Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи РАТЬКИН АЛЕКСАНДР ВАЛЕНТИНОВИЧ МЕХАНИЗМЫ ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ СЕСКВИТЕРПЕНОВЫХ ЛАКТОНОВ 14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор фармацевтических наук, доцент Чучалин Владимир Сергеевич Томск – 2017 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ..................................................................................................................... 5 ГЛАВА 1. ДОСТИЖЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ ФАРМАКОТЕРАПИИ НАРУШЕНИЙ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА И АТЕРОСКЛЕРОЗА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) .............................................................................................14 1.1. Гиполипидемические средства .........................................................................14 1.2. Экспериментальные модели атеросклероза и дислипидемий .......................17 1.3. Гиполипидемические свойства средств растительного происхождения .....23 1.4. Перспективы использования сесквитерпеновых лактонов как гиполипидемических препаратов ............................................................................26 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .......................................30 2.1. Характеристика объектов исследования .........................................................30 2.2. Модели, методы исследования и экспериментальные животные .................35 2.3. Скрининг гиполипидемической активности (1-й этап исследования) .........38 2.3.1. Модель острой экспериментальной гиперлипидемии у крыс, индуцированной этиловым спиртом .......................................................................38 2.3.2. Модель острой экспериментальной гиперлипидемии у крыс, индуцированной детергентом WR 1339 .................................................................40 2.3.3. Экспериментальная модель гиперлипидемии у крыс, индуцированной диетой, содержащей холестерол и жиры ..................................42 2.3.4. Изучение гиполипидемического действия на клеточной культуре крысиной гепатомы при экспериментальной модели гиперлипидемии, индуцированной жировой эмульсией .....................................................................45 2.3.5. Оценка экспрессии генов ключевых ферментов липидного обмена на клеточной культуре крысинной гепатомы ........................................................49 3 2.3.5.1. Оценка экспрессии мРНК генов метаболизма липидов...........................51 2.3.5.2. Синтез комплементарной ДНК...................................................................56 2.3.5.3. Полимеразная цепная реакция в реальном времени ................................56 2.4. Исследование механизмов гиполипидемической активности сесквитерпеновых лактонов (2-й этап исследования) ...........................................59 2.4.1. Оценка экспрессии мРНК генов метаболизва липидов в печени крыс .....59 2.4.2. Изучение активности ГМГ-КоА-редуктазы и экскреци холестерола .......62 2.5. Статистическая обработка данных ...................................................................64 ГЛАВА 3. СКРИНИНГ ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (1-Й ЭТАП ИССЛЕДОВАНИЯ)......................................................................................................66 3.1. Исследование эффектов лактонов при острой экспериментальной гиперлипидемии у крыс, индуцированной этиловым спиртом ...........................66 3.2. Гиполипидемическое действие лактонов при острой экспериментальной гиперлипидемии у крыс, индуцированной детергентом WR 1339 ......................79 3.3. Действие сесквитерпеновых лактонов при экспериментальной модели гиперлипидемии у крыс, индуцированной диетой, содержащей холестерол и жиры ...........................................................................................................................91 3.4. Изучение гиполипидемического действия на клеточной культуре крысиной гепатомы (НТС) in vitro при экспериментальной модели гиперлипидемии, индуцированной жировой эмульсией ...................................................................105 3.4.1. Жизнеспособность клеточной культуры гепатомы крыс под воздействием сесквитерпеновых лактонов и гемфиброзила ......................................................105 3.4.2. Содержание липидов в клеточной культуре гепатомы крыс ..................108 3.4.3. Содержание липидов в клеточной культуре гепатомы крыс на экспериментальной модели гиперлипидемии .................................................114 3.5. Оценка экспрессии геновключевых ферментов липидного обмена в клеточной культуре гепатомы под влиянием сесквитерпеновых лактонов ..121 4 3.5.1. Ген рецепторов к липопротеинам низкой плотности (Ldlr) .....................121 3.5.2. Ген 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr) ......................123 3.5.3. Ген ацил КоА-холестерол ацилтрансферазы (Soat1) ................................125 3.5.4. Ген холестерол 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1) .......................................126 3.5.5. Гены карнитин-пальмитоилтрансферазы 1и 2 (Cpt1a и Cpt2) .................128 3.5.6. Ген ацетил-КоА карбоксилазы (Acaca).......................................................131 ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СЕСКВИТЕРПЕНОВЫХ ЛАКТОНОВ (2-Й ЭТАП ИССЛЕДОВАНИЯ)....................................................................................................143 4.1. Влияние сесквитерпеновых лактонов на экспрессию генов ключевых ферментов липидного обмена в печени крыс на модели гиперлипидемии у экспериментальных животных, вызванной атерогенной диетой .......................143 4.1.1. Ген рецепторов к липопротеинам низкой плотности (Ldlr) .....................143 4.1.2. Ген 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr) ......................144 4.1.3. Ген ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1) ..................................146 4.1.4. Ген холестерол 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1) .......................................148 4.1.5. Гены карнитин-пальмитоилтрансферазы 1и 2 (Cpt1a и Cpt2)..................150 4.2. Экскреция холестерола через желудочно-кишечный тракт под влиянием леукомизина .............................................................................................................153 4.3. Влияние леукомизина на активность ГМГ-КоА-редуктазы в печени ........155 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..........................................................................................................168 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ .............................173 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................175 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования В течение последних лет в мире достигнут значительный прогресс в лечении и профилактике сердечно-сосудистых заболеваний. Несмотря на это, атеросклероз и его осложнения сохраняют лидирующие позиции по смертности, социальному и экономическому ущербу в России и во всех индустриально развитых странах мира [11]. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), сердечно-сосудистые заболевания, ассоциированные с атеросклерозом, продолжают оставаться наиболее частой причиной смертности населения в экономически развитых странах и глобальной социально-значимой проблемой. В России заболеваемость системы кровообращения достигает 18% от общей заболеваемости, а смертность от сосудистых поражений мозга и сердца составляет около 50% от общей смертности. Основными факторами высокого риска развития атеросклероза являются дислипидемии и повышенный уровень холестерина липопротеинов низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП) в крови. Эпидемиологические исследования показали прямую корреляцию между нарушениями липидного обмена и риском развития сердечно-сосудистых осложнений [6]. Степень разработанности В связи с высокой медико-социальной значимостью проблема профилактики и терапии атеросклероза вызывает пристальное внимание медиков, биологов и клиницистов во всем мире. Наиболее эффективным фармакологическим подходом к решению проблемы профилактики и лечения атеросклероза является использование лекарственных средств, способных снижать уровень холестерина и общих липидов и нормализовать спектр липидов крови. 6 Получены убедительные статистические свидетельства существенного снижения риска развития таких осложнений атеросклероза, как ишемический инсульт, инфаркт миокарда и коронарная смерть при гиполипидемической терапии. В основном это стало возможным благодаря внедрению в медицинскую практику нового класса гиполипидемических препаратов, которые по механизму действия являются ингибиторами 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим Аредуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы) [179]. Несмотря на широкий арсенал лекарственных средств, используемых для терапии атеросклероза и его проявлений, проблема терапии еще полностью не решена. Не до конца изученными остаются молекулярные механизмы, затрагивающие метаболические и клеточные процессы, лежащие в основе развития патологического процесса. Актуальным вопросом является поиск молекулярных включающий мишеней оценку действия активности биологически и экспрессии активных ключевых веществ, ферментов метаболизма липидов. Ограничивающим фактором поиска гиполипидемических средств выступает сложность моделирования атеросклероза, на сегодняшний день нет адекватной модели in vivo и (или) in vitro, которая могла бы воспроизвести все стадии атеросклероза [193]. Генетические дефекты ключевых ферментов липидного обмена, рецепторов к липопротеинам (ЛП) и к аполипопротеинам, белковых факторов являются важным фактором развития атеросклероза. Создание модели атеросклероза, идентичной организму человека, позволит точнее исследовать патогенетические факторы развития заболевания, а также механизмы его лечения и профилактики [37, 193, 184]. К ряду ценных исходных объектов относятся биологически активные вещества растений в связи с их сравнительно низкой токсичностью, хорошей переносимостью и комплексным воздействием на организм. Перспективным классом природных соединений с высокой фармакологической активностью являются сесквитерпеновые -лактоны [43, 124]. В настоящее время известно более 2000 соединений данного ряда. Установлено, что некоторые лактоны ингибируют 7 активность различных ферментов, таких как фарнезилпротеинтрансфераза, циклооксигеназа и др. [153]. Сесквитерпеновые лактоны артишока (Cynara scolymus L.) цинаропикрин, агуерин В и гроссгемин обладают антигиперлипидемическим действием [46]. В связи с этим большой интерес представляет поиск ингибиторов синтеза холестерина именно среди соединений указанного класса. Гиполипидемические свойства характерны для веществ терпеноидного ряда, содержащих, подобно статинам, 3,5-дигидроксигептановую кислоту. Выраженную активность проявляют сесквитерпеновые лактоны [29], однако молекулярные механизмы их гиполипидемического эффекта остаются неизученными. Учеными Акционерного общества «Международный научнопроизводственный холдинг «Фитохимия» (АО МНПХ «Фитохимия», Казахстан) из растительного сырья выделена группа сесквитерпеновых лактонов: арглабин, людартин, гроссгемин, ахиллин, гроссмизин и леукомизин с потенциальной гиполипидемической активностью, возможно, обусловленной ингибированием ГМГ-КоА редуктазы. В этой связи перспективным является изучение сесквитерпеновых лактонов как потенциальных средств гиполипидемического и антиатерогенного действия. Цель исследования Идентификация механизмов гиполипидемического действия сесквитерпеновых лактонов, выделяемых из растительного сырья, для разработки на их основе средств профилактики и лечения атеросклероза. Задачи исследования 1. Оценить гиполипидемическую активность сесквитерпеновых лактонов (арглабин, людартин, гроссгемин, ахиллин, гроссмизин и леукомизин) на острых экспериментальных моделях in vivo: гиперлипидемии, вызванные этанолом и детергентом WR1339. 8 2. Изучить гиполипидемическую активность сесквитерпеновых лактонов при экспериментальной хронической гиперлипидемии, вызванной у крыс атерогенной диетой. 3. Оценить влияние сесквитерпеновых лактонов на жизнеспособность и обмен липидов культуры клеток гепатомы крыс. 4. Изучить влияние лактонов на экспрессию генов ключевых ферментов обмена липидов в культуре клеток. 5. Установить механизмы нарушения обмена липидов в условиях воздействия липофундина на культуру клеток гепатомы крыс и изучить влияние сесквитерпеновых лактонов на обмен липидов в культуре клеток. 6. Изучить влияние лактонов на экспрессию генов ключевых ферментов обмена липидов в печени крыс при экспериментальной хронической гиперлипидемии, вызванной атерогенной диетой. 7. Исследовать антиатерогенные, гиполипидемические свойства и механизмы действия леукомизина. Научная новизна Впервые проведена фармакологическая оценка гиполипидемического действия шести образцов сесквитерпеновых лактонов (арглабин, людартин, гроссгемин, ахиллин, гроссмизин и леукомизин) и установлены молекулярные механизмы этого эффекта. Впервые предложены и апробированы методы скрининга гиполипидемической активности с использованием культуры клеток. Методы отличаются быстротой, этичностью и низкой себестоимостью, в отличие от традиционно используемых методов исследований на животных. Изучена эффективность сесквитерпеновых лактонов на острых и хронической моделях гиперлипидемии и атеросклероза: индуцированных этанолом, детергентом WR 1339 и атерогенной диетой у экспериментальных животных, а также жировой эмульсией в культуре клеток. 9 Проведена оценка экспрессии ключевых генов метаболизма липидов под влиянием сесквитерпеновых лактонов (арглабин, людартин, гроссгемин, ахиллин, гроссмизин и леукомизин) в культуре клеток и в печени крыс на модели атеросклероза, вызванного атерогенной диетой. Теоретическая и практическая значимость работы Согласно современным представлениям, атеросклероз является гетерогенным многофакторным заболеванием. Исследователями накоплено достаточно данных для утверждения того, что профилактика и лечение этого заболевания должны быть направлены на молекулярные механизмы нарушений обмена липидов. Проведенное иследование позволило установить молекулярные механизмы гиполипидемической сесквитерпеновых лактонов, активности потенциально ряда соединений перспективных для группы создания лекарственных средств. Исследование проведено с целью поиска новых перспективных источников гиполипидемических лекарственных средств. Работа выполнена при финансовой поддержке АО МНПХ «Фитохимия», г. Караганда, Казахстан) (договоры на выполнение научно-исследовательских работ №216 от 25.10.2012 и №77/99 от 19.05.2015 между АО МНПХ «Фитохимия» и Федеральным государственным бюджетным образовательным учреждением высшего образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России, г. Томск, Россия). Полученные данные носят фундаментальный характер и представляют высокую научную и практическую ценность. Результаты раскрывают механизмы гиполипидемического действия сесквитерпеновых лактонов. Работа выполена в рамках реализации стратегии АО МНПХ «Фитохимия» (Казахстан) по созданию новых лекарственных средств растительного происхождения. Материалы настоящей работы могут быть использованы как результаты доклинического исследования эффективности и безопасности новых средств профиактики и 10 лечения атеросклероза, создаваемых на основе изученных сесквитерпеновых лактонов. Идентифицированные молекулярные механизмы гиполипидемической активности группы сесквитерпеновых лактонов (арглабин, людартин, гроссгемин, ахиллин, гроссмизин и леукомизин) открывают возможности для создания и внедрения новых препаратов с целью профилактики и лечения дислипидемий и атеросклероза и расширения арсенала подобных препаратов. Полученные результаты и разработанные методы скрининга гиполипидемической активности могут быть рекомендованы для включения в учебные программы дипломной и последипломной подготовки фармакологов и биохимиков. Результаты и методы настоящей работы используются в лаборатории биологических моделей ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (г. Томск) для выполнения работ по изучению потенциальных гиполипидемических средств растительного и синтетического происхождения. Методология и методы исследования Согласно поставленной цели и задачам выбраны методологически оправданные и информативные методы исследования. За методологическую основу взято Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств и дополненно оригинальными методологическими подходами, направленными на углубленное исследование. Работа выполнена на базе научно-исследовательских лабораторий ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России. Исследование проведено в два этапа: скрининг механизмов гиполипидемического действия сесквитерпеновых лактонов, последующее расширенное изучение механизмов влияния лактонов на экспрессию генов обемена липидов в печени экспериментальных животных и исследование фармакологических свойств наиболее активного лактона – леукомизина, определенного на первом этапе. 11 Исследование является частью доклинического изучения эффективности и безопастности вновь создаваемых лекарственных препаратов, поэтому были использованы соответствующие рекомендованые методы, дополненные изучением молекулярных механизмов действия. Эксперименты выполнены in vivo и in vitro на беспородных крысах-самцах и в культуре клеток гепатомы крыс. Для моделирования патологии обмена липидов и атеросклероза использовали три модели на животных и одну модель на культуре клеток. Положения, выносимые на защиту 1. Сесквитерпеновые лактоны (арглабин, людартин, гроссгемин, гроссмизин, ахиллин и леукомизин) снижают уровень триацилглицеролов, свободных жирных кислот и холестерола на острых моделях гиперлипидемии, индуцированных этанолом и тритоном WR 1339. При этом исследуемые сесквитерпеновые лактоны в зависимости от структуры оказывают влияние на разные показатели липидного обмена. Леукомизин проявил более высокую активность в сравнении с другими лактонами. 2. Экспериментальная оценка влияния исследуемых объектов на показатели липидного обмена лабораторных животных при хронической гиперлипидемии, вызванной высокожировой диетой, свидетельствует о способности сесквитерпеновых лактонов снижать уровень триацилглицеролов, свободных жирных кислот и холестерола. 3. Исследуемые сесквитерпеновые лактоны, проявляя гиполипидемическую активность, в различной степени влияют на экспрессию ключевых генов обмена липидов в культуре клеток гепатомы крыс и в печени животных на фоне атерогенной диеты. 4. По результатам скрининга гиполипидемической активности лактонов, максимальный эффект проявляет леукомизин, менее выраженный – два химически близких соединения – ахиллин и гроссмизин (гидроксиахиллин). 12 Арглабин, гроссгемин и людартин характеризуются самой низкой активностью и (или) большей токсичностю в экспериментах на культуре клеток. 5. Механизмы гиполипидемического действия леукомизина включают: способность на фоне атерогенной диеты, подобно розувастатину, повышать экспрессию генов карнитин-пальмитоилтрансферазы 1 и 2 (Cpt1a и Cpt2) и снижать величину экспрессии ацилКоА-холестерол ацилтрансферазы (Soat1). Гиполипидемический эффект леукомизина связан с его способностью ингибировать активность ГМГ-КоА-редуктазы в гепатоцитах крыс. Леукомизин увеличивает экскрецию холестерола с фекалиями из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Степень достоверности и апробация результатов Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным объемом экспериментального материала с использованием современных методов и методических подходов, соотвествующих поставленным задачам. Выводы, сформулированные в диссертации, подтверждены экспериментальным материалом, анализом литературы, точностью статистической обработки. Основные положения работы доложены на Европейской конференции по биологии и медицинским наукам «Восток-Запад» (Вена, Австрия, 2014), Международной перспективы научно-практической развития фитохимии» конференции (Караганда, «Достижения Казахстан, 2015), и XIII Международной научно-парктической коференции «Научные перспективы XXI века. Достижения и перспективы нового столетия» (Новосибирск, Россия, 2015), 9-й Международной научно-практической конференции (Махачкала, Россия, 2015), Международной научно-практической конференции «Наука и образование 2015» (Мурманск, Россия, 2015). Исследование выполнено в рамках реализации грантов совета при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ: 13 1. «Идентификация молекулярных мишеней регуляции апоптоза, пролиферации и дифференцировки клеток крови при патологии инфекционного и неинфекционного генеза», соглашение № 16.120.11.614-НШ (2012–2013); 2. «Молекулярные механизмы нарушения апоптоза, пролиферации, дифференцировки и коммуникации клеток крови при социально-значимых заболеваниях инфекционного и неинфекционного генеза», соглашение № НШ4184.2014.7 (2014–2015). По профилю диссертации опубликовано 25 работ, из них 14 полнотекстовых статей в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации. Личное участие автора Автор принимал личное участие в проведении научно-исследовательской работы на всех этапах – от планирования до обсуждения результатов и публикации результатов научного исследования. Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования и двух глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований), заключения и списка литературы. Работа изложена на 198 страницах машинописного текста, иллюстрирована 35 таблицами и 48 рисунками. Библиографические ссылки включают 205 источников, из которых 169 – публикации зарубежных авторов. 14 ГЛАВА 1. ДОСТИЖЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ ФАРМАКОТЕРАПИИ НАРУШЕНИЙ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА И АТЕРОСКЛЕРОЗА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Гиполипидемические средства Арсенал лекарственных препаратов и технологий, используемых в терапии нарушений липидного обмена и связанных с ними сердечно-сосудистых заболеваний, достаточно широк. Существуют разные по механизму действия лекарственные препараты, нормализующие уровень липидов и холестерина [4, 13, 83]. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (2016), гиполипидемические препараты классифицируются следующим образом: 1) статины (ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы); 2) фибраты; 3) секвестранты желчных кислот; 4) никотиновая кислота и ее производные; 5) препараты с прочими механизмами действия; 6) комбинированные лекарственные средства, содержащие в качестве обязательного компонента ингибитор ГМГ-КоАредуктазы. Ряд препаратов, используемых для терапии дислипидемий и атеросклероза, обладают невысокой активностью или вызывают побочные эффекты [32, 97, 99, 141, 150]. В качестве гиполипидемических средств применяются следующие группы препаратов: ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы (статины), фибраты, анионообменные смолы, никотиновая кислота и ее производные. В соотвествии с международной классификацией, гиполипидемические препараты являются средствами, влияющими на сердечно-сосудистую систему (код С) [35, 64]. В настоящее время наиболее широко применяемыми, изученными и эффективными средствами, используемыми в терапии атеросклероза и дислипидемий, являются статины [30, 31, 36] – конкурентные ингибиторы 15 фермента ГМГ-КоА-редуктазы, являющегося ключевым ферментом синтеза холестерола в печени [74–76]. Кроме прямого гиполипидемического эффекта, статины обладают несколькими другими полезными биологическими свойствами [31, 83]. Например, они повышение улучшают функциональное состояние биодоступности оксида азота [74, эндотелия через 135], оказывают противовоспалительное действие, реализованное через снижение уровня Среактивного белка [190], улучшают реологические свойства крови и снижают агрегацию тромбоцитов [32, 160], способны останавливать рост и стабилизировать атеросклеротические отложения [160]. Статины регулируют ангиогенез [75], проявляют антиоксиданое, антитромботическое другие действия [19, 190]. По мнению некоторых ученых, подобные эффекты ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы не опосредованы их гиполипидемическим действием, а являются самостоятельными механизмами [83]. Внутриклеточный метаболит мевалонат является основным звеном для синтеза холестерола и принимает участие в синтезе других производных изопреноиднов, например, фарнезилфосфата или геранилпирофосфата. Эти изопреноиды принимают участие во внутриклеточном транспорте ряда белков, таких как Rho и Ras, которые играют гладкомышечных важную роль клеток, что в дифференциации может положительно и пролиферации сказываться на эффективности терапии атеросклероза [76]. Несмотря на достаточно высокую эффективность статинов, длительное их применение способно вызывать побочные эффекты. Проведенные в разных странах мира исследования подтверждают наличние побочных эффектов. К рискам использования статинов и возможным побочным эффектам их применения относят гепатотоксические эффекты [54, 97, 141] и развитие миопатии, вплоть до рабдомиолиза. Вероятность риска миопатии невысока, но она увеличивается с повышением дозировки препаратов и в тяжелых случаях может привести к рабдомиолизу [97, 141], что связано со снижением содержания холестерола в миоцитах. Исходя из выше изложенного, статины следует 16 назначать с осторожностью лицам, страдающим различными хроническими заболеваниями, в том числе печени, сахарным диабетом и гипотиреозом. Фибраты являются производными фиброевой кислоты и по своим гиполипидемическим липопротеинов, свойствам богатых преимущественно триацилглицеролами (ТАГ). влияют на Фибраты обмен снижают содержание холестерола (ХС) в ЛПНП, уменьшают количество плотных мелких частиц ЛПНП и повышают содержание крупных ЛПНП, что улучшает «узнаваемость» ЛПНП рецепторами печени и повышает клиренс катаболических процессов. Фибраты способны увеличивать синтез апобелков «хорошего» холестерола – апоA-I, апоА-II [30, 83, 133]. Производные фиброевой кислоты также улучшают липолиз ТАГ-богатых липопротеинов через активацию ферментов липопротеинлипазы и липазы гепатоцитов. Множественные биологические эффекты фибратов опосредованы через активирование ядерных α-рецепторов, активирующих пролиферацию пироксисом (PPARα) [30, 83, 133]. Наряду с гиполипидемическим противовоспалительным, действием антитромботическим фибраты свойствами, обладают а также способностью улучшать функцию эндотелия сосудов. Фибраты уменьшают оксидативный стресс, улучшают функцию эндотелия, что связано с воздействием на PPARα рецепторы и изменение экспрессии ряда генов [63]. Фибраты положительно влияют на гемореологические свойства крови и улучшают фибринолитическую активность [80] и микроциркуляцию [83, 133]. Вместе с тем, фибраты не лишены побочных эффектов, таких как гепатотоксические свойства, нарушения со стороны ЖКТ (тошнота, запоры, диарея и др.), болевые ощущения [83, 128]. С появлением статинов роль других групп гиполипидемических препаратов значительно снизилась. Так, в настоящее время практически потеряли свое значение как гиполипидемические средства секвестранты желчных кислот и производные никотиновой кислоты. Их изредка назначают в качестве дополнительных средств при терапии статинами [30, 36]. Кроме того, 17 гиполипидемический эффект никотиновой кислоты проявляется в высоких дозах (2–6 г в сутки) и ее применение ограничевается серьезными и разнообразными побочными эффектами от высоких доз [13, 30, 83]. Таким образом, гиполипидемических и несмотря на антиатерогенных значительное препаратов количество на мировом фармацевтическом рынке, важной научной задачей является поиск новых гиполипидемических лекарственных средств, обладающих высокой эффективностью и безопасностью применения. 1.2. Экспериментальные модели атеросклероза и дислипидемий Дислипидемия – это нарушенние соотношения в плазме классов липопротеинов (ЛП) [14]. Дислипидемии проявляются гипертриглицеридемией, гиперхолестеринемией или смешанной гиперлипопротеинемией [132, 201, 204]. Дислипидемии являются одним из факторов риска развития атеросклероза [145, 202]. Нарушение постпрандиального метаболизма липидов увеличивает время нахождения ЛП в кровотоке и повышает риск атеросклероза сосудов [196]. Атеросклероз инфильтрацией – липидами многофакторное поврежденной заболевание, интимы сосудов, проявляющееся разрастанием соединительной ткани с образованием фиброзных бляшек, что в итоге приводит к сужению просвета сосудова [26]. Патогенез атеросклероза представляет собой динамичный процесс. В настоящее время нет единой теории, объясняющей и учитывающей все его стороны. Все данные о атогенезе атеросклероза можно объединить в рамки двух концепций: гипотеза «ответ на повреждение» и липидно-инфильтрационная гипотеза. Гипотезы не противоречат друг другу и во многом дополняют одна другую при объяснении различных процессов, возникающих при атеросклерозе [3, 18]. Первая научная липидная теория развития атеросклероза была разработана отечественным патоморфологом Н. Н. Аничковым, который совместно с С. С. Халатовым в 1913 г. показал, что добавление холестерола и жира к 18 обычному корму кроликов вызывает атеросклероз аорты и ее ветвей [3]. Согласно этой теории, пусковым моментом развития атеросклероза является инфильтрация интимы и субэндотелия липидами и ЛП. В основе гипотезы «ответ на повреждение», предложенной в середине 1970-х гг. американскими исследователями R. Ross и J. A. Glomset, в качестве фактора, инициирующего атеросклеротический процесс, рассматривается нарушение целостности эндотелия. В эндотелиальном слое повреждается цитоскелет, увеличивается расстояние между клетками, ослабляются межклеточные связи с экспозицией субэндотелиальных структур [176]. Повреждению эндотелия способствуют эндогенные и экзогенные химические факторы (метаболиты гликозилирования и табачного перекисного дыма, катехоламины, окисления), повышение продукты артериального давления, дислипидемия, модификация ЛП. В качестве повреждающих агентов также могут выступать бактериальная и вирусная инфекции и сопутствующие им клеточные и гуморальные иммунные и (или) аутоиммунные реакции [18, 96, 154]. При повреждении эндотелия увеличивается экспрессия провоспалительных цитокинов (интерлейкин-1, фактор некроза опухолей α), хемокинов, факторов роста тромбоцитов и фибробластов. Данные факторы вызывают адгезию и миграцию моноцитов и Т-лимфоцитов в интиму сосуда [65, 92]. В последующем моноциты дифференцируются в макрофаги. Они синтезируют рецептор фагоцитоза, позволяющий поглощать окисленные ЛПНП. Цитоплазма макрофагов обогащается частицами липидов. Макрофаги трансформируются в пенистые клетки, образуют липидные полоски – предшественники зрелых фиброзных бляшек [119]. В развитии атеросклероза, наряду с дисфункцией эндотелия, важными этиологическими факторами являются дислипидемии. Липидный спектр плазмы характеризуются триацилглицеролов, высоким уровнем хиломикронов ХС и в их ЛПНП (ХС-ЛПНП), транспортных белков 19 (аполипопротеина В). Содержание ХС липопротеинов высокой плотности (ХСЛПВП) и их транспортного белка апо-А-1 уменьшается [14]. Первичные дислипидемии возникают в результате дефектов генов, регулирующих функции рецепторов, ферментов или транспортных белков, участвующих в липидном обмене [21, 149, 194]. Вторичные дислипидемии развиваются при заболеваниях печени, гормональных нарушениях (сахарный диабет, дисфункция щитовидной железы) или приеме лекарственных средств (мочегонные, β-адреноблокаторы, иммунодепрессанты) [15]. Для изучения способности веществ оказывать гиполипидемическое и антиатеросклеротическое действие используют in vivo и in vitro ряд экспериментальных моделей гиперлипидемии с различными механизмами развития. Идеальная модель для изучения дислипидемии на животных должна отображать развитие различных стадий заболевания, включая накопление пенистых клеток, соответствующих образование осложнений, атеросклеротических таких как бляшек, кальцификация, а также изъязвления, кровоизлияния, тромбоз и стеноз. Разрабатываются модели на животных, которые адекватно отражают патогенез атеросклероза, однако каждая из них имеет некоторые ограничения [114]. Как правило, нарушения обмена веществ у животных вызывают с помощью генетических манипуляций, диетотерапии, хирургии, введения ксенобиотиков (лекарств или токсинов), а также используют комбинации указанных методов [173]. Выделяют острые и хронические модели гиперлипидемии [27]. Модель острой гиперлипидемии, вызванной однократным введением в желудок мышей или крыс 40%-го раствора этанола (5 г/кг), основана на его способности стимулировать секрецию адреналина и активировать липолиз. В результате усиления липолиза повышается уровень жирных кислот (ЖК) в плазме. Они включаются в печени в ТАГ, секретируемые в составе ЛПОНП. [27, 28]. В патогенезе алкогольной гиперлипидемии важную роль играет 20 недостаточное окисление ЖК в митохондриях. Кроме того, при метаболизме этанола образуется большое количество НАДН. Этот кофермент нарушает цикл трикарбоновых кислот и окисление свободных жирных кислот (СЖК) с развитием гиперлипидемии [70, 200]. Гиперлипидемию (твин 80, тритон моделируют WR 1339). однократным Детергенты, введением ингибируя детергентов липопротеинлипазу эндотелия, препятствуют утилизации ЛП, богатых ТАГ, и способствуют накоплению ТАГ в крови экспериментальных животных [16, 27]. Увеличение концентрации общего ХС в крови при воздействии тритона WR 1339 обусловлено также повышенным всасыванием ХС из кишечника, усилением синтеза эндогенного ХС или нарушением его элиминации в составе ЛПНП. Детергент тритон WR 1339 снижает клиренс липопротеинов, усиливает синтез холестерола в печени за счет активации ГМГ-КоА-редуктазы и повышает экспрессию участвующих в метаболизме ЛПНП рецепторов, [16]. Модель гиперлипидемии, вызванной тритоном WR 1339, характеризуется значительным увеличением концентрации различных проатерогенных фракций липопротеинов в крови и оценивается как перспективная для изучения влияния фракционного и субфракционного состава ЛП на патогенез атеросклероза и исследования гиполипидемических средств [23]. Для оценки способности веществ оказывать влияние на скорость постпрандиального метаболизма липидов применяют модель гиперлипидемии, вызванной однократным введением в желудок животных оливкового масла в дозе 5 мл/кг [47]. В развитии гиперлипидемии и атеросклероза важную роль играют как эндогенные нарушения синтеза, транспорта, ферментативного превращения и катаболизма ХС и ТАГ, так и экзогенные влияния в виде различных пищевых нагрузок [22]. Серьезное ограничение на моделирование атеросклероза и дислипидемий накладывают видовые особенности метаболизма. Так, у мышей и крыс, в 21 отличие от людей, регистрируется низкий уровень ХС-ЛПНП и высокий уровень ХС-ЛПВП. У мышей это связано с отсутствием белка-транспортера эфиров ХС (CEPT), который осуществляет перенос эфиров ХС из липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в ЛПОНП и ЛПНП [91]. Таким образом, у мышей 80% ХС плазмы локализован в составе антиатерогенных ЛПВП, что препятствует развитию гиперхолестеринемии и атеросклероза [195]. Для изучения гиполипидемической активности новых веществ широко используется способ моделирования гиперлипидемии с помощью длительного (от 2 нед до 3 мес.) кормления экспериментальных животных высокожировой диетой, богатой ХС [27]. Воспроизведение гиперлипидемии с помощью только атерогенной диеты является достаточно проблематичным у крыс и мышей [162]. Для преодоления ограничений используют ДНК-технологии, чтобы создать генетические модификации. Получены линии мышей с удаленными генами аполипопротеина Е, рецептора ЛПНП, печеночной липазы, а также с увеличенной экспрессией гена апо В-100 [112, 164, 203]. Аполипопротеин Е расположен на поверхности циркулирующих в крови ЛП (хиломикронов, ЛПОНП, ЛПВП) и является лигандом рецепторов в печени. В крови мышей с удаленным геном аполипопротеина Е повышается уровень богатых ТАГ ЛП, что приводит к развитию атеросклероза на фоне стандартной диеты [131]. После удаления у мышей гена, кодирующего рецептор ЛПНП, увеличивается количество циркулирующих в крови атерогенных ЛП, но для развития атеросклероза у таких животных необходимо добавлять в пищу ХС [90]. Для моделирования атеросклероза у кроликов используют диету с высоким содержанием ХС или многократно повреждают интиму аорты ренгенконтрастными полиэтиленовыми катетерами и (или) оксидом азота [12]. Дополнительное повреждение интимы на фоне атерогенной диеты способствует 22 более быстрому развитию атеросклеротических повреждений в брюшной аорте [142]. В настоящее время для скрининга лекарственных средств и углубленного изучения механизмов развития дислипидемии и атеросклероза используют культуры клеток. Культуры клеток легко воспроизводятся и поддерживаются, обеспечивают высокую доказательность результатов, при этом не требуют значительных финансовых расходов. Эксперименты на культуре клеток предпочтительны и по этическим соображениям [24, 109, 172]. Для выяснения механизмов действия высоких концентраций триглицеролов и холестерола на липидный обмен были предложены модели гиперлипидемии in vitro, которые воспроизводятся добавлением жировой эмульсии и (или) жирных кислот к культурам клеток [187]. Известно, что нарушение обмена ХС и ТАГ в гепатоцитах способствует развитию гиперлипидемии в результате изменения активности ферментов [5]. Культивирование клеточной культуры гепатомы человека с пальмитиновой, стеариновой и олеиновой кислотами снижает активность ферментов, участвующих в окислительном фосфорилировании, за счет уменьшения количества цитохромов – транспортеров электронов в дыхательной цепи. Эти нарушения связаны с окислительным стрессом, вызванным избыточным количеством ЖК [88]. Культивирование гепатоцитов крыс с жировой эмульсией (липофундин) в течение 48 ч вызывает накопление ТАГ и ЖК, а также окислительный стресс с нарушением функций клеток [105]. Таким образом, дислипидемии и атеросклероз представляют собой полиэтиологические заболевания. Для изучения веществ с потенциальной гиполипидемической активностью и выяснения механизмов этого эффекта необходимо использовать модели гиперлипидемии, отражающие различные стадии патогенеза этого состояния. 