклональных антител, являются: а) Мечников И. и Эрлих П. б) Пастер Л. и Кох Р. в) Кёлер Г. и Мильштейн Ц. г) Портер Р. и Эдельман Д. 2. Для получения гибридом используются следующие клетки: а) Т-лимфоциты и АОК б) миеломные клетки и АОК в) макрофаги и базофилы г) нейтрофилы и базофилы Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 21 3. Для получения МкАТ используются следующие животные: а) кролики б) мыши в) бараны г) лошади 4.Источником получения АОК от иммунизированного животного является а) кровь б) печень в) лимфатические узлы г) селезенка 5. Для слияния клеток применяют а) ПЭГ б) адъювант в) гаптен г) антиген 6. Синтез моноклональных антител обеспечивается: а) гибридомой б) бактериями в) вирусами 7. Моноклональные антитела по структуре являются: а) генетическими фрагментами б) фрагментами микробных клеток в) ферментами г) иммуноглобулинами 8. Гибридомный банк штаммов продуцентов моноклональных антител хранится: а) в холодильнике при + 4 0С б) в холодильнике при -700 С в) при комнатной температуре г) в термостате при 37 0С 9. Аффинная хроматография с моноклональными антителами используется для: а) выделения антигенов и биологически активных веществ из сложных смесей б) специальной окраски белковых молекул в) для разрушения структуры антигенов 10. В онкологии для радиоиммуносканирования опухолей используют моноклональные антитела: а) конъюгированные с флуорохромом б) конъюгированные с радиоактивным изотопом в) конъюгированные с ферментом Ответы: 1 - в), 2 – б), 3 – б), 4 – г), 5 – а), 6 – а), 7 – г), 8 – б), 9 – а), 10 – б). Будчанов Ю.И. Моноклональные антитела. 22