23 1.3. Гиполипидемические свойства средств растительного происхождения Активно исследуемым гиполипидемических происхождения. и препаратов Растительные важным потенциальным являются вещества биологически ресурсом растительного активные вещества характеризуются комплексным воздействием на липидный обмен, умеренной или низкой токсичностью, доступностью сырья [39]. Антиатеросклеротические и гиполипидемические эффекты растений определяются различными биологически активными веществами, чаще это терпеноиды, алкалоиды, флавоноиды, полифенолы, сапонины, витамино- и гормоноподобные вещества [38, 139]. Значительный интерес представляют различные природные вещества, способные контролировать уровень липидов в плазме [62, 188]. Механизмы гиполипидемического действия могут быть опосредованы через изменение транкрипции генов обмена липидов, непосредственного влияния на активность ферментов, а также воздействия на сигнальные пути обмена липидов. Гиполипидемическую активность проявляют вещества из групп полифенолов, алкалоидов, флавоноидов, например, развератрол, рутин, куркумин, полипренолы, берберин [40, 84, 171]. С высокой степенью доказанности в различных исследованиях, включая клинические исследования, антиареросклеротической можно говорить активности об выделяемых гиполипидемической из растений и веществ: берберина, куркумина, коэнзима Q10, полифенолов и антоцианов, кверцетина и некоторых других [62]. Берберин представляет собой изохинолиновый алкалоид типа протоберберина, который содержится в корнях, корневище и стволовой коре многих видов растений, таких как Coptis chinensis Franch, широко применяется в традиционной китайской медицине. Эффекты и механизмы гиполипидемического действия берберина изучены в экспериментах и в клинической практике. Берберин снижает уровень холестерола, обладает 24 противовоспалительным и антиоксидантным действием, увеличивает утилизацию глюкозы адипоцитах и миоцитах, оказывая тем самым лечебное действие и при диабете, у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией уменьшает повреждения аорты [55, 77, 125, 144]. Экстракт бергамота, содержащий полифенолы, на фоне атерогенной диеты и гиперлипидемии у крыс, а также у исследованных 237 пациентов, страдающих гиперлипидемией снижает общий уровень холестерола, ТГ и ЛПНП, причем эффект сопровождается повышением уровня антиатерогенных ЛПВП. Экстракт бергамота ингибирует реактивность сосудистой ГМГ-КоА-редуктазу стенки, таким и снижает образом, повышенную представляет собой эффективное гиполипидемическое средство растительного происхожденния [103, 127, 177]. Полифенолы зеленого чая, в числе множественных эффектов оказывают гиполипидемическое действие, механизмы данного действия связаны с влиянием на уровень рецепторов к липопротеинам, стабилизацией эндотелия сосудов и снижением активности ГМГ-КоА-редуктазы в печени [79, 95, 180, 185]. Гиполипидемические свойства полифенола куркумина, основного куркуминоида, входящий в состав корня куркумы, доказаны в клинической практике с ипользованием рандомизированного, двойного слепого плацебо контролируемого исследования [120, 163]. Механизм действия куркумина связан с влиянием на усиление утилизации ЛПНП и изменением экспрессии генов обмена липидов [67, 68]. Гиполипидемические свойства при модели сахарного диабета показаны лдя распространенного как сорняк растения лопуха большого (Arctium láppa), водное извлечение из лопуха снижало соджержание триацилглицеролов, холестерина и нормализовывало содержание липопротеинов высокой плотности в крови [44, 82]. Присутсвующие во многих фруктах в значительных количествах пектины, или пектиновые вещества, представляющие собой полисахариды состоящие из 25 остатков галактуроновой кислоты оказывают гиполипидемическое действие, механизм которого связан с усилением выделения холестрола через желудочнокишечный тракт [78, 137]. Полисахариды Cyclocarya paliurus на модели гиперлипедемии у животных улучшали липидный спектр сыворотки крови, уменьшали стеатоз печени и улучшали резистентность к глюкозе и инсулину, что может быть объяснено модуляцией активности печеночных ферментов обмена липидов и холестерола [146]. Бобы фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris L.) и ее отдельные действующие вещества, такие как фитостеролы и сапонины, обладают гиполипидемическим действием in vivo и in vitro. Механизм действия включает в себя ингибирование абсорбции липидов в кишечнике, связывание желчных кислот, увеличение экскреции холестерола с фекалиями [148]. Гипенозиды - сапонины, получаемые из некоторых растений традиционной китайской медицины, обладают гиполипидемическим действием на экспериментальной модели у мышей [122]. Суммарные экстракты из растений способны регулировать микрофлору желудочно-кишечного тракта и улучшать липидный спектр крови у добровольцев с гиперхолестиринемией. Экстракты увеличивали скорость утилизации ЛПНП [155]. Комбинированная терапия гиперлипидемий и атеросклероза с помощью растительных средств и коррекции образа жизни пациентов в ряде случаев может быть хорошей альтернативой медикаментозной терапии [66]. Таким образом, проводимые в мире работы по изучению растительных средств профилактики и терапии гиперлипидемий позволяют сделать вывод о целесообразности исследования биологически активных веществ растений как потенциальных гиполипидемических и антиатеросклеротических препаратов. 26 1.4. Перспективы использования сесквитерпеновых лактонов как гиполипидемических препаратов Важным источником новых фармакологических средств, обладающих гиполипидемическим действием, является растительное сырье. Большой интерес, связанный с химическим разнообразием, структурной схожестью с некоторыми эндогенными биологичесикими веществами и лекарственными средствами, различными эффектами, показанными in vivo и in vitro, представляют терпеноиды [101, 104, 143, 153, 186]. Терпеноиды, как большой класс схожих химических соединений, проявляют множественные виды фармакологической активности – гиполипидемическую, противоспалительную, противопаразитарную, цитотоксическую, антимикробную и др. [41, 46, 69, 111, 115]. Среди терпеноидов, продуцируемых растениями, активно изучаются сесквитерпеновые лактоны, которые представляют собой обширную группу, как по количеству соединений, так и по разнообразию углеродного скелета, и обладают высокой биологической активностью [60, 110]. В наибольшем количестве сесквитерпены присутствуют в растениях семейств Астровых (Asteraceae), Кизиловых (Cornaceae), Рутовых (Rutaceae) и Магнолиевых (Magnoliaceae) [25]. Сесквитерпеновые лактоны обладают антиоксидантным и противовоспалительным действием [156]. Терпеноиды, выделенные из растений рода Полынь (Artemisia), обладают несколькими важными молекулярными механизмами действия, например, угнетают выработку простагландина Е2 и оксида азота (NO), фактора некроза опухолей α и интерлейкина 1β в макрофагах, стимулированных липополисахаридом. Терпеноиды полыней проявляют противовоспалительное действие, опосредованное через ингибирование циклооксигеназы-2, NO-синтазы, активируя NF-kB путь [72, 166]. Сесквитерпеновые лактоны, выделенные из Полыни бледной (Artemisia pallens) оказывают противовоспалительное действие сравнимое с эффектами синтетических нестероидных противовоспалительных средств [167]. 27 Противовоспалительные свойства показаны для секвитерпеноида деацилцинаропикрина [50]. Содержащиеся в Сферантусе индийском (Sphaeranthus indicus) биологически активные вещества группы сесквитерпеновых лактонов проявляют гиполипидемическую, противовоспалительную, гепатозащитную и другие виды фармакологической активности [87, 100]. Сесквитерпеноиды, выделенные из представителей семейства Миртовых (Myrtaceae), оказывают антиоксидантное и Противовоспалительное гипохолестеринемическое, противовоспалительное действие антимикробное, действия сесквитерпеноидов [178]. проявляется при ревматизме, цитотоксические свойства находят применение в терапии опухолей; показана эффектвиность сесквитерпеновых лактонов при лейкемии [124]. Показано, что сесквитерпеновые лактоны Тысячелистника Вильгельмса (Achillea Wilhelmsii) снижают уровень общего холестерола и ЛПНП, одновременно повышая содержание антиатерогенных ЛПВП. Кроме того, снижается давление крови [49], оказывая гиполипидемическое действие. Изучены некоторые механизмы гиполипидемического действия сесквитерпеновых лактонов. Например, показано снижение содержания общего ХС и триацилглицеролов в крови, механизм связан с ингибированием ряда ферментов. Структурами, обуславливающими активность сесквитерпеноидов, считают гамма-лактонную часть, циклопентановое кольцо и альфа- эпокисциклопентановый фрагмент [45]. Гиполипиемические свойства и способность нормализовывать уровень глюкозы в крови показаны для сесквитерпеновых лактонов ванилосмина и костунолида, выделенных из Малайского имбиря (Costus speciosus). Механизм действия связан с влиянием на разные звенья обмена липидов и глюкозы, в том числе на секрецию инсулина и систему глутатиона [42, 81, 108, 134]. Кроме того, костунолид обладает антимикробными и противогрибковыми свойствами [51]. Терпеноидный альдегид госсипол способен снижать содержание общего ХС и ХС-ЛПНП [169]. Упоминается о важности лактонного кольца в проявлении 28 гиполипидемического действия. Так, терпеноидные соединения пентацецилиды ингибируют образование липидных капель в макрофагах [198]. Одним из возможных механизмов гиполипидемического действия сесквитрпеновых лактонов является замедление эвакуации пищи из желудка. Показана важность бутиролактонового кольца сесквитерпенов в реализации гиполипидемического действия [47]. Сесквитерпеноид зерумбон, содержащийся в растениях рода имбирь, оказывает гиполипидемическое действие, нормализует содержание ТГ, ХС и ЛНП. Механизм действия зерумбона связян с влиянием на экспрессию генов, участвующих в обмене липидов [121]. Терпеноиды коры проторуса длиннолистного (Protorhus longifolia), улучшали утилизацию глюкозы и обмен липидов в культуре клеток адипоцитов, а при модели атеросклероза, вызванного у крыс высокожировой диетой, указанные терпеноиды нормализовывали липидный спектр крови [106, 107]. Гиполипидемическое действие при различных моделях гиперлипидемии, оказывает сесквитерпеновый лактон цинаропикрин, содержащийся в различных растениях, в частности выделенный из артишока испанского (Cynara scolymus L), проявляет [48]. Косвенное влияние на нормализацию обмена липидов может оказывать гепатопротекторный эффект сесквитерпеновых лактонов, например, выделенных их Одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale) [100]. Важный механизм гиполипидемиеского действия, идентичный механизму действия статинов, показан для фарнезола и дитерпеновых лактонов Полиалтии длиннолистной (Polyalthia longifolia) [76, 113, 165]. Рядом авторов изучены гиполипидемические свойства леукомизина – одного из перспективных веществ, исследованных в настоящей диссертации. Леукомизин проявляет противоатеросклеротическое действие, тормозит развитие повреждений эндотелия сосудов, сохраняет эластические элементы в аорте [2, 7]. Леукомизин проявляет противоаллергические эффекты [2, 7, 53, 29 183]. Установлено свойство леукомизина снижать уровень холестерола и триацилглицеролов при пищевой гиперлипидеимии [7]. Фармакокинетика леукомизина характеризуется его способностью легко распределяться по всему организму и проникать через гематоэнцефалический барьер; препарат преимущественно накапливается в сердце и печени [2, 7]. Распредение леукомизина в организме после инъекционного введения носит двухфазный характер: первая фаза длится около одного часа и характеризуется коротким временем полуэлиминации. Вторая фаза отличается от первой большим временем полувыведения [2, 7]. При пероральном введении леукомизина максимальная концентрация в крови создается через 3 ч, биодоступность составляет около 15%, препарат длительно циркулирует в организме, стационарная его концентрация при ежедневном однократном приеме создается через 54 ч [2, 7]. Таким образом, сесквитерпеновые лактоны являются перспективным классом веществ для создания препаратов с гиполипидемической активностью. Это дает предпосылки для скрининга веществ терпеноидной структуры по их влиянию на обмен липидов в условиях in vivo и in vitro. Однако молекулярные механизмы гиполипидемического эффекта сесквитерпеновых лактонов остаются неизвестными в полной мере. Указанные факты определяют актуальность и целесообразность выполнения настоящей исследовательской научной работы по изучению молекулярных сесквитерпеновых лактонов. механизмов гиполипидемического действия 30 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальные исследования проводились на базе лаборатории биологических моделей ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (г. Томск). Исследование выполнено в рамках договоров между ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России и Акционерным обществом «Международный научнопроизводственный холдинг «Фитохимия» (г. Караганда, Казахстан). Исследование проведено в два этапа: 1. Скрининговое изучение эффектов и механизмов гиполипидемического действия сесквитерпеновых лактонов (шесть перспективных образцов, потенциально обладающих антиатерогенным и гиполипидемическим действием: арглабин, людартин, гроссгемин, ахиллин, гроссмизин и леукомизин). 2. Исследование механизмов гиполипидемического действия лактонов по уровню экспрессии генов обмена липидов; изучение наиболее активного лактона, определенного на первом этапе (леукомизин), перспективного для создания лекарственного препарата. Эксперименты выполнены in vivo и in vitro – на крысах-самцах и культуре клеток гепатомы крыс. Для моделирования патологии обмена липидов и атеросклероза использовали три модели на животных и одну модель – на культуре клеток. 2.1. Характеристика объектов исследования Объекты исследования, шесть образцов сесквитерпеновых лактонов (арглабин, людартин, предоставлены АО гроссгемин, ахиллин, «Международный гроссмизин и леукомизин) научно-производственный холдинг «Фитохимия» (г. Караганда, Казахстан). Исследованные лактоны относятся к гвайановому ряду. Арглабин брутто-формула (1(10)β-эпокси-5,7α(Н),6β(Н)-гвай-3(4),11(13)диен-12,6-олид), С15Н18О3, CAS номер: UVJYAKBJSGRTHA-CUZKYEQNSA-N (Рисунок 1). 84692-91-1,InChIKey: 31 O H O O Рисунок 1 – Структурная формула арглабина Количественное содержание арглабина в серии исследуемой субстанции составляло не менее 99 % (СО ГФ РК, ГФ РК, том 3, глава 5.12; с. 122, АНД РК 42-1434-10). Источником получения является СО2-экстракт полыни Artemisia glabella Kar. et Kir. (Anthemideae), Artemisia filatovae A. Kupr., Artemisia myriantha Wall. (Anthemideae). Арглабин – белый порошок, горький на вкус, без запаха, легко растворим в этаноле, хлороформе, ацетоне, этилацетате, диэтиловом эфире, практически не растворим в воде. Арглабин официально зарегистрирован как лекарственный препарат (фармацевтическая субстанция) в Республике Казахстан и используеться для производства одноименного противоопухолевого препарата. Людартин брутто-формула (3,4α-эпокси-5,7α(Н),6(Н)-гвай-1(10),11(13)-диен-12,6-олид), С15Н17О3, CAS номер: 36149-87-8, InChIKey: QXJYIGSXUBOSID-RFQJILJESA-N (Рисунок 2). Количественное содержание людартина в серии исследуемой субстанции составляло не менее 98 %. Источником получения является СО2-эксракт полыни Artemisia curruthii Wood. Людартин – порошок белого цвета, без запаха, растворим в этаноле, хлороформе, ацетоне, этилацетате, диэтиловом эфире, практически не растворим в воде. 32 O H O O Рисунок 2 – Структурная формула людартина Гроссгемин 12,6-олид), (3-оксо-8-гидрокси-1,5,7α,4,8β(Н)-гвай-10(14),11(13)-диен- брутто-формула С15Н18О4, CAS номер: 22489-66-3, InChIKey:YGMIBVIKXJJQQJ-MSOSQAFRSA-N (Рисунок 3). H O OH H O O Рисунок 3 – Структурная формула гроссгемина Количественное содержание гроссгемина в серии исследуемой субстанции составляло не менее 99 %. Источником получения является СО2-эксракт Amberboa lippi D.C. (Cynareae), Centaurea lippii (Cynareae), Chartolepis intermedia Boiss (Cynareae), Chartolepis pterocaula (Trautv.) Czerep. (Cynareae), Crepis virens (Lactuceae), Grossheimia macrocephala (Muss. - Puschk) D. Sosn et Takhii. (Cynareae), Grossheimia ossica (Cynareae), Venidium decurens Less. 33 Гроссгемин – порошок белого цвета, без запаха, растворим в хлороформе, бензоле, этаноле, практически не растворим в воде. Ахиллин (2-оксо-5α,7α,6β,11β-(Н)-гвай-1(10),3(4)-диен-12,6-олид), бруттоформула С15Н18О3, CAS номер: 5956-04-7, InChIKey: BJPSSVHNEGMBDQUHFFFAOYSA-N (Рисунок 4). O H O O Рисунок 4 – Структурная формула ахиллина Количественное содержание ахиллина в серии исследуемой субстанции составляло не менее 99 % (СО ГФ РК (ГФ РК, том 3, глава 5.12; с. 122). Источником получения является СО2-эксракт Achillea lanulosa Nutt, Achillea micrantha Willd. (Anthemideae), Achillea millefolium L. (Anthemideae), Artemisia leucodes Schrenk., Eupatorium japonicum. (Eupatorieae), Hypochaeris setosus (Lactuceae), Stevia alpina Griseb. (Eupatorieae). Ахиллин – порошок белого цвета, без запаха, растворим в хлороформе, бензоле, вэтаноле, практически не растворим в воде. Гроссмизин (8-альфа-гидрокси-2-оксо-5-альфа,11-альфа-Н-1(10),3- гвайадиен-12,6-альфа-олид), CAS номер: 35879-92-6, брутто-формула С15Н18О4. Представляет собой гидроксиахиллин (Рисунок 5). 34 O OH H O O Рисунок 5 – Структурная формула гроссмизина Количественное содержание гроссмизина в серии исследуемой субстанции составляло не менее 98 %. Источником получения является СО2-эксракт Achillea lanulosa Willd. (Anthemideae), Achillea santolina L. (Anthemideae), Achillea sibirica var. discoidea Regel (Anthemideae), Artemisia caucasica Willd. (Anthemideae), Artemisia frigida Willd. (Anthemideae), Artemisia leucodes Shrenk. (Anthemideae, Artemisia xerophytica Krasch. (Anthemideae), Tanacetum microphyllum (Anthemideae). Гроссмизин – порошок белого цвета, без запаха, растворим в хлороформе, бензоле, этаноле, практически не растворим в воде. Леукомизин (2-оксо-5,7,6,11(Н)-гвай-1(10),3(4)-диен-6,12-олид), CAS номер: 68247-35-8, брутто-формула С15Н18О3. Леукомизин – сесквитерпеновый лактон гвайанового ряда (Рисунок 6) [168]. O H O O Рисунок 6 – Структурная формула леукомизина. 35 Леукомизин является лекарственным средством на территории Республики Казахстан (субстанция, Фармакопейная статья Республики Казахстан – ФС РК 42-1909-08) и используется для производства препарата «Атеролид», являющегося средсвтом профилактики и лечения атеросклероза и дислипидемий [3, 29]. В экспериментах использовали субстанцию леукомизина с содержанием действующего вещества 99,7%. Леукомизин получают выделением и селективной хроматографической очисткой из СО2-экстракта Полыни беловатой (Artemisia leucodes Schrenk). Ппредставляет собой белый порошок, горький на вкус, без запаха, легко растворимый в диметилсульфоксиде (ДМСО), бензоле, этаноле, хлороформе, метаноле, практически нерастворим в гексане, воде, диэтиловом эфире [2, 7]. Леукомизин можно применять перорально, так как он стабилен в кислой среде, однако разрушается в щелочных средах (pH > 8,0) [2]. Леукомизин является малотоксичным веществом, не обладает эмбриотоксическим, тератогенным и бластомогенным действием [17]. 2.2. Модели, методы исследования и экспериментальные животные Эксперименты проведены на крысах-самцах и культуре клеток гепатомы крыс (HTC). Для моделирования патологии обмена липидов и атеросклероза использовали три экспериментальные модели на животных и одну модель на культуре клеток. Эксперименты in vivo выполнены в зимне-весенний период на 354 аутбредных крысах-самцах массой тела 220–350 г. Животные были получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИ фармакологии и регенеративной медицины имени Е. Д. Гольдберга Томского НИМЦ РАН (г. Томск, Россия), имеется сертификат здоровья. Животных содержали в условиях вивария на естественном световом режиме, при свободном доступе к пище и воде (температура воздуха в виварии (20 ± 2) С, влажность – не более 70 %). Рацион питания животных включал специализированный для лабораторных крыс и мышей гранулированный 36 корм «ПроКорм» (ЗАО «БиоПро», г. Новосибирск, Россия), который имеет сбалансированный витаминный, макро- и микроэлементный состав и соответствует ГОСТ Р 50258-92. Содержание и все манипуляции, которым подвергались животные, соответствовали Правилам лабораторной практики, утвержденным приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики», а также с соблюдением конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, принятой Европейским союзом в 1986 г., и директивы 86/609 ЕЭС, основанной на тексте соглашения «Dr. Robert Hubrecht, Current EU Legislation Controlling Animal Experiments». После карантина для проведения эксперимента методом случайной выборки формировались группы по 8–10 крыс из особей, имеющих близкую массу тела, контролируемую ежедневным взвешиванием для коррекции количества вводимых препаратов. Все манипуляции выполняли с 9.00 до 12.00 ч с целью исключения суточных влияний на метаболизм. На первом этапе скрининговых исследований для доказательства гиполипидемического эффекта, согласно Руководству по доклиническому исследованию модели лекарственных гиперлипидемии, средств, использовали вызванной тритоном экспериментальные WR1339, острой гиперлипидемии, вызванной этанолом, и хронической модели гиперлипидемии и атеросклероза, индуцированной у крыс диетой, содержащей холестерол и жиры (Рисунок 7). На втором этапе исследований для выяснения механизмов гиполипидемического действия наиболее активного сесквитерпенового лактона (леукомизина) изучали степень его влияния на активность фермента ГМГ-КоАредуктазы и выделение холестерола с фекалиями через желудочно-кишечный тракт. 37 1 этап – скрининг гиполипидемической активности Объект исследования: сесквитерпеновые лактоны арглабин, людартин, гроссгемин, ахиллин, гроссмизин и леукомизин Острые модели гиперлипидемии у крыс: 1. вызванной этиловым спиртом 2. индуцированной детергентом тритон WR1339 Хроническая модель у крыс: гиперлипидемия и атеросклероз, индуцированные диетой, содержащей холестерол и жиры. Культура клеток гепатомы крыс: 1. изучение влияния лактонов на обмен липидов в культуре клеток при модели нарушения обмена липидов 2. оценка экспрессии генов ключевых ферментов липидного обмена Вывод об эффективности лактонов и перспективности дальнейших исследований 2 этап – исследование механизмов гиполипидемической активности сесквитерпеновых лактонов Хроническая модель у крыс: экспрессии генов ключевых ферментов липидного обмена в печени крыс Изучение влияния на активность фермента ГМГ-КоА редуктазы и экскрецию холестерола Объект: леукомизин Рисунок 7 – Дизайн исследования 38 2.3. Скрининг гиполипидемической активности (1-й этап исследования) 2.3.1. Модель острой экспериментальной гиперлипидемии у крыс, индуцированной этиловым спиртом Экспериментальные животные получали внутрижелудочно сесквитерпеновые лактоны (в дозе 10 мг/кг) и препарат сравнения никотиновую кислоту (25 мг/кг) в виде раствора в 0,5%-й крахмальной слизи в течение 7 дней. Животные контрольной группы получали эквивалентные количества 0,5%-го раствора крахмальной слизи. Распределение экспериментальных животных по группам представлено в Таблице 1. Таблица 1 – Распределение экспериментальных животных по группам при исследовании гиполипидемических свойств сесквитерпеновых лактонов на модели острой гиперлипидемии, индуцированной этанолом. Группа животных 1 0,5%-й раствор крахмальной слизи внутрижелудочно, 7 сут 2 Никотиновая кислота 25 мг/кг внутрижелудочно, 7 сут 3 Леукомизин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно, 7 сут Арглабин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно, 7 сут Людартин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно, 7 сут Гроссгемин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно, 7 сут Ахиллин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно, 7 сут Гроссмизин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно, 7 сут 4 5 6 7 8 Количество животных 9 9 9 9 9 9 9 9 На 7-е сут через 2 ч после введения препаратов у животных брали кровь из хвостовой вены, получали сыворотку крови, в которой определяли 39 содержание триацилглицеролов и общего холестерола ферментативным методом с использованием наборов фирмы Chronolab (Испания). После этого животным всех групп внутрижелудочно вводили 40%-й раствор этанола в дозе 5 г/кг массы тела. Через 6 ч крыс умерщвляли СО2асфиксией с использованием стандартной камеры. Полученную кровь центрифугировали при 1500 g в течение 15 мин на центрифуге СМ-6М и в сыворотке определяли содержание триацилглицеролов, СЖК, общего ХС, ХСЛПНП и ХС-ЛПВП с помощью ферментативных наборов. Триацилглицеролы и холестерол определяли с помощью ферментативных наборов «Triglycerides» (код 101-0052) и «Cholesterol» (код 101-0051) фирмы Chronolab (Испания) согласно протоколам, прилагаемым к наборам. Холестерол в липопротеинах низкой и высокой плотности определяли прямым ферментативным колориметрическим методом с помощью наборов «LDL Cholesterol» (код 101-0516) и «HDL Cholesterol» (код 101-0597) фирмы Chronolab (Испания). Свободные жирные кислоты в сыворотке крови измеряли с использованием ферментативных наборов «NEFA» (Lot 220393) фирмы RANDOX (Великобритания). Для определения содержания ТАГ и ХС в ткани печени липидную фракцию из навесок печени (500 мг) экстрагировали по методу J. Folch (1957) смесью хлороформ-метанол (2 : 1). Определение содержания ТАГ и холестерола в экстрагированных липидах осуществляли ферментативным методом с использованием наборов производствакомпании Chronolab. Для подготовки анализа к хлоформной фазе был добавлен 20%-й раствор детергента Thesit (Sigma Aldrich) в хлороформе. Хлороформ удаляли потоком сжатого азота и заэмульгированные липиды, растворялив в воде очищенной [191]. К полученной таким образом эмульсии добавляли реагенты наборов для определения ТАГ и ХС, содержание которых выражали в миллиграммах на грамм ткани печени. Измерения проводили на спектрофотометре свидетельство о поверке № 8028/203 от 01.11.2012. марки СФ-2000, 40 2.3.2. Модель острой экспериментальной гиперлипидемии у крыс, индуцированной детергентом WR 1339 Экспериментальные животные получали внутрижелудочно сесквитерпеновые лактоны (в дозе 10 мг/кг массы тела) и препарат сравнения фенофибрат («Трайкор», Франция) (100 мг/кг) в виде раствора в 0,5%-й крахмальной слизи в течение 7 дней. Животные контрольной и 2-й групп (введение тритона WR 1339) получали эквивалентные количества 0,5%-го раствора крахмальной слизи. Распределение экспериментальных животных по группам представлено в Таблице 2. Для оценки гиполипидемического действия исследуемых веществ нами была использована модель гиперлипидемии, воспроизводимая у экспериментальных животных при введении тритона WR 1339, являющегося неионным детергентом. Данная модель характеризуется простотой воспроизведения, при этом низкая токсичность тритона и зависимость эффекта от концентрации детергента позволяет воспроизводить гиперлипидемию разной степени выраженности [28]. Для воспроизведения этой модели на 8-е сут через час после введения сесквитерпеновых лактонов, препарата сравнения и крахмальной слизи животным всех групп, кроме 1-й группы, внутрибрюшинно вводили детергент тритон WR 1339 в дозе 200 мг/кг массы тела, растворенный в 0,9%-м стерильном апирогенном растворе натрия хлорида. Животным 1-й группы внутрибрюшинно вводили 1мл 0,9%-го стерильного апирогенного раствора натрия хлорида. Через 24 ч крыс умерщвляли СО2-асфиксией с использованием стандартной камеры. Полученную кровь центрифугировали при 1500 g в течение 15 мин на центрифуге СМ-6М и в сыворотке определяли содержание ТАГ, СЖК, общего ХС, ХС-ЛПНП и ХС-ЛПВП с помощью ферментативных наборов. 41 Таблица 2 – Распределение экспериментальных животных по группам при исследовании гиполипидемических свойств сесквитерпеновых лактонов на модели острой гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339 Количество животных Группы животных и режим введения 1 0,5%-й раствор крахмальной слизи внутрижелудочно ежедневно 7 сут, на 8-е сут 0,9%-й NaCl внутрибрюшинно (1 мл) 2 0,5%-й раствор крахмальной слизи внутрижелудочно ежедневно 7 сут, на 8-е сут раствор тритона WR 1339 (200 мг/кг) внутрибрюшинно 3 Фенофибрат 100 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно ежедневно 7 сут, на 8-е сут раствор тритона WR 1339 (200 мг/кг) внутрибрюшинно 4 Ахиллин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно ежедневно 7 сут, на 8-е сут раствор тритона WR 1339 (200 мг/кг) внутрибрюшинно 5 Леукомизин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно ежедневно 7 сут, на 8-е сут раствор тритона WR 1339 (200 мг/кг) внутрибрюшинно 6 Арглабин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно ежедневно 7 сут, на 8-е сут раствор тритона WR 1339 (200 мг/кг) внутрибрюшинно 7 Людартин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно ежедневно 7 сут, на 8-е сут раствор тритона WR 1339 (200 мг/кг) внутрибрюшинно 8 Гроссгемин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно ежедневно 7 сут, на 8-е сут раствор тритона WR 1339 (200 мг/кг) внутрибрюшинно 9 Гроссмизин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно ежедневно 7 сут, на 8-е сут раствор тритона WR 1339 (200 мг/кг) внутрибрюшинно 9 9 9 9 9 9 9 9 9 Триацилглицеролы и холестерол определяли с помощью ферментативных наборов «Triglycerides» (код 101-0052) и «Cholesterol» (код 101-0051) фирмы Chronolab (Испания) согласно протоколам, прилагаемым к наборам. Холестерол в липопротеинах низкой и высокой плотности определяли прямым 42 ферментативным колориметрическим методом с помощью наборов «LDLCholesterol» (код 101-0516) и «HDLCholesterol» (код 101-0597) фирмы Chronolab (Испания). Уровень свободных жирных кислот в сыворотке крови измеряли с использованием ферментативных наборов «NEFA» (Lot 220393) фирмы RANDOX (Великобритания). Для определения количества ТАГ и ХС в ткани печени липидную фракцию из навесок печени (250 мг) экстрагировали по методу J. Folch (1957) смесью хлороформ-метанол (2 : 1). Определение содержания ТАГ и ХС в экстрагированных липидах проводили с помощью биохимических наборов производства фирмы Chronolab. До проведения анализа к хлороформной фазе добавляли 20%-й раствор поверхностно активного вещества Thesit (Sigma Aldrich) в хлороформе. Хлороформ удаляли потоком сжатого азота, эмульгированные липиды растворяли в воде очищенной [191]. Затем к полученной эмульсии липидов в воде добавляли рабочие реагенты наборов для определения ТАГ и ХС, содержание которых выражали в миллиграммах на грамм печени. 2.3.3. Экспериментальная модель гиперлипидемии у крыс, индуцированной диетой, содержащей холестерол и жиры Одним из широко применяемых способов моделирования гиперлипидемии в эксперименте является длительное (2–3 нед) применение диеты, содержащей холестерол (2,5%), метилтиоурацил (0,12%) и 30% растительного масла [27]. Данная модель гиперлипидемии варьирует как по соотношению ингредиентов в диете, так и по длительности ее применения. Животные в течение 4 нед получали высокожировую диету (45% энергии за счет животного жира), содержащую 2,5% холестерола (Sigma), 0,5% холевой кислоты (Sigma) (для улучшения всасывания Х в ЖКТ) и 0,1% 2-тиоурацила (Sigma) (для подавления функции щитовидной железы). Стандартная лабораторная диета представляла специальные гранулы с минеральными и витаминными добавками для лабораторных крыс (марка 43 «ПроКорм»), производства фирмы ЗАО «БиоПро» (г. Новосибирск). Состав нутриентов корма указан в Таблице 3. Таблица 3 – Состав и пищевая ценность стандартного корма для лабораторных животных (крыс) Нутриенты Содержание и калорийность по массе, % по ккал, % ккал/100 г Белки 22,0 28,0 90,2 Углеводы 47,7 60,8 195,8 Жиры 4,0 11,2 36,0 Итого 73,7 100 322 Методика приготовление корма (атерогенная диета), обеспечивающего 45% энергии за счет животного жира и содержащего 2,5% холестерола, 0,5% холевой кислоты, 0,1% 2-тиоурацила: в 20 г топленого сливочного масла (98% животного жира) растворяли 2,5 г холестерола (Sigma), 0,5 г холевой кислоты (Sigma) и 0,1 г 2-тиоурацила (Sigma) и смешивали с 77 г стандартного корма вышеуказанного состава. Калорийность полученного корма составляла 545 ккал на 100 г. Атерогенную диету лабораторные животные получали в течение 4 нед. После этого экспериментальным группам животных, продолжавшим получать эту же диету, в течение 2 нед вводили внутрижелудочно сесквитерпеновые лактоны (в дозе 10 мг/кг) и препараты сравнения фенофибрат (100 мг/кг, торговое название «Трайкор», производства «Ресифарм Фонтэн», Франция) и розувастатин кальция (100 мг/кг, ЛСР-008601/09-291009, MSN Laboratories Limited, Индия) в виде раствора в 0,5%-й крахмальной слизи. Животным контрольной группы на фоне атерогенной диеты в течение 2 нед вводили эквивалентный объем 0,5%-го раствора крахмальной слизи. Животные 44 «интактной» группы, на фоне стандартного питания в течение 2 нед получали эквивалентный объем 0,5%-го раствора крахмальной слизи. Распределение экспериментальных животных по группам представлено в Таблице 4. Таблица 4 – Распределение экспериментальных животных по группам при исследовании гиполипидемических свойств сесквитерпеновых лактонов на модели хронической гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой Экспериментальные группы (n=8) 1 Интактные 2 Контроль 3 Фенофибрат 4 Розувастатин 5 Арглабин 6 Ахиллин 7 Гроссгемин 8 Гроссмизин 9 Леукомизин 10 Людартин Режим назначения препаратов 0,5%-й раствор крахмальной слизи внутрижелудочно 14 сут на фоне стандартной диеты 0,5%-й раствор крахмальной слизи внутрижелудочно 14 сут на фоне атерогенной диеты Фенофибрат 100 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно14 сут на фоне атерогенной диеты Розувастатин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно 14 сут на фоне атерогенной диеты Арглабин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно 14 сут на фоне атерогенной диеты Ахиллин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно 14 сут на фоне атерогенной диеты Гроссгемин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно 14 сут на фоне атерогенной диеты Гроссмизин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно 14 сут на фоне атерогенной диеты Леукомизин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно 14 сут на фоне атерогенной диеты Людартин 10 мг/кг в растворе 0,5%-й крахмальной слизи внутрижелудочно 14 сут на фоне атерогенной диеты 45 Через 2 нед введения препаратов, после 12-часового голодания крыс умерщвляли СО2-асфиксией с использованием стандартной камеры. Полученную кровь центрифугировали при 1500 g в течение 15 мин на центрифуге СМ-6М и в сыворотке определяли содержание ТАГ, СЖК, общего ХС, ХС-ЛПНП и ХС-ЛПВП с помощью ферментативных наборов. Триацилглицеролы и холестерол определяли с помощью ферментативных наборов «Triglycerides» (код 101-0052) и «Cholesterol» (код 101-0051) фирмы Chronolab (Испания) согласно протоколам, прилагаемым к наборам. Холестерол в липопротеинах ферментативным низкой и высокой колориметрическим плотности методом определяли прямым помощью наборов с «LDLCholesterol» (код 101-0516) и «HDL Cholesterol» (код 101-0597) фирмы Chronolab (Испания). Свободные жирные кислоты в сыворотке крови измеряли с использованием ферментативных наборов «NEFA» (Lot 220393) фирмы RANDOX (Великобритания). Для определения содержания ТАГ и ХС в ткани печени липидную фракцию из навесок печени (250 мг) экстрагировали по методу J. Folch (1957) смесью хлороформ-метанол (2 : 1). Содержание ТАГ и ХС в экстрагированных липидах определяли ферментативным методом с использованием наборов производства фирмы Chronolab. Перед выполннением анализа к хлороформной фазе добавляли 20%-й раствор поверхностно-активного вещества Thesit (Sigma Aldrich) в хлороформе. Хлороформ удаляли потоком сжатого азота, заэмульгированные липиды растворяли в очищенной воде [191]. В полученной таким образом водной эмульсии определяли с помощью стандартных наборов содержание ТАГ и ХС, которое выражали в миллиграммах на грамм ткани печени. 2.3.4. Изучение гиполипидемического действия на клеточной культуре крысиной гепатомы при экспериментальной модели гиперлипидемии, индуцированной жировой эмульсией Эксперименты выполнены на перевиваемой клеточной культуре крысиной гепатомы (HTC), полученной из Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург) 46 с паспортом установленного образца. Клеточную культуру НТС транспортировали в виде монослоя в культуральном флаконе (матрасе) из Института цитологии РАН в течение 1 дня авиатранспортом в специализированном контейнере. При этом флакон с выросшим монослоем был залит ростовой средой до горлышка, закрыт пробкой и для полной герметизации обернут парафином. Культивирование клеточной линии HTC Клеточную культуру HTC культивировали в 6-луночных планшетах (SPLlifescience, Республика Корея) до 70–80 % конфлюэнтного монослоя (0,5 106 клеток в 1 мл среды в течение 2 сут) в среде DMEM с L-глутамином («Биолот», Россия) и добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (PAA Laboratories, Австрия), 50 мкг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия) (полная среда DMEM) при температуре 37ºС в СО2-инкубаторе МСО-5АС (SANYO, Япония) в атмосфере 95 % воздуха и 5 % СО2. Через 48 ч в инкубационную среду добавляли ахиллин, гроссмизин и леукомизин в конечных концентрациях от 10 до 100 мкмоль, арглабин, гроссгемин и людартин – от 0,5 до 5,0 ммоль, препарат сравнения гемфиброзил (Sigma Aldrich, США) – от 0,25 до 1,5 ммоль, соответственно. Сесквитерпеновые лактоны и гемфиброзил растворяли в ДМСО («ПанЭко», Россия). В контрольную пробу добавляли соответствующее количество ДМСО, клетки культивировали 48 ч. Моделирование экспериментальной гиперлипидемии на клеточной культуре НТС После достижения клетками 70–80 % конфлюэнтного монослоя (через 48 ч) для моделированиягиперлипидемии клетки инкубировали в течение 48 ч с добавлением жировой эмульсии липофундина МСТ/ЛСТ в конечных концентрациях 0,01 %, 0,05 % и 0,1 % («Б. Браун Медикал», Россия) [105]. Липофундин добавляли перед внесением препаратов, в контрольную пробу вносили соответствующее количество ДМСО. 47 Оценка жизнеспособности клеток Жизнеспособность клеточной линии HTC оценивали через 48 ч после внесения препаратов в культуральную среду двумя методами: МТТ-тестом (стандартный колориметрический метод) с использованием в качестве реагента соли тетразолия – 3-[4,5-диметилтиазолил-2-ел]-2,5-дифенилтетразолиум бромида (МТТ реагент) («ПанЭко», Россия) и с 0,1%-м трипановым синим («ДИАЭМ», Германия). МТТ-тест основан на восстановлении желтого МТТ метаболически активными клетками до нерастворимых в воде темно-фиолетовых гранул формазана. В митохондриальной дыхательной цепи жизнеспособных клеток ферменты дегидрогеназы восстанавливают МТТ. После растворения кристаллы формазана дают окрашивание, интенсивность которого определяется спектрофотометрически. Трипановый синий окрашивает мертвые клетки, количество которых подсчитывается в камере Горяева под микроскопом. После инкубации с препаратами клетки снимали с планшета раствором трипсина (0,25 %) и этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА) (0,02 %) («ПанЭко», Россия) и отмывали 1 раз в 1хPBS (pH 7.4) (Ambion, США). Затем к осадку добавляли 1 мл рабочего раствора МТТ и инкубировали 3 ч при температуре 37ºС в суховоздушном термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Далее клетки осаждали центрифугированием в течение 2 мин при 330 g на центрифуге SkyLine СМ-6М (ELMI, Латвия) и добавляли к осадку 1,5 мл 96%-го изопропанола («Экос-1», Россия) для растворения гранул формазана. Количество восстановленного продукта – формазана измеряли на спектрофотометре СФ-2000 («ОКБ-Спектр», Россия) при длине волны 570 нм. Жизнеспособность в контрольной культуре клеток принимали за 100 %. Для приготовления стокового раствора МТТ растворяли 1,15 мг МТТ-реагента в 1 мл 1хPBS (pH 7.4). Для приготовления рабочего раствора МТТ-PBS брали 125 мкл стокового раствора МТТ и 875 мкл фосфатного буферного раствора − 1хPBS (pH 7.4). Каждый опыт повторяли 4–5 раз [170, 181]. Для оценки жизнеспособности клеток методом окраски с трипановым синим стоковый раствор 0,1%-го трипанового синего разводили в 10 раз до 48 рабочей концентрации. Затем аликвоту суспензии клеток вносили в 96-луночный планшет и окрашивали клетки в течение 5 мин. Подсчет живых и мертвых клеток производили в камере Горяева под световым микроскопом МИКМЕД-1 (Россия) с увеличением (7 ок. × 9 об.) в 5 больших квадратах 1 × 1 мм. Затем пересчитывали количество клеток на 1 мл суспензии, учитывая фактор дилюции. Определяли процент неокрашенных (живых) клеток среди 100% посчитанных. Каждый опыт повторяли 4–5 раз [170, 181]. Оценка содержания триацилглицеролов и белка в клетках Содержание ТАГ в клеточной культуре НТС определяли ферментативным методом с использованием наборов «Triglycerides» (код 101-0052) фирмы Chronolab (Испания) согласно прилагаемому протоколу. Предварительно липидную фракцию экстрагировали из клеток по методу J. Folch (1957) смесью хлороформ-метанол (2 : 1). Перед определением содержания ТАГ в клетках к хлоформной фазе был добавлен 20%-й раствор детергента Thesit («SigmaAldrich», США) в хлороформе. Хлороформ был удален потоком азота и липиды были заэмульгированны в дистиллированной воде [191]. К полученной водной эмульсии добавлялись рабочие реагенты набора для определения ТАГ. Содержание триацилглицеролов выражали в нмоль на мг белка. Измерения проводили на спектрофотометре СФ-2000. Содержание белка в клеточной культуре НТС определяли по методу Брэдфорда с использованием кумаси G 250 [116]. Для этого клеточный осадок (≈ 5 105 клеток) ресуспендировали в 1 мл холодного раствора 1% тритона Х-100 («Sigma-Aldrich», США) для приготовления лизата. Лизат разводили в 2 раза 1хPBS (pH 7.4), и к 100 мкл (≈ 5 103 клеток) добавляли 900 мкл реагента Брэдфорда. Для приготовления реагента Брэдфорда 100 мг Coomassie blue G 250 (Thermoscientific, США) растворяли в 50 мл 95 %-го этанола. Полученный раствор смешивали со 100 мл 85 %-й фосфорной кислоты и доводили до 1 л дистиллированной водой. Измерение проводили на спектрофотометре СФ-2000 при длине волны 595 нм [116]. 49 Оценка содержания липидов в клетках Содержание липидов в клеточной культуре HTC определяли флуоресцентным методом с витальным липофильным красителем NileRed, который взаимодействует с липидными каплями в цитозоле [170]. Клетки снимали с пластика раствором трипсин-ЭДТА через 48 ч после внесения препаратов в культуральную среду и отмывали 1 раз в 1хPBS (pH 7,4). Надосадочную жидкость аккуратно аспирировали и клетки инкубировали 30 мин с NileRed (Sigma-Aldrich, США) в темноте в конечной концентрации 3 мкмоль. Затем клетки отмывали в 1хPBS (pH 7.4) и детектировали флуоресценцию NileRed на микропланшетном ридере Infinite 200PRO (Tecan, Швейцария) при длине волны возбуждения 580 нм и эмиссии 630 нм. Каждый опыт повторяли 5 раз [105, 170]. Окрашивание нейтральных липидов с красителем Oil Red O [197] также проводили через 48 ч после внесения препаратов в культуральную среду. Клетки фиксировали в 10 %-м забуференном растворе формалина (Biovitrum, Россия) в течение 10 мин. Затем клетки отмывали в 1хPBS (pH 7.4) в течение 1 мин и 60 %-м растворе изопропилового спирта в течение 15 с. Клетки окрашивали Oil Red O (Sigma-Aldrich, США) при темперавтуре 37ºС в течение 1 мин в темноте. Затем не связавшийся краситель отмывали в 60%-м изопропиловом спирте в течение 15 с, 3 раза по 3 мин в 1хPBS (pH 7.4) и фотографировали на микроскопе («Биомед», Россия) (об. 25 × ок. 10), оснащенном цифровой камерой DCM 510 [197]. 2.3.5. Оценка экспрессии генов ключевых ферментов липидного обмена на клеточной культуре крысинной гепатомы В культуре клеток гепатомы под влиянием исследованных лактонов оценивали величину экспрессии генов: метаболизма холестерола: 1) рецептора к ЛПНП (Ldlr); 50 2) ключевого фермента синтеза холестерола – 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr); 3) ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1) – фермента, катализирующего образование эфиров холестерола; 4) холестерин 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1) – фермента, регулирующего скорость синтеза желчных кислот; катаболизма жирных кислот: 1) карнитин-пальмитоилтрансфераза 1 (Cpt1a) – фермента, лимитирующего скорость окисления митохондриями длинноцепочечных жирных кислот; 2) карнитин-пальмитоилтрансфераза 2 (Cpt2) – фермента, катализирущего перенос ацила на внутримитохондриальный КоА; синтеза жирных кислот и триацилглицеролов: 1) ацетил-КоА карбоксилазы (Acaca) – ключевого фермента синтеза жирных кислот, катализирующего карбоксилирование ацетил-КоА с образованием малонил-КоА; Клеточную культуру HTC культивировали в 6-луночных планшетах (SPLlifescience, Республика Корея) до 70–80 % конфлюэнтного монослоя (0,5 106 клеток в 1 мл среды в течение 2 сут) в среде DMEM с L-глутамином («Биолот», Россия) и добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (PAA Laboratories, Австрия), 50 мкг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия) (полная среда DMEM) при 37ºС в СО2-инкубаторе МСО-5АС (SANYO, Япония) в атмосфере 95 % воздуха и 5 % СО2. Через 48 ч в инкубационную среду добавляли ахиллин, гроссгемин и людартин в конечных концентрациях 10 мкмоль, арглабин, гроссмизин и леукомизин – в концентрация 500 мкмоль, препарат сравнения гемфиброзил (Sigma-Aldrich, США) – в концентрации 250 мкмоль. Ранее нами было показано, что указанных концентрациях сесквитерпеновые лактоны и препарат сравнения не оказывают токсического действия на клеточную культуру и проявляют гиполипидемические свойства. Сесквитерпеновые лактоны и гемфиброзил растворяли в диметилсульфоксиде 51 («ПанЭко», Россия). В контрольную пробу добавляли соответствующее количество ДМСО и клетки культивировали 48 ч, после чего из клеток выделяли суммарную РНК. 2.3.5.1. Оценка экспрессии мРНК генов метаболизма липидов Выделение суммарной РНК из клеточной культуры НТС Суммарную РНК из клеточной культуры НТС выделяли с помощью набора Illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit (GE Healthcare, Великобритания). Перед выделением РНК готовили лизирующий буфер из расчета 350 мкл буфера RA1 (на ≥ 5 106 клеток) с добавлением 3,5 мкл β-меркаптоэтанола. Клеточной осадок хорошо перемешивали с лизирующим буфером на вортексе Microspin FV-2400 (Biosan, Латвия). Для уменьшения вязкости и очистки лизаты фильтровали через колонки RNAspin Mini Filter units, помещенные в пробирки (колонки и пробирки входят в набор для выделения), и центрифугировали при 11000 g в течение 1 мин на микроцентрифуге Minispin (Eppendorf, Германия). Фильтраты переносили в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки (Axygen, США). Для связывания РНК к лизатам добавляли 350 мкл этанола 70% и смешивали на вортексе 2 х 5 с. Далее лизаты пипетировали 2–3 раза и переносили на колонки RNAspin Minicolumn, помещенные в 2 мл микроцентрифужные пробирки, центрифугировали при 8000 g в течение 30 с и перемещали колонки в новые собирательные пробирки (входят в набор для выделения) и добавляли по 350 мкл MDB (Membrane Desalting Buffer), далее центрифугировали при 11000 g в течение 1 мин. Профильтрованную через колонку жидкость отбрасывали и возвращали колонку обратно в пробирку. Для разрушения ДНК предварительно готовили реакционную смесь, содержащую ДНК-азу, из расчета на каждое выделение 10 мкл reconstituted DNase I и 90 мкл DNase reaction buffer. 95 мкл этой смеси наносили на мембрану колонки и инкубировали при комнатной температуре 15 мин. После инкубации мембрану колонок промывали три раза. 52 Первый раз добавляли 200 мкл буфера RA2 на колонки RNAspin Minicolumn, центрифугировали 11000 g в течение 1 мин, затем перемещали колонки в новые собирательные пробирки. Буфер RA2 инактивировал ДНК-азу I. При второй промывке добавляли 600 мкл буфера RA3, колонки RNAspin Minicolumn центрифугировали 1 мин при 11000 g. Профильтрованную жидкость отбрасывали, и колонки возвращали в пробирки. При третьей промывке добавляли 250 мкл буфера к RA3 колонкам RNAspinMinicolumn, центрифугировали при 11000 g в течение 2 мин. Затем колонки переносили в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, не содержащие нуклеаз. РНК элюировали в 100 мкл специальной воды (вода без нуклеаз, входит в набор для выделения) и центрифугировали при 11000 g в течение 1 мин. Элюированную РНК немедленно помещали на лед для предотвращения деградации. Изолированную РНК хранили при температуре –80оС в низкотемпературном морозильнике (SANYO, Япония) и использовали для оценки экспрессии генов при помощи количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией (RT-qPCR). Концентрацию и чистоту выделенной РНК оценивали на спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, США) (Рисунок 8). Концентрация изолированной РНК в пробах составляла от 100 до 500 нг/мкл, А260/А280 = 1,95–2,05; А260/А230 = 1,90–2,31. Целостность РНК оценивали при помощи капиллярного электрофореза на приборе Tape Station (Agilent Technologies, США) и набора R6KScreenTape (AgilentTechnologies, США). RIN составлял 5,6–9,0 (Рисунки 9, 10). Капиллярный электрофорез выполнен на приборе TapeStation (Agilent Technologies, США). Полученные результаты характеризуются наличием бендов 28S и 18S рибосомальной РНК и показателем целостности РНК - RIN (RNA Integrity Number), который составляет 9.0. Спектрофотометрические показатели этого образца РНК – А260/280 = 2.08, А260/230 = 1.95, концентрация – 323 нг/мкл. 53 Рисунок 8 – Спектрофотометрические кривые поглощения двух образцов РНК, выделенных из клеточной культуры НТС с использованием набора Illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit (GE Healthcare, Великобритания). 54 Рисунок 9 –Электрофореграмма суммарной РНК, выделенной из клеточной культуры НТС при помощи набора Illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit (GE Healthcare, Великобритания) 55 Рисунок 10 – Денситограмма суммарной РНК, выделенной из клеточной культуры НТС при помощи набора Illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit (GE Healthcare, Великобритания). 56 2.3.5.2. Синтез комплементарной ДНК Для синтеза кДНК на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью набора RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва). В тонкостенные пробирки «Maxymum Recovery» типа «Эппендорф» для ПЦР на 200 мкл (Axygen, США) вносили по 12 мкл «смеси 1» из расчета на 1 образец: 11 мкл РНК, 1 мкл случайных гексамерных праймеров (Fermentas, Литва). Образцы инкубировали при температуре 65оС в течение 5 мин. Смесь 2 готовили из расчета на один образец: 1 мкл RevertAid M-MuLV ReverseTranscriptase (Fermentas, Литва) в концентрации 200 ед/мкл, 4 мкл 5х буфера (Fermentas, Литва), 2 мкл дНТФ (10 ммоль) (Fermentas, Литва), 1 мкл ингибитора RiboLockRNase (Fermentas, Литва) в концентрации 20 ед/мкл. Перемешивали аккуратно на вортексе, затем вносили «смесь 2» в эппендорфы к «смеси 1». Пробирки помещали в амплификатор «Терцик» («ДНК-технология», Россия) и инкубировали по программе: 5 мин при температуре 25оС, затем 60 мин при 42оС. Останавливали реакцию при нагревании 70оС в течение 5 мин. кДНК хранили при температуре –20оС для последующего анализа. 2.3.5.3. Полимеразная цепная реакция в реальном времени Уровень экспрессии генов метаболизма липидов оценивали при помощи количественной обратно-транскриптазной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR) по технологии TaqMan на амплификаторе «RotorGene-6000» (Corbett Research, Австралия). Праймеры и зонды (FAM-BHQ1) были подобраны с использованием программы Vector NTI Advance 11.5, Oligo 7.5 и базы данных NCBI Nucleotide Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) (Таблица 5). ПЦР ставили в дублях в объеме 15 мкл. Готовили реакционную «смесь 1» для каждого гена в расчете на один образец: 1,5 мкл 1 х SE буфера (67 ммоль Tris–HCl pH 8,8 при 25ºC, 16.6 ммоль (NH4)2SO4, 0,01 % Tween-20) («Sibenzyme», Россия), 1,5 мкл дНТФ (250 мкмоль, («Sibenzyme», Россия), 0,75 мкл MgCl2 (2,5 ммоль, «Sibenzyme», Россия), 0,1 мкл Tag ДНК-полимеразу 57 (5 Еа/мкл, «Sibenzyme», Россия), 1 мкл синтезированной кДНК (50 нг) и 7,15 мкл деионизованной воды. Таблица 5 – Последовательности праймеров и зондов, используемых в исследовании экспрессии генов Actb Прямой праймер 5’-GAAAAGATGACCCAGATCATGT-3’ NM_031144.3 Обратный праймер 5’-AACACAGCCTGGATGGCTA-3’ Ампликон71 bp Зонд 5’-AGACCTTCAACACCCCAGCCAT-3’ Acaca Прямой праймер 5’-CGCAGGCATCAGAAGATCA-3’ NM_022193.1 Обратный праймер 5’-TGGCAAGTTTTACAGCACACT-3’ Ампликон94 bp Зонд 5’-ACCCCAGCAGTATTTGAACACATG-3’ Cpt1a Прямой праймер 5’-CATTGACCTCCGCCTGA-3’ NM_031559.2 Обратный праймер 5’-TGATGCCATTCTTGAACCG-3’ Ампликон 98 bp Зонд 5’-CCACGAAGCCCTCAAACAGAT-3’ Cpt2 Прямой праймер 5’-GCTGTTCACGATGACTGGATAG-3’ NM_012930.1 Обратный праймер 5’-TCGAAAATGTCTTCCAAGCA-3’ Ампликон 104 bp Зонд 5’-ACGCAATGCCCGAGAGTTTC-3’ Cyp7a1 Прямой праймер 5’-CTGATGCTCTCCTGCTTTGA-3’ NM_012942.2 Обратный праймер 5’-CATGTAGTGGTGGCAAAATTC-3’ Ампликон 103 bp Зонд 5’-TGTGGAGAGCCAAGTCAAGTGTC-3’ Hmgcr Прямой праймер 5’-GCTTGAGATCATGTGCTGCTT-3’ NM_013134.2 Обратный праймер 5’-CCGAGAAAGCTCTAGGACCA-3’ Ампликон 106 bp Зонд 5’-CTGTATGTCCGTGCTTGCCAACT-3’ Ldlr Прямой праймер 5'-GCCATCTATGAGGACAAAGTGT-3’ NM_175762.2 Обратный праймер 5’-GCCACCAAATTCACATCTGA-3’ Ампликон 95 bp Зонд 5’-AGGCGGTTGGCACTGAAAATG-3’ Soat1 Прямой праймер 5’-GTGCTCGTGTCCTGGTCC-3’ NM_031118.1 Обратный праймер 5’-AAGGCAAAGAACGAAAGGAA-3’ Ампликон 79 bp Зонд 5’-AGCACACCTGGCAAGATGGAGTT-3’ Примечание: все пробы – FAM → BHQ1; NM – номер последовательности РНК в NCBI Nucleotide Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore); bp – basepair. 58 Смесь перемешивали на вортексе. При подготовке «смеси 2» для каждого гена в расчете на один образец брали по 1 мкл прямого, обратного праймеров и зонда (300 нмоль прямого и обратного праймеров и 200 нмоль зонда («ДНКСинтез», Россия)). В тонкостенные пробирки «Maxymum Recovery» типа «Эппендорф» для ПЦР на 200 мкл (Axygen, США) вносили по 3 мкл «смеси 2», затем добавляли по 12 мкл «смеси 1», сверху вносили минеральное масло. ПЦР проводили на амплификаторе «RotorGene-6000» (Corbett Research, Австралия). Двухшаговая программа амплификации включала 1 цикл – 94ºС, 2 мин – предварительная денатурация; 40 циклов – 1-й шаг 94ºС, 6 с и 2-й шаг – 10 с при температуре 60,5ºС. Проверку чистоты ПЦР-продуктов проводили с использованием электрофореза в 2,5%-м агарозном геле с 0,2%-м бромистым этидием (Рисунок 11). Рисунок 11 – Электрофореграмма ампликонов исследуемых генов липидного обмена и гена рефери Actb: 1 – Cyp7a1, 2 – Ldlr, 3 – Cpt2, 4 – Soat1, 5 – Acaca, 6 – Hmgcr, 7 – Cpt1a, 8 – Actb 59 Уровень экспрессии каждого целевого гена выражали в условных единицах по отношению к контролю (клетки инкубировали с DMSO) и гену-рефери фермента Actb (Rattus norvegicus actin, beta). Относительная экспрессия генов метаболизма липидов была оценена с помощью метода Pfaffl [140], и следующая формула использовалась с целью определить отношение экспрессии между образцом и калибратором: (𝐸𝑡𝑎𝑟𝑔𝑒𝑡 )∆𝐶𝑡,𝑡𝑎𝑟𝑔𝑒𝑡(𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑡𝑜𝑟−𝑡𝑒𝑠𝑡) Ratio = (𝐸𝑟𝑒𝑓 )∆𝐶𝑡,𝑟𝑒𝑓(𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑡𝑜𝑟−𝑡𝑒𝑠𝑡) где Е – эффективность реакции, Ct – пороговый цикл генов мишеней (target) и гена-рефери (ref). ∆Ct, target (calibrator-test) = Ct гена мишени в калибраторе минус Ct гена мишени в опытном образце; ∆Ct, ref(calibrator – test) = Ct генарефери в калибраторе минус Ct гена-рефери в опытном образце [140]. В качестве калибратора использовалась РНК, выделенная из клеток контрольной группы. 2.4. Исследование механизмов гиполипидемической активности сесквитерпеновых лактонов (2-й этап исследования) На данном этапе проводили расширенное исследование эффектов и механизмов гиполипидемического действия in vivo и in vitro. 2.4.1. Оценка экспрессии мРНК генов метаболизва липидов в печени крыс Исследовали влияние сесквитерпеновых лактонов на экспрессию генов ключевых ферментов липидного обмена в печени крыс на модели гиперлипидемии у экспериментальных животных, вызванной атерогенной диетой. Распределение животных по группам, дозировки и режим введения изучаемых сесквитерпеновых лактонов и препаратов сравнения приведены в разделе 2.3.3 настоящей главы. Суммарную РНК из ткани печени выделяли с помощью набора Illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit (GE Healthcare, Великобритания) согласно протоколу. 60 Концентрацию и чистоту выделенной РНК оценивали на спектрофотометре Nano Drop-2000 (Thermo Scientific, США). Целостность РНК оценивали при помощи набора R6K Screen Tape (Agilent Technologies, США) методом капиллярного электрофореза на приборе Tape Station (Agilent Technologie, США). Праймеры и зонды были подобраны с использованием программы Vector NTI Advance 11.5, Oligo 7.5 и базы данных NCBI Nucleotide Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) (Таблица 6). Для синтеза кДНК по матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью набора RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва) согласно прилагаемому протоколу. Полученный раствор помещали в амплификатор «Терцик» («ДНК-технология», Россия) и инкубировали по программе: 5 мин при температуре 25 оС, затем 60 мин при 42оС. Останавливали реакцию при нагревании 70 оС в течение 5 мин. кДНК хранили при температуре –20оС для последующего анализа. Экспрессию генов метаболизма липидов оценивали при помощи количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени по технологии TaqMan на амплификаторе «RotorGene-6000» (Corbett Research, Австралия). ПЦР проводили в дублях в объеме 15 мкл на амплификаторе «RotorGene6000» (Corbett Research, Австралия). Двухшаговая программа амплификации включала: 1 цикл предварительная денатурация – 94ºС, 2 мин; 40 циклов – 1-й шаг 94ºС, 6 с, 2-й шаг – 60,5ºС, 10 с. Проверку чистоты ПЦР-продуктов проводили с использованием электрофореза в 2,5%-м агарозном геле с 0,2%-м бромистым этидием. Уровень экспрессии каждого целевого гена выражали в условных единицах по отношению к контролю (интактная группа) и гену-рефери фермента Actb (Rattus norvegicus actin, beta). 61 Таблица 6 – Последовательности праймеров и зондов, используемых в исследовании экспрессии генов Hmgcr NM_013134.2 Ампликон 106 п.о. Ldlr NM_175762.2 Ампликон 95 п.о. Soat1 NM_031118.1 Ампликон 79 п.о. Cyp7a1 NM_012942.2 Ампликон 103 п.о. Cpt1a NM_031559.2 Ампликон 98 п.о. Cpt2 NM_012930.1 Ампликон 104 п.о. Actb NM_031144.3 Ампликон 71 п.о. Прямой праймер 5’-GCTTGAGATCATGTGCTGCTT-3’ Обратный праймер 5’-CCGAGAAAGCTCTAGGACCA-3’ Зонд 5’-CTGTATGTCCGTGCTTGCCAACT-3’ Прямой праймер 5'-GCCATCTATGAGGACAAAGTGT-3’ Обратный праймер 5’-GCCACCAAATTCACATCTGA-3’ Зонд 5’-AGGCGGTTGGCACTGAAAATG-3’ Прямой праймер 5’-GTGCTCGTGTCCTGGTCC-3’ Обратный праймер 5’-AAGGCAAAGAACGAAAGGAA-3’ Зонд 5’-AGCACACCTGGCAAGATGGAGTT-3’ Прямой праймер 5’-CTGATGCTCTCCTGCTTTGA-3’ Обратный праймер 5’-CATGTAGTGGTGGCAAAATTC-3’ Зонд 5’-TGTGGAGAGCCAAGTCAAGTGTC-3’ Прямой праймер 5’-CATTGACCTCCGCCTGA-3’ Обратный праймер 5’-TGATGCCATTCTTGAACCG-3’ Зонд 5’-CCACGAAGCCCTCAAACAGAT-3’ Прямой праймер 5’-GCTGTTCACGATGACTGGATAG-3’ Обратный праймер 5’-TCGAAAATGTCTTCCAAGCA-3’ Зонд 5’-ACGCAATGCCCGAGAGTTTC-3’ Прямой праймер 5’-GAAAAGATGACCCAGATCATGT-3’ Обратный праймер 5’-AACACAGCCTGGATGGCTA-3’ Зонд 5’-AGACCTTCAACACCCCAGCCAT-3’ Примечание: NM – номер последовательности мРНК в NCBI Nucleotide Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore); п.о. – пара оснований. 62 Относительную экспрессию генов метаболизма липидов оценивали методом Pfaffl. Для определения отношения экспрессии между образцом и калибратором использовали формулу: Ratio = (Etarget )∆Ct,target(calibrator−test) (Eref )∆Ct,ref(calibrator−test) , где Е – эффективность реакции, Ct – пороговый цикл генов мишеней (target) и гена-рефери (ref). ∆Ct, target (calibrator – test) = Ct гена мишени в калибраторе минус Ct гена мишени в опытном образце; ∆Ct, ref(calibrator – test) = Ct генарефери в калибраторе минус Ct гена-рефери в опытном образце [140]. В качестве калибратора использовали РНК, выделенную из ткани печени интактных крыс. 2.4.2. Изучение активности ГМГ-КоА-редуктазы и экскреци холестерола Для установления молекулярных механизмов действия сесквитерпенового лактона леукомизина изучали его влияние на активность главного фермента синтеза холестерола – ГМГ-КоА редуктазы (КФ 1.1.1.34) в печени крыс. С целью оценки энтерогепатической циркуляции холестерола под влиянием леукомизина исследовали экскрецию холестерола с фекалиями из ЖКТ крыс. В данных экспериментах леукомизин вводили экспериментальным животным в дозе 10 мг/кг в течение 10 сут. В качестве препарата сравнения по влиянию на активность ГМГ-КоА-редуктазы использовали ее ингибитор, лекарственный препарат розувастатин кальция (регистрационный номер ЛСР-008601/09-291009, производства MSN Laboratories Limited, Индия). Животных умерщвляли СО2асфиксией на 10--е сут исследования. В гомогенатах печени крыс определяли активность ГМГ-КоА-редуктазы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [129]. Для получения гомогената 1,0 г печени гомогенизировали в 5 мл буфера (состав: 20 ммоль буферфосфатный (имеющий рН 7,4), 0,2 моль KCl 0,2 моль сахарозы, 5 ммоль ЭДТА, 5 ммоль дитиотриэтола, исполльзованные реагенты производства 63 «Merck» или «Sigma Aldrich»), с помощью диспергатора IKA T10 basic (Германия). Полученный гомогенат ткани печени центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин, отделяли супернатант и его центрифугировали при 30000 g (температура 4ºС, время 30 мин), отбирали надосадочную жидкость, в которой определяли активность ГМГ-КоА-редуктазы методом ВЭЖХ. Определение проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent 1100 (США). Инкубационная среда для проведения ферментативной реакции содержала 200 мкл буфера (состав: 20 ммоль буферфосфатный (имеющий рН 7,4), 0,2 моль KCl 0,2 моль сахарозы, 5 ммоль ЭДТА, 5 ммоль дитиотриэтола), 50 мкл 50 ммоль восстановленного НАДФН+Н+ (все использованные реагенты производства «Merck» или «Sigma Aldrich»), 100 мкл гомогената печени. Ферментативную реакцию запускали добавлением 50 мкл 1 ммоль ГМГ-КоА производства фирмы «Sigma Aldrich». инкубации. Использовали следующие условия и параметры хроматографирования: 64 Хроматограмму, получаемую методом ВЭЖХ, регистрировали для каждой пробы дважды, на 0-й и 60-й мин ферментативной реакции. Расчет активности фермента осуществляли по разнице площадей пиков содержания ГМГ-КоА на 0-й и 60-й мин инкубации соответственно. Активность фермента ГМГ-КоАредуктазы выражали в пмоль ГМГ-КоА расходуемого в минуту на миллиграмм белка. Для изучения влияния леукомизина на процесс экскреции холестерола через ЖКТ измеряли его содержание в кале экспериментальных животных (крыс). Кал собирали в течение 1 сут, затем высушивали. Липиды экстрагировали из экскрементов смесью хлороформ-метанол (2 : 1) по методике J. Folch [85]. Уровнь холестерола в полученном экстракте определяли ферментативным методом с помощью набора фирмы «Chronolab» (Испания). В сыворотке крови экспериментальных животных также определяли уровни ТАГ и общего ХС. 2.5. Статистическая обработка данных Результаты исследования обрабатывали с использованием программы Microsoft Exсel (2007), GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, США) и стандартного пакета программ SPSS 17.0 for Windows. При оценке полученных данных использовали методы статистического описания и проверки статистических гипотез [8, 9]. Проверка на соответствие выборок нормальному закону распределения проводилась при помощи критерия Шапиро-Уилка. 65 Равенство выборочных средних, имеющих нормальный закон распределения, проверяли с применением t-критерия Стьюдента. Результаты представляли в виде выборочного среднего (M или Х ) и стандартной ошибки среднего (±m). Статистически значимые считали различия при уровне значимости p < 0,05. Равенство выборочных средних, имеющих ненормальный закон распределения, проверяли с применением непараметрического критерия МаннаУитни [10]. Достоверность различий независимых выборок оценивали с помощью непараметрического критерия для малых групп Манна-Уитни. Различия считались достоверными при достигнутом уровне значимости р < 0,05. Расчеты проводили с использованием программы SPSS Statistics 17.0 для Windows. 66 ГЛАВА 3. СКРИНИНГ ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (1-Й ЭТАП ИССЛЕДОВАНИЯ) 3.1. Исследование эффектов лактонов при острой экспериментальной гиперлипидемии у крыс, индуцированной этиловым спиртом Гиперлипидемию вызывали однократным внутрижелудочным введением этилового спирта. Механизм гиперлипидемического действия этанола обусловлен стимуляцией выработки адреналина надпочечниками, что приводит к быстрой активации липолиза в жировой ткани, повышению уровня свободных жирных кислот в крови; ускоряется синтез жирных кислот и их этерификация с образованием ТАГ в печени, стимулируется продукция холестерина и его эфиров, тормозится β-окисление жирных кислот в митохондриях, увеличивается секреция гепатоцитами ЛПОНП, что приводит к гиперлипидемии [27, 108]. Влияние сесквитерпеновых лактонов и никотиновой кислоты на уровень триацилглицеролов в сыворотке крови крыс при острой экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной этиловым спиртом Превентивное курсовое введение леукомизина экспериментальным животнымв дозе 10 мг/кг массы тела в течение 7 дней, как и препарата сравнения никотиновой кислоты в дозе 25 мг/кг массы тела статистичеески значимо (p < 0,01) снижало уровень ТАГ в сыворотке крови на 39,3% и 42,8% соответственно (Таблица 7). Курсовое введение крысам гроссмизина сопровождалось тенденцией к снижению уровня ТАГ в сыворотке крови на 16,7% (р < 0,1). Курсовое введение экспериментальным животным в той же дозе арглабина, людартина, гроссгемина и ахиллина не приводило к статистически значимому изменению уровня ТАГ в сыворотке крови. Таким образом, леукомизин и, в меньшей степени, гроссмизин, при курсовом введении, подобно никотиновой кислоте, снижали уровень ТАГ в сыворотке крови экспериментальных животных. 67 Таблица 7 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (10 мг/кг в течение 7 дней) и препарата сравнения никотиновой кислоты (25 мг/кг) на уровень триацилглицеролов в сыворотке крови крыс (X ± m) Экспериментальные группы Уровень ТАГ, ммоль/л 1. Интактные (n = 9) 0,83 ± 0,07 2. Никотиновая кислота (n = 9) 0,47 ± 0,03* 3. Леукомизин (n = 9) 0,50 ± 0,04* 4. Арглабин (n = 9) 0,76 ± 0,03 5. Людартин (n = 9) 0,75 ± 0,09 6. Гроссгемин (n = 9) 0,76 ± 0,09 7. Ахиллин (n = 9) 0,74 ± 0,05 8. Гроссмизин (n = 9) 0,69 ± 0,09* р р2–1 < 0,01 –42,8% р3–1 < 0,01 –39,3% р4–1 > 0,05 –7,5% р5–1 > 0,05 –9,3% р6–1 > 0,05 –7,5% р7–1 > 0,05 –10,6% р8–1 < 0,1 –16,7% Примечание: n – количество экспериментальных животных в группе; * – различия достоверны при сравнении экспериментальных групп с интактной. После курсового введения препаратов у этих же экспериментальных животных индуцировали гиперлипидемию однократным введением этанола (5 г/кг массы тела) в виде 40%-го раствора. Известно, что этанол стимулирует выработку адреналина надпочечниками, что приводит к липолизу, гиперлипидемии и повышенному депонированию ТАГ в печени [27]. Действительно, через 6 ч после введения этанола у животных контрольной группы уровень ТАГ в сыворотке крови статистически значимо повышался в 1,9 раза и составлял (1,55 ± 0,13) ммоль/л (до введения (0,83 ± 0,07) ммоль/л) (Таблица 8). Это свидетельствует о развитии у животных острой гиперлипидемии, вызванной введением этилового спирта. Курсовое введение сесквитерпеновых лактонов, подобно никотиновой кислоте, существенно снижало уровень ТАГ в сыворотке крови 68 экспериментальных животных на фоне развития острой гиперлипидемии, вызванной введением этилового спирта. Курсовое введение арглабина снижало повышенный уровень ТАГ в сыворотке крови крыс, вызванный этанолом, на 51,2% (р < 0,01), леукомизина и ахиллина – на 49,5% (р < 0,01) и 49,8% (р < 0,01) соответственно. Людартин и гроссмизин на модели острой гиперлипидемии, вызванной этанолом, оказывали менее выраженное действие и снижали повышенный уровень ТАГ в сыворотке крови крыс на 37,5% (р < 0,01) и 34,1% (р < 0,05) соответственно (Таблица 8). Таблица 8 – Влияние сесквитерпеновых лактонов (7 дней, 10 мг/кг) и никотиновой кислоты (7 дней, 25 мг/кг) на уровень триацилглицеролов в сыворотке крови крыс при экспериментальной острой гиперлипидемии, вызванной этанолом (X ± m) Экспериментальные группы Уровень ТАГ в сыворотке крови до введения этанола, ммоль/л после введения этанола, ммоль/л 1. Контроль (n = 9) 0,83 ± 0,07 1,55 ± 0,13* 2. Никотиновая кислота (n = 9) 0,47 ± 0,03 0,89 ± 0,08* 3. Леукомизин (n = 9) 0,50 ± 0,04 0,78 ± 0,07* 4. Арглабин (n = 9) 0,76 ± 0,03 0,75 ± 0,05 5. Людартин (n = 9) 0,75 ± 0,09 0,97 ± 0,14 6. Гроссгемин (n = 9) 0,76 ± 0,09 1,24 ± 0,13* 7. Ахиллин (n = 9) 0,74 ± 0,05 0,77 ± 0,08 8. Гроссмизин (n = 9) 0,69 ± 0,09 1,02 ± 0,15* р р2–1 < 0,01 –42,4% р3–1 < 0,01 –49,5% р4–1 < 0,01 –51,2% р5–1 < 0,01 –37,5% р6–1 < 0,1 –19,8% р7–1 < 0,01 –49,8% р8–1 < 0,05 –34,1% Примечание: n – количество экспериментальных животных в группе; * – различия достоверны при сравнении экспериментальных групп до и после введения этанола 69 Влияние сесквитерпеновых лактонов и никотиновой кислоты на уровень свободных жирных кислот в сыворотке крови крыс при острой экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной этиловым спиртом Известно, что одним из механизмов развития острой гиперлипидемии, вызванной этанолом, является активация липолиза, приводящая к значительному повышению уровня СЖК в сыворотке крови, которые в печени участвуют в синтезе триацилглицеролов и способствуют развитию гиперлипидемии. В результате экспериментов установлено, что через 6 ч после введения этанола (5 г/кг массы тела) в сыворотке крови контрольных животных уровень СЖК повышается в 3,2 раза и составлял (2,73 ± 0,30) ммоль/л (до введения 0,85±0,07 ммоль/л) (Таблица 9). Таблица 9 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (7 дней, 10 мг/кг) и никотиновой кислоты (7 дней, 25 мг/кг) на уровень свободных жирных кислот в сыворотке крови крыс при экспериментальной острой гиперлипидемии, индуцированной этанолом (5г/кг) (X ± m) Экспериментальные Уровень СЖК, группы ммоль/л 1. Интактные р 0,85±0,07 2. Этанол (контроль) (n = 9) 2,73 ± 0,30* р2–1 < 0,01, +321,1% 3. Никотиновая кислота (n = 9) 1,19 ± 0,24* р3–2 < 0,01, –67,9% 4. Леукомизин (n = 9) 1,60 ± 0,11* р4–2 < 0,05, –41,6% 5. Арглабин (n = 9) 1,65 ± 0,19* р5–2 < 0,05, –39,6% 6. Людартин (n = 9) 1,00 ± 0,05* р6–2 < 0,01, –63,4% 7. Гроссгемин (n = 9) 1,07 ± 0,12* р7–2 < 0,01, –60,7% 8. Ахиллин (n = 9) 1,58 ± 0,20* р8–2 < 0,01, –42,1% 9. Гроссмизин (n = 9) 2,54 ± 0,34 р9–2 > 0,05, –7,4% Примечание: n – количество экспериментальных животных в группе; * – различия достоверны при сравнении экспериментальных групп с контрольной, контрольной с интакной. 70 Курсовое введение сесквитерпеновых лактонов, подобно никотиновой кислоте, существенно снижало уровень СЖК в сыворотке крови экспериментальных животных. Курсовое введение людартина и гроссгемина снижало повышенный уровень СЖК в сыворотке крови крыс, вызванный этанолом, на 63,4% (р < 0,01) и 60,7% (р < 0,01) соответственно. Курсовое введение ахиллина, леукомизина и арглабина на модели острой гиперлипидемии, вызванной этанолом, оказывало менее выраженное действие и приводило к снижию повышенного уровня СЖК в сыворотке крови крыс на 42,1% (р < 0,01), 41,6% (р < 0,05) и 39,6% (р < 0,05) соответственно. Введение гроссмизина не оказывало существенного влияния на содержание СЖК в сыворотке крови крыс при экспериментальной острой гиперлипидемии, вызванной этанолом (Таблица 9). Влияние сесквитерпеновых лактонов и никотиновой кислоты на уровень холестерола в сыворотке крови крыс при острой экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной этиловым спиртом В результате эксперимента было установлено, что курсовое введение сесквитерпеновых лактонов леукомизина, арглабина и гроссмизина, в отличие от никотиновой кислоты, приводило к статистически значимому снижению уровня общего холестерола в сыворотке крови экспериментальных животных (Таблица 10). Введение леукомизина снижало уровень общего ХС в сыворотке крови крыс на 20,4% (р < 0,05), а арглабина и гроссмизина на 18,3% (р < 0,05) и 15,8% (р < 0,05) соответственно. Курсовое введение людартина, ахиллина и гроссгемина не сопровождалось статистически значимым изменением уровня общего ХС в сыворотке крови экспериментальных животных (Таблица 10). После курсового введения препаратов у этих же экспериментальных животных индуцировали гиперлипидемию однократным введением этанола (5 г/кг массы тела) в виде 40%-го раствора. Через 6 ч после введения этанола у животных контрольной группы уровень общего холестерола в сыворотке крови 71 статистически значиимо не изменялся и составлял (1,92 ± 0,06) ммоль/л (до введения – (2,08 ± 0,11 ммоль/л) (Таблица 11). Таблица 10 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (10 мг/кг массы тела в течение 7 дней) и препарата сравнения никотиновой кислоты (25 мг/кг) на уровень общего холестерола в сыворотке крови крыс (X ± m) Экспериментальные группы Уровень ХС, ммоль/л p 1. Контроль (n = 9) 2,08 ± 0,11 2. Никотиновая кислота (n = 9) 1,73 ± 0,13 р2–1 > 0,05, –16,8% 3. Леукомизин (n = 9) 1,65 ± 0,14* р3–1 < 0,05, –20,4% 4. Арглабин (n = 9) 1,69 ± 0,12* р4–1 < 0,05, –18,3% 5. Людартин (n = 9) 1,80 ± 0,16 р5–1 > 0,05, –13,3% 6. Гроссгемин (n = 9) 1,85 ± 0,14 р6–1 > 0,05, –10,9% 7. Ахиллин (n = 9) 1,78 ± 0,09 р7–1 > 0,05, –14,2% 8. Гроссмизин (n = 9) 1,75 ± 0,10* р8–1 < 0,05, –15,8% Примечание: n – количество экспериментальных животных в группе; * – статистически значимы при сравнении экспериментальных групп с контролем. различия Курсовое введение никотиновой кислоты, арглабина, леукомизина, людартина, ахиллина и гроссмизина вызывало существенное снижение уровня общего ХС в сыворотке крови экспериментальных животных на фоне острой гиперлипидемии, вызванной этиловым спиртом. Так, арглабин снижал уровень общего ХС в сыворотке крови крыс после введения этанола на 30,4% (р < 0,05), леукомизина – на 20,3% (р < 0,05), людартина – на 15,8% (р < 0,05), ахиллина и гроссмизина – на 14,6% (р < 0,05) и 13,0% (р < 0,05) соответственно. Курсовое введение гроссгемина не оказывало существенного влияния на уровень общего ХС в сыворотке крови экспериментальных животных (Таблица 11). 72 Таблица 11 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (7 дней, 10 мг/кг) и никотиновой кислоты (7 дней, 25 мг/кг) на уровень общего холестерола в сыворотке крови крыс при экспериментальной острой гиперлипидемии, индуцированной этанолом (5г/кг) (X ± m) Экспериментальная группа Уровень общего ХС в сыворотке крови до введения этанола, ммоль/л после введения этанола, ммоль/л 1. Контроль (n = 9) 2,08 ± 0,11 1,92 ± 0,06 2. Никотиновая кислота (n = 9) 1,73 ± 0,13 1,59 ± 0,07* 3. Леукомизин (n = 9) 1,65 ± 0,14 1,53 ± 0,09* 4. Арглабин (n = 9) 1,69 ± 0,12 1,34 ± 0,08* 5. Людартин (n = 9) 1,80 ± 0,16 1,62 ± 0,08* 6. Гроссгемин (n = 9) 1,85 ± 0,14 1,67 ± 0,08 7. Ахиллин (n = 9) 1,78 ± 0,09 1,64 ± 0,07* 8. Гроссмизин (n = 9) 1,75 ± 0,10 1,67 ± 0,09* p р2-1 < 0,05 –17,2% р3-1 < 0,05 –20,3% р4-1 < 0,05 –30,4% р5-1 < 0,05 –15,8% р6-1 > 0,05 –12,9% р7-1 < 0,05 –14,6% р8-1 < 0,05 –13,0% Примечание: n – количество экспериментальных животных в группе; * – различия статистически значимы при сравнении в экспериментальных группах до и после введения этанола. Известно, что холестерол локализуется в сыворотке крови преимущественно во фракциях липопротеинов очень низкой плотности (ХСЛПОНП), низкой (ХС-ЛПНП) и высокой плотности (ХС-ЛПВП). При этом высокий уровень холестерола в ЛПНП способствует развитию атеросклероза, а в ЛПВП оказывает атерогенное действие. У крыс холестерол в сыворотке крови находится преимущественно во фракции ЛПВП [27]. Поэтому было исследовано влияние изучаемых сесквитерпеновых лактонов на уровень ХС во фракциях ЛПНП и ЛПВП на модели острой гиперлипидемии, вызванной введением этанола. 73 Влияние сесквитерпеновых лактонов и никотиновой кислоты на уровень холестерола в липопротеинах низкой плотности и высокой плотности в сыворотке крови крыс при острой экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной этиловым спиртом В результате эксперимента было установлено, что курсовое введение всех исследуемых веществ группы лактонов на модели острой гиперлипидемии, индуцированной этанолом, подобно никотиновой кислоте, статистически значимо снижало уровень холестерола в ЛПНП (Таблица 12). Так, людартин, гроссмизин и арглабин снижали уровень холестерола в ЛПНП на 23,8% (р < 0,01), 20,0% (р < 0,01) и 19,8% (р < 0,01) соответственно. Гроссгемин, ахиллин и леукомизин на модели острой гиперлипидемии достоверно снижали уровень холестерола в ЛПНП на 17,6% (р < 0,05), 15,8% (р < 0,01) и 14,8% (р < 0,05) соответственно. Таким образом, по способности снижать уровень холестерола в ЛПНП при курсовом введении на модели острой гиперлипидемии исследуемые сесквитерпеновые лактоны составили следующий ряд: людартин > гроссмизин > арглабин > гроссгемин > ахиллин > леукомизин Вместе с тем, курсовое введение исследуемых сесквитерпеновых лактонов на фоне острой гиперлипидемии, вызванной введением этанола, не оказывало существенного влияния на уровень холестерола в ЛПВП (Таблица 13). На основании полученных экспериментальных данных было вычислено отношение холестерола в ЛПВП к холестеролу в ЛПНП (ХС-ЛПВП/ХС-ЛПНП), а также индекс атерогенности (ИА) по формуле согласно [98]: ИА= (общий ХС – ХС-ЛПВП)/ХС-ЛПВП Известно, что у крыс холестерол содержится преимущественно в ЛПВП. Установлено, что отношение холестерола в ЛПВП к холестеролу в ЛПНП при острой гиперлипидемии, вызванной этанолом, при курсовом введении гроссгемина, гроссмизина, людартина и арглабина статистически значимо 74 увеличивалось на 42,8% (р < 0,05), 38,6% (р < 0,05), 32,7% (р < 0,05) и 32,3% (р < 0,05) соответственно (Таблица 13). Таблица 12 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (7 дней, 10 мг/кг) и никотиновой кислоты (7 дней, 25 мг/кг) на уровень холестерола в липопротеинах низкой плотности и высокой плотности в сыворотке крови крыс при экспериментальной острой гиперлипидемии, индуцированной этанолом (5 г/кг) (X ± m) Экспериментальные группы 1. Интактные (n = 9) 2. Этанол (контроль) (n = 9) 3. Никотиновая кислота (n = 9) ХС-ЛПНП ммоль/л ХС-ЛПВП p 0,21 ± 0,02 0,36 ± 0,02* 0,30 ± 0,01* 4. Леукомизин (n = 9) 0,30 ± 0,01* 5. Арглабин (n = 9) 0,28 ± 0,01* 6. Людартин (n = 9) 0,27 ± 0,02* 7. Гроссгемин (n = 9) 0,29 ± 0,01* 8. Ахиллин (n = 9) 0,30 ± 0,02* 9. Гроссмизин (n = 9) 0,28 ± 0,01* ммоль/л p 1,08 ± 0,07 р2-1 < 0,05 +71,4% Р3-2 < 0,05 –15,7% Р4-2 < 0,05 –14,8% Р5-2 < 0,05 –19,8% Р6-2 < 0,01 –23,8% Р7-2 < 0,01 –17,6% Р8-2 < 0,01 –15,8% Р9-2 < 0,01 –20% 0,90 ± 0,06 0,94 ± 0,07 0,88 ± 0,06 0,97 ± 0,09 0,90 ± 0,06 1,05 ± 0,04 0,95 ± 0,05 1,01 ± 0,06 р2-1 > 0,05 –16,7% Р3-2 > 0,05 +4,7% Р4-2 > 0,05 –2,3% р5-2 > 0,05 +8,1% р6-2 > 0,05 +0,2% р7-2 > 0,05 +17,5% р8-2 > 0,05 +6,3% р9-2 > 0,05 +12,2% Примечание: n – количество экспериментальных животных в группе; * – различия статистически значимы при сравнении экспериментальных групп с контролем, контрольной с интактной. При курсовом введении ахиллина на модели острой гиперлипидемии отмечена тенденция к снижению отношения холестерола в ЛПВП к холестеролу в ЛПНП. Курсовое введение леукомизина на этот показатель статистически значимого влияния не оказывало. 75 Рассчитанный по формуле индекс [98] атерогенности на фоне индуцированной этанолом гиперлипидемии статистически значимо снижался при курсовом (Таблица 13). введении Арглабин, всех исследуемых людартин, сесквитерпеновых гроссгемин, гроссмизин, лактонов ахиллин и леукомизин снижали ИА на фоне индуцированой этанолом гиперлипидемии на 66,8% (р < 0,05), 49,3% (р < 0,05), 44,8% (р < 0,05), 43,9% (р < 0,05), 39,9% (р < 0,05) и 38,3% (р < 0,05) соответственно. Таблица 13 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (7 дней, 10 мг/кг) и никотиновой кислоты (7 дней, 25 мг/кг) на отношение уровня холестерола в липопротеинах низкой плотности (ХС-ЛПНП) и высокой плотности (ХС-ЛПВП) и индекс атерогенности при экспериментальной острой гиперлипидемии, индуцированной этанолом (5 г/кг) (X ± m) Экспериментальные группы ХС-ЛПВП/ХС-ЛПНП значение 1. Контроль (n = 9) 2,56 ± 0,22 2. Никотиновая кислота (n = 9) 3,13 ± 0,23* 3. Леукомизин (n = 9) 2,95 ± 0,26 4. Арглабин (n = 9) 3,39 ± 0,21* 5. Людартин (n = 9) 3,40 ± 0,21* 6. Гроссгемин (n = 9) 3,66 ± 0,24* 7. Ахиллин (n = 9) 3,29 ± 0,29* 8. Гроссмизин (n = 9) 3,55 ± 0,15* p ИА значение p 1,22 ± 0,17 р2-1 < 0,1 +22,1% р3-1 > 0,05 +15,6% р4-1 < 0,05 +32,3% р5-1 < 0,05 +32,7% р6-1 < 0,05 +42,8% р7-1 < 0,1 +28,7% р8-1 < 0,05 +38,6% 0,81 ± 0,21 0,75 ± 0,05* 0,40 ± 0,06* 0,62 ± 0,08* 0,67 ± 0,08* 0,73 ± 0,06* 0,68 ± 0,12* р2-1 > 0,05 –33,5% р3-1 < 0,05 –38,3% р4-1 < 0,05 –66,8% р5-1 < 0,05 –49,3% р6-1 < 0,05 –44,8% р7-1 < 0,05 –39,9% р8-1 < 0,05 –43,9% Примечание: n – количество экспериментальных животных в группе; * – различия статистически значимы при сравнении экспериментальных групп с контролем, контрольной группы с интактной. 76 Таким образом, по способности снижать индекс атерогенности при курсовом введении на модели острой гиперлипидемии исследуемые сесквитерпеновые лактоны составили следующий ряд: арглабин > людартин > гроссгемин > гроссмизин > ахиллин >леукомизин Влияние сесквитерпеновых лактонов и никотиновой кислоты на содержание триацилглицеролов и холестерола в печени крыс при острой экспериментальной гиперлипидемии, вызванной этанолом В результате экспериментов было установлено, что введение этилового спирта в дозе 5 г/кг массы тела приводило к увеличению содержания триглицеролов в печени крыс в 2,4 раза и составляло (10,26 ± 0,40) мг/г (без введения спирта – (4,35 ± 0,53 мг/г) (Таблица 14). Увеличение уровня ТАГ в печени под влиянием этилового спирта обусловлено активацией липолиза, повышением уровня СЖК в крови, которые используются для синтеза ТАГ. Все исследуемые сесквитерпеновые лактоны при курсовом введении статистически значимо снижали содержание ТАГ в печени в условиях острой гиперлипидемии, индуцированной введением этанола. Арглабин, гроссмизин, ахиллин, людартин, гроссгемин и леукомизин снижали содержание ТАГ в печени на 53,2% (р < 0,01); 52,3% (р < 0,01); 46,9% (р < 0,01); 43,2% (р < 0,01); 30,3 (р < 0,01) и 28,3% (р < 0,05) соответственно (см. Таблицу 14). Таким образом, по способности снижать содержание ТАГ в печени крыс при курсовом введении на модели острой гиперлипидемии исследуемые сесквитерпеновые лактоны составили следующий ряд: арглабин > гроссмизин > ахиллин > людартин > гроссгемин > леукомизин В условиях острой гиперлипидемии, индуцированной этанолом, курсовое введение арглабина, леукомизина, ахиллина и людартина статистически значимо снижало уровень ХС в печени крыс на 38,8% (р < 0,05); 25,0% (р < 0,05); 22,7% (р < 0,05) и 18,3% (р < 0,05) соответственно. Гроссмизин и гроссгемин не оказывали существенного влияния на данный показатель (см. Таблицу 14). 77 Таблица 14 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (7 дней, 10 мг/кг) и никотиновой кислоты (7 дней, 25 мг/кг) на содержание триацилглицеролов и общего холестерола в печени крыс (X ± m) Экспериментальные группы 1. Интактные (n = 9) 2. Этанол (контроль) (n = 9) 3. Никотиновая кислота (n = 9) ТАГ мг/гпечени ХС p 4,35 ± 0,53 10,26 ± 0,4* 6,71 ± 0,39* 4. Леукомизин (n = 9) 7,36 ± 0,30* 5. Арглабин (n = 9) 4,79 ± 0,47* 6. Людартин (n = 9) 5,83 ± 0,36* 7. Гроссгемин (n = 9) 7,16 ± 0,46* 8. Ахиллин (n = 9) 5,44 ± 0,36* 9. Гроссмизин (n = 9) 4,90 ± 0,40* мг/г печени p 1,87 ± 0,08 р2-1 < 0,01 +235,9% р3-2 < 0,01 –34,6% Р4-2 < 0,05 –28,3% Р5-2 < 0,01 –53,2% Р6-2 < 0,01 –43,2% Р7-2 < 0,01 –30,3% р8-2 < 0,01 –46,9% р9-2 < 0,01 –52,3% 3,63 ± 0,25* 2,96 ± 0,19* 2,73 ± 0,14* 2,22 ± 0,19* 2,97 ± 0,17* 3,23 ± 0,14 2,81 ± 0,30* 3,25 ± 0,19 Р2-1 < 0,01 +194,1% Р3-2 < 0,05 –18,7% Р4-2 < 0,05 –25,0% р5-2 < 0,05 –38,8% Р6-2 < 0,05 –18,3% Р7-2 > 0,05 –11,0% р8-2 < 0,05 -22,7% Р9-2 > 0,05 –11,3% Примечание: n – количество экспериментальных животных в группе. * – различия статистически значимы при сравнении экспериментальных групп с контролем, контрольной группы с интактной. Резюме Экспериментальная оценка влияния исследуемых объектов свидетельствует о способности сесквитерпеновых лактонов снижать уровень триацилглицеролов, сводных жирных кислот и холестерола на модели острой гиперлипидемии, индуцированной этанолом. При этом исследуемые сесквитерпеновые лактоны 78 оказывают влияние на разные показатели липидного обмена. Леукомизин проявил относительно большую активность в сравнении с другими лактонами. Для установления молекулярных механизмов гиполипидемического действия сесквитерпеновых лактонов и их сравнительной эффективности в зависимости от структуры были исследовать эффекты латонов на других моделях гиперлипидемии (модель острой экспериментальной гиперлипидемии у крыс, индуцированной детергентом WR 1339, и экспериментальной модели гиперлипидемии у крыс, индуцированной диетой, содержащей холестерол), а также на культуре гепатоцитов. 79 3.2. Гиполипидемическое действие лактонов при острой экспериментальной гиперлипидемии у крыс, индуцированной детергентом WR 1339 Для оценки гиполипидемического действия исследуемых веществ нами была использована модель гиперлипидемии, воспроизводимая у экспериментальных животных при введении тритона WR 1339, являющегося неионным детергентом. Данная модель характеризуется простотой воспроизведения, при этом низкая токсичность тритона и зависимость эффекта от концентрации детергента позволяет воспроизводить гиперлипидемию разной степени выраженности [28]. Известно, что липопротеинлипазы, детергент что WR 1339 препятствует ингибирует утилизации активность липопротеинов и способствует накоплению ТАГ в сыворотке крови экспериментальных животных [27, 28]. Влияние сесквитерпеновых лактонов и фенофибрата на уровень триацилглицеролов в сыворотке крови крыс при острой экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной детергентом WR 1339 После курсового введение препаратов у экспериментальных животных индуцировали гиперлипидемию однократным введением детергента WR 1339 (200 мг/кг массы тьела) в 0,9%-м растворе NaCl. Установлено, что введение крысам детергента WR 1339 способствует повышению уровня ТАГ в сыворотке крови животных через 24 ч в 29 раз (р < 0,01) (Таблица 15). Резкое повышение уровня ТАГ при однократном введении тритона свидетельствует о выраженной гиперлипидемии. Схожие результаты отмечались ранее при введении крысам, мышам, кроликам и морским свинкам тритона в близких дозах. Известно, что детергент WR 1339 ингибирует активность липопротеинлипазы, что препятствует утилизации липопротеинов и способствует накоплению ТАГ в сыворотке крови экспериментальных животных [27, 28]. 80 Таблица 15 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (10 мг/кг в течение 7 дней) и препарата сравнения фенофибрата (100 мг/кг) на уровень триацилглицеролов в сыворотке крови крыс при экспериментальной острой гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339 (200 мг/кг) (X ± m) Экспериментальные группы 1. Интактные (n = 9) Уровень ТАГ, ммоль/л p 0,84 ± 0,13 2. Тритон WR 1339 (контроль) (n = 9) 24,27 ± 2,96* 3. Фенофибрат + тритон WR 1339 (n = 9) 3,98 ± 0,32* 4. Ахиллин + тритон WR 1339 (n = 9) 15,14 ± 1,13* 5. Леукомизин + тритон WR 1339 (n = 9) 10,55 ± 1,14* 6. Арглабин + тритон WR 1339 (n = 9) 15,23 ± 1,65* 7. Людартин + тритон WR 1339 (n = 9) 9,36 ± 1,47* 8. Гроссгемин + тритон WR 1339 (n = 9) 17,25 ± 1,52* 9. Гроссмизин + тритон WR 1339 (n = 9) 15,61 ± 1,34* р2-1 < 0,01 +2900% р3-2 < 0,01 –83,6% р4-2 < 0,05 –37,6% р5-2 < 0,01 –56,5% р6-2 < 0,05 –37,2% р7-2 < 0,01 –61,4% р8-2 < 0,05 –28,9% р9-2 < 0,01 –35,7% Примечание: n – количество экспериментальных животных в группе; * – различия достоверны при сравнении контрольной группы с интактной, экспериментальных групп с контрольной. Животным контрольной группы внутрибрюшинно вводили 1мл 0,9%-го раствора NaCl. Курсовое введение сесквитерпеновых лактонов, подобно фенофибрату, существенно снижало уровень ТАГ в сыворотке крови экспериментальных животных на фоне развития острой гиперлипидемии, вызванной введением тритона WR 1339. Наиболее выраженное гиполипидемическое действие на данной модели оказали людартин и леукомизин, которые статистически значимо снижали повышенный детергентом уровень ТАГ на 61,4% (р < 0,01) и 56,5% 81 (р < 0,01) соответственно. Курсовое введение арглабина снижало повышенный уровень ТАГ в сыворотке крови крыс, вызванный детергентом, на 37,2% (р < 0,05), ахиллина и гроссмизина – на 37,6% (р < 0,05) и 35,7% (р < 0,01) соответственно. Гроссгемин на модели острой гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339, оказывал менее выраженное действие и снижал повышенный уровень ТАГ в сыворотке крови крыс на 28,9% (р < 0,05). Влияние сесквитерпеновых лактонов и фенофибрата на уровень свободных жирных кислот в сыворотке крови крыс при острой экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339 В результате экспериментов установлено, что через 24 ч после внутрибрюшинного введения тритона WR 1339 (200 мг/кг) уровень СЖК в сыворотке крови контрольных животных повышался на 168,9% и составлял (1,71 ± 0,19) ммоль/л (у интактных животных – (1,01 ± 0,04) ммоль/л) (Таблица 16). Курсовое введение фенофибрата существенно снижало (на 46,9%, р < 0,05) уровень СЖК в сыворотке крови экспериментальных животных. Леукомизин при курсовом назначении уменьшал на 32,1% (р < 0,05) повышенную тритоном концентрацию СЖК в сыворотке крови крыс. Предварительное введение ахиллина, арглабина, людартина, гроссгемина и гроссмизина на модели острой гиперлипидемии, вызванной детергентом WR 1339, не оказывало выраженного действия на повышенный уровень СЖК. 82 Таблица 16 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (7 дней, 10 мг/кг) и препарата сравнения фенофибрата (100 мг/кг) на уровень свободных жирных кислот в сыворотке крови крыс при экспериментальной острой гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339 (200 мг/кг) (X ± m) Экспериментальные группы Уровень СЖК, ммоль/л 1. Интактные (n = 9) 1,01 ± 0,04 2. Тритон WR 1339 (контроль) (n = 9) 1,71 ± 0,19* 3. Фенофибрат + тритон WR 1339 (n = 9) 0,91 ± 0,07* 4. Ахиллин + тритон WR 1339 (n = 9) 1,45 ± 0,06 5. Леукомизин + тритон WR 1339 (n = 9) 1,16 ± 0,09* 6. Арглабин + тритон WR 1339 (n = 9) 1,52 ± 0,13 7. Людартин + тритон WR 1339 (n = 9) 1,59 ± 0,06 8. Гроссгемин + тритон WR 1339 (n = 9) 1,92 ± 0,14 9. Гроссмизин + тритон WR 1339 (n = 9) 1,68 ± 0,08 p р2-1 < 0,05 +168,9% р3-2 < 0,05 –46,9% р4-2 > 0,05 –15,5% р5-2 < 0,05 –32,1% р6-2 > 0,05 –11,5% р7-2 > 0,05 –7,3% р8-2 > 0,05 +11,9% р9-2 > 0,05 –2,3% Примечание: n – количество экспериментальных животных в группе. * – различия достоверны при сравнении контрольной группы с интактной, экспериментальных групп с контрольной. Животным контрольной группы внутрибрюшинно вводили 1мл 0,9%-го раствора NaCl. Влияние сесквитерпеновых лактонов и фенофибрата на уровень холестерола в сыворотке крови крыс при острой экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339 Через 24 ч после введения детергента WR 1339 в крови у животных отмечалось существенное повышение (до (6,35 ± 0,67) ммоль/л) уровня общего ХС. У крыс, которым вместо тритона вводили 0,9%-й NaCl, уровень холестерола соответствовал (2,13 ± 0,19) ммоль/л (Таблица 17). 83 Таблица 17 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (10 мг/кг в течение 7 дней) и препарата сравнения фенофибрата (100 мг/кг в течение 7 дней) на уровень холестерола в сыворотке крови крыс при экспериментальной острой гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339 (200 мг/кг однократно) (X ± m) Экспериментальные группы Уровень ХС, ммоль/л 1. Интактные (n = 9) 2,13 ± 0,19 2. Тритон WR 1339 (контроль) (n = 9) 6,35 ± 0,67* 3. Фенофибрат + тритон WR 1339 (n = 9) 2,21 ± 0,14* 4. Ахиллин + тритон WR 1339 (n = 9) 4,28 ± 0,18* 5. Леукомизин + тритон WR 1339 (n = 9) 3,86 ± 0,18* 6. Арглабин + тритон WR 1339 (n = 9) 4,78 ± 0,53 7. Людартин + тритон WR 1339 (n = 9) 3,58 ± 0,37* 8. Гроссгемин + тритон WR 1339 (n = 9) 5,07 ± 0,64 9. Гроссмизин + тритон WR 1339 (n = 9) 4,89 ± 0,17 p р2-1 < 0,01 +297,0% р3-2 < 0,05 –65,1% р4-2 < 0,05 –32,5% р5-2 < 0,05 –39,2% р6-2 > 0,05 –24,8% р7-2 < 0,05 –43,7% р8-2 > 0,05 –20,3% р9-2 > 0,05 –23,1% Примечание: n – количество экспериментальных животных в группе. * – различия достоверны при сравнении контрольной группы с интактной, экспериментальных групп с контрольной. Животным контрольной группы внутрибрюшинно вводили 1мл 0,9%-го раствора NaCl. Увеличение концентрации общего ХС в сыворотке крови при воздействии на животных тритона может быть связано с его повышенной абсорбцией из кишечника, усилением синтеза эндогенного ХС или снижением выведения в составе липопротеинов (в первую очередь ЛПНП) из сыворотки крови. Показано, 84 что тритон WR 1339, с одной стороны, усиливает синтез холестерола в клетках печени, с другой стороны, снижает клиренс липопротеинов [16]. В результате эксперимента было установлено, что курсовое введение фенофибрата приводило к статистически значимому снижению повышенного детергентом содержания общего ХС в сыворотке крови экспериментальных животных на 65,1% (р < 0,05) и его уровень составил (2,21 ± 0,14) ммоль/л. Введение людартина снижало уровень общего ХС в сыворотке крови крыс на 43,7% (р < 0,05), а леукомизина и ахиллина на 39,2% (р < 0,05) и 32,5% (р < 0,05) соответственно. Курсовое введение арглабина, гроссмизина и гроссгемина не сопровождалось статистически значимым снижением повышенного детергентом уровня общего ХС в сыворотке крови экспериментальных животных (см. Таблицу 17). Известно, что холестерол локализуется в сыворотке крови преимущественно во фракциях липопротеинов очень низкой плотности (ХСЛПОНП), низкой плотности (ХС-ЛПНП) и высокой плотности (ХС-ЛПВП). При этом высокий уровень холестерола в ЛПНП способствует развитию атеросклероза, а в ЛПВП – оказывает атерогенное действие. У крыс холестерол в сыворотке крови находится преимущественно во фракции ЛПВП [27]. Поэтому было исследовано влияние изучаемых сесквитерпеновых лактонов на уровень холестерола во фракциях ЛПНП и ЛПВП на модели острой гиперлипидемии, вызванной введением детергента WR 1339. Влияние сесквитерпеновых лактонов и фенофибрата на уровень холестерола в липопротеинах низкой плотности и высокой плотности в сыворотке крови крыс при острой экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339 В результате эксперимента было установлено, что внутрибрюшинное введение крысам тритона WR 1339 в дозе 200 мг/кг массы тела через 24 ч приводило к резкому увеличению содержания холестерола в атерогенных ЛПНП. Содержание холестерола в ЛПНП крыс после введения детергента составило 85 (1,90 ± 0,29) ммоль/л, что в 9 раз превышает значение этого показателя у животных, получавших 0,9%-й NaCl (Таблица 18). Таблица 18 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (10 мг/кг в течение 7 дней) и препарата сравнения фенофибрата (100 мг/кг в течение 7 дней) на уровень холестерола в липопротеинах низкой плотности и высокой плотности в сыворотке крови крыс при экспериментальной острой гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339 (200 мг/кг однократно), (X ± m) Экспериментальные группы 1. Интактные (n = 9) 2. Тритон WR 1339 (контроль) (n = 9) 3. Фенофибрат + тритон WR 1339 (n = 9) 4. Ахиллин + тритон WR 1339 (n = 9) 5. Леукомизин + тритон WR 1339 (n = 9) 6. Арглабин + тритон WR 1339 (n = 9) 7. Людартин + тритон WR 1339 (n = 9) 8. Гроссгемин + тритон WR 1339 (n = 9) 9. Гроссмизин + тритон WR 1339 (n = 9) ХС-ЛПВП, ммоль/л p 1,08 ± 0,07 1,76 ± 0,24* 1,21 ± 0,06* 1,63 ± 0,12 1,53 ± 0,13 1,36 ± 0,13 1,02 ± 0,14* 1,82 ± 0,26 1,32 ± 0,07 ХС-ЛПНП, ммоль/л p 0,21 ± 0,02 р2-1 < 0,05 +62,7% р3-2 < 0,05 –31,2% р4-2 > 0,05 –6,9% р5-2 > 0,05 –12,5% р6-2 > 0,05 –22,5% р7-2 < 0,05 –41,9% р8-2 > 0,05 +3,7% р9-2 > 0,05 –24,9% 1,90 ± 0,29* 0,34 ± 0,01* 0,41 ± 0,03* 0,57 ± 0,05* 0,61 ± 0,06* 0,4 ± 0,05* 0,46 ± 0,06* 0,24 ± 0,03* р2-1 < 0,01 +803,8% р3-2 < 0,01 82,1% р4-2 < 0,01 –78,3% р5-2 < 0,01 –70,1% р6-2 < 0,01 –67,8% р7-2 < 0,01 –78,8% р8-2 < 0,01 –75,5% р9-2 < 0,01 –87,3% Примечание: n – количество экспериментальных животных в группе. * – различия достоверны при сравнении контрольной группы с интактной, экспериментальных групп с контрольной. Животным контрольной группы внутрибрюшинно вводили 1мл 0,9%-го раствора NaCl. Гроссмизин и фенофибрат снижали уровень холестерола в ЛПНП на 87,3% (р < 0,01) и 82,1% (р < 0,01) соответственно. Гроссгемин, ахиллин и людартин на 86 модели острой гиперлипидемии статистически значимо уменьшали концентрацию холестерола в ЛПНП на 75,5% (р < 0,01), 78,3% (р < 0,01) и 78,8% (р < 0,01) соответственно. Леукомизин и арглабин статистически значимо снижали уровень холестерола в ЛПНП на 70,1% (р < 0,01) и 67,8% (р < 0,01). Таким образом, по способности снижать уровень холестерола в ЛПНП при курсовом введении на модели острой гиперлипидемии исследуемые сесквитерпеновые лактоны составили следующий ряд: гроссмизин > людартин > ахиллин > гроссгемин > леукомизин > арглабин Наряду с этим, исследуемые лактоны, за исключением людартина, не оказывали существенного влияния на уровень холестерола в ЛПВП (см. Таблицу 18). Людартин статистически значимо снижал уровень холестерола в ЛПВП на 41,9% (р < 0,05). На основе полученных экспериментальных данных было вычислено отношение холестерола в ЛПВП к холестеролу в ЛПНП (ХС-ЛПВП/ХС-ЛПНП), а также ИА по формуле согласно [98]: ИА = (общий ХС – ХС-ЛПВП)/ХС-ЛПВП Отношение холестерола в ЛПВП к холестеролу в ЛПНП у группы контрольных животных составило 5,21 ± 0,25 (Таблица 19). Установлено, что при курсовом введении препарат сравнения фенофибрат статистически значимо увеличивал отношение холестерола в ЛПВП к холестеролу в ЛПНП при острой гиперлипидемии, индуцированной введением тритона WR 1339 в 2,5 раза (р < 0,01) (Таблица 19). Гроссмизин, ахиллин, гроссгемин, леукомизин, людартин и арглабин также повышали отношение ХСЛПВП/ХС-ЛПНП на фоне индуцированой детергентом WR 1339 гиперлипидемии в 5 раз (р < 0,01), 3 раза (р < 0,01), 3 раза (р < 0,01), 1,7 раза (р < 0,01), 1,5 раза (р < 0,01) и 1,3 раза (р < 0,01) соответственно. 87 Рассчитанный по формуле [98] индекс атерогенности для препарата сравнения фенофибрата при гиперлипидемии, индуцированной детергентом WR 1339, статистически значимо снижался на 70,6% (р < 0,01) (Таблица 19). Таблица 19 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (10 мг/кг в течение 7 дней) и препарата сравнения фенофибрата (100 мг/кг в течение 7 дней) на отношение уровня холестерола в липопротеинах низкой плотности (ХС-ЛПНП) и высокой плотности (ХС-ЛПВП) и индекс атерогенности в сыворотке крови крыс при экспериментальной острой гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339 (200 мг/кг однократно) (X ± m) Экспериментальные группы 1. Интактные (n = 9) 2. Тритон WR 1339 (контроль) (n = 9) 3. Фенофибрат + тритон WR 1339 (n = 9) 4. Ахиллин + тритон WR 1339 (n = 9) 5. Леукомизин + тритон WR 1339 (n = 9) 6. Арглабин + тритон WR 1339 (n = 9) 7. Людартин + тритон WR 1339 (n = 9) 8. Гроссгемин + тритон WR 1339 (n = 9) 9. Гроссмизин + тритон WR 1339 (n = 9) ХС-ЛПВП/ ХС-ЛПНП p 5,21 ± 0,25 1,00 ± 0,10* 3,56 ± 0,18* 4,14 ± 0,43* 2,76 ± 0,12* 2,28 ± 0,17* 2,56 ± 0,26* 4,06 ± 0,46* 6,13 ± 0,73* ИА p 0,99 ± 0,10 р2-1 < 0,01 –80,7% р3-2 < 0,01 +254,6% р4-2 < 0,01 +312,2% р5-2 < 0,01 +174,1% р6-2 < 0,01 +126,8% р7-2 < 0,01 +155,0% р8-2 < 0,01 +303,7% р9-2 < 0,01 +508,9% 2,86 ± 0,36* 0,84 ± 0,10* 1,71 ± 0,20* 1,63 ± 0,23* 2,36 ± 0,21 2,67 ± 0,27 1,84 ± 0,23* 2,74 ± 0,17 р2-1 < 0,05 +188,2% р3-2 < 0,01 –70,6% р4-2 < 0,05 –40,2% р5-2 < 0,05 –42,8% р6-2 > 0,05 –17,6% р7-2 > 0,05 –6,5% р8-2 < 0,05 –35,7% р9-2 > 0,05 –4,2% Примечание: n – количество экспериментальных животных в группе. * – различия достоверны при сравнении контрольной группы с интактной, экспериментальных групп с контрольной. Животным контрольной группы внутрибрюшинно вводили 1 мл 0,9%-го раствора NaCl. 88 При острой гиперлипидемии курсовое введении леукомизина, ахиллина и гроссгемина способствовало снижению индекса атерогенности на 42,8% (р < 0,05), 40,2% (р < 0,05) и 35,7% (р < 0,05) соответственно. Курсовое введение арглабина, людартина и гроссмизина не оказывало существенного влияния на индекс атерогенности при острой гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339. Таким образом, по способности снижать индекс атерогенности при курсовом введении на модели острой гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339, исследуемые сесквитерпеновые лактоны составили следующий ряд: леукомизин > ахиллин > гроссмизин Влияние сесквитерпеновых лактонов и фенофибрата на содержание триацилглицеролов и холестерола в печени крыс при острой экспериментальной гиперлипидемии, вызванной тритоном WR 1339 В результате экспериментов было установлено, что введение тритона WR 1339 в дозе 200 мг/кг массы тела приводило к увеличению содержания триацилглицеролов в печени крыс и составляло (7,02 ± 0,22) мг/г (у животных группы контроля – (4,87 ± 0,33) (Таблица 20). Увеличение уровня триглицеролов в печени под влиянием детергента WR 1339 обусловлено ингибированием активности липопротеинлипазы, снижением клиренса липопротеинов, что способствует накоплению ТАГ в печени экспериментальных животных. Курсовое введение арглабина, гроссгемина, ахиллина, людартина и гроссмизина способствовало статистически значимому снижению содержания ТАГ в печени при острой гиперлипидемии, индуцированной введением тритона WR 1339, на 54,5% (р < 0,01), 48,2% (р < 0,01), 41,7% (р < 0,01), 34,1% (р < 0,01) и 29,2% (р < 0,01) соответственно. Курсовое введение леукомизина в условиях 89 острой гиперлипидемии не оказало существенного влияния на содержание ТАГ в печени экспериментальных животных. Таблица 20 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (10 мг/кг в течение 7 дней) и препарата сравнения фенофибрата (100 мг/кг в течение 7 дней) на содержание триацилглицеролов и общего холестерола в печени крыс при экспериментальной острой гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339 (200 мг/кг однократно) (X ± m) Экспериментальные группы 1. Интактные (n = 9) 2. Тритон WR 1339 (контроль) (n = 9) 3. Фенофибрат + тритон WR 1339 (n = 9) 4. Ахиллин + тритон WR 1339 (n = 9) 5. Леукомизин + тритон WR 1339 (n = 9) 6. Арглабин + тритон WR 1339 (n = 9) 7. Людартин + тритон WR 1339 (n = 9) 8. Гроссгемин + тритон WR 1339 (n = 9) 9. Гроссмизин + тритон WR 1339 (n = 9) ТАГ мг/г печени ХС p 4,87 ± 0,33 7,02 ± 0,22* 3,43 ± 0,39* 4,09 ± 0,44* 6,24 ± 0,47 3,19 ± 0,21* 4,63 ± 0,27* 3,63 ± 0,34* 4,97 ± 0,30* мг/г печени p 1,94 ± 0,06 р2-1 < 0,01 +44,05% р3-2 < 0,01 –51,1% р4-2 < 0,01 –41,7% р5-2 > 0,05 –10,9% р6-2 < 0,01 –54,5% р7-2 < 0,01 –34,1% р8-2 < 0,01 –48,2% р9-2 < 0,01 –29,2% 2,25 ± 0,12* 1,43 ± 0,05* 1,90 ± 0,07* 1,73 ± 0,05* 1,70 ± 0,09* 1,78 ± 0,07* 1,69 ± 0,12* 1,86 ± 0,13* р2-1 < 0,05 +16,07% р3-2 < 0,01 –36,5% р4-2 < 0,01 –15,6% р5-2 < 0,01 –23,2% р6-2 < 0,01 –24,7% р7-2 < 0,01 –20,8% р8-2 < 0,01 –25,0% р9-2 < 0,05 –17,5% Примечание: n – количество экспериментальных животных в группе. * – различия достоверны при сравнении контрольной группы с интактной, экспериментальных групп с контрольной. Животным контрольной группы внутрибрюшинно вводили 1 мл 0,9%-го раствора NaCl. 90 Таким образом, по способности снижать содержание ТАГ в печени крыс при курсовом введении на модели острой гиперлипидемии исследуемые сесквитерпеновые лактоны составили следующий ряд: арглабин > гроссгемин > ахиллин > людартин > гроссмизин > леукомизин При исследовании влияния сесквитерпеновых лактонов на уровень ХС в печени при острой гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339, установлено, что все исследуемые вещества статистически значимо снижали повышенный детергентом уровень холестерола в печени крыс. Препарат сравнения фенофибрат снижал содержание ХС в печени на 36,5% (р < 0,01). Гроссгемин снижал повышенный введением тритона WR 1339 уровень ХС в печени на 25,0% (р < 0,01), арглабин – на 24,7% ( р < 0,01), леукомизин – на 23,2% (р < 0,01), людартин – на 20,8% (р < 0,01), гроссмизин – на 17,5% (р < 0,05), ахиллин – на 15,6% (р < 0,01) (см. Таблицу 20). Таким образом, по способности снижать уровень холестерола в печени экспериментальных животных при курсовом введении на модели острой гиперлипидемии, индуцируемой тритоном WR 1339, исследуемые сесквитерпеновые лактоны составили следующий ряд: гроссгемин > арглабин > леукомизин > людартин > гроссмизин > ахиллин Резюме Экспериментальная оценка влияния исследуемых объектов на показатели липидного обмена свидетельствует о способности сесквитерпеновых лактонов снижать уровень триацилглицеролов, свободных жирных кислот и холестерола при острой гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339. При этом исследуемые сесквитерпеновые лактоны в зависимости от структуры оказывают влияние на разные показатели липидного обмена. 91 3.3. Действие сесквитерпеновых лактонов при экспериментальной модели гиперлипидемии у крыс, индуцированной диетой, содержащей холестерол и жиры Одним из широко распространенных способов моделирования гиперлипидемии в эксперименте является длительное применение диеты, содержащей холестерол (2,5%), метилтиоурацил (0,12%) и 30% растительного масла [27]. Данная модель гиперлипидемии варьирует как по соотношению ингредиентов в диете, так и по длительности ее применения. При этой модели в организме животных развиваются нарушения наиболее близкие к таковым при атеросклерозе у человека. В процесс не только вовлекаются биохимические показатели, но также появляются изменения в морфологии сосудов. В наших экспериментах лабораторные животные получали атерогенную диету в течение 4 недель. Затем экспериментальным группам животных, продолжавшим получать эту же диету, в течение 2 недель вводили внутрижелудочно сесквитерпеновые лактоны (в дозе 10 мг/кг массы тела) и препараты сравнения фенофибрат («Трайкор», Франция) (100 мг/кг) и розувастатин кальция (ЛСР-008601/09-291009, MSN Laboratories Limited, Индия) в виде раствора в 0,5% крахмальной слизи. Влияние сесквитерпеновых лактонов, фенофибрата и розувастатина на уровень триацилглицеролов в сыворотке крови крыс при хронической экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой В результате экспериментов установлено, что в сыворотке крови животных, получавших атерогенную диету, уровень ТАГ повысился на 51,8% (р < 0,05) (Таблица 21). Увеличение уровня ТАГ при атерогенной диете обусловлено повышенным содержанием в ней животных жиров (45% калорийности; в контроле – 4%). Наряду с этим содержание в диете холевой кислоты (0,5%), участвующей в эмульгировании жира в кишечнике, также способствует усвоению экзогенного жира. 92 Препараты сравнения фенофибрат и розувастатин снижали повышенный уровень ТАГ на фоне высокожировой атерогенной диеты. При этом фенофибрат оказывал более выраженное гиполипидемическое действие и уменьшал содержание ТАГ в сыворотке крови на 57,2% (р < 0,01), тогда как розувастатин на 48,4% (р < 0,01). Таблица 21 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (10 мг/кг в течение 14 дней), препаратов сравнения фенофибрата (100 мг/кг) и розувастатина (10 мг/кг) на уровень триацилглицеролов в сыворотке крови крыс при экспериментальной хронической гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой (X ± m) Экспериментальные группы Уровень ТАГ, ммоль/л 1. Интактные (n = 8) 0,90 ± 0,13 2. Контроль (n = 8) 1,36 ± 0,13* 3. Фенофибрат (n = 8) 0,58 ± 0,09* 4. Розувастатин (n = 8) 0,70 ± 0,13* 5. Арглабин (n = 8) 0,52 ± 0,10* 6. Ахиллин (n = 8) 0,62 ± 0,11* 7. Гроссгемин (n = 8) 0,79 ± 0,05* 8. Гроссмизин (n = 8) 0,72 ± 0,07* 9. Леукомизин (n = 8) 0,45 ± 0,06* 10. Людартин (n = 8) 0,47 ± 0,05* p р2-1 < 0,05 +51,8% р3-2 < 0,01 –57,2% р4-2 < 0,01 –48,4% р5-2 < 0,01 –61,4% р6-2 < 0,01 –54,2% р7-2 < 0,01 –41,9% р8-2 < 0,01 –47,4% р9-2 < 0,01 –67,1% р10-2 < 0,01 –65,5% Примечание: n – количество экспериментальных животных в группе; * – различия достоверны при сравнении контрольной группы с интактной, экспериментальных групп с контрольной. 93 Основным механизмом гиполипидемического действия фибратов, в том числе фенофибрата, является снижение синтеза ТАГ и увеличение их гидролиза [136, 189]. Фибраты, являясь агонистами рецептора, активируемого пероксисомным пролифератором (PPAR), действуют на ядерные рецепторы, увеличивая экспрессию генов, которые регулируют синтез ключевых ферментов липидного обмена и белков метаболизма липопротеинов [52]. Снижение синтеза ТАГ происходит за счет ингибирующего влияния фенофибрата на активность микросомальной диацилглицерол ацилтрансферазы. К тому же, фенофибрат активирует деградацию АпоВ, что приводит к снижению секреции ЛПОНП [205]. Курсовое введение сесквитерпеновых лактонов, подобно фенофибрату и розувастатину, существенно снижало уровень ТАГ в сыворотке крови экспериментальных животных на фоне развития хронической гиперлипидемии, вызванной атерогенной диетой. Наиболее выраженное гиполипидемическое действие на данной модели оказали людартин и леукомизин, которые статистически значимо снижали повышенный уровень ТАГ на 65,5% (р < 0,01) и 67,1% (р < 0,01) соответственно. Курсовое введение арглабина и ахиллина снижало повышенный в результате атерогенной диеты уровень ТАГ в сыворотке крови крыс на 61,4% (р < 0,01) и 54,2% (р < 0,01). Гроссмизин и гроссгемин на модели хронической гиперлипидемии оказывали менее выраженное действие и снижали повышенный уровень ТАГ в сыворотке крови крыс на 47,4% (р < 0,01) и 41,9% (р < 0,01) соответственно (см. Таблицу 21). Поскольку ТАГ в крови преимущественно находятся в составе ЛПОНП, можно предполагать, что уменьшение уровня ТАГ в сыворотке крови крыс на фоне высокожировой диеты под действием сесквитерпеновых лактонов обусловлено снижением синтеза и (или) секреции ЛПОНП печенью. 94 Влияние сесквитерпеновых лактонов, фенофибрата и розувастатина на уровень свободных жирных кислот в сыворотке крови крыс при хронической экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой В результате экспериментов установлено, что при атерогенной диете в сыворотке крови контрольных животных уровень СЖК повышался на 35,37% (р < 0,01) и составлял (1,21 ± 0,04) ммоль/л, у крыс интактной группы этот показатель составил (0,89 ± 0,06) ммоль/л) (Таблица 22). Таблица 22 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (10 мг/кг в течение 14 дней), препаратов сравнения фенофибрата (100 мг/кг) и розувастатина (10 мг/кг) на уровень свободных жирных кислот в сыворотке крови крыс при экспериментальной хронической гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой (X ± m) Экспериментальные группы Уровень СЖК, ммоль/л p 1. Интактные (n = 8) 0,89 ± 0,06 2. Контроль (n = 8) 1,21 ± 0,04* р2-1 < 0,01, +35,4% 3. Фенофибрат (n = 8) 0,71 ± 0,05* р3-2 < 0,01, –40,9% 4. Розувастатин (n = 8) 0,75 ± 0,07* р4-2 < 0,01, –37,6% 5. Арглабин (n = 8) 0,58 ± 0,07* р5-2 < 0,01, –52,4% 6. Ахиллин (n = 8) 0,64 ± 0,07* р6-2 < 0,01, –47,3% 7. Гроссгемин (n = 8) 0,65 ± 0,05* р7-2 < 0,01, –46,8% 8. Гроссмизин (n = 8) 0,68 ± 0,06* р8-2 < 0,01, –43,6% 9. Леукомизин (n = 8) 0,56 ± 0,05* р9-2 < 0,01, –54,1% 10. Людартин (n = 8) 0,77 ± 0,06* р10-2 < 0,01, –36,8% Примечание: n – количество экспериментальных животных в группе; * – различия достоверны при сравнении контрольной группы с интактной, экспериментальных групп с контрольной. 95 Курсовое введение фенофибрата и розувастатина сопровождалось снижением содержания СЖК в сыворотке крови крыс на 40,9% (р < 0,01) и 37,6% (р < 0,01) соответственно. Наиболее существенно повышенную в результате атерогенной диеты концентрацию СЖК в сыворотке крови крыс уменьшали леукомизин и арглабин (на 54,1% (р < 0,01) и 52,4% (р < 0,01) соответственно). Курсовое назначение других сесквитерпеновых лактонов с экспериментальной гиперлипидемией также способствовало эффективному снижению повышенного уровня СЖК в сыворотке крови животных (ахиллин – 47,3% (р < 0,01); гроссгемин – 46,8% (р < 0,01); гроссмизин – 43,6% (р < 0,01); людартин – 36,8% (р < 0,01)) (см. Таблицу 22). Так как животные перед забором крови голодали в течение 12 ч, можно предполагать, что повышенный уровень СЖК в сыворотке крови при атерогенной диете не обусловлен экзогенными жирными кислотами и отражает, в определенной мере, интенсивность липолиза в жировой ткани. Ингибирование липолиза лежит в основе гиполипидемического действия никотиновой кислоты, под влиянием которой снижается уровень СЖК в сыворотке крови, подавляется синтез ТАГ в печени и секреция ЛПОНП гепатоцитами [56]. В механизме гиполипидемического действия сесквитерпенового лактона леукомизина определенную роль также играет его способность ингибировать липолиз жировой ткани [1]. Полученные в результате эксперимента данные позволяют предполагать, что снижение уровня ТАГ в сыворотке крови крыс на фоне атерогенной диеты под действием исследуемых сесквитерпеновых лактонов происходит в результате снижения содержания СЖК и может быть обусловлено, в определенной мере, ингибированием липолиза в жировой ткани. 96 Влияние сесквитерпеновых лактонов, фенофибрата и розувастатина на уровень холестерола в сыворотке крови крыс при хронической экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой У грызунов, в отличие от людей, низкий уровень холестерола в ЛПНП и высокий в ЛПВП, что способствует их слабой восприимчивости к атеросклерозу. Добавление в диету холевой кислоты подавляет превращение холестерола в желчные кислоты [73]. Кроме того, присутствие холевой кислоты в диете оказывает влияние на транскрипцию факторов, контролирующих гены, участвующие в регуляции метаболизма липопротеинов и воспалении, которые играют важную роль в возникновении атеросклероза. Наличие в диете ингибитора синтеза гормонов щитовидной железы 2-тиоурацила обязательно, так как его отсутствие, несмотря на повышение уровня общего холестерола и холестерола в атерогенных липопротеинах низкой плотности, не приводит к развитию атеросклероза [73]. У животных, получавших атерогенную диету в течение 6 недель, в крови отмечалось значительное повышение общего ХС, уровень которого составлял (8,49 ± 1,39) ммоль/л, что в 4,2 раза больше, чем у крыс, получавших стандартный корм ((1,62 ± 0,25) ммоль/л) (Таблица 23). Атерогенность используемой диеты подтверждается наличием липидных бляшек в аорте (Рисунок 12), выявленных окрашиванием нейтральных липидов с красителем OilRedO. В результате эксперимента было установлено, что курсовое введение розувастатина приводило к статистически значимому снижению повышенного в результате диеты содержания общего холестерола в сыворотке крови экспериментальных животных на 60,3% (р < 0,01) и его уровень составил (3,37 ± 0,04) ммоль/л. Фенофибрат оказывал менее выраженное действие и снижал уровень общего холестерола на 48,4% (р < 0,05) (Таблица 23). 97 а б Рисунок 12 – Окрашенные красителем Oil Red O аорты крыс. а – аорта кры получавших стандартную диету; б− аорте крыс, получавших в течение 4 недель атерогенную диету (атеросклеротические бляшки) Известно, что снижение уровня ХС под влиянием розувастатина определяется, главным образом, ингибированием ключевого фермента его биосинтеза 3-гидрокси-3-метилглутарил коэнзим А редуктазы (ГМГ-КоА- редуктазы). В то же время на фоне повышенного поглощения экзогенного холестерола при атерогенной диете, содержащей 2,5% холестерола, этот механизм, по-видимому, не играет ключевую роль в изменении его количества. Наряду с ингибированием ГМГ-КоА-редуктазы снижение уровня холестерола статинами может быть обусловлено увеличением его экскреции с фекалиями (Farvin K. H. S, 2009). Снижение уровня ХС под влиянием фенофибрата на модели хронической гиперлипидемии может быть обусловлено ингибированием синтеза и (или) секреции печенью ЛПОНП – предшественников атерогенных ЛПНП. Кроме того, фибраты препятствуют абсорбции холестерола в кишечнике, что может оказывать существенный вклад в снижение его уровня в сыворотке крови на модели гиперхолестеролемии, вызываемой поступлением экзогенного ХС [189]. 98 Таблица 23 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (10 мг/кг в течение 14 дней), препаратов сравнения фенофибрата (100 мг/кг) и розувастатина (10 мг/кг) на уровень холестерола в сыворотке крови крыс при экспериментальной хронической гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой (X ± m, n=8) Экспериментальные группы Уровень ХС, ммоль/л 1. Интактные 1,62 ± 0,25 2. Контроль 8,49 ± 1,39* 3. Фенофибрат 4,38 ± 0,20* 4. Розувастатин 3,37 ± 0,40* 5. Арглабин 3,78 ± 0,43* 6. Ахиллин 4,18 ± 0,36* 7. Гроссгемин 3,94 ± 0,55* 8. Гроссмизин 4,15 ± 0,33* 9. Леукомизин 3,66 ± 0,41* 10. Людартин 3,83 ± 0,44* p р2-1 < 0,01 +423,2% р3-2 < 0,05 –48,4% р4-2 < 0,01 –60,3% р5-2 < 0,01 –55,5% р6-2 < 0,01 –50,7% р7-2 < 0,01 –53,6% р8-2 < 0,01 –51,2% р9-2 < 0,01 –56,8% р10-2 < 0,01 –54,8% Примечание: * – различия достоверны при сравнении контрольной группы с интактной, экспериментальных групп с контрольной. Введение леукомизина, арглабина и людартина способствовало снижению уровня общего ХС в сыворотке крови крыс на 56,8% (р < 0,01), 55,5% (р < 0,01) и 54,8% (р < 0,01) соответственно. Курсовое введение гроссгемина, гроссмизина и ахиллина также приводило к значимому снижению повышенного уровня общего холестерола сыворотки крови крыс на 53,6% (р < 0,01), 51,2% (р < 0,01) и 50,7% (р < 0,01) соответственно. 99 Известно, что холестерол локализуется в сыворотке крови преимущественно во фракциях липопротеинов очень низкой плотности, низкой плотности и высокой плотности. При этом высокий уровень холестерола в ЛПНП способствует развитию атеросклероза, а в ЛПВП – оказывает атерогенное действие. Поэтому было исследовано влияние изучаемых сесквитерпеновых лактонов на уровень холестерола во фракциях ЛПНП и ЛПВП на модели хронической гиперлипидемии, вызванной атерогенной диетой. Влияние сесквитерпеновых лактонов, фенофибрата и розувастатина на уровень холестерола в липопротеинах низкой плотности и высокой плотности в сыворотке крови крыс при хронической экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой В результате эксперимента было установлено, что курсовое введение всех исследуемых веществ группы лактонов на модели хронической гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой, сопровождалось статистически значимым снижением уровня холестерола в ЛПНП (Таблица 24). Под влиянием леукомизина, гроссмизина и арглабина содержание холестерола в ЛПНП уменьшалось на 56,1% (р < 0,01), 53,0% (р < 0,01) и 50,2% (р < 0,05) соответственно. Гроссгемин, людартин и ахиллин на модели хронической гиперлипидемии статистически значимо снижали уровень холестерола в ЛПНП на 39,6% (р < 0,05), 37,4% (р < 0,05) и 35,9% (р < 0,05) соответственно (Таблица 24). Таким образом, по способности снижать уровень холестерола в ЛПНП при курсовом введении на модели хронической гиперлипидемии исследуемые сесквитерпеновые лактоны составили следующий ряд: леукомизин > гроссмизин > арглабин > гроссгемин > людартин > ахиллин 100 Таблица 24 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (10 мг/кг в течение 14 дней), препаратов сравнения фенофибрата (100 мг/кг) и розувастатина (10 мг/кг) на уровень холестерола в липопротеинах низкой плотности и высокой плотности в сыворотке крови крыс при экспериментальной хронической гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой (X ± m, n=8) Экспериментальные группы ХС-ЛПВП, ммоль/л 1. Интактные 0,76 ± 0,07 2. Контроль 1,91 ± 0,22* 3. Фенофибрат 2,19 ± 0,17 4. Розувастатин 1,40 ± 0,14 5. Арглабин 1,27 ± 0,19 6. Ахиллин 1,20 ± 0,16* 7. Гроссгемин 1,29 ± 0,15* 8. Гроссмизин 1,29 ± 0,14* 9. Леукомизин 1,73 ± 0,21 10. Людартин 1,43 ± 0,18 ХС-ЛПНП, ммоль/л p p 0,20 ± 0,10 р2-1 < 0,01 +149,5% р3-2 > 0,05 +14,9% р4-2 > 0,05 –26,5% р5-2 > 0,05 –33,0% р6-2 < 0,05 –36,8% р7-2 < 0,05 –32,3% р8-2 < 0,05 –32,3% р9-2 > 0,05 –9,14% р10-2 > 0,05 –24,8% 1,17 ± 0,17* 0,94 ± 0,08 0,43 ± 0,04* 0,58 ± 0,09* 0,75 ± 0,06* 0,71 ± 0,11* 0,55 ± 0,08* 0,51 ± 0,07* 0,73 ± 0,08* р2-1 < 0,01 +479,3% р3-2 > 0,05 –19,2% р4-2 < 0,01 –63,2% р5-2 < 0,05 –50,2% р6-2 < 0,05 –35,9% р7-2 < 0,05 –39,6% р8-2 < 0,01 –53,0% р9-2 < 0,01 –56,1% р10-2 < 0,05 –37,4% Примечание: * – различия достоверны при сравнении контрольной группы с интактной, экспериментальных групп с контрольной. Вместе с тем, курсовое введение ахиллина, гроссгемина и гроссмизина способствовало снижению уровня холестерола в ЛПВП на 36,8% (р < 0,05), 32,3% (р < 0,05) и 32,3% (р < 0,05) соответственно. Остальные исследуемые сесквитерпеновые лактоны на фоне хронической гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой, не оказывали существенного влияния на 101 уровень холестерола в ЛПВП (Таблица 24). Для интегральной характеристики липидного спектра плазмы крови и оценки риска развития атеросклероза наиболее простым и в то же время информативным является индекс атерогенности, отражающий отношение содержания холестерина ватерогенных липопротеинах к антиатерогенным. На основе полученных экспериментальных данных был вычислен индекс атерогенности по формуле согласно [98]: ИА = (общий ХС – ХС-ЛПВП)/ХС-ЛПВП Рассчитанный индекс атерогенности на фоне индуцированной атерогенной диетой гиперлипидемии составлял 3,96 ± 0,70, что существенно превышало его значение у животных, получавших стандартную диету (1,07 ± 0,18) (Таблица 25). Таблица 25 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (10 мг/кг в течение 14 дней), препаратов сравнения фенофибрата (100 мг/кг) и розувастатина (10 мг/кг) на индекс атерогенности в сыворотке крови крыс при экспериментальной хронической гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой (X ± m, n=8) Экспериментальные группы 1. Интактные Индекс атерогенности 1,07 ± 0,18 p 2. Контроль 3,96 ± 0,7* р2-1 < 0,05, +188,2% 3. Фенофибрат 1,1 ± 0,21* р3-2 < 0,05, –70,6% 4. Розувастатин 1,41 ± 0,16* р4-2 < 0,05, –64,4% 5. Арглабин 2,12 ± 0,26* р5-2 < 0,05, –46,5% 6. Ахиллин 2,64 ± 0,36 р6-2 > 0,05, –33,3% 7. Гроссгемин 2,1 ± 0,35* р7-2 < 0,05, –47,0% 8. Гроссмизин 2,34 ± 0,28* р8-2 < 0,05, –40,7% 9. Леукомизин 1,17 ± 0,15* р9-2 < 0,05, –70,4% 10. Людартин 1,88 ± 0,33* р10-2 < 0,05, –52,4% Примечание: * – различия достоверны при сравнении контрольной группы с интактной, экспериментальных групп с контрольной. 102 Препараты сравнения фенофибрат и розувастатин способствовали снижению повышенного диетой индекса атерогенности на 70,6% (р < 0,05) и 64,4% (р < 0,05) соответственно. На фоне хронической гиперлипидемии по способности снижать ИА исследуемые сесквитерпеновые лактоны при их курсовом назначении составили следующий ряд: леукомизин (70,4%) > людартин (52,4%) > гроссгемин (47%) > арглабин (46,5%) > гроссмизин (40,7%) Курсовое введение ахиллина на фоне хронической гиперлипидемии не оказывало существенного влияния на индекс атерогенности. Влияние сесквитерпеновых лактонов, фенофибрата и розувастатина на содержание триацилглицеролов и холестерола в печени крыс при хронической экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой В результате экспериментов было установлено, что использование атерогенной диеты приводило к увеличению содержания триацилглицеролов в печени крыс в 5,3 раза и составляло (29,94 ± 0,65) мг/г (у животных, получавших стандартный корм, – (5,56 ± 0,59) мг/г) (Таблица 26). Увеличение уровня триглицеролов в печени при высокалорийной атерогенной диете (45% калорийности за счет животного жира) обусловлено повышенным уровнем циркулирующих в крови СЖК, которые захватываются печенью и используются для синтеза ТАГ. Кормление животных атерогенной диетой, содержащей 2,5% холестерола, 0,5% холевой кислоты и 0,1% 2-тиоурацила в течение 6 недель, приводило к значительному увеличению содержания холестерола (до (102,57 ± 8,78) мг/г) в печени крыс, что в 37 раз превышало уровень холестерола в печени крыс, получавших стандартный корм – (2,75 ± 0,22) мг/г. (Таблица 26). 103 Таблица 26 – Влияние курсового введения сесквитерпеновых лактонов (10 мг/кг в течение 14 дней), препаратов сравнения фенофибрата (100 мг/кг) и розувастатина (10 мг/кг) на содержание триацилглицеролов и холестерола в печени крыс при экспериментальной хронической гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой (X ± m) ТАГ Экспериментальные группы мг/г печени 1. Интактные 5,56 ± 0,59 2. Контроль 29,94 ± 0,65* 3. Фенофибрат 21,42 ± 0,55* 4. Розувастатин 20,94 ± 1,65* 5. Арглабин 22,61 ± 0,87* 6. Ахиллин 21,53 ± 1,18* 7. Гроссгемин 26,17 ± 2,25 8. Гроссмизин 22,31 ± 2,04* 9. Леукомизин 21,67 ± 1,00* 10. Людартин 24,78 ± 1,15* ХС p мг/г печени p 2,75 ± 0,22 р2-1 < 0,01 +535,1% р3-2 < 0,01 –28,5% р4-2 < 0,01 –30,1% р5-2 < 0,01 –24,5% р6-2 < 0,01 –28,1% р7-2 > 0,05 –12,6% р8-2 < 0,01 –25,5% р9-2 < 0,01 –27,6% р10-2 < 0,01 –17,3% 102,57 ± 8,78* 65,53 ± 8,60* 61,60± 6,71* 74,77 ± 3,57* 84,58 ± 4,30 80,50 ± 3,35* 65,47 ± 3,29* 56,25 ± 6,72* 66,96 ± 7,65* р2-1 < 0,01 +3724,5% р3-2 < 0,05 –36,1% р4-2 < 0,01 –39,9% р5-2 < 0,05 –27,1% р6-2 > 0,05 –17,5% р7-2 < 0,05 –21,5% р8-2 < 0,01 –36,2% р9-2 < 0,01 –45,2% р10-2 < 0,01 –34,7% Примечание: * – различия достоверны при сравнении контрольной группы с интактной, экспериментальных групп с контрольной. Препараты сравнения фенофибрат и розувастатин при курсовом введении крысам, получавшим атерогенную диету, снижали повышенный уровень ТАГ 104 в печени на 28,5% (р < 0,01) и 30,1% (р < 0,01), а также холестерола на 36,1% (р < 0,05) и 39,9% (р < 0,01) соответственно. Сесквитерпеновые лактоны ахиллин, леукомизин, гроссмизин, арглабин, людартин статистически значимо снижали содержание ТАГ в печени в условиях хронической гиперлипидемии, индуцированной атерогенной диетой на 28,1% (р < 0,01), 27,6% (р < 0,01), 25,5% (р < 0,01), 24,5% (р < 0,01) и 17,3% (р < 0,01) соответственно. Курсовое введение гроссгемина на фоне хронической гиперлипидемии не оказывало существенного влияния на уровень ТАГ в печени крыс (см. Таблицу 26). В условиях хронической гиперлипидемии, вызванной атерогенной диетой, курсовое введение леукомизина, гроссмизина, людартина, арглабина и гроссгемина статистически значимо снижало уровень холестерола в печени крыс на 45,2% (р < 0,01), 36,2% (р < 0,01), 34,7% (р < 0,01), 27,1% (р < 0,05) и 21,5% (р < 0,05) соответственно. Ахиллин не оказывал существенного влияния на данный показатель (см. Таблицу 26). Таким образом, по способности снижать повышенный уровень ТАГ и холестерола на фоне хронической атерогенной гиперлипидемии исследуемые сесквитерпеновые лактоны составили следующий ряд: ТАГ: ахиллин> леукомизин> гроссмизин> арглабин> людартин Холестерол: леукомизин> гроссмизин> людартин> арглабин> гроссгемин Резюме Экспериментальная оценка влияния исследуемых объектов на показатели липидного обмена лабораторных животных при хронической гиперлипидемии, вызванной высокожировой диетой (45% энергии за счет животного жира), содержащей 2,5% холестерола, 0,5% холевой кислоты и 0,1% 2-тиоурацила), свидетельствует о способности сесквитерпеновых лактонов снижать уровень триацилглицеролов, свободных жирных кислот и холестерола. При этом 105 исследуемые сесквитерпеновые лактоны оказывают влияние в разной степени на отдельные показатели липидного обмена. 3.4. Изучение гиполипидемического действия на клеточной культуре крысиной гепатомы (НТС) in vitro при экспериментальной модели гиперлипидемии, индуцированной жировой эмульсией 3.4.1. Жизнеспособность клеточной культуры гепатомы крыс под воздействием сесквитерпеновых лактонов и гемфиброзила Для выявления цитопротективных или цитотоксических свойств исследуемых образцов предварительно проводили оценку жизнеспособности клеток при инкубации их с различными концентрациями сесквитерпеновых лактонов и препарата сравнения гемфиброзила. В результате экспериментов было установлено, что жизнеспособность клеток НТС при культивировании с арглабином, гроссгемином и людартином в концентрации от 10 до 50 мкмоль не изменялась по сравнению с соответствующим показателем контрольной культуры (p > 0,05) (Таблица 27). При повышении концентрации исследуемых сесквитерпеновых лактонов в культуральной среде до 100 мкмоль жизнеспособность клеток снижалась (p < 0,05). Культивирование клеток гепатомы с ахиллином, гроссмизином в более высоких концентрациях (от 0,25 до 1,5 ммоль) и леукомизином (от 0,5 до 1,0 ммоль) не приводило к изменению жизнеспособности клеток, которая составляла при использовании метода окраски с трипановым синим не менее (97,1 ± 1,5) %, а МТТ-теста – не менее (81,8 ± 2,2) %. При повышении концентрации ахиллина и гроссмизина до 2,0 ммоль, а леукомизина до 1,5 ммоль в культуральной среде жизнеспособность клеток по сравнению с контролем снижалась (p < 0,05) (Таблица 27). 106 Таблица 27 – Влияние сесквитерпеновых лактонов и препарата сравнения гемфиброзила на жизнеспособность клеточной культуры гепатомы крыс НТС, оцениваемую при помощи МТТ-теста Концентрация препарата n Содержание живых клеток (в %), M ± m p Арглабин 10 мкмоль 4 98,8 ± 3,7 0,963 50 мкмоль 4 97,5 ± 2,5 0,823 75 мкмоль 4 69,1 ± 2,5 0,001 100 мкмоль 5 28,4 ± 2,9 <0,001 250 мкмоль 4 4,9 ± 0,1 <0,001 Гроссгемин 10 мкмоль 4 102,5 ± 4,6 0,788 50 мкмоль 4 85,2 ± 1,2 0,110 100 мкмоль 5 61,7 ± 4,9 <0,001 250 мкмоль 4 24,7 ± 2,6 <0,001 500 мкмоль 4 4,9 ± 0,8 <0,001 Людартин 10 мкмоль 4 107,4 ± 6,2 0,346 50 мкмоль 4 87,1 ±1,9 0,135 100 мкмоль 5 24,7 ± 3,7 <0,001 250 мкмоль 4 7,4 ± 0,9 <0,001 500 мкмоль 4 1,2 ± 0,3 <0,001 Гемфиброзил 0,25 ммоль 4 98,8 ± 4,9 0,437 0,5 ммоль 4 81,8 ± 2,2 0,224 1,0 ммоль 4 16,0 ± 2,5 <0,001 1,5 ммоль 4 0,0 <0,001 107 Окончание таблицы 27 Концентрация препарата n Количество живых клеток ( в %), M ± m Ахиллин 0,25 ммоль 4 107,4 ± 1,2 0,297 0,5 ммоль 4 97,3 ± 2,5 0,506 1,0 ммоль 5 91,4 ± 3,8 0,375 1,5 ммоль 4 88,9 ± 4,9 0,235 2,0 ммоль 4 76,5 ± 5,17 0,010 2,5 ммоль 4 37,0 ± 2,5 <0,001 5,0 ммоль 4 17,3 ± 2,6 <0,001 р Гроссмизин 0,25 ммоль 4 111,2 ± 4,4 0,183 0,5 ммоль 4 109,9 ± 4,2 0,238 1,0 ммоль 5 90,1 ± 4,9 0,264 1,5 ммоль 4 86,4 ± 1,2 0,133 2,0 ммоль 4 81,2 ± 1,0 0,031 2,5 ммоль 4 80,2 ± 2,5 0,027 5,0 ммоль 4 64,2 ± 4,9 <0,001 Леукомизин 0,25 ммоль 4 114,0 ± 2,5 0,152 0,5 ммоль 4 109,9 ± 2,5 0,180 1,0 ммоль 5 90,0 ± 3,4 0,253 1,5 ммоль 4 60,5 ± 3,7 <0,001 2,0 ммоль 4 59,3 ± 0,9 <0,001 2,5 ммоль 4 58,0 ± 1,2 <0,001 5,0 ммоль 4 56,8 ± 1,0 <0,001 Примечание.. Жизнеспособность клеток в контроле принимали за 100 %. Данные представлены в виде выборочного среднего M и ошибки среднего m в % от контроля, n – количество измерений, p – уровень статистической значимости различий по сравнению с контролем. 108 Препарат сравнения гемфиброзил в концентрации от 0,25 до 0,5 ммоль (p > 0,05) не влиял на жизнеспособность клеток культуры НТС, а в концентрации 1,0 ммоль и выше оказывал цитотоксическое действие на клетки, при этом содержание живых клеток составляло (16,0 ± 2,5) % от контроля (p < 0,05). 3.4.2. Содержание липидов в клеточной культуре гепатомы крыс Добавление сесквитерпеновых лактонов к культуре НТС приводило к дозозависимому снижению интенсивности флуоресценции Nile Red с (93,7 ± 2,5) % до (47,2 ± 1,4) % при концентрации арглабина от 10 до 100 мкмоль. Ахиллин в концентрации 0,5–5,0 ммоль снижал интенсивность флуоресценции Nile Red с (75,3 ± 1,3) % до (35,6 ± 2,8) %,; гроссгемин – с (60,6 ± 2,7) % до (36,7 ± 4,9) % (10–100 мкмоль), гроссмизин – с (72,6 ± 0,3) % до (35,1 ± 4,0) % (0,5–5,0 ммоль), леукомизин – с (96,8 ± 3,5) % до (38,5 ± 4,3) % (0,5–5,0 ммоль), людартин – с (75,6 ± 2,3) % до (34,2 ± 3,0) % (10–100 мкмоль) и препарат сравнения гемфиброзил – с (99,2 ± 1,9) % до (57,9 ± 4,9) % (0,25–1,0 ммоль) (p < 0,05) (Таблица 28). Статистически значимое уменьшение интенсивности флуоресценции Nile Red в клетках НТС отмечалось при концентрации арглабина 50 мкмоль, ахиллина – 1,0 ммоль, гроссгемина – 10 мкмоль, гроссмизина – 0,5 ммоль, леукомизина – 1,0 ммоль, людартина – 50 мкмоль и гемфиброзила – 0,5 ммоль, что отражает факт снижения содержания липидов в клеточной культуре. 109 Таблица 28 – Влияние сесквитерпеновых лактонов и препарата сравнения гемфиброзила на флуоресценцию Nile Red в клеточной культуре НТС Концентрация препарата n 10 мкМ 50 мкМ 100 мкМ 5 5 5 10 мкМ 50 мкМ 100 мкМ 5 5 5 10 мкМ 50 мкМ 100 мкМ 5 5 5 0,5 мМ 1,0 мМ 1,5 мМ 2,0 мМ 2,5 мМ 5,0 мМ 5 5 5 5 5 5 0,5 мМ 1,0 мМ 1,5 мМ 2,0 мМ 2,5 мМ 5,0 мМ 5 5 5 5 5 5 0,5 мМ 1,0 мМ 1,5 мМ 2,0 мМ 2,5 мМ 5,0 мМ 5 5 5 5 5 5 0,25 мМ 0,5 мМ 1,0 мМ 5 5 5 Интенсивность флуоресценции Nile Red (в % от контроля), M ± m Арглабин 93,7 ± 2,5 70,4 ± 3,3 47,2 ± 1,4 Гроссгемин 60,6 ± 2,7 58,5 ± 1,5 36,7 ± 4,9 Людартин 75,6 ± 2,3 70,1 ± 1,3 34,2 ± 3,0 Ахиллин 75,3 ± 1,3 71,4 ± 3,9 65,7 ± 0,9 56,8 ± 3,8 55,1 ± 2,0 35,6 ± 2,8 Гроссмизин 72,6 ± 0,3 66,9 ± 4,6 58,2 ± 5,0 52,8 ± 1,3 44,3 ± 2,3 35,1 ± 4,0 Леукомизин 96,8 ± 3,5 70,9 ± 5,3 66,3 ± 0,5 58,5 ± 3,7 51,2 ± 4,1 38,5 ± 4,3 Гемфиброзил 99,2 ± 1,9 65,1 ± 2,3 57,9 ± 4,9 р 0,617 0,049 0,004 0,016 0,013 0,002 0,087 0,045 0,002 0,082 <0,05 0,027 0,012 0,009 0,002 <0,05 0,035 0,014 0,007 0,003 0,003 0,803 0,049 0,048 0,027 0,007 0,010 0.949 0.025 0.023 Примечание. Флуоресценцию Nile Red в контроле принимали за 100 %; n – количество измерений; p – уровень статистической значимости различий по сравнению с контролем. 110 Полученные результаты подтверждаются данными микроскопии клеток после окрашивания нейтральных липидов в клетках HTC с красителем Oil Red O. Под действием 50 мкМ арглабина, 1,0 мМ ахиллина, 10 мкМ гроссгемина, 0,5 мМ гроссмизина, 1,0 мМ леукомизина, 50 мкМ людартина и 0,5 мМ гемфиброзила в клетках снижалось содержание липидных капель, окрашенных Oil Red O, по сравнению с контролем (Рисунок 13). а б в г д е ж з Рисунок 13 – Клеточные культы HTC после инкубации с исследуемыми веществами: а – контроль; б –50 мкМ арглабин; в– 1,0 мМ ахиллин; г– 10 мкМ гроссгемин; д – 0,5 мМ гроссмизин; е – 1,0 мМ леукомизин; ж – 50 мкМ людартин; з – 0,5 мМ гемфиброзил. Гранулы липидов, окрашенные красителем Oil Red O, – красного цвета 111 С учетом полученных результатов для исследования гиполипидемического действия на модели гиперлипидемии in vitro сесквитерпеновые лактоны и гемфиброзил были использованы в концентрациях, при которых жизнеспособность клеток значимо неизменялась и отмечалось снижение содержания липидов в клетках по сравнению с контрольными значениями (Рисунки 14–20). При расчетах жизнеспособность клеток и флуоресценцию NileRed в контроле принимали за 100 %. 120 Процент жизнеспособных клеток % от контроля 100 Флуоресценция Nile Re d 80 60 * * 40 20 * 10 0 50 10 0 Концентрация арглабина (мкМ ) Рисунок 14 – Влияние арглабина на жизнеспособность клеток с применением МТТ-теста и на флуоресценцию Nile Red в клеточной культуре крысиной гепатомы (НТС) (n = 5). * – p < 0,05 по сравнению с контролем 120 Процент жизнеспособных клеток % от контроля 100 * 80 60 * 40 Флуоресценция Nile Red * * * * * 20 * 5. 0 2. 5 2. 0 1. 5 1. 0 0. 5 0 Концентрация ахиллина (мМ ) Рисунок 15 – Влияние различных концентраций ахиллина на жизнеспособность клеток с применением МТТ-теста и на флуоресценцию Nile Red в клеточной культуре крысиной гепатомы (НТС), (n = 5). * – p < 0,05 по сравнению с контролем. 112 120 Процент жизнеспособных клеток % от контроля 100 Флуоресценция Nile Red 80 * 60 * 40 * 20 * 10 0 50 10 0 Концентрация гроссгемина (мМ) Рисунок 16 – Влияние различных концентраций гроссгемина на жизнеспособность клеток с применением МТТ-теста и на флуоресценцию Nile Red в клеточной культуре крысиной гепатомы (НТС) (n = 5). * – p < 0,05 по сравнению с контролем 120 % от контроля 100 * 80 60 Процент жизнеспособных клеток * Флуоресценция Nile Red * * 40 * * * 20 * * 5. 0 2. 5 2. 0 1. 5 1. 0 0. 5 0 Концентрация гроссмизина (мМ) Рисунок 17 – Влияние гроссмизина на жизнеспособность клеток с применением МТТ-теста и на флуоресценцию Nile Red в клеточной культуре крысиной гепатомы (НТС) (n = 5). * – p < 0,05 по сравнению с контролем 113 120 Процент жизнеспособных клеток % от контроля 100 Флуоресценция Nile Red 80 * 60 * * 40 * 20 * * * * 5. 0 2. 5 2. 0 1. 5 1. 0 0. 5 0 Концентрация леукомизина (мМ ) Рисунок 18 – Влияние различных концентраций леукомизина на жизнеспособность клеток с применением МТТ-теста и на флуоресценцию Nile Red в клеточной культуре крысиной гепатомы (НТС) (n = 5). * – p < 0,05 по сравнению с контролем 120 Процент жизнеспособных клеток % от контроля 100 Флуоресценция Nile Red 80 60 * 40 * 20 50 10 10 0 * 0 Концентрация людартина (мкМ ) Рисунок 19 – Влияние различных концентраций людартина на жизнеспособность клеток с применением МТТ-теста и на флуоресценцию NileRed в клеточной культуре крысиной гепатомы (НТС) (n = 5). * – p < 0,05 по сравнению с контролем 114 120 Процент жизнеспособных клеток Флуоресценция Nile Red % от контроля 100 80 * 60 * 40 * 20 1. 0 0. 5 0. 25 0 Концентрация гемфиброзила (мМ ) Рисунок 20 – Влияние препарата сравнения гемфиброзила на жизнеспособность клеток с применением МТТ-теста и на флуоресценцию Nile Red в клеточной культуре крысиной гепатомы (НТС) (n = 5). * – p < 0,05 по сравнению с контролем 3.4.3. Содержание липидов в клеточной культуре гепатомы крыс на экспериментальной модели гиперлипидемии В работе E. Ilan et al. показано, что культивирование первичных крысиных гепатоцитов с жировой эмульсией (липофундином) в течение 48 ч приводит к накоплению ТАГ и жирных кислот в клетках [105]. Использовали данную модель для оценки влияния сесквитерпеновых лактонов и гемфиброзила на обмен липидов в культуре гепатомы крыс при ее культивировании с жировой эмульсией. В результате наших экспериментов установлено, что при культивировании с липофундином в концентрации от 0,01% до 0,1% жизнеспособность клеток не уменьшалась по сравнению с соответствующим показателем контрольной культуры (p > 0,05) и составляла ≈ 97% (методом с трипановым синим) и ≈ 95% (методом МТТ-теста) (Таблица 29). Инкубация клеток НТС в течение 48 ч в присутствии 0,01%-го липофундина приводила к увеличению содержания в них ТАГ в 1,5 раза – с 1,91 (1,72–1,98) до 2,99 (2,87 – 3,05) нмоль/мг белка. При добавлении 0,05%-го липофундина содержание ТАГ увеличивалось в 3 раза до 5,68 (5,54–5,75) 115 нмоль/мг белка по сравнению с контрольными значениями. При добавлении 0,1%-го липофундина исследуемый показатель повышался по сравнению со значениями контроля в 2,4 раза – до 4,57 (4,40–4,68) нмоль/мг белка (Таблица 30). Таблица 29 – Влияние липофундина на жизнеспособности клеточной культуры гепатомы крыс НТС, M ± m Концентрация липофундина n % p 0,01% 5 96,5 ± 1,4 >0,05 0,05% 5 98,9± 2,9 >0,05 0,1% 5 97,2± 1,6 >0,05 Примечание. Жизнеспособность клеток оценивали МТТ-тестом и в контроле принимали за 100 %. Таблица 30 – Влияние липофундина на содержание триациглицеролов в клетках гепатомы крыс НТС, Ме (Q1–Q3) Концентрация липофундина в инкубационной среде Контроль n Содержание ТАГ (нмоль/мг белка) p 5 1,91 (1,72–1,98) 0,01 % 5 2,99 (2,87–3,05) <0,05 0,05 % 5 5,68 (5,54–5,75) <0,05 0,1 % 5 4,57 (4,40–4,68) <0,05 (без липофундина) Примечаниие. Данные представлены в виде медианы (Ме), характеризующей центральную тенденцию, и верхнего и нижнего квартилей, характеризующих разброс значений показателя у 50% образцов (Q1–Q3), где Q1 – 25% перцентиль, Ме – 50% перцентиль, Q3 – 75% перцентиль. n – количество измерений. p – уровень статистической значимости различий по сравнению с контролем. 116 Таким образом, культивирование клеточной линии НТС в присутствии липофундина приводило к накоплению в клетках ТАГ в зависимости от его концентрации. При этом максимальное увеличение содержания ТАГ в клетках отмечалось при концентрации липофундина в инкубационной среде 0,05 %. Полученный результат также подтверждался при оценке интенсивности флуоресценции Nile Red, которая повышалась в 4 раза по сравнению с контролем и составляла (48534,7 ± 1924,0) ед. флуоресценции (в контроле – (10928,4 ± 967,3) ед. флуоресценции) (p < 0,05). Накопление липидов в культуре НТС подтверждается данными микроскопии клеток после окрашивания нейтральных липидов с красителем Oil Red O. При инкубации клеток с липофундином 0,05 % отмечалось большее количество гранул липидов, окрашенных Oil Red O, чем в контрольной культуре (Рисунок 21). а б Рисунок 21 – Микрофотографии клеточной культы HTC: а – 0,05 % липофундин; б – контроль. Гранулы липидов, окрашенные красителем Oil Red O – красного цвета В экспериментальной модели гиперлипидемии, вызванной жировой эмульсией, ахиллин проявлял способность понижать уровень липидов в культуре НТС и уже в концентрации 0,5 ммоль значительно уменьшал интенсивность флуоресценции Nile Red ((72,5 ± 1,2) %) по сравнению с контролем (p < 0,05). Гроссмизин, леукомизин и людартин в концентрации 0,5 ммоль оказывали подобный эффект, ослабляя флуоресценцию на (67,8 ± 0,8) %, (78,3 ± 0,6) % и (84,0 ± 2,4) % соотвественно (p < 0,05 во всех случаях). Гемфиброзил снижал 117 содержание липидов до (36,5 ± 3,7) % при концентрации 0,25 мМ (p < 0,05) (Таблица 31). Таблица 31 – Влияние сесквитерпеновых лактонов и препарата сравнения гемфиброзила на интенсивность флуоресценцию Nile Red в культуре гепатомы крыс НТС при культивировании клеток с липофундином 0,05 %, M ± m Концентрация препаратов n 10 мкМ 50 мкМ 75 мкМ 100 мкМ 4 4 4 4 10 мкМ 50 мкМ 100 мкМ 250 мкМ 4 4 4 4 10 мкМ 50 мкМ 100 мкМ 4 4 4 0,5 мМ 1,0 мМ 1,5 мМ 3 3 3 0,5 мМ 1,0 мМ 1,5 мМ 2,5 мМ 3 3 3 3 0,5 мМ 1,0 мМ 1,5 мМ 2,0 мМ 2,5 мМ 3 3 3 3 3 0,25 мМ 0,5 мМ 1,0 мМ 3 3 3 Интесивность флуоресценции (в % к контролю) Арглабин 99,2 ± 3,8 97,8 ± 6,3 83,8 ± 3,3 61,3 ± 2,6 Гроссгемин 99,0 ± 1,8 93,1 ± 5,6 74,1 ± 5,2 68,4 ± 5,7 Людартин 84,0 ± 2,4 69,5 ± 4,7 67,3 ± 3,6 Ахиллин 72,5 ± 1,2 70,6 ± 0,5 62,1 ± 2,1 Гроссмизин 67,8 ± 0,8 58,3 ± 5,1 56,5 ± 5,1 55,0 ± 0,6 Леукомизин 78,3 ± 0,6 76,2 ± 5,7 65,3 ± 4,8 65,0 ± 0,1 61,9 ± 2,4 Гемфиброзил 36,5 ± 3,7 29,5 ± 3,2 19,5 ± 2,5 Примечание: флуоресценцию Nile Red в контроле принимали за 100 %. p 0,889 0,781 0,020 <0,001 0,835 0,356 0,021 0,011 0,014 0,012 0,001 0,002 0,048 0,001 0,010 0,001 0,001 <0,001 0,016 0,007 0,003 0,001 0,001 <0,001 <0,001 <0,001 118 В то же время при гиперлипидемии, индуцированной инкубацией клеток в присутствии липофундина, гиполипидемическое действие сесквитерпеновых лактонов арглабина и гроссгемина проявлялось менее выражено. Арглабин в концентрации 75 мкМ снижал содержание липидов в клетках до (83,8 ± 3,3) %, а гроссгемин при концентрации 100 мкМ − до (74,1 ± 5,2) % (p < 0,05 в обоих случаях). Способность липофундина индуцировать гиперлипидемию показана не только на культуре первичных гепатоцитов in vitro, но и в экспериментах in vivo. Липофундин при введении экспериментальным животным вызывал повышение в крови уровня ТАГ, общего ХС и ХС-ЛПНП. Это обусловлено тем, что высокий уровень экзогенных ТАГ индуцирует синтез аполипопротеина В-100 (АпоВ-100) и ХС в печени, что, в свою очередь, способствует образованию и секреции ЛПОНП [181]. Механизм, с помощью которого сесквитерпеновые лактоны снижают содержание липидов в клетках крысиной гепатомы, не исследован. Вместе с тем известно, что основным механизмом гиполипидемического действия фибратов, в том числе гемфиброзила, являются снижение синтеза ТАГ и увеличение их гидролиза [136, Гемфиброзил, 189]. являясь агонистом рецептора, активирующего пролиферацию пероксисом (PPAR), действует на ядерные рецепторы, увеличивая экспрессию генов, которые регулируют синтез ключевых ферментов липидного обмена и белков метаболизма липопротеинов [136]. Снижение синтеза ТАГ происходит за счет ингибирующего влияния гемфиброзила на активность микросомальной диацилглицерол ацилтрансферазы. Наряду с этим, гемфиброзил активирует деградацию АпоВ, что приводит к снижению секреции ЛПОНП [205]. Флавоноид нарингенин, полученный из цитрусовых, снижает секрецию ЛПОНП также за счет увеличения внутриклеточной деградации АпоВ [58]. Полученные нами данные об уменьшении флуоресценции Nile Red и снижении содержания окрашенных Oil Red O липидных капель в цитозоле клеток под влиянием сесквитерпеновых лактонов могут быть обусловлены ингибированием липогенеза или повышенным 119 гидролизом ТАГ, а также снижением синтеза холестерола вследствие ингибирования ГМГ-КоА-редуктазы и образования его эфиров с жирными кислотами. Для установления молекулярных мишеней действия сесквитерпеновых лактонов на метаболизм липидов в культуре НТС необходимо в дальнейшем исследовать экспрессию генов ключевых ферментов липидного обмена. Резюме Исследуемые сесквитерпеновые лактоны (арглабин, людартин, гроссгемин, гроссмизин, ахиллин и леукомизин) способны снижать уровень триацилглицеролов, свободных жирных кислот и холестерола на модели острой гиперлипидемии, индуцированной этанолом. При этом исследуемые сесквитерпеновые лактоны оказывают влияние на разные показатели липидного обмена. Статистически значимых отличий в активности препаратов не выявлено, и на основании спиртовой модели сложно сделать вывод о преимуществах какого-либо из лактонов. Исследование влияния лактонов на показатели липидного обмена свидетельствует о способности всех лактонов снижать уровень триацилглицеролов, свободных жирных кислот и холестерола при острой гиперлипидемии, индуцированной тритоном Эффективность WR 1339. большинства лактонов сравнима с фенофибратом (препарат сравнения), что свидетельствует об их высокой гиполипидемической активности. При этом исследуемые сесквитерпеновые лактоны в зависимости от структуры оказывают влияние на разные показатели липидного обмена. Экспериментальная оценка влияния исследуемых объектов на показатели липидного обмена лабораторных животных при хронической гиперлипидемии, вызванной высокожировой диетой (45% энергии за счет животного жира), содержащей 2,5% холестерола, 0,5% холевой кислоты и 0,1% 2-тиоурацила, свидетельствуют о способности сесквитерпеновых лактонов снижать уровень триацилглицеролов, свободных жирных кислот и холестерола. Сесквитерпеновые лактоны оказывают влияние в разной степени на отдельные 120 биохимические показатели липидного обмена. В данной хронической модели, наиболее приближенной к условиям развития атеросклероза у человека, наибольшую активность проявили: арглабин, ахиллин и леукомизин, чуть меньшую – людартин, гроссмизин и гроссгемин. Следует отметить, что все лактоны проявили активность, близкую к препаратам сравнения – фенофибрату и розувастатину, незначительно уступая лишь по ряду показателей. В экспериментах in vitro сесквитерпеновые лактоны снижают содержание липидов в культуре гепатомы крыс НТС, о чем свидетельствует уменьшение флуоресценции Nile Red и окрашенных Oil Red O липидных капель в цитозоле. При этом арглабин, гроссгемин и людартин снижают флуоресценцию Nile Red в концентрации от 10 до 50 мкМ, а в концентрации 100 мкМ и выше оказывают цитотоксическое действие. Гроссмизин, ахиллин и леукомизин уменьшают содержание липидов в клеточной культуре НТС в концентрациях от 0,5 до 1,0 мМ и обладают низкой цитотоксичностью, которая проявляется при концентрации препаратов в инкубационной среде свыше 2,0 мМ. Сесквитерпеновые лактоны людартин, ахиллин, гроссмизин и леукомизин на модели гиперлипидемии, индуцированной добавлением жировой эмульсии липофундина к клеточной культуре НТС, в более низких концентрациях препятствовали накоплению липидов в клетках. Арглабин и гроссгемин на этой модели проявляли гиполипидемическое действие только в цитотоксических концентрациях. На основании интегрального анализа данных об эффективности лактонов в условиях всех четырех экспериментальных моделей можно сделать вывод о том, что все препараты проявляют гиполипидемическую активность, но механизмы этого эффекта различаются. На наш взгляд, наиболее перспективными для дальнейшего углубленного изучения являются леукомизин и ахиллин, как проявившие активность на всех моделях и имеющие низкую токсичность в опытах на культуре клеток. 121 3.5. Оценка экспрессии геновключевых ферментов липидного обмена в клеточной культуре гепатомы под влиянием сесквитерпеновых лактонов 3.5.1. Ген рецепторов к липопротеинам низкой плотности (Ldlr) Одним из процессов, определяющих уровень внутриклеточного холестерола, является его поступление в клетку в составе частиц ЛПНП путем рецептор-опосредованного пиноцитоза, осуществляемого с участием рецепторов к ЛПНП (Ldlr), расположенных на плазматической мембране гепатоцитов [93]. В результате экспериментов было установлено, что инкубация клеток гепатомы с препаратом сравнения гемфиброзилом в концентрации 250 мкМ в течение 48 ч приводила к увеличению экспрессии мРНК гена Ldlr в 2,2 раза * 2.5 2.0 * 1.5 1.0 Гемфиброзил 250 мкМ Людартин 10 мкМ Гроссмизин 500 мкМ Гроссгемин 10 мкМ Ахиллин 500 мкМ 0.0 Леукомизин 500 мкМ 0.5 Арглабин 10 мкМ Уровень экспрессии мРНК гена Ldlr (2,21 ± 0,16) усл. ед. относительно контрольных значений, р < 0,05) (Рисунок 22). Рисунок 22 – Влияние сесквитерпеновых лактонов и гемфиброзила на экспрессию мРНК гена рецепторов к ЛПНП (Ldlr) в клеточной культуре гепатомы НТС, М ± m Величина экспрессии мРНК гена Ldlr выражена в усл. ед. и нормализована по гену-рефери β-актину(Actb) и контролю (клетки инкубировали с растворителем ДМСО). Относительная экспрессия мРНК гена Ldlr в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем 122 Людартин в концентрации 10 мкМ увеличивал экспрессию мРНК гена Ldlr в клетках гепатомы в 1,4 раза ((1,42 ± 0,05) усл.ед., р < 0,05) по сравнению с контролем. Ахиллин, гроссмизин, леукомизин в концентрациях 500 мкМ, арглабин и гроссгемин в концентрации 10 мкМ не оказывали влияния на экспрессию мРНК гена Ldlr, и величина экспрессии мРНК составляла 1,31 ± 0,13; 1,26 ± 0,12; 1,13 ± 0,09; 1,21 ± 0,11 и (1,20 ± 0,09) усл. ед. соответственно (р > 0,05 во всех случаях). Известно, что фибраты повышают экспрессию Ldlr в мышиной гепатоме AML12 и увеличивает связывание ЛПНП с культивируемыми клетками [102]. Индукция экспрессии Ldlr фенофибратом зависит от PPAR-α и стерол регулирующего элемента (SRE). В основе механизма повышения экспрессии Ldlr лежат фосфорилирование протеинкиназы B (Akt) и обусловленная SREBP2 транскрипция гена [102]. В то же время нельзя исключить механизм повышения мРНК гена Ldlr под влиянием гемфиброзила в культуре гепатомы Нер2 вследствие увеличения стабилизации (периода полураспада) м-РНК гена Ldlr [94]. Анализ литературы позволяет говорить о том, что ключевой регулятор экспрессии этого гена – транскрипционный фактор стерол регулирующий элемент, связывающий белок SREBP (sterol regulatory element binding protein), образующийся из предшественника — preSREBP [20, 152, 192]. Скорость перехода предшественника в активную форму зависит от концентрации холестерола, и при его высоком уровне эта реакция подавляется [199]. Неактивный предшественник preSREBP накапливается в мембранах эндоплазматического ретикулума в комплексе с белком SCAP. При низком уровне холестерола белок SCAP обеспечивает транспорт белка preSREBP в аппарат Гольджи, где происходит протеолитическое расщепление молекулы preSREBP с образованием активного белка SREBP. Активный SREBP проникает в ядро клетки и активирует экспрессию генов, контролирующих биосинтез холестерола и его поступление из внеклеточного пространства [71, 118]. 123 Активация SREBP приводит к увеличению транскрипции рецептора ЛПНП – трансмембранного гликопротеида, имеющего апоВ- и апоЕ- лиганды, который опосредует перенос в клетку путем эндоцитоза холестерол связывающих липопротеинов, контролируя уровень холестерола в клетках и плазме. Таким образом, увеличение экспрессии мРНК гена Ldlr людартином может быть обусловлено активацией транскрипционных факторов SREBP и PPAR-α. 3.5.2. Ген 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr) Фермент 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктаза (ГМГ-КоА- редуктаза) локализован на эндоплазматическом ретикулуме и пероксисомах и лимитирует скорость биосинтеза холестерола. Этот фермент экспрессируется во всех тканях, но в наибольшем количестве в печени, которая играет центральную роль в регуляции метаболизма холестерола и его концентрации в плазме крови [193]. В результате экспериментов было установлено, что экспрессия мРНК гена Hmgcr увеличилась в 1,4 раза ((1,39 ± 0,12) усл. ед., р < 0,05) при инкубации клеток гепатомы в течение 48 ч с ахиллином (500 мкМ) и в 1,5 раза – с леукомизином ((1,52 ± 0,17) усл. ед., р < 0,05) (Рисунок 23). Арглабин ((0,92 ± 0,08) усл, ед., р > 0,05), гроссгемин ((1,08 ± 0,11) усл, ед., р > 0,05), гроссмизин ((1,13 ± 0,11) усл, ед., р > 0,05), людартин ((1,11 ± 0,10) усл, ед., р > 0,05) и препарат сравнения гемфиброзил ((1,20 ± 0,11) усл, ед., р > 0,05) не оказывали существенного влияния на экспрессию исследуемого гена по сравнению с контролем (Рисунок 23). SREBPs – мембраносвязанные транскрипционные факторы, которые транскрипционально регулируют Hmgcr и другие ферменты пути биосинтеза холестерола вместе с генами, кодирующими рецептор к ЛПНП и сам SREBP-2 [159]. 2.0 * * 1.5 1.0 Гемфиброзил 250 мкМ Людартин 10 мкМ Гроссмизин 500 мкМ Гроссгемин 10 мкМ Ахиллин 500 мкМ 0.0 Леукомизин 500 мкМ 0.5 Арглабин 10 мкМ Уровень экспрессии мРНК гена Hmgcr 124 Рисунок 23 – Влияние сесквитерпеновых лактонов и гемфиброзила на экспрессию мРНК гена 3-гидрокси 3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr) в клеточной культуре гепатомы НТС, М ± m Величина экспрессии мРНК гена Hmgcr выражена в усл. ед. и нормализована по гену-рефери β-актину (Actb) и контролю (клетки инкубировали с растворителем ДМСО). Относительная экспрессия мРНК гена Hmgcr в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем Показано, что конкурентное ингибирование симвастатином фермента ГМГ-КоА-редуктазы в культуре гепатомы человека запускает скоординированную регуляцию экспрессии генов, кодирующих ГМГ-КоАредуктазу и рецептор к ЛПНП. Ингибирование ГМГ-КоА-редуктазы in vivo статинами вызывает комплексный ответ, сопровождающийся повышением экспрессии генов Hmgcr и рецепторов к ЛПНП [93]. Рост количества рецепторов к ЛПНП способствует увеличению захвата богатых холестеролом ЛПНП из кровеносного русла и по отрицательной обратной связи снижению экспрессии генов Hmgcr. В отличие от этого, в экспериментах in vitro при культивировании клеток гепатомы в среде, не 125 содержащей сыворотку, уровень холестерола в клетках определяется только эндогенным синтезом, а снижение холестерологенеза под действием препаратов приводит к быстрой индукции рецепторов к ЛПНП. В экспериментах in vivo другие факторы, такие как снижение образования ЛПНП или усиление поглощения клетками ЛППП, вносят свой вклад в гипохолестеролемический эффект препаратов [151]. Повышение экспрессии мРНК гена 3-гидрокси-3-метилглутарил КоАредуктазы (Hmgcr) в клеточной культуре гепатомы НТС под действием леукомизина подтверждает показанную нами ранее способность данного лактона ингибировать активность ключевого фермента синтеза ХС [1]. Известно, что снижение уровня ХС по принципу отрицательной обратной связи приводит к увеличению экспрессии гена данного ферманта [93]. 3.5.3. Ген ацил КоА-холестерол ацилтрансферазы (Soat1) Ацил КоА-холестерол ацилтрансфераза (Soat1) – фермент, катализирующий образование эфиров холестерола из холестерола [117]. Установлено, что культивирование клеточной культуры НТС с препаратом сравнения гемфиброзилом приводило к снижению экспрессии мРНК гена Soat1 на 40% ((0,61 ± 0,07) усл. ед., р < 0,05) (Рисунок 24). Еще более выраженное снижение экспрессии данного гена в клеточной культуре НТС вызывал леукомизин в концентрации 500 мкМ ((0,43 ± 0,04) усл. ед., р < 0,05). Гроссгемин и гроссмизин уменьшали экспрессию мРНК Soat1 на 30% ((0,72 ± 0,08) усл. ед., р < 0,05) и 20% ((0,80 ± 0,07) усл. ед., р < 0,05) по сравнению с контролем. Арглабин ((1,10 ± 0,09) усл. ед., р > 0,05), ахиллин ((0,89 ± 0,09) усл. ед., р > 0,05) и людартин ((1,06 ± 0,09) усл. ед., р > 0,05) не оказывали влияние на экспрессию мРНК исследуемого гена. 1.5 * 1.0 * * Гемфиброзил 250 мкМ Людартин 10 мкМ Гроссмизин 500 мкМ Гроссгемин 10 мкМ Ахиллин 500 мкМ 0.0 Леукомизин 500 мкМ * 0.5 Арглабин 10 мкМ Уровень экспрессии мРНК гена Soat1 126 Рисунок 24 – Влияние сесквитерпеновых лактонов и гемфиброзила на экспрессию мРНК гена ацилКоА-холестерол ацилтрансферазы (Soat1) в клеточной культуре гепатомы НТС, М ± m Величина экспрессии мРНК гена Soat1выражена в усл. ед. и нормализована по гену-рефери β-актину (Actb) и контролю (клетки инкубировали с растворителем ДМСО). Относительная экспрессия мРНК гена Soat1 в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем Таким образом, ингибиторы ацилКоА-холестерол ацилтрансферазы снижают уровень холестерола в плазме, уменьшая абсорбцию поступающего с пищей холестерола и подавляя образование и секрецию аполипопротеин В содержащих липопротеинов, таких как ЛПОНП в печени и хиломикронов в кишечнике [126]. 3.5.4. Ген холестерол 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1) Печень устраняет избыток холестерола из организма путем непосредственной секреции в желчь или после преобразования его в желчные кислоты через ферментативные пути, на которые оказывает влияние фермент, лимитирующий скорость синтеза желчных кислот – холестерол 7α-гидроксилаза (Cyp7a1) [61, 161]. 127 В результате экспериментов нами было установлено, что культивирование клеток с препаратом сравнения гемфиброзилом (250 мкМ) приводило к снижению экспресии мРНК Cyp7a1 на 25% и величина экспрессии составляла 6 * 5 4 3 * * * * 2 Людартин 10 мкМ Леукомизин 500 мкМ Гроссмизин 500 мкМ Гроссгемин 10 мкМ Ахиллин 500 мкМ 0 Гемфиброзил 250 мкМ * 1 Арглабин 10 мкМ Уровень экспрессии мРНК гена Cyp7a1 (0,75 ± 0,06) усл. ед. (р < 0,05) (Рисунок 25). Рисунок 25 – Влияние сесквитерпеновых лактонов и гемфиброзила на экспрессию мРНК гена холестерин 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1) в клеточной культуре гепатомы НТС, М ± m. Величина экспрессии мРНК гена Cyp7a1 выражена в усл. ед. и нормализована по гену-рефери β-актину (Actb) и контролю (клетки инкубировали с растворителем ДМСО). Относительная экспрессия мРНК гена Cyp7a1 в контроле принята за единицу. * р < 0,05 – по сравнению с контролем Действительно, ранее было показано, что фибраты, в том числе гемфиброзил, уменьшают экспрессию мРНК гена Cyp7a1 у пациентов с гиперлипидемией [123, 158] и в клеточной культуре гепатомы HepG2 [89]. Уменьшение экспрессии мРНК гена Cyp7a1 способствует снижению синтеза и секреции желчных кислот, что приводит к повышению литогенности желчи, т.е. 128 к риску образования желчных камней [158]. Поэтому гемфиброзил противопоказан больным с желчнокаменной болезнью. Исследуемые лактоны, за исключением леукомизина ((0,96 ± 0,08) усл. ед., р > 0,05), напротив, повышали экспрессию мРНК исследуемого гена в сравнении с контролем. Гроссгемин в наибольшей степени (4,7 раза) увеличивал экспрессию гена Cyp7a1 ((4,68 ± 0,46) усл. ед., р < 0,05). Гроссмизин повышал экспрессию мРНК Cyp7a1 в 2,8 раза ((2,79 ± 0,26) усл. ед., р < 0,05), ахиллин и людартин – в 2,6 раза (2,56 ± 0,23 и (2,64 ± 0,26) усл. ед. соответственно, р < 0,05). 3.5.5. Гены карнитин-пальмитоилтрансферазы 1и 2 (Cpt1a и Cpt2) Жирные кислоты с длинной углеводородной цепью переносятся через внутреннюю мембрану митохондрий с помощью карнитина. Карнитинпальмитоилтрансфераза 1 (Cpt1a) является ферментом, регулирующим скорость окисления длинноцепочечных жирных кислот в митохондриях. Этот фермент расположен на внешней мембране митохондрий и осуществляет транспорт длинноцепочечных жирных кислот в митохондрии, катализируя реакцию с образованием ацилкарнитина [57]. Образовавшийся ацилкарнитин проходит через межмембранное пространство к наружной стороне внутренней мембраны и транспортируется с помощью карнитин-ацил-карнитинтранслоказы на внутреннюю поверхность внутренней мембраны митохондрий, где фермент карнитин-пальмитоилтрансфераза 2 (Cpt2) катализирует перенос ацила на пул внутримитохондриального КоА [57]. Поэтому нами была исследована экспрессия мРНК обоих генов ферментов, участвующих в катаболизме жирных кислот. Наибольшая величина в экспрессии мРНК гена Cpt1a наблюдалась при культивировании клеток (Рисунок 26). Экспресия (3,39 ± 0,10) усл. ед. НТС с препаратом сравнения гемфиброзилом гена увеличивалась в 3,4 раза и (р < 0,05). Леукомизин повышал составляла экспрессию мРНК исследуемого гена в клетках гепатомы в 2,8 раза ((2,81 ± 0,14) усл. ед., р < 0,05), 129 гроссмизин в 1,8 раза ((1,80 ± 0,10) усл. ед., р < 0,05), а гроссгемин – в 1,6 раза ((1,59 ± 0,07) усл. ед., р < 0,05). Арглабин и ахиллин в исследуемых концентрациях не оказывали существенного влияния на экспрессию мРНК гена карнитин-пальмитоилтрансфераза 1 и (0,96 ± 0,08 (1,13 ± 0,06) усл. ед. 4.0 * 3.5 * 3.0 2.5 * 2.0 * 1.5 1.0 Гемфиброзил 250 мкМ Людартин 10 мкМ Леукомизин 500 мкМ Гроссмизин 500 мкМ Гроссгемин 10 мкМ 0.0 Ахиллин 500 мкМ 0.5 Арглабин 10 мкМ Уровень экспрессии мРНК гена Cpt1a соответственно, р > 0,05 в обоих случаях) (Рисунок 26). Рисунок 26 – Влияние сесквитерпеновых лактонов и гемфиброзила на экспрессию мРНК гена карнитин-пальмитоилтрансфераза 1 (Cpt1a) в клеточной культуре гепатомы НТС, М ± m Величина экспрессии мРНК гена Cpt1a выражена в усл. ед. и нормализована по гену-рефери β-актину (Actb) и контролю (клетки инкубировали с растворителем ДМСО). Относительная экспрессия мРНК гена Cpt1a в контроле принята за единицу. * – р < 0,05. по сравнению с контролем На экспрессию мРНК гена карнитин-пальмитоилтрансфераза 2 исследуемые вещества оказывали менее выраженное влияние (Рисунок 27). Гемфиброзил увеличивал экспрессию мРНК гена Cpt2 в 1,8 раза ((1,81 ± 0,14) усл. ед., р < 0,05), гроссмизин – в 1,7 раза ((1,74 ± 0,12) усл. ед., р < 0,05), леукомизин и 130 людартин – в 1, 6 раза (1,64 ± 0,10 и (1,59 ± 0,07) усл. ед. соответственно, р < 0,05). Ахиллин повышал величину экспрессию мРНК исследуемого гена в 1,5 раза ((1,55 ± 0,14) усл. ед., р < 0,05), а арглабин не влиял на экспрессию 2.5 * * Людартин 10 мкМ * Леукомизин 500 мкМ * * 2.0 1.5 1.0 Гемфиброзил 250 мкМ Гроссмизин 500 мкМ Гроссгемин 10 мкМ 0.0 Ахиллин 500 мкМ 0.5 Арглабин 10 мкМ Уровень экспрессии мРНК гена Cpt2 мРНК гена Cpt2 ((1,20 ± 0,09) усл. ед., р > 0,05) (Рисунок 27). Рисунок 27 – Влияние сесквитерпеновых лактонов и гемфиброзила на экспрессию мРНК гена карнитин-пальмитоилтрансфераза 2 (Cpt2) в клеточной культуре гепатомы НТС, М ± m Величина экспрессии мРНК гена Cpt2 выражена в усл. ед. и нормализована по гену-рефери β-актину (Actb) и контролю (клетки инкубировали с растворителем ДМСО). Относительная экспрессия мРНК гена Cpt2в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем Известно, что в результате активации PPAR-α происходит увеличение экспрессии генов ферментов, вовлеченных в окисление длинноцепочечных жирных кислот. Напротив, у животных, получавших с обычным кормом холестерол (1%), наблюдается снижение количества мРНК Cpt1a и Cpt2 [193]. Это свидетельствует о том, что при кормлении крыс холестеролом происходит снижение катаболизма жирных кислот, что может быть причиной повышения уровня триацилглицеролов в печени [193]. 131 3.5.6. Ген ацетил-КоА карбоксилазы (Acaca) Ацетил-КоА карбоксилаза (Acaca) – ключевой фермент синтеза жирных кислот, катализирующий карбоксилирование ацетил-КоА с образованием малонил-КоА. Увеличение экспрессии мРНК гена Acaca может быть обусловлено снижением субстрата ацетил-КоА, необходимого для синтеза малонил-КоА, поскольку выявленное нами увеличение экспресии генов Cpt1a и Cpt2 (Рисунки 26, 27) усиливает β-окисление жирных кислот [130]. Установлено, что гемфиброзил увеличивал экспрессию мРНК гена фермента ацетил-КоА карбоксилазы в клетках гепатомы НТС в 1,6 раза ((1,62 ± 0,14) усл. ед., р < 0,05) (Рисунок 28). Арглабин (10 мкМ) в меньшей степени (в 1,3 раза) повышал экспрессию исследуемого гена * 2.0 1.5 * 1.0 * * Гемфиброзил 250 мкМ Людартин 10 мкМ Леукомизин 500 мкМ Гроссмизин 500 мкМ Гроссгемин 10 мкМ 0.0 Ахиллин 500 мкМ 0.5 Арглабин 10 мкМ Уровень экспрессии мРНК гена Acaca ((1,30 ± 0,12) усл. ед., р < 0,05). Рисунок 28 – Влияние сесквитерпеновых лактонов и гемфиброзила на экспрессию мРНК гена ацетил-КоА карбоксилазы (Acaca) в клеточной культуре гепатомы НТС, М ± m Величина экспрессии мРНК гена Acaca выражена в усл. ед. и нормализована по гену-рефери β-актину (Actb) и контролю (клетки инкубировали с растворителем ДМСО). Относительная экспрессия мРНК гена Acaca в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем 132 Гроссмизин и людартин, напротив, снижали экспрессию мРНК гена Acacaна на 44% ((0,56 ± 0,05) усл. ед., р < 0,05) и 36% ((0,64 ± 0,06) усл. ед., р < 0,05). Ахиллин и леукомизин не оказывали влияния на экспрессию исследуемого гена ((0,93 ± 0,09) усл. ед. и (1,02 ± 0,09) усл. ед. соответственно, р > 0,05 в обоих случаях). Таким образом, гиполипидемическое действие сесквитерпеновых лактонов гроссмизина и людартина на клеточной культуре гепатомы может быть обусловлено ингибированием синтеза жирных кислот в клетках (снижение экспрессии мРНК гена ацетил-КоА карбоксилазы (Acaca)), Обсуждение результатов по скринингу гиполипидемической активности (1-й этап исследования) Показано, что исследуемые сесквитерпеновые лактоны (арглабин, людартин, гроссгемин, гроссмизин, ахиллин и леукомизин) на моделях острой гиперлипидемии, индуцированной этанолом и тритоном WR 1339, и на модели хронической гиперлипидемии, вызванной высокожировой диетой, содержащей холестерол, способны снижать уровень триацилглицеролов, свободных жирных кислот и холестерола. При этом исследуемые сесквитерпеновые лактоны оказывают влияние на разные показатели липидного обмена. В экспериментах in vitro сесквитерпеновые лактоны также снижали содержание липидов в культуре гепатомы крыс НТС, о чем свидетельствует уменьшение флуоресценции Nile Red и окрашенных Oil Red O липидных капель в цитозоле. Результаты оценки эффективности лактонов на экспериментальных моделях in vitro и in vivo позволили предполагать, что механизмы гиполипидемической активности исследуемых веществ различаются. Для установления молекулярных механизмов гиполипидемического действия сесквитерпеновых лактонов было изучено их влияние на экспрессию генов, регулирующих метаболизм липидов. 133 Несмотря на существование множества различных генов, вовлеченных в соответствующие молекулярные каскады метаболизма жирных кислот, жиров и холестерола, полиморфизмы только немногих из таких генов достоверно ассоциированы с развитием атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний [33]. В настоящей работе проанализировано влияние сесквитерпеновых лактонов (арглабина, ахиллина, гроссгемина, гроссмизина, леукомизина и людартина) на экспрессию мРНК генов: 1. метаболизма холестерола: – рецептор к ЛПНП (Ldlr); – ключевого фермента синтеза холестерола 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА редуктазы (Hmgcr); – фермента, катализирующего образование эфиров холестерола, ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1); – фермента, регулирующего скорость синтеза желчных кислот, 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1); 2. катаболизма жирных кислот: – фермента, регулирующего скорость окисления митохондриями длинноцепочечных жирных кислот, карнитин-пальмитоилтрансферазы 1 (Cpt1a); – фермента, катализирущего перенос ацила на внутримитохондриальный КоА, карнитин-пальмитоилтрансферазы 2 (Cpt2); 3. синтеза жирных кислот и триацилглицеролов: – ключевогофермента синтеза жирных кислот и триацилглицеролов ацетил-КоАкарбоксилазы (Acaca). Гемфиброзил относится к дериватам фиброевой кислоты – группе гиполипидемических липопротеиновых препаратов, влияющих преимущественно на обмен частиц, богатых триглицеридами (хиломикроны, 134 липопротеины очень низкой и промежуточной плотности). Фибраты являются агонистами ядерных α-рецепторов, активирующих пролиферацию пероксисом (PPARα) [182], и их гиполипидемическое действие обусловлено несколькими механизмами [175]. На клеточной культуре гепатомы гемфиброзил индуцирует β-окисление жирных кислот, о чем свидетельствует увеличение экспрессии мРНК генов Cpt1aи Cpt2 с сопутствующим уменьшением синтеза жирных кислот и ТАГ Уровень экспрессии мРНК генов (Рисунок 29). * 4.0 3.5 3.0 * 2.5 * * 2.0 1.5 * 1.0 * 0.5 0.0 Ldlr Hmgcr Soat1 Cyp7a1 Acaca Cpt1a Cpt2 Рисунок 29 – Влияние гемфиброзила (250 мкМ) на экспрессию мРНК генов метаболизма липидов в клеточной культуре гепатомы НТС. Величина экспрессии мРНК генов выражена в усл. ед. и нормализована по генурефери β-актину (Actb) и контролю (клетки инкубировали с растворителем ДМСО). Относительная экспрессия мРНК генов в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем Ldlr – рецептор к ЛПНП; Hmgcr – 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктаза; Soat1 – ацилКоА-холестерол ацилтрансфераза; Cyp7a1 – 7-альфа-гидроксилаза; Cpt1a – карнитин-пальмитоилтрансфераза 1; Cpt2 – карнитинпальмитоилтрансфераза 2; Acaca – ацетил-КоА карбоксилаза Ингибирование ацилтрансферазы экспресии (Soat1) приводит мРНК к гена уменьшению ацилКоА холестерол образования эфиров 135 холестерола; увеличение экспрессии мРНК гена рецепторов к ЛПНП (Ldlr) способствует извлечению из циркуляции в крови атерогенных ЛПНП. В то же время, снижение экспрессии мРНК гена 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1) приводит к уменьшению синтеза и секреции желчных кислот, что может привести к развитию желчнокаменной болезни и ограничивает применение фибратов. Сесквитерпеновый лактон арглабин на клеточной культуре увеличивает экспрессию мРНК рецепторов к ЛПНП (Ldlr), что способствует снижению атерогенных ЛПНП (Рисунок 30). Наряду с этим, арглабин увеличивает экспрессию гена 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1), что может способствовать Уровень экспрессии мРНК генов синтезу желчных кислот и экскреции холестерола с желчью. 2.5 2.0 1.5 * * 1.0 0.5 0.0 Ldlr Hmgcr Soat1 Cyp7a1 Acaca Cpt1a Cpt2 Рисунок 30 – Влияние арглабина (10 мкМ) на экспрессию мРНК генов метаболизма липидов в клеточной культуре гепатомы НТС. Величина экспрессии мРНК генов выражена в усл. ед. и нормализована по генурефери β-актину (Actb) и контролю (клетки инкубировали с растворителем ДМСО). Относительная экспрессия мРНК генов в контроле принята за единицу. р < 0,05 по сравнению с контролем. Ldlr – рецептор к ЛПНП; Hmgcr –3-гидрокси-3-метилглутарил КоА редуктаза; Soat1 – ацилКоА холестерол ацилтрансфераза; Cyp7a1 –7-альфа-гидроксилаза; Cpt1a – карнитин-пальмитоилтрансфераза 1; Cpt2 – карнитинпальмитоилтрансфераза 2; Acaca– ацетил-КоА карбоксилаза 136 Возможный механизм гиполипидемического действия ахиллина обусловлен увеличением окисления длинноцепочечных жирных кислот в митохондриях, о чем свидетельствует повышение экспрессии мРНК генакарнитин- пальмитоилтрансферазы (Cpt2) (Рисунок 31). Снижение уровня холестерола может быть связано с повышенной экскрецией его желчью вследствие повышенной экспрессии гена 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1). Увеличение экспрессии гена 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr) может быть вызвано снижением уровня холестерола в клетках гепатомы по механизму Уровень экспрессии мРНК генов отрицательной обратной связи. * 3.0 2.5 2.0 * * 1.5 1.0 0.5 0.0 Ldlr Hmgcr Soat1 Cyp7a1 Acaca Cpt1a Cpt2 Рисунок 31 – Влияние ахиллина (500 мкМ) на экспрессию мРНК генов метаболизма липидов в клеточной культуре гепатомы НТС. Величина экспрессии мРНК генов выражена в усл. ед. и нормализована по генурефери β-актину (Actb) и контролю (клетки инкубировали с растворителем ДМСО). Относительная экспрессия мРНК генов в контроле принята за единицу. – р < 0,05 по сравнению с контролем. Ldlr – рецептор к ЛПНП; Hmgcr –3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктаза; Soat1 – ацилКоА холестерол ацилтрансфераза; Cyp7a1 – 7-альфагидроксилаза; Cpt1a – карнитин-пальмитоилтрансфераза 1; Cpt2 – карнитинпальмитоилтрансфераза 2; Acaca – ацетил-КоА карбоксилаза 137 Гиполипидемическое действие сесквитерпенового лактона гроссгемина на клетках гепатомы обусловлено, главным образом, значительным повышением экспрессии гена 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1), увеличением синтеза желчных кислот из холестерола и выведением последнего с желчью (Рисунок 32). Кроме того, повышается окисление длинноцепочечных жирных кислот (увеличивается экспрессия мРНК гена Cpt1a) и снижается образование эфиров холестерола (снижение экспрессии гена Soat1), что, как известно, приводит к снижению Уровень экспрессии мРНК генов сборки апоВ100-содержащих липопротеинов [117]. 6 * 5 4 3 * 2 1 * 0 Ldlr Hmgcr Soat1 Cyp7a1 Acaca Cpt1a Cpt2 Рисунок 32 – Влияние гроссгемина (10 мкМ) на экспрессию мРНК генов метаболизма липидов в клеточной культуре гепатомы НТС. Величина экспрессии мРНК генов выражена в усл. ед. и нормализована по генурефери β-актину (Actb) и контролю (клетки инкубировали с растворителем ДМСО). Относительная экспрессия мРНК генов в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем. Ldlr – рецептор к ЛПНП; Hmgcr –3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктаза; Soat1 – ацилКоА холестерол ацилтрансфераза; Cyp7a1 – 7-альфа-гидроксилаза; Cpt1a – карнитин-пальмитоилтрансферазы 1; Cpt2 – карнитинпальмитоилтрансфераза 2; Acaca – ацетил-КоА-карбоксилаза; На клеточной культуре гепатомы гроссмизин индуцирует окисление жирных кислот (увеличение экспрессии мРНК генов Cpt1a и Cpt2) и ингибирует их синтез (снижение экспрессии ацетил-КоА-карбоксилазы) (Рисунок 33). Уровень экспрессии мРНК генов 138 3.5 * 3.0 2.5 * 2.0 1.5 * * 1.0 * 0.5 0.0 Ldlr Hmgcr Soat1 Cyp7a1 Acaca Cpt1a Cpt2 Рисунок 33 – Влияние гроссмизина (10 мкМ) на экспрессию мРНК генов метаболизма липидов в клеточной культуре гепатомы НТС. Величина экспрессии мРНК генов выражена в усл. ед. и нормализована по гену-рефери β-актину (Actb) и контролю (клетки инкубировали с растворителем ДМСО). Относительная экспрессия мРНК генов в контроле принята за единицу * – р< 0,05 по сравнению с контролем, Ldlr –рецептор к ЛПНП; Hmgcr –3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктаза; Soat1 – ацилКоА холестерол ацилтрансфераза; Cyp7a1 – 7-альфа-гидроксилаза; Cpt1a – карнитин-пальмитоилтрансферазы 1; Cpt2 – карнитинпальмитоилтрансфераза 2; Acaca– ацетил-КоА-карбоксилаза; Ингибирование экспресии мРНК гена ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1) может привести к снижению образования апоВ100содержащих липопротеинов, а увеличение экспресии мРНК гена 7-альфагидроксилазы (Cyp7a1) способствует выведению холестерола с желчью. Сесквитерпеновый лактон леукомизин на клеточной культуре гепатомы НТС повышал экспрессию генов, способствующих окислению длинноцепочечных жирных кислот (Cpt1aи Cpt2) (Рисунок 34), значительно снижал величину экспрессии ацилКоА холестерол ацилтрансферазы, приводило к снижению содержания эфиров холестерола и упаковке ЛПОНП. что Уровень экспрессии мРНК генов 139 4.0 3.5 * 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 * * * 0.5 0.0 Ldlr Hmgcr Soat1 Cyp7a1 Acaca Cpt1a Cpt2 Рисунок 34 –Влияние леукомизина (500 мкМ) на экспрессию мРНК генов метаболизма липидов в клеточной культуре гепатомы НТС. Величина экспрессии мРНК генов выражена в усл. ед. и нормализована по генурефери β-актину (Actb) и контролю (клетки инкубировали с растворителем ДМСО). Относительная экспрессия мРНК генов в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем. Ldlr – рецептор к ЛПНП; Hmgcr – 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктаза; Soat1 – ацилКоА холестерол ацилтрансфераза; Cyp7a1 – 7-альфа-гидроксилаза; Cpt1a – карнитин-пальмитоилтрансферазы 1; Cpt2 – карнитинпальмитоилтрансферазы 2; Acaca – ацетил-КоА карбоксилаза Повышение экспрессии мРНК гена 3-гидрокси-3-метилглутарил КоАредуктазы (Hmgcr) в клеточной культуре гепатомы НТС под действием леукомизина может быть обусловлено снижением уровня холестерола в клетках вследствие ингибирования активности фермента, что по принципу отрицательной обратной связи приводит к увеличению экспрессии гена данного фермента [93]. Гиполипидемическое действие сесквитерпенового лактона людартина на клеточной культуре гепатомы может быть обусловлено ингибированием синтеза жирных кислот в клетках (снижение экспрессии мРНК гена ацетил-КоАкарбоксилазы (Acaca)), а также повышенным выведением холестерола с желчью (повышение экспрессии мРНК гена Cyp7a1). Кроме того, повышенная 140 экспрессия гена рецепторов к ЛПНП может приводить к уменьшению их Уровень экспрессии мРНК генов содержания в сыворотке крови (Рисунок 35). 3.5 * 3.0 2.5 2.0 * * 1.5 * 1.0 0.5 0.0 Ldlr Hmgcr Soat1 Cyp7a1 Acaca Cpt1a Cpt2 Рисунок 35 – Влияние людартина (10 мкМ) на экспрессию мРНК генов метаболизма липидов в клеточной культуре гепатомы НТС. Величина экспрессии мРНК генов выражена в усл. ед. и нормализована по генурефери β-актину (Actb) и контролю (клетки инкубировали с растворителем ДМСО). Относительная экспрессия мРНК генов в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем. Ldlr – рецептор к ЛПНП; Hmgcr –3-гидрокси-3-метилглутарил КоА редуктаза; Soat1 – ацилКоА холестерол ацилтрансфераза; Cyp7a1 –7-альфа-гидроксилаза; Cpt1a – карнитин-пальмитоилтрансферазы 1; Cpt2 – карнитинпальмитоилтрансферазы 2; Acaca – ацетил-КоА карбоксилаза В результате проведенного исследования установлено, что сесквитерпеновые лактоны влияли на экспресиию ключевых генов обмена липидов следующим образом: 1. Арглабин на клеточной культуре гепатомы НТС увеличивает экспрессию мРНК гена рецептора к ЛПНП (Ldlr) и гена 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1). 2. Ахиллин на клеточной культуре гепатомы НТС повышает экспрессию мРНК генакарнитин-пальмитоилтрансферазы 2 (Cpt2), гена 7-альфа- 141 гидроксилазы (Cyp7a1) и гена 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr). 3. Сесквитерпеновый лактон гроссгемин на клеточной культуре гепатомы НТС повышает экспрессию мРНК гена 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1), гена карнитин-пальмитоилтрансферазы 1 (Cpt1a) и снижает экспрессию гена ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1). 4. Сесквитерпеновый лактон гроссмизин на клеточной культуре гепатомы НТС увеличивает экспрессию мРНК гена карнитин-пальмитоилтрансферазы 1 (Cpt1a), гена карнитин-пальмитоилтрансферазы 2 (Cpt2), гена 7-альфа- гидроксилазы (Cyp7a1) и снижает экспрессию гена ацетил-КоА карбоксилазы (Acaca) и гена ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1). 5. Сесквитерпеновый лактон леукомизин на клеточной культуре гепатомы НТС повышает экспрессию мРНК гена карнитин-пальмитоилтрансферазы 1 (Cpt1a), гена карнитин-пальмитоилтрансферазы 2 (Cpt2), гена 3-гидрокси-3метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr) и значительно снижает величину экспрессии гена ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1). 6. Сесквитерпеновый лактон людартин на клеточной культуре гепатомы НТС снижает экспрессию мРНК гена ацетил-КоА-карбоксилазы (Acaca), повышает экспрессию мРНК гена 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1) и гена рецептора к ЛПНП (Ldlr). 142 Резюме по скринингу гиполипидемической активности Результаты первого этапа настоящего исследования - скрининга гиполипидемической активности исследуемых сесквитерпеновых лактонах (арглабин, людартин, гроссгемин, гроссмизин, ахиллин и леукомизин) на моделях in vitro и in vivo, а также результаты влияния лактонов на экспрессию генов ключевых ферментов обмена липидов и холестерола позволяют сделать вывод об эффективности лактонов. Результаты скрининга фармакологической активности позволяют ранжировать исследуемые сесквитерпеновые лактоны по эффективности в следующий ряд: леукомизин > ахиллин > гроссмизин > арглабин > гроссгемин > людартин Наибольшую активность проявил леукомизин, затем два близких соединения ахиллин и гроссмизин (гидроксиахиллин). Арглабин, гроссгемин и людартин проявили относительно меньшую активность и (или) большую токсичность в экспериментах на культуре клеток. Таким образом, на втором этапе исследования было проведено углубленное изучение механизмов гиполипидемического действия леукомизина, считая данное вещество перспективным для создания лекарственного средства. 143 ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СЕСКВИТЕРПЕНОВЫХ ЛАКТОНОВ (2-Й ЭТАП ИССЛЕДОВАНИЯ) 4.1. Влияние сесквитерпеновых лактонов на экспрессию генов ключевых ферментов липидного обмена в печени крыс на модели гиперлипидемии у экспериментальных животных, вызванной атерогенной диетой 4.1.1. Ген рецепторов к липопротеинам низкой плотности (Ldlr) Одним из процессов, определяющих уровень внутриклеточного ХС, является его поступление в клетку в составе частиц липопротеинов низкой плотности путем рецептор-опосредованного пиноцитоза, осуществляемого с участием рецепторов к ЛПНП (Ldlr), расположенных на плазматической мембране гепатоцитов [93]. В результате экспериментов было установлено, что атерогенная диета приводила к снижению величины экспрессии мРНК гена рецепторов к ЛПНП на 60% ((0,40 ± 0,04) усл. ед.) относительно контроля, р < 0,05) (Рисунок 36). Известно, что снижение величины экспрессии мРНК гена рецепторов к ЛПНП в этих условиях является одной из причин увеличения циркулирующих в крови атерогенных ЛПНП [93]. Препараты сравнения из групп фибратов (фенофибрат) и статинов (розувастатин) препятствовали снижению величины экспрессии мРНК гена Ldlr, с чем связывают один из механизмов их гиполипидемического действия [102]. Величина экспрессии мРНК гена рецепторов к ЛПНП при применении розувастатина составляла (1,13 ± 0,11) усл. ед., фенофибрата – (1,01 ± 0,09) усл. ед., что не отличалось от величины экспрессии мРНК гена Ldlrв печени интактных животных. Исследуемые сесквитерпеновые лактоны, подобно препаратам сравнения, также препятствовали снижению величины экспрессии мРНК гена Ldlr в печени 144 крыс при атерогенной диете, и значения этого параметра составляли (0,95 ± 0,12) усл. ед. (арглабин), (0,89 ± 0,10) усл. ед. (ахиллин), (1,15 ± 0,14) усл. ед. (гроссгемин), (1,01 ± 0,13) усл. ед. (гроссмизин), (1,21 ± 0,13) усл. ед. (леукомизин) и (0,93 ± 0,11) усл. ед. (людартин) и не отличались от величины экспрессии мРНК гена Ldlr в печени животных, получавших стандартный лабораторный 1.5 # 1.0 0.5 # # # # # # # * Розувастатин Фенофибрат Людартин Леукомизин Гроссмизин Гроссгемин Ахиллин Арглабин 0.0 Атерогенная диета Уровень экспрессии мРНК гена Ldlr корм (Рисунок 36). Рисунок 36 – Влияние сесквитерпеновых лактонов, фенофибрата и розувастатина на экспрессию мРНК гена рецепторов к ЛПНП (Ldlr) в печени крыс при атерогенной диете, М ± m. Величина экспрессии мРНК гена Ldlr выражена в усл. ед. и нормализована по гену-рефери β-актину (Actb) и контролю (стандартная диета). Относительная экспрессия мРНК гена Ldlr в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем; # – р < 0,05 по сравнению с атерогенной диетой 4.1.2. Ген 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr) Фермент 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктаза (ГМГ-КоА редуктаза) локализован на эндоплазматическом ретикулуме и пероксисомах и лимитирует скорость биосинтеза холестерола. 145 Этот фермент экспрессируется во всех тканях, но в наибольшем количестве в печени, которая играет центральную роль в регуляции метаболизма холестерола и его концентрации в плазме крови [193]. В результате экспериментов было установлено, что экспрессия мРНК гена Hmgcr при атерогенной диете снижалась на 29% (р < 0,05) и составляла (0,71 ± 0,08) усл, ед. (Рисунок 37). Известно, что конечный продукт метаболического пути – холестерол регулирует скорость транскрипции гена ГМГ-КоА-редуктазы по принципу отрицательной обратной связи. Поэтому снижение величины экспрессии в печени гена ГМГ-КоА-редуктазы при атерогенной диете обусловлено значительным увеличением содержания холестерола в гепатоцитах. Фенофибрат препятствовал снижению величины экспрессии мРНК гена Hmgcr в печени животных при атерогенной диете, и она составляла (1,21 ± 0,10) усл. ед. (р < 0,05) (Рисунок 37). Это значение не отличалось от величины экспрессии мРНК гена ГМГ-КоА-редуктазы в печени животных, получавших стандартный корм. Розувастатин повышал величину экспрессии мРНК гена Hmgcrв 1,8 раза ((1,82 ± 0,17) усл. ед., р < 0,05) (Рисунок 37). Известно, что ингибирование ГМГ-КоА-редуктазы in vivo статинами вызывает комплексный ответ, сопровождающийся повышением экспрессии генов ГМГ-КоА-редуктазы и рецепторов к ЛПНП [93]. Гроссгемин и леукомизин на фоне атерогенной диеты, подобно розувастатину, способствовали увеличению экспрессии мРНК гена ГМГ-КоА-редуктазы в 1,3 раза ((1,34 ± 0,07) усл, ед., р < 0,05) и 1,5 раза ((1,46 ± 0,13) усл, ед., р < 0,05), что может быть обусловлено ингибированием активности данного фермента. Повышение экспрессии мРНК гена 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr) в печени животных под действием леукомизина подтверждает показанную нами ранее способность данного лактона ингибировать активность ключевого фермента синтеза холестерола [1]. 2.5 *# 2.0 * 1.5 1.0 *# # # # # * Розувастатин Фенофибрат Людартин Гроссмизин Гроссгемин Ахиллин Арглабин 0.0 Леукомизин 0.5 Атерогенная диета Уровень экспрессии мРНК гена Hmgcr 146 Рисунок 37 – Влияние сесквитерпеновых лактонов, фенофибрата и розувастатина на экспрессию мРНК гена 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr) в печени крыс при атерогенной диете, М ± m. Величина экспрессии мРНК гена Hmgcr выражена в усл. ед. и нормализована по гену-рефери β-актину (Actb) и контролю (стандартная диета). Относительная экспрессия мРНК гена Hmgcr в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем; # – р < 0,05 по сравнению с атерогенной диетой Арглабин, ахиллин, гроссмизин, людартин, как и фенофибрат, препятствуют снижению величины экспрессии мРНК гена Hmgcr в печени крыс при атерогенной диете, и она составляла соответственно 0,88 ± 0,10; 1,10 ± 0,14; 0,99 ± 0,06 и (1,12 ± 0,09) усл. ед. (р > 0,05 во всех случаях) (Рисунок 37). 4.1.3. Ген ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1) АцилКоА холестерол ацилтрансфераза (Soat1) – фермент, катализирующий образование эфиров холестерола из холестерола [117]. Установлено, что атерогенная диета у крыс приводила к повышению величины экспрессии мРНК гена ацилКоА холестерол ацилтрансферазы в 147 3,2 раза ((3,17 ± 0,31) усл. ед., р < 0,05 ) по сравнению с величиной экспрессии фермента в печени животных, получавших стандартный лабораторный корм (Рисунок 38). Препараты сравнения розувастатин и фенофибрат на фоне атерогенной диеты способствовали снижению величины экспрессии мРНК гена Soat1 на 54% ((до 1,45 ± 0,15) усл. ед., р < 0,05) и 49% ((до 1,64 ± 0,16) усл. ед., 4 * 3 *# 2 # * * * *# # # *# * # *# Розувастатин Фенофибрат Людартин Леукомизин Гроссмизин Гроссгемин Арглабин 0 Ахиллин 1 Атерогенная диета Уровень экспрессии мРНК гена Soat1 р < 0,05) соответственно. Рисунок 38 – Влияние сесквитерпеновых лактонов, фенофибрата и розувастатина на экспрессию мРНК гена ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1) в печени крыс при атерогенной диете, М ± m Величина экспрессии мРНК гена Hmgcr выражена в усл. ед. и нормализована по гену-рефери β-актину (Actb) и контролю (стандартная диета). Относительная экспрессия мРНК гена Soat1 в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем; # – р < 0,05 по сравнению с атерогенной диетой, Ахиллин и леукомизин также уменьшали повышенную на фоне атерогенной диеты экспрессию мРНК гена Soat1 на 46% ((1,71 ± 0,17) усл. ед., р < 0,05) и на 49% ((1,63 ± 0,18) усл. ед., р < 0,05) соответственно. Арглабин ((2,04 ± 0,18) усл. ед., р < 0,05), гроссгемин ((1,73 ± 0,18) усл. ед., р < 0,05), 148 гроссмизин ((1,85 ± 0,17) усл. ед., р < 0,05) и людартин ((2,04 ± 0,18) усл. ед., р < 0,05) снижали экспрессию мРНК исследуемого гена на 36%, 45%, 42% и 36% соответственно (Рисунок 38). Известно, что этерификация холестерола, обусловленная АцилКоА холестерол ацилтрансферазой, играет важную роль в упаковке, продукции и секреции ЛПОНП печенью [59]. АцилКоА холестерол ацилтрансфераза модулирует катаболизм холестерола в гепатоцитах и концентрацию его в плазме, уменьшая уровень свободного ХС в клетках печени, что способствует снижению экспрессии и активности 7A-гидроксилазы. При атерогенной диете повышение активности АцилКоА холестерол ацилтрансферазы способствует увеличению секреции гепатоцитами ЛПОНП. Показано, что ингибиторы этого фермента увеличивают синтез желчных кислот через повышение экспрессии холестерол 7-альфа-гидроксилазы. Таким образом, повышение экспрессии Soat1 может способствовать снижению экспрессии холестерол 7-альфа-гидроксилазы и развитию гиперхолестеринемии при атерогенной диете [157]. 4.1.4. Ген холестерол 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1) Печень устраняет избыток холестерола из организма путем непосредственной секреции в желчь или после преобразования его в желчные кислоты через ферментативные пути, на которые оказывает влияние фермент, лимитирующий скорость синтеза желчных кислот – холестерол 7α-гидроксилаза (Cyp7a1) [61, 161]. В результате экспериментов нами было установлено, что атерогенная диета у крыс приводила к снижению величины экспрессии мРНК гена Cyp7a1 на 25% и составляла (0,75 ± 0,06) усл. ед. (р < 0,05) (Рисунок 39). Одной из причин уменьшения экспрессии холестерин 7-альфа-гидроксилазы при атерогенной диете может быть обнаруженная нами у этих животных повышенная экспрессия гена Soat1 [157]. 6 5 4 *# * # * # * *# # *# *# 3 2 * Розувастатин Фенофибрат Людартин Леукомизин Ахиллин Арглабин 0 Гроссмизин * Гроссгемин 1 Атерогенная диета Уровень экспрессии мРНК гена Cyp7a1 149 Рисунок 39 – Влияние сесквитерпеновых лактонов, фенофибрата и розувастатина на экспрессию мРНК гена холестерин 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1) в печени крыс при атерогенной диете, М ± m Величина экспрессии мРНК гена Cyp7a1 выражена в усл. ед. и нормализована по гену-рефери β-актину (Actb) и контролю (стандартная диета). Относительная экспрессия мРНК гена Cyp7a1 в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем; # – р < 0,05 по сравнению с атерогенной диетой Установлено, что розувастатин повышал величину экспрессии мРНК гена Cyp7a1 в печени животных при атерогенной диете в 4,6 раза ((4,62 ± 0,46) усл. ед., р < 0,05) (Рисунок 39). Известно, что статины повышают величину экспрессии мРНК ключевого фермента синтеза желчных кислот холестерин 7альфа-гидроксилазы [86]. Фенофибрат, напротив, не изменял сниженную на фоне атерогенной диеты величину экспрессии мРНК гена Cyp7a1, ее значение оставалось ниже контроля и составляло (0,64 ± 0,06) усл. ед. (р < 0,05) (Рисунок 39). Известно, что фибраты, в том числе фенофибрат, уменьшают экспрессию мРНК гена Cyp7a1 у пациентов 150 с гиперлипидемией [147, 158] и в клеточной культуре гепатомы HepG2 [89]. Уменьшение экспрессии мРНК гена Cyp7a1 способствует снижению синтеза и секреции желчных кислот, что приводит к повышению литогенности желчи, т.е. к риску образования желчных камней [158]. Поэтому фибраты противопоказаны больным с желчнокаменной болезнью. Исследуемые лактоны, подобно розувастатину, повышали экспрессию мРНК гена Cyp7a1. Гроссгемин в наибольшей степени (в 4,4 раза) увеличивал экспрессию гена Cyp7a1 ((4,36 ± 0,44) усл. ед., р < 0,05). Леукомизин повышал экспрессию мРНК гена Cyp7a1 в 4,2 раза ((4,20 ± 0,43) усл. ед., р < 0,05), гроссмизин – в 3,5 раза (3,49 ± 0,16) усл. ед., р < 0,05), ахиллин – в 3,7 раза ((3,67 ± 0,36) усл. ед., р < 0,05), арглабин – в 3,3 раза ((3,27 ± 0,33) усл. ед., р < 0,05), людартин – в 2,6 раза ((2,64 ± 0,26) усл. ед., р < 0,05). 4.1.5. Гены карнитин-пальмитоилтрансферазы 1и 2 (Cpt1a и Cpt2) Жирные кислоты с длинной углеводородной цепью переносятся через внутреннюю мембрану митохондрий с помощью карнитина. Поэтому карнитинпальмитоилтрансфераза 1 (Cpt1a) является ферментом, регулирующим скорость окисления длинноцепочечных жирных кислот в митохондриях. Этот фермент расположен на внешней мембране митохондрий и осуществляет транспорт длинноцепочечных жирных кислот в митохондрии, катализируя реакцию с образованием ацилкарнитина [57]. Образовавшийся ацилкарнитин проходит через межмембранное пространство к наружной стороне внутренней мембраны и транспортируется с помощью карнитин-ацил-карнитинтранслоказы на внутреннюю поверхность внутренней мембраны митохондрий, где фермент карнитин-пальмитоилтрансфераза 2 (Cpt2) катализирует перенос ацила на пул внутримитохондриального КоА [57]. Поэтому нами была исследована экспрессия мРНК обоих генов ферментов, участвующих в катаболизме жирных кислот. 151 В результате экспериментов установлено, что при атерогенной диете величина экспрессии ((0,71 ± 0,10) усл. мРНК генов ед., р < 0,05) и Cpt1a и 26% снижалась на 29% Cpt2 ((0,74 ±0,08) усл. ед., р < 0,05) # 7 # 6 * 5 # * 4 # # * #* * * # # 3 * * 2 Розувастатин Фенофибрат Людартин Леукомизин Ахиллин Арглабин 0 Гроссмизин * Гроссгемин 1 Атерогенная диета Уровень экспрессии мРНК гена Cpt1a соответственно (Рисунки 40, 41). Рисунок 40 – Влияние сесквитерпеновых лактонов, фенофибрата и розувастатина на экспрессию мРНК гена карнитин-пальмитоилтрансферазы 1 (Cpt1a) в печени крыс при атерогенной диете, М ± m Величина экспрессии мРНК гена Cpt1a выражена в усл. ед. и нормализована по гену-рефери β-актину (Actb) и контролю (стандартная диета). Относительная экспрессия мРНК гена Cpt1a в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем,; # – р<0,05 по сравнению с атерогенной диетой, Известно, что в результате активации PPAR-α происходит увеличение экспрессии генов ферментов, вовлеченных в окисление длинноцепочечных жирных кислот [174]. Напротив, у животных, получавших с обычным кормом холестерол (1%), наблюдалось снижение количества мРНК Cpt1a и Cpt2 [193]. Это свидетельствует о том, что при кормлении крыс холестеролом происходит снижение катаболизма жирных кислот, что может являться причиной повышения уровня триацилглицеролов в печени [193]. 3 # # 2 # # Арглабин Ахиллин # # * * * Розувастатин Фенофибрат Людартин Леукомизин 0 Гроссмизин * Гроссгемин 1 * # Атерогенная диета Уровень экспрессии мРНК гена Cpt2 152 Рисунок 41 – Влияние сесквитерпеновых лактонов, фенофибрата и розувастатина на экспрессию мРНК гена карнитин-пальмитоилтрансферазы 2 (Cpt2) в печени крыс при атерогенной диете, М ± m Величина экспрессии мРНК гена Cpt2 выражена в усл. ед. и нормализована по гену-рефери β-актину (Actb) и контролю (стандартная диета). Относительная экспрессия мРНК гена Cpt2в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем; # – р < 0,05 по сравнению с атерогенной диетой Фенофибрат значительно повышал величину экспрессии мРНК обоих генов – в 6,1 раза (Cpt1a) и 2,5 раза (Cpt2), при этом значение экспрессии составляло (6,10 ± 0,77) усл. ед. (р < 0,05) и (2,46 ± 0,26) усл. ед. (р < 0,05) соответственно. Розувастатин также увеличивал величину экспрессии мРНК генов Cpt1a и Cpt2 в 3,2 раза ((3,17 ± 0,37) усл. ед., р < 0,05) и 1,6 раза (( 1,61 ± 0,16) усл. ед., р < 0,05) (Рисунки 40; 41). Подобно препаратам сравнения, исследуемые лактоны повышали величину экспрессии мРНК гена Cpt1a: арглабин в 5,1 раза ((5,11 ± 0,60) усл. ед., р < 0,05), ахиллин – в 4,6 раза ((4,59 ± 0,41) усл. ед., р < 0,05), леукомизин – в 4,5 раза ((4,49 ± 0,46) усл. ед., р < 0,05), гроссгемин – в 3,7 раза ((3,71 ± 0,32) усл. ед., 153 р < 0,05) гроссмизин – в 3,5 раза ((3,53 ± 0,34) усл. ед., р < 0,05), людартин – в 2,7 раза (2,71 ± 0,25) усл. ед., р < 0,05) (см. Рисунок 40). На экспрессию мРНК гена карнитин-пальмитоилтрансфераза 2 исследуемые вещества оказывали менее выраженное влияние (см. Рисунок 41). Людартин и леукомизин повышали экспрессию мРНК гена Cpt2 в 2 раза ((2,03 ± 0,22) усл. ед., р < 0,05) и 1,3 раза ((1,34 ± 0,11) усл. ед., р < 0,05) соответственно. Арглабин ((1,16 ± 0,16) усл. ед.), ахиллин ((1,07 ± 0,11) усл. ед.) и гроссгемин ((1,21 ± 0,12) усл. ед. (во всех случаях р > 0,05) препятствовали вызванному атерогенной диетой снижению величины экспрессии мРНК гена карнитин-пальмитоилтрансферазы 2, и их значения не отличались от контроля (стандартная лабораторная диета). Гроссмизин не оказывал влияния на величину экспрессии мРНК гена Cpt2 (см. Рисунок 41). 4.2. Экскреция холестерола через желудочно-кишечный тракт под влиянием леукомизина Одним из важных элементов системы обмена липидов, поддержания необходимого уровня холестерола в крови является его экскреция через ЖКТ. В экспериментах на крысах определяли вляиние леукомизина, применяемого курсом в течение 10 дней, на концентрацию ТАГ, содержание ХС в крови, в ткани печени и его экскрецию с фекалиями. В нашем исследовании1 леукомизин, вводимый крысам в течение 10 дней, на 53% (р < 0,01) снижал концентрацию ТАГ и на 15% (р < 0,05) концентрацию общего ХС в сыворотке крови крыс, в сравнении контролем (Таблица 32). Препарат сравнения из группы статинов розувастатин кальция статистически значимо (р < 0,05) снижал уровень ХС в сыворотке крови крыс на 16%, а уровень ТАГ – на 80% (р < 0,01) (Таблица 32). Кроме того, было исследовано влияние леукомизина и препарата сравнения на содержания ТАГ и ХС в печени экспериментальных животных. Применение розувастатина кальция способствовало снижению уровня ТАГ в 1 Исследование выполнено совместно с Е. А. Родновой 154 печени на 56 % (р < 0,01) относительно значений этого показателя в контрольной группе животных ((1,80 ± 0,10) мг ТАГ/г печени), и снижало концентрацию ХС на 28 % (р < 0,01) в сравнении с данным показателем у крыс, не подвергавшихся воздействию статина ((0,91 ± 0,03) мг/г печени) (Таблица 33). Леукомизин вызывал уменьшение содержания в печени ТАГ на 40% (р < 0,01), холестерола – на 17%, относительно соответствующих значений в контрольной группе животных (Таблица 33). Таблица 32 – Влияние леукомизина и розувастатина кальция на уровень ТАГ и общего холестерола в сыворотке крови крыс ( Х ± m, n = 6) Экспериментальная группа Показатель Контроль Леукомизин Розувастатин кальция Уровень ТАГ, мМ 0,989 ± 0,124 0,460 ± 0,044 –53% (p < 0,01) 0,202 ± 0,023 –80% (p < 0,01) Уровень общего холестерола, мМ 1,69 ± 0,06 1,44 ± 0,05 –15% (p < 0,05) 1,42 ± 0,05 –16% (p < 0,05) Таблица 33 – Влияние леукомизина и розувастатина кальция на содержание ТАГ и холестерола в печени крыс, ( Х ± m, n = 8) Экспериментальная группа Показатель Контроль Леукомизин Розувастатин кальция Содержание ТАГ, мг/г ткани печени 4,14 ± 0,42 2,48 ± 0,20 –40% (p < 0,01) 1,80 ± 0,10 –56% (p < 0,01) Холестерол, мг/г ткани печени 1,26 ± 0,02 1,05 ± 0,06 –17 % (p < 0,01) 0,91 ± 0,03 –28 % (p < 0,01) Таким образом, курсовое введение леукомизина (10 дней, доза 10 мг/кг) вызывало снижение в сыворотке крови и печени крыс содержания ТАГ и 155 холестерола подобно препарату сравнения из группы статинов розувастатину кальция. Также мы обнаружили, что ингибитор ГМГ-КоА-редуктазы розувастатин кальция статистически значимо увеличивал выведение ХС из кишечника на 127 % ((9,68 ± 0,33) мг/г фекалий, p < 0,01) относительно показателя контрольной группы (Таблица 34). Изучаемый сесквитерпеновый лактон также способствовал повышенному выведению ХС с фекалиями, концентрация холестерола составляла (6,60 ± 0,24) мг/г фекалий, что на 55% выше уровня в контрольной группе (p < 0,01). Таблица 34 – Влияние курсового введения леукомизина и розувастатина кальция на экскрецию холестерола с фекалиями, ( Х ± m, n = 6) Холестерол, мг/г фекалий Изменение под влиянием препаратов, % р Контроль 4,26±0,11 – – Леукомизин (10 дней, 10 мг/кг) 6,60±0,24 + 55 Розувастатин кальция (10 дней, 10 мг/кг) 9,68±0,33 + 127 Группа p < 0,01 p < 0,01 Таким образом, сесквитерпеновый лактон леукомизин обладает важным эффектом, аналогичным свойствам статинов - увеличивает выведение холестерола с фекалиями подобно препарату сравнения розувастатину кальция. Усиление экскреции ХС может являться одним из интегральных механизмов гиполипидемического действия леукомизина. 4.3. Влияние леукомизина на активность ГМГ-КоА-редуктазы в печени Фермент ГМГ-КоА-редуктаза – ключевой в синтезе холестерола, он катализирует синтез мевалоновой кислоты. Именно эта стадия считается лимитирующей в метаболическом пути биосинтеза ХС и других изопреноидов. Ингибирование ГМГ-КоА-редуктазы является ключевым механизмом 156 гиполипидемического действия статинов – важного класса средств, наиболее часто применяемого при дислипидемиях. Леукомизин обладает структурным сходством со статинами, имеет в своем составе лактонное кольцо, проявляет гиполипидемическую активность, для выявления механизмов которой изучали влияние лейукомизина на способность ингибировать активность ГМГ-КоА-редуктазы2. Розувастатин кальция в наших экспериментах in vitro статистически значимо снижал активность ключевого фермента биосинтеза холестерола – ГМГКоА-редуктазы на 51% в сравнении со значениями этого показателя в контрольной группе. Леукомизин в несколько меньшей степени ингибировал ГМГ-КоА-редуктазу, уменьшая ее активность на 35% относительно контрольных значений (Таблица 35). Таблица 35 – Влияние леукомизина и розувастатина кальция на активность ГМГКоА-редуктазы в печени крыс ( Х ± m, n = 6) Показатель Активность ГМГ-КоАредуктазы, пмоль ГМГ-КоА/мин·мг белка Таким образом, Контроль Леукомизин 10 мг/кг Розувастатин кальция 10 мг/кг 236,1 ± 9,5 153,3 ± 8,5 –35% р < 0,01 114,8 ± 5,7 –51% р < 0,01 механизм гипохолестеролемического действия сесвитерпеноида леукомизина может быть обусловлен его способностью снижать активность ГМГ-КоА-редуктазы в печени, что сопровождается ингибированием биосинтеза холестерола. 2 Исследование выполнено совместно с Е. А. Родновой 157 Обсуждение результатов по исследованию механизмов гиполипидемической активности сесквитерпеновых лактонов (2-й этап исследования) На первом этапе исследования было показано, что исследуемые сесквитерпеновые лактоны (арглабин, людартин, гроссгемин, гроссмизин, ахиллин и леукомизин) на моделях острой гиперлипидемии, индуцированной этанолом и тритоном WR 1339, и на модели хронической гиперлипидемии, вызванной высокожировой диетой, содержащей ХС, способны снижать уровень ТАГ и холестерола в печени и сыворотке крови экспериментальных животных. При этом исследуемые сесквитерпеновые лактоны оказывают влияние на разные показатели липидного обмена. В экспериментах in vitro сесквитерпеновые лактоны также снижали содержание липидов в культуре гепатомы крыс НТС, о чем свидетельствует уменьшение флуоресценции Nile Red и окрашенных Oil Red O липидных капель в цитозоле. Результаты оценки эффективности лактонов на экспериментальных моделях in vitro и in vivo позволили предполагать, что механизмы гиполипидемической активности исследуемых веществ различаются. Для установления молекулярных механизмов гиполипидемического действия сесквитерпеновых лактонов было изучено их влияние на экспрессию ключевых генов, регулирующих метаболизм липидов в печени при атерогенной диете. Несмотря на существование множества различных генов, вовлеченных в соответствующие молекулярные каскады метаболизма жирных кислот, жиров и холестерола, полиморфизмы лишь немногих из таких генов достоверно ассоциированы с развитием атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний [33]. Поэтому в настоящей работе было проанализировано влияние изучаемых сесквитерпеновых лактонов (арглабина, ахиллина, гроссгемина, гроссмизина, леукомизина и людартина) на величину экспрессии мРНК ключевых генов липидного обмена в печени животных при атерогенной диете: 158 рецептора к ЛПНП (Ldlr); ключевого фермента синтеза холестерола, 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr); фермента, катализирующего образование эфиров холестерола, ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1); фермента, регулирующего скорость синтеза желчных кислот, 7-альфагидроксилазы (Cyp7a1); фермента, регулирующего скорость окисления митохондриями длинноцепочечных жирных кислот, карнитин-пальмитоилтрансферазы 1 (Cpt1a); фермента, катализирущего перенос ацила на внутримитохондриальный КоА карнитин-пальмитоилтрансферазы 2 (Cpt2). В результате экспериментов было установлено, что высокожировая атерогенная диета приводит к снижению в печени экспериментальных животных величины экспрессии мРНК генов рецептора к ЛПНП (Ldlr), 7-альфагидроксилазы (Cyp7a1), карнитин-пальмитоилтрансферазы 1 (Cpt1a) и карнитинпальмитоилтрансферазы 2 (Cpt2) (Рисунок 42,а). Это способствует снижению поглощения печенью циркулирующих в крови ЛПНП (Ldlr), интенсивности окисления жирных кислот митохондриями (Cpt1a и Cpt2) и выведению холестерола в виде желчных кислот (Cyp7a1). Снижение величины экспрессии в печени гена ГМГ-КоА-редуктазы при атерогенной диете обусловлено избыточным поступлением ХС с пищей, который по принципу отрицательной обратной связи уменьшает экспрессию данного гена при участии фактора транскрипции – стеролсвязывающего регуляторного белка SREBP-2 [93]. При атерогенной диете происходит увеличение величины экспрессии мРНК гена ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1) (Рисунок 42). Известно, что этерификация холестерола, обусловленная АцилКоА холестерол ацилтрансферазой, играет важную роль в упаковке, продукции и секреции ЛПОНП печенью [59]. 159 а – атерогенная диета; б – атерогенная диета+фенофибрат или розувастатин Рисунок 42 – Влияние фенофибрата (а) и розувастатина (б) на экспрессию мРНК генов метаболизма липидов в печени крыс при атерогенной диете. Величина экспрессии мРНК генов выражена в усл. ед. и нормализована по генурефери β-актину (Actb) и контролю (стандартная диета). Относительная экспрессия мРНК генов в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем; # – р < 0,05 по сравнению с атерогенной диетой. Ldlr – рецептор к ЛПНП; Hmgcr –3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктаза; Soat1 – ацилКоА холестерол ацилтрансфераза; Cyp7a1 – 7-альфа-гидроксилаза; Cpt1a – карнитин-пальмитоилтрансфераза 1; Cpt2 – карнитинпальмитоилтрансфераза 2 АцилКоА холестерол ацилтрансфераза модулирует катаболизм ХС в гепатоцитах и концентрацию его в плазме, уменьшая уровень свободного ХС в клетках печени, что способствует снижению экспрессии и активности 7-альфагидроксилазы. При атерогенной АцилКоА холестерол ацилтрансферазы диете повышение способствует увеличению активности секреции гепатоцитами ЛПОНП. Показано, что ингибиторы этого фермента увеличивают синтез желчных кислот через повышение экспрессии холестерин 7-альфагидроксилазы. Повышение экспрессии Soat1 может способствовать снижению 160 экспрессии холестерин 7-альфа-гидроксилазы и развитию гиперхолестеринемии при атерогенной диете [157]. Фенофибрат относится к дериватам фиброевой кислоты – группе гиполипидемических липопротеиновых препаратов, влияющих преимущественно на обмен частиц, богатых триацилглицеролами (хиломикроны, липопротеины очень низкой и промежуточной плотности). Фибраты являются агонистами ядерных α-рецепторов, активирующих пролиферацию пероксисом (PPARα) [182], и их гиполипидемическое действие обусловлено несколькими механизмами [174]. Фенофибрат в печени крыс на фоне атерогенной диеты индуцирует βокисление жирных кислот, о чем свидетельствует увеличение экспрессии мРНК генов Cpt1a и Cpt2 с сопутствующим уменьшением синтеза жирных кислот и ТАГ (см. Рисунок 42,б). Ингибирование фенофибратом экспресии мРНК гена ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1) приводит к уменьшению образования эфиров ХС. Увеличение экспрессии мРНК гена рецепторов к ЛПНП (Ldlr) способствует извлечению из циркуляции в крови атерогенных ЛПНП. В то же время снижение экспрессии мРНК гена 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1) способствует уменьшению синтеза и секреции желчных кислот, что может спровоцировать развитие желчнокаменной болезни и ограничивает применение фибратов [158]. Статины ингибиторами являются структурными ГМГ-КоА-редуктазы – аналогами ключевого и конкурентными фермента биосинтеза холестерола в гепатоцитах. Основной механизм их действия основан на снижении внутриклеточного содержания ХС в клетках печени, в результате чего происходит увеличение количества мембранных рецепторов к ЛПНП. Это приводит к связыванию и выведению из кровотока атерогенных ЛПНП и, таким образом, уменьшению концентрации ХС в крови. Розувастатин на фоне атерогенной диеты уменьшает величину экспрессии мРНК гена ацилКоА холестерол ацилтрансферазы, повышая при этом в печени экспрессию генов, кодирующих синтез рецепторов ЛПНП (Ldlr), синтез желчных 161 кислот (Cyp7a1) и окисление жирных кислот в митохондриях (Cpt1a и Cpt2), что обуславливает его гиполипидемическое действие (см. Рисунок 42,б). В то же время розувастатин увеличивает величину экспрессии мРНК фермента ГМГ-КоА-редуктазы (см. Рисунок 42,б). Ранее было показано, что конкурентное ингибирование фермента ГМГКоА-редуктазы симвастатином в культуре гепатомы человека запускает скоординированную регуляцию экспрессии генов, кодирующих ГМГ-КоАредуктазу и статинами рецептор in vivo к ЛПНП. вызывает Ингибирование комплексный ответ, ГМГ-КоА-редуктазы сопровождающийся повышением экспрессии генов ГМГ-КоА-редуктазы и рецепторов к ЛПНП [93]. Увеличение количества рецепторов к ЛПНП способствует усилению захвата богатых холестерином ЛПНП из кровеносного русла и по отрицательной обратной связи – снижению экспрессии гена Hmgcr. Поэтому можно предполагать, что обнаруженное в наших экспериментах увеличение экспрессии гена ГМГ-КоА-редуктазы в печени крыс под действием розувастатина при атерогенной диете обусловлено снижением содержания ХС под действием статина. Известно, что снижение уровня ХС по принципу отрицательной обратной связи приводит к увеличению экспрессии гена данного фермента [93]. Исходя из полученных данных по влиянию исследуемых сесквитерпеновых лактонов на уровень липидов и экспрессию м-РНК генов ключевых ферментов липидного обмена (Ldlr, Hmgcr, Soat1, Cyp7a1, Cpt1a, Cpt2) в печени крыс при атерогенной диете, можно предполагать следующие механизмы их гиполипидемического действия. Арглабин в печени крыс при экспериментальной гиперлипидемии, вызванной атерогенной диетой, увеличивает экспрессию гена 7-альфа- гидроксилазы, что может способствовать синтезу желчных кислот и повышению экскреции ХС с желчью (Рисунок 43). 162 – атерогенная диета; – атерогенная диета + арглабин Рисунок 43 – Влияние арглабина на экспрессию мРНК генов метаболизма липидов в печени крыс при атерогенной диете. Величина экспрессии мРНК генов выражена в усл. ед. и нормализована по генурефери β-актину (Actb) и контролю (стандартная диета). Относительная экспрессия мРНК генов в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем; # – р < 0,05 по сравнению с атерогенной диетой, Ldlr – рецептор к ЛПНП; Hmgcr – 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктаза; Soat1 – ацилКоА холестерол ацилтрансфераза; Cyp7a1 – 7-альфа-гидроксилаза; Cpt1a – карнитин-пальмитоилтрансфераза 1; Cpt2 – карнитинпальмитоилтрансфераза 2. Наряду с этим снижение величины экспрессии мРНК гена ацилКоА холестерол ацилтрансферазы приводит к уменьшению образования эфиров ХС и включения их в ЛПОНП. Возможный механизм гиполипидемического действия арглабина обусловлен также увеличением окислением длинноцепочечных жирных кислот в митохондриях, о чем свидетельствует повышение экспрессии мРНК генакарнитин-пальмитоилтрансферазы 1 (Рисунок 43). Ахиллин, подобно арглабину, при экспериментальной гиперлипидемии, вызванной атерогенной диетой, повышает величину экспрессии мРНК генакарнитин-пальмитоилтрансферазы 1 и 7-альфа-гидроксилазы (Рисунок 44). 163 – атерогенная диета; – атерогенная диета+ахиллин Рисунок 44 – Влияние ахиллина на экспрессию мРНК генов метаболизма липидов в печени крыс при атерогенной диете. Величина экспрессии мРНК генов выражена в усл. ед. и нормализована по генурефери β-актину (Actb) и контролю (стандартная диета). Относительная экспрессия мРНК генов в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем; # – р < 0,05по сравнению с атерогенной диетой. Ldlr – рецептор к ЛПНП; Hmgcr –3-гидрокси-3-метилглутарил КоА редуктаза; Soat1 – ацилКоА холестерол ацилтрансфераза; Cyp7a1 – 7-альфа-гидроксилаза; Cpt1a – карнитин-пальмитоилтрансфераза 1; Cpt2 – карнитинпальмитоилтрансфераза 2 Снижение уровня ХС в печени может быть связано с увеличением экскреции ХС желчью вследствие повышенной экспрессии. гена 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1). Снижение в крови экспериментальных животных уровня ТАГ при атерогенной диете может быть обусловлено повышением экспрессии мРНК гена Cpt1a и способствует усилению катаболизма жирных кислот в митохондриях гепатоцитов. Гроссгемин при экспериментальной гиперлипидемии, вызванной атерогенной диетой, оказывает гиполипидемическое действие, главным образом, значительным повышением экспрессии гена 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1), 164 увеличением синтеза желчных кислот из холестерола и выведением холестерола с желчью (Рисунок 45). Кроме того, повышается окисление длинноцепочечных жирных кислот (увеличивается экспрессия мРНК гена Cpt1a) и снижается образование эфиров холестерола (снижение экспрессии гена Soat1), что, как известно, приводит к снижению сборки апоВ100-содержащих липопротеинов [117]. – атерогенная диета; – атерогенная диета + гроссгемин Рисунок 45 – Влияние гроссгемина на экспрессию мРНК генов метаболизма липидов в печени крыс при атерогенной диете. Величина экспрессии мРНК генов выражена в усл. ед. и нормализована по генурефери β-актину (Actb) и контролю (стандартная диета). Относительная экспрессия мРНК генов в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем; # – р < 0,05 по сравнению с атерогенной диетой. Ldlr – рецептор к ЛПНП; Hmgcr –3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктаза; Soat1 – ацилКоА холестерол ацилтрансфераза; Cyp7a1 –7-альфа-гидроксилаза; Cpt1a – карнитин-пальмитоилтрансфераза 1; Cpt2 – карнитинпальмитоилтрансфераза 2. Кроме того, гроссгемин, подобно розувастатину, увеличивает величину экспрессии мРНК гена 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr) и 165 гена рецепторов к ЛПНП (Ldlr), поскольку ингибирование ГМГ-КоА-редуктазы in vivo статинами вызывает комплексный ответ, сопровождающийся повышением экспрессии генов ГМГ-КоА-редуктазы и рецепторов к ЛПНП [93]. Гроссмизин индуцирует окисление жирных кислот (увеличение величины экспрессии мРНК гена Cpt1a) и ингибирует величину экспресии мРНК гена ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1), что может способствовать снижению образования апоВ100-содержащих липопротеинов (Рисунок 46). Увеличение величины экспресии мРНК гена 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1) на фоне атерогенной диеты способствует выведению ХС с желчью. – атерогенная диета; – атерогенная диета + гроссмизин Рисунок 46 – Влияние гроссмизина на экспрессию мРНК генов метаболизма липидов в печени крыс при атерогенной диете. Величина экспрессии мРНК генов выражена в усл. ед. и нормализована по генурефери β-актину (Actb) и контролю (стандартная диета). Относительная экспрессия мРНК генов в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем; # – р < 0,05 по сравнению с атерогенной диетой, Ldlr – рецептор к ЛПНП; Hmgcr – 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктаза; Soat1 – ацилКоА холестерол ацилтрансфераза; Cyp7a1 – 7-альфа-гидроксилаза; Cpt1a – карнитин-пальмитоилтрансфераза 1; Cpt2 – карнитинпальмитоилтрансфераза 2. 166 Леукомизин на фоне атерогенной диеты, подобно розувастатину, повышает экспрессию генов, способствующих окислению длинноцепочечных жирных кислот (Cpt1a и Cpt2) (Рисунок 47), снижает величину экспрессии ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1), что может вызвать уменьшение содержания эфиров ХС и секреции ЛПОНП. – атерогенная диета; – атерогенная диета + леукомизин Рисунок 47 – Влияние леукомизина на экспрессию мРНК генов метаболизма липидов в печени крыс при атерогенной диете. Величина экспрессии мРНК генов выражена в усл. ед. и нормализована по генурефери β-актину (Actb) и контролю (стандартная диета). Относительная экспрессия мРНК генов в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем; # – р < 0,05 по сравнению с атерогенной диетой. Ldlr – рецептор к ЛПНП; Hmgcr – 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА редуктаза; Soat1 – ацилКоА холестерол ацилтрансфераза; Cyp7a1 – 7-альфа-гидроксилаза; Cpt1a – карнитин-пальмитоилтрансфераза 1; Cpt2 – карнитинпальмитоилтрансфераза 2 Повышение величины экспрессии мРНК гена 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr) в гепатоцитах животных, получавших атерогенную диету, под действием леукомизина может быть обусловлено снижением уровня ХС в клетках вследствие ингибирования активности фермента. По принципу 167 отрицательной обратной связи это вызывает увеличение экспрессии гена данного фермента [93]. Людартин на фоне атерогенной диеты в печени крыс стимулирует катаболизм жирных кислот в гепатоцитах (увеличение величины экспрессии мРНК гена Cpt1a и Cpt2), а также повышает выведение холестерола с желчью (увеличение величины экспрессии мРНК гена Cyp7a1) (Рисунок 48). Снижение величины экспрессии ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1) может приводить к уменьшению содержания эфиров холестерола и секреции липопротеинов очень низкой плотности. : – атерогенная диета; – атерогенная диета +людартин; Рисунок 48 – Влияние людартина на экспрессию мРНК генов метаболизма липидов в печени крыс при атерогенной диете. Величина экспрессии мРНК генов выражена в усл. ед. и нормализована по генурефери β-актину (Actb) и контролю (стандартная диета). Относительная экспрессия мРНК генов в контроле принята за единицу. * – р < 0,05 по сравнению с контролем; # – р < 0,05 по сравнению с атерогенной диетой. Ldlr – рецептор к ЛПНП; Hmgcr –3-гидрокси-3-метилглутарил КоА редуктаза; Soat1 – ацилКоА холестерол ацилтрансфераза; Cyp7a1 – 7-альфа-гидроксилаза; Cpt1a – карнитин-пальмитоилтрансфераза 1; Cpt2 – карнитинпальмитоилтрансфераза 2 168 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Исследуемые сесквитерпеновые лактоны (арглабин, людартин, гроссгемин, гроссмизин, ахиллин и леукомизин) способны снижать уровень триацилглицеролов, свободных жирных кислот и холестерола на модели острой гиперлипидемии, индуцированной этанолом. При этом исследуемые сесквитерпеновые лактоны оказывают влияние на разные показатели липидного обмена. Статистически значимых отличий в активности препаратов не выявлено, и по результатам испытаний препаратов на спиртовой модели сложно сделать вывод о преимуществах какого-либо из лактонов. Изучение влияния лактонов на показатели липидного обмена выявило способность всех лактонов снижать уровень триацилглицеролов, свободных жирных кислот и холестерола при острой гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339. Эффективность большинства лактонов сравнима с фенофибратом (препарат сравнения), что свидетельствует об их высокой гиполипидемической активности. При этом исследуемые сесквитерпеновые лактоны в зависимости от структуры оказывают влияние на разные показатели липидного обмена. Экспериментальная оценка влияния исследуемых объектов на показатели липидного обмена лабораторных животных при хронической гиперлипидемии, вызванной высокожировой диетой (45% энергии за счет животного жира), содержащей 2,5% холестерола, 0,5% холевой кислоты и 0,1% 2-тиоурацила, свидетельствуют о способности сесквитерпеновых лактонов снижать уровень триацилглицеролов, свободных жирных кислот и холестерола. Сесквитерпеновые лактоны оказывали различные по степени выраженности эффекты на отдельные биохимические показатели липидного обмена. В данной хронической модели, наиболее приближенной к условиям развития атеросклероза у человека, наибольшую активность проявили: арглабин, ахиллин и леукомизин, чуть меньшую – людартин, гроссмизин и гроссгемин. Следует отметить, что все лактоны проявили активность, близкую к действию препаратов 169 сравнения – фенофибрату и розувастатину, незначительно уступая лишь по ряду показателей. В экспериментах in vitro сесквитерпеновые лактоны снижают содержание липидов в культуре гепатомы крыс НТС, о чем свидетельствует уменьшение флуоресценции Nile Red и окрашенных Oil Red O липидных капель в цитозоле. При этом арглабин, гроссгемин и людартин снижают флуоресценцию Nile Red в концентрации от 10 до 50 мкМ, а в концентрации 100 мкМ и выше оказывают цитотоксическое действие. Гроссмизин, ахиллин и леукомизин уменьшают содержание липидов в клеточной культуре НТС в концентрациях от 0,5 до 1,0 мМ и обладают низкой цитотоксичностью, которая проявляется при достаточно высокой концентрации препаратов в инкубационной среде (свыше 2,0 мМ). Сесквитерпеновые лактоны людартин, ахиллин, гроссмизин и леукомизин на модели гиперлипидемии, индуцированной добавлением жировой эмульсии липофундина к клеточной культуре НТС, препятствовали накоплению липидов в клетках. Арглабин и гроссгемин на этой модели проявляли гиполипидемическое действие только в цитотоксических концентрациях. На основании интегрального анализа данных по оценке эффективности лактонов в условиях всех четырех вышеуказанных экспериментальных моделей можно сделать вывод о том, что все препараты проявляют гиполипидемическую активность, но механизмы этого эффекта различаются. Таким образом, по результатам скрининга гиполипидемической активности лактонов наибольшую активность проявил леукомизин, затем два близких соединения ахиллин и гроссмизин (гидроксиахиллин). Арглабин, гроссгемин и людартин продемонстрировали слабый эффект и (или) большую токсичность в экспериментах на культуре клеток. В проведенных нами экспериментах у животных на фоне атерогенной диеты, леукомизин, подобно розувастатину, повышал экспрессию генов, способствующих окислению длинноцепочечных жирных кислот карнитинпальмитоилтрансферазы 1 и 2 (Cpt1a и Cpt2), снижал величину экспрессии 170 ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1). Также леукомизин, подобно статинам, снижал активность ГМГ-КоА-редуктазы в печени экспериментальных животных. Механизм этого эффекта леукомизина может быть связан с конкурентным ингибированием ГМГ-КоА-редуктазы, фермента биосинтеза холестерола, благодаря наличию лактонного кольца, которое является основой статинов [34]. Роль лактонового кольца леукомизина в реализации гиполипидемического действия сесквитерпеноида подтверждается данными о способности ряда терпеноидов оказывать ингибирующее влияние на ключевой фермент биосинтеза холестерола. Например, ГМГ-КоА-редуктазу ингибируют дитерпеновые лактоны, выделенные из полиалтии длиннолистной (Polyalthia longifolia) [76]. Сесквитерпеноид фарнезол угнетает мевалонатный путь биосинтеза холестерола в культуре S. aureus, ингибируя ГМГ-КоА-редуктазу [113]. В то же время, не исключено, что активность фермента ГМГ-КоАредуктаза в гепатоцитах крыс под воздействием леукомизина снижается вследствие уменьшения скорости его трансляции, как это показано для лимонена и гераниола [138]. Таким образом, способность ингибировать ключевой фермент биосинтеза холестерола – ГМГ-КоА-редуктазу является одним из ключевых механизмов гиполипидемического действия леукомизина. Кроме того, механизм терапевтического действия гиполипидемичесих препаратов статинов заключаеться в усилении выделения холестерола через ЖКТ. В наших экспериментах на животных леукомизин, как и розувастатин, увеличивал выделение холестерола с фекалиями. Таким образом, среди исследованных сесквитерпеновых лактонов леукомизин проявляет наиболее эффективное гиполипидемическое действие, механизмы которого связаны с ингибированием липолиза в жировой ткани, снижением активности ГМГ-КоА-редуктазы в печени и усилением экскреции холестерола через желудочно-кишечный тракт. На основании проведенных исследований можно сделать вывод о том, что леукомизин является перспективным веществом для создания лекарственного 171 препарата, обладающего гиполипидемическим и противоатеросклеротическим действием. ВЫВОДЫ 1. Сесквитерпеновые лактоны (арглабин, людартин, гроссгемин, гроссмизин, ахиллин и леукомизин) снижают уровень триацилглицеролов, свободных жирных кислот и холестерола на острых моделях гиперлипидемии, индуцированных этанолом и тритоном WR 1339. Леукомизин, ахиллин и гроссмизин снижают индекс атерогенности на модели острой гиперлипидемии, индуцированной тритоном WR 1339. 2. При хронической гиперлипидемии, вызванной высокожировой диетой у экспериментальных животных, гиполипидемическое действие, сесквитерпеновые снижают уровень лактоны проявляют триацилглицеролов, свободных жирных кислот и холестерола, при этом леукомизин в наибольшей степени среди исследованных лактонов снижает повышенный индекс атерогенности сыворотки крови. 3. В экспериментах in vitro сесквитерпеновые лактоны снижают содержание липидов в культуре гепатомы крыс НТС. При этом арглабин, гроссгемин и людартин снижают содержание липидов в концентрации препаратов инкубационной среде от 10 до 50 мкМ, а в концентрации 100 мкМ и выше оказывают цитотоксическое действие. Гроссмизин, ахиллин и леукомизин уменьшают содержание липидов в клеточной культуре НТС в концентрациях от 0,5 до 1,0 мМ и обладают низкой цитотоксичностью, которая проявляется при концентрации препаратов в инкубационной среде свыше 2,0 мМ. 4. Исследуемые сесквитерпеновые лактоны, проявляя гиполипидемическую активность, в различной степени влияют на экспрессию ключевых генов обмена липидов в культуре клеток НТС. Леукомизин на клеточной культуре гепатомы НТС повышает экспрессию мРНК гена карнитин- пальмитоилтрансферазы 1 (Cpt1a), гена карнитин-пальмитоилтрансферазы 2 (Cpt2), гена 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr) и 172 значительно снижает величину экспрессии гена ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1). 5. Сесквитерпеновые лактоны людартин, ахиллин, гроссмизин и леукомизин на модели гиперлипидемии, индуцированной добавлением жировой эмульсии липофундина к клеточной культуре НТС, препятствуют накоплению липидов в клетках. Арглабин и гроссгемин на этой модели проявляют гиполипидемическое действие только в цитотоксических концентрациях. 6. На фоне терапии арглабином, людартином, гроссгемином, гроссмизином, ахиллином и гиперлипидемии, леукомизином вызванной экспериментальной атерогенной диетой хронической значимо изменяют экспрессию генов ключевых ферментов обмена липидов в печени крыс. 7. Механизмы гиполипидемического действия леукомизина включают: способность на фоне атерогенной диеты, подобно розувастатину, повышать экспрессию генов карнитин-пальмитоилтрансферазы 1 и 2 (Cpt1a и Cpt2), и снижать величину экспрессии ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1). Важным механизмом гиполипидемического действия леукомизина является снижение активности ГМГ-КоА-редуктазы в печени крыс и увеличиение выведения холестерола через желудочно-кишечный тракт. 173 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ АО МНПХ «Фитохимия» – Акционерное общество «Международный научнопроизводственный холдинг «Фитохимия» (г. Караганда, Казахстан) ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ГМГ-КоА-редуктаза – 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А редуктаза ГФ – государственная фармакопея ДМСО – диметилсульфоксид ЖК – жирные кислоты ЖКТ – желудочно-кишечный тракт ИА – индекс атерогенности ЛП – липопротеины ЛПВП – липопротеины высокой плотности ЛПНП – липопротеины низкой плотности ЛПОНП – липопротеины очень низкой плотности ПЦР – полимеразная цепная реакция СЖК – свободные жирные кислоты ТАГ – триацилглицеролы ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России – Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Томск, Россия) ХС – холестерол, общий холестерол ХС-ЛПВП – холестерол во фракциях липопротеинов высокой плотности ХС-ЛПНП – холестерол во фракциях липопротеинов низкой плотности ХС-ЛПОНП – холестерол во фракциях липопротеинов очень низкой плотности ЭДТА – этилендиаминтетраацетат натрия 174 Acaca – ген ацетил-КоА карбоксилазы, ключевого фермента синтеза жирных кислот, катализирующего карбоксилирование ацетил-КоА с образованием малонил-КоА Cpt1a – ген карнитин-пальмитоилтрансферазы 1, фермента, лимитирующего скорость окисления митохондриями длинноцепочечных жирных кислот Cpt2 – ген карнитин-пальмитоилтрансферазы 2, фермента, катализирущего перенос ацила на внутримитохондриальный КоА Cyp7a1 – ген холестерин 7-альфа-гидроксилазы, фермента, регулирующего скорость синтеза желчных кислот Hmgcr – ген фермента синтеза холестерола 3-гидрокси-3-метилглутарил КоАредуктазы HTC – культура клеток гепатомы крыс Ldlr – ген рецептора к липопротеинам низкой плотности PPAR – рецептор, активирующий пролиферацию пероксисом PPARα – ядерные α-рецепторы, активирующие пролиферацию пероксисом Soat1 – ген ацилКоА холестерол ацилтрансферазы, фермента, катализирующего образование эфиров холестерола SRE – стерол регулирующий элемент SREBP – транскрипционный фактор стерол регулирующего элемента SREBPs – мембраносвязанные транскрипционные факторы 175 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Адекенов, С. М. К механизму гипохолестеролемического действия сесквитерпенового лактона леукомизина / С. М. Адекенов, Е. А. Роднова, В. В. Иванов, В. С. Чучалин, С. И. Ледюкова / Фармацевтический бюллетень. – 2012. – № 2–3. – С. 50–53. 2. Аксартов, Р. М. Гиполипидемические свойства и фармакокинетика сесквитерпенового лактона леукомизин : автореф. дис.… канд. мед. наук / Р. М. Аксартов. – Астана, 2004. – 29 с. 3. Аронов, Д. М. Некоторые аспекты патогенеза атеросклероза / Д. М. Аронов, В. П. Лупанов // Атеросклероз и дислипидемии. – 2011. – № 1. – С. 48–56. 4. Биохимические критерии оценки эффективности гиполипидемической терапии / Н. Я. Доценко, С. С. Боев, И. А. Шехунова и др. // Therapia. – 2009. – № 5. – С. 47–50. 5. Буеверова, Е. Л. Атерогенная дислипидемия и печень / Е. Л. Буеверова, О. М. Драпкина, В. Т. Ивашкин // Российские медицинские вести. – 2008. –Т. 13, № 1. – С. 17–23. 6. Ваулин, Н. А. Антиатеросклеротические эффекты статинов: обзор клинических исследований // Фарматека. – 2004. - № 6. –С. 56–61. 7. Гиполипидемическое действие сесквитерпенового лактона леукомизина / Р. М. Аксартов, Г. У. Жанайдарова, А. Е. Гуляев, С. М. Адекенов // Астана медициналық журналы. – 2007.– № 4.– С. 109–113. 8. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. – Пер. с англ. – М. : Практика, 1998. – 459 с. 9. Гмурман, В. Е. Теория вероятности и математическая статистика / В. Е. Гмурман. – М. : Высшая школа, 2006. – 284 с. 176 10. Гублер, Е. В. Применение непараметрических критериев в медикобиологических исследованиях / Е. В. Гублер, А. А. Генкин. – М.: Медицина, 1998. – 141 с. 11. Гуров, А. Н., Катунцева, Н. А. цереброваскулярными болезнями, Уровень летальности заболеваемости и смертности в Московской области в 2014 г. // Альманах клинической медицины. – 2015. – № 39. – С. 11–14. 12. Демидова, М. А. Моделирование атерогенной гиперлипидемии у кроликов / М. А. Демидова, О. В. Волкова, Е. Н. Егорова, И. А. Савчук // Современные проблемы науки и образования. – 2011. – № 3. – С.8-13. 13. Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза. Российские рекомендации (IV пересмотр), 2009. – 80 c. 14. Евдокимова, Г. Дислипидемия как фактор риска развития сердечнососудистых заболеваний и осложнений / Г. Евдокимова. – Consilium Medicum. – 2009. – № 10. – С. 93–99. 15. Звенигородская, Л. А. неалкогольной Гиполипидемическая жировой болезнью печени терапия / у больных с Л. А. Звенигородская, Н. Г. Самсонова, Е. А. Черкашова // РМЖ. – 2011. – Т. 19, № 17. – С. 1061–1066. 16. Изменения фракционного состава липопротеинов сыворотки крови мышей и крыс при липемии, вызванной тритоном WR 1339 / Ф. В. Тузиков, Т. А. Короленко, Н. А. Тузикова и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – № 5. – С. 499–502. 17. Изучение неспецифической токсичности сырья полыни беловатой Artemisia leucodes Schrenk. / Аксартов Р. М., Рахимова Б. Б., Талжанов Н. А. и др. // В сб. «Развитие фитохимии и перспективы создания новых лекарственных препаратов».– Алматы: Ғылым, 2004. – Т.3.– С. 130–140. 177 18. Карпов, Р. С. Атеросклероз: патогенез, клиника, функциональная диагностика, лечение / Р. С. Карпов, В. А. Дудко. – Томск: STT, 1998. – 672 с. 19. Колесникова, Е. В. Статины и урсодезоксихолевая кислота: терапевтические возможности при неалкогольной жировой болезни печени / Е. В. Колесникова // Сучасна гастроентерологiя. – 2010. – № 5. – С. 103–108. 20. Колчанов, Н. А. Генные сети липидного метаболизма / Н. А. Колчанов, М. И. Воевода, Т. Н. Кузнецова, В. А. Мордвинов, Е. В. Игнатьева // Бюллетень СО РАМН. – 2006. – № 2. – С. 29–42. 21. Костюкевич, О. И. Дислипидемия у кардиологических пациентов с сочетанным поражением ЖКТ: новое в патогенезе и современные возможности терапии / О. И. Костюкевич // РМЖ. – 2011. – Т. 19, № 14. – С. 870–873. 22. Котюжинская, С. Г. системы у Патогенетические больных атеросклерозом аспекты при липитранспортной жировой нагрузке / С. Г. Котюжинская, А. И. Гоженко, А. А. Свирский // Актуальні проблеми сучасної медицини: Вісник Української медичної стоматологічної академії. – 2014. – Т. 45, № 1. – С. 90–94. 23. Логинова, В. М. Влияние аторвастатина на липиды сыворотка крови мышей при экспериментальной липемии / В. М. Логинова, Ф. В. Тузиков, Н. А. Тузикова, М. С. Черканова, Е. Е. Филюшина, Т. А. Короленко // Бюллетень СО РАМН. – 2011. – Т. 31, №. 2. – С. 133–137. 24. Макаров, М. С. Флуоресценция в исследовании клеток: пути и возможности / М. С. Макаров // Молекулярная медицина. – 2013. – № 4. – С. 10–14. 25. Племенков, В. В. Химия изопреноидов. Глава 6. Сесквитерпены В. В. Племенков // Химия растительного сырья. – 2006. – № 4. – С. 59–86. / 178 26. Руководство по кардиологии: Учебное пособие. В 3 томах / Под ред. Г. И. Сторожакова, А. А. Горбаченкова – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2008. – Т. 1. – 682 с. 27. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / под ред. А. Н. Миронова. – М. : Гриф и К., 2012. – 944 с. 28. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р. У. Хабриева. – М. : Медицина, 2005 – 832 с. 29. Состав и технология отечественного препарата «Атеролид» / Г. Х. Тулеуова, Х. И. Итжанова, Б. Б. Рахимова и др. // Фармация Казахстана.– 2007. – № 5. – С. 27–28. 30. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. – М., АстраФармСервис, 2011. – 1728 с. 31. Статины в современной кардиологической практике / Ю. Н. Беленков, И. В. Сергиенко, А. А. Лякишев, В. В. Кухарчук – М., 2010. – 64 c. 32. Статины, фибраты и венозная тромбоэмболия: метаанализ / А. Сквиззато, М. Галли, Э. Ромуалди и др. // Серцева недостатнiсть. – 2011. – № 2. – С. 107–116. 33. Торшин, И. Ю. Сосудистые заболевания сердца, мозга и молекулярные гены. Часть 2: Роль молекулярных генов в системе гемостаза и формировании атеросклероза / И. Ю. Торшин, О. А. Громова // Трудный пациент. – 2008. – Т. 6, № 4. – С. 5–11. 34. Трошков, В. В. Получение гидроксиглутарильного статиноподобных и синтетических липофильного соединений с эквивалентов синтонов терпеноидным для 3R-3синтеза фрагментом / В. В. Трошков, В. В. Фоменко, Н. Ф. Салахутдинов // Химия и технология растительных веществ: Тезисы докладов V Всероссийской научной конференции, 8–12 июня 2008 г. – Уфа. – 2008. – С. 291. 179 35. Центральный НИИ организации и информатизации здравоохранения [Электронный ресурс] / Министерство здравоохранения Российской Федерации. – Электрон. дан. – Режим доступа : http://zo.mednet.ru/bd_zo_rf/zo_rf.php?type=1. – Загл. с экр. 36. Шилова, А. Н. Объем мирового фармрынка за 12 месяцев – к январю 2012 года [Электронный ресурс] / А. Н. Шилова // Аптека онлайн [Электронный ресурс] – Электрон. журн. – 2012. Вып. 822, № 1 . – Режим доступа : http://www.apteka.ua 37. A novel AMPK activator, WS070117, improves lipid metabolism discords in hamsters and HepG2 cells / Z. Lian, Y. Li, J. Gao et al. // Lipids Health Dis. – 2011. – Vol. 10. – P. 67–74. 38. A review of hyperlipidemia and medicinal plants / A. Kumar, A. Dhaliya Salam, A. S. Surya et al. // Int. J. Biomed. Sci. – 2013. – Vol. 2, N 4. – P. 219– 237. 39. Alagumanivasagam, G. A review on medicinal plants with potential hypolipidemic activity / G. Alagumanivasagam, P. Veeramani // Int. J. Pharmacy Anal. Res. – 2015. – Vol. 4, N 2 – P. 129–134. 40. Amino acid, mineral, and polyphenolic profiles of black vinegar, and its lipid lowering and antioxidant effects in vivo / C.H. Chou, C.W. Liu, D.J. Yang et al. // Food Chemistry. – 2015. – Vol. 168. –№1 – P. 63-69. 41. Anti-cancer potential of sesquiterpene lactones: bioactivity and molecular mechanisms / S. Zhang, Y. K. Won, C. N. Ong [et al.] // Curr Med Chem Anticancer Agents. – 2005. – Vol. 5, № 3. – P. 239–249. 42. Antidiabetic and antilipidemic effect of eremanthin from Costus speciosus (Koen.) Sm., in STZ-induced diabetic rats / J. Eliza, P. Daisy, S. Ignacimuthu, V. Duraipandiyan // Chem Biol Interact. – 2009. – Vol. 182, № 1. – P. 67–72. 43. Antidiabetic and antilipidemic effect of eremanthin from Costus speciosus (Koen.)Sm., in STZ-induced diabetic rats / J. Eliza, P. Daisy , S. Ignacimuthu, V. Duraipandiyan // Chem Biol Interact. – 2009. – Vol. 182, № 1 – P. 67–72. 180 44. Antidiabetic effect of burdock (Arctium lappa L.) root ethanolic extract on strepto-zotocin-induced diabetic rats / J. Cao, C. Li, P. Zhang et al. // Afr. J. Bio-technol. – 2012. – Vol. 11, N 37. – P. 9079–9085. 45. Antihyperlipidemic activity of sesquiterpene lactones and related compounds / I. H. Hall, K. H. Lee, C. O. Starnes et al. // J Pharm Sci. – 1980. – Vol. 69, № 6. – P. 694–697. 46. Anti-hyperlipidemic effects of red ginseng acidic polysaccharide from Korean Red Ginseng / Y. S. Kwak, J. S. Kyung, J. S. Kim et al. // Biol.Pharm.Bull. – 2010. – Vol. 33, № 3. – P. 468–472. 47. Anti-hyperlipidemic sesquiterpenes and new sesquiterpene glycosides from the leaves of artichoke (Cynara scolymus L.): structure requirement and mode of action / H. Shimoda, K. Ninomiya, N. Nishida et al. // Bioorg Med Chem Lett. – 2003. Vol. 13, № 2. – P. 223–228. 48. Antihyperlipidemic sesquiterpenes and new sesquiterpene glycosides from the leaves of Artichoke (Cynara scolymus L.): structure requirement and mode of action / H. Shimoda, K. Ninomiya, N. Nishida et al. // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2003. – Vol. 13, N 2. – P. 223–228. 49. Antihypertensive and antihyperlipidemic effects of Achillea Wilhelmsii / S. Asgary, G. H. Naderi, N. Sarrafzadegan et al. // Drugs Exp Clin Res. – 2000. – Vol. 26, № 3. – P. 89–93. 50. Anti-inflammatory properties from isolated compounds of Cyclolepis genistoides / A. Sosa, M. R. Fusco, P. Rossomando et al. // Pharm Biol. – 2011. – Vol. 49, № 7. – P. 675–678. 51. Antimicrobial activity of sesquiterpene lactones isolated from traditional medicinal plant, Costus speciosus (Koen ex.Retz.) Sm. / V. Duraipandiyan, N. A. Al-Harbi, S. Ignacimuthu, C. Muthukumar // BMC Complement Altern Med. – 2012. – Vol. 12. – P. 13. 52. Apoptosis-mediated cytotoxic effects of parthenolide and the new synthetic analog MZ-6 on two breast cancer cell lines / A. Wyrebska, J. Szymanski, K. Gach et al. // Mol. Biol. Rep. – 2013. – Vol. 40. – P. 1655–1663. 181 53. Arglabin-DMA, a plant derived sesquiterpene, inhibits farnesyltransferase / T. E. Shaikenov, S. M. Adekenov, R. M. Williams // Oncol Rep. – 2001. – Vol. 8, № 1. – P. 173–179. 54. Bays, H. Statin safety: an overview and assessment of the data 2005 / H. Bays // Am. J. Cardiol. – 2006. – Vol. 97. – Р. 6–27. 55. Berberine ameliorates inflammation in patients with acute coronary syndrome following percutaneous coronary intervention / S. Meng, L.S. Wang, Z.Q. Huang et al. // Clinical and Experiment Pharmacology and Physiology. – 2012. – Vol. 39. – P. 406-411. 56. Bodor, E. T. Nicotinic acid: an old drug with a promising future / E. T. Bodor, S. Offermanns // Br J Pharmacol. – 2008. – Vol. 153, № 1. – P. 68–75. 57. Bonnefont, J. P. Carnitine palmitoyltransferases 1 and 2: biochemical, molecular and medical aspects / J. P. Bonnefont, F. Djouadi, C. Prip-Buus, S. Gobin, A. Munnich, J. Bastin // Mol. Aspects Med. – 2004. – Vol. 24, № 56. – P. 495–520. 58. Borradaile, N. M. Inhibition of hepatocyte apoB secretion by naringenin: enhanced rapid intracellular degradation independent of reduced microsomal cholesteryl esters / N. M. Borradaile, L. E. Dreu et al. // J. Lipid Res. 2002. V. 43, № 9. P. 1544–1554. 59. Burnett, J. R. The ACAT inhibitor avasimibe increases the fractional clearance rate of postprandial triglyceride-rich lipoproteins in miniature pigs / J. R. Burnett, D. E. Telford, P. H. Barrett, M. W. Huff // Biochim. Biophys. Acta. – 2005. – Vol. 1738, № 1–3. – P. 10–18. 60. Chaturvedi, D. Sesquiterpene lactones: structural diversity and their biological activities / D. Chaturvedi // Opportunity, challenge and scope of natural products in medicinal chemistry. – 2011. – P. 313–334. 61. Chen, Z. Y. Cholesterol-lowering nutraceuticals and functional foods / Z. Y. Chen, R. Jiao, K. Y. Ma // J. Agric. Food Chem. – 2008. – Vol. 56, № 19. – P. 8761–8773. 182 62. Cicero, A. Food and plant bioactives for reducing cardiometabolic disease: How does the evidence stack up? / A. Cicero, A. Colletti // Trends in Food Science & Technology. – 2017. – Vol. 69. – P. 192-202. 63. Ciprofibrate therapy improves endothelial function and reduces postprandial lipemia and oxidative stress in type 2 diabetes mellitus / M. Evans, R. A. Anderson, J. Graham et al. // Circulation – 2000. – Vol. 101, № 15. – P. 1773–1779. 64. Classification of different cholesterol and triglyceride reducing medicines [Электронный ресурс] / WHO Collaborating Centre for Drug Statistics Methodogy. – Электрон. дан. – Режим доступа : http://www.whocc.no/atc_ddd_index/?code=C&showdescription=yes. – Загл. сэкр. 65. Combadiere, C. Combined inhibition of CCL2, CX3CR1, and CCR5 abrogates Ly6C(hi) and Ly6C(lo) monocytosis and almost abolishes atherosclerosis in hypercholesterolemic mice / C. Combadiere, S. Potteaux, M. Rodero et al. // Circulation. – 2008. – Vol. 117. – P. 1649–1657. 66. Combinations of phytomedicines with different lipid lowering activity for dyslipidemia management: The available clinical data / A. Cicero, A. Colletti // Phytomedicine. – 2016. – Vol. 23. –№11. – P. 1113-1118. 67. Curcumin enhanced cholesterol efflux by upregulating ABCA1 expression through AMPK-SIRT1-LXRalpha signaling in THP-1 macrophage-derived foam cells / X.L. Liu, M.H. Liu, H.J. Hu et al. // DNA and Cell Biology. – 2015. – Vol. 34. – P. 561-572. 68. Curcumin enhances cell-surface LDLR level and promotes LDL uptake through downregulation of PCSK9 gene expression in HepG2 cells / M.H. Tai, P.K. Chen, P.Y. Chen et al. // Molecular Nutrition and Food Research. – 2014. – Vol. 58. – P. 2133-2145. 69. Cytotoxic activity of some natural and synthetic sesquiterpene lactones / M. Bruno, S. Rosselli, A. Maggio et al. / Planta Med. – 2005. – Vol. 71, № 12. – P. 1176–1178. 183 70. Dahiru, D. Effect of Aqueous Extract of Ziziphus mauritiana Leaf on Cholesterol and Triglyceride Levels in Serum and Liver of Rats Administered Alcohol / D. Dahiru, O. Obidoa // Pakistan Journal of Nutrition. – 2009. – Vol. 8, № 12. – P. 1884–1888. 71. De Souza, M. O. The hypocholesterolemic activity of açaí (Euterpe oleracea Mart.) is mediated by the enhanced expression of the ATP-binding cassette, subfamily G transporters 5 and 8 and low-density lipoprotein receptor genes in the rat / M. O. de Souza, L. Souza, E. Silva, C. L. de Brito Magalhães, B. B. de Figueiredo, D. C. Costa, M. E. Silva, M. L. Pedrosa // Nutr. Res. – 2012. – Vol. 32, № 12. – P. 976–984. 72. Development of a structural model for NF-kappa B inhibition of sesquiterpene lactones using self-organizing neural networks / S. Wagner, A. Hofmann, B. Siedle et al. // J Med Chem. – 2006. – Vol. 49, № 7. – P. 2241–2252. 73. Diet-induce atherosclerosis/hypercholesterolemia in rodent models [Электронный ресурс] / ed. by M. A. Pellizzon. – Электрон. дан. – URL: http://www.researchdiets.com/product-literature 74. Direct effects of statins on the vascular wall / A. Corsini, F. Pazzucconi, L. Arnaboldi et al. // J. Cardiovasc. Pharmacol. – 1998. – Vol. 31. – P. 773– 778. 75. Direct vascular effects of HMG-CoA reductase inhibitors / S. Bellosta, F. Bernini, N. Ferri et al. // Atherosclerosis. – 1998. – Vol. 137. – P. 101–109. 76. Discovery of a new class of HMG-CoA reductase inhibitor from Polyalthia longifolia as potential lipid lowering agent / K. V. Sashidhara, S. P. Singh, A. Srivastava et al. // Eur J Med Chem. – 2011. – Vol. 46, № 10. – P. 5206– 5211. 77. Effect of Berberine on promoting the excretion of cholesterol in high-fat dietinduced hyperlipidemic hamsters / X.Y. Li, Z.X. Zhao, M. Huang et al. // Journal of Translational Medicine. – 2015. – Vol. 13. – P. 278. 184 78. Effect of pectin and amidated pectin on cholesterol homeostasis and cecal metabolism in rats fed a high-cholesterol diet / M. Marounek, Z. Volek, A. Synytsya et al. // Physiol. Res. – 2007. – Vol. 56. – P. 433-442. 79. Effects of supplementation with green tea catechins on plasma C-reactive protein concentrations: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials / C. Serban, A. Sahebkar, D. Antal et al. // Nutrition. – 2015. – Vol. 31. – P. 1061-1071. 80. Elisaf, M. Effects of fi brates on serum metabolic parameters / M. Elisaf // Current Med Res Opinion – 2002. – Vol. 18, № 5. – P. 269–276. 81. Eliza, J. Antioxidant activity of costunolide and eremanthin isolated from Costus speciosus (Koen ex. Retz) Sm. / J. Eliza, P. Daisy, S. Ignacimuthu // Chem Biol Interact. – 2010. – Vol. 188, № 3. – P. 467–472. 82. Evaluation of hypoglycemic activity of total lignans from Fructus Arctii in the spon-taneously diabetic Goto-Kakizaki rats // Z. Xu, J. Ju, K. Wanget et al. //J. Ethnopharmacol. – 2014. – Vol. 151, N 1. – P. 548–555. 83. Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of Hight Blood Cholesterol in Adults. Executive Summary of The Third Report of the National Cholesterol Education Programm (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of Hight Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA. – 2001. – Vol. 285. – P. 2486–2497. 84. Flavonoids, vascular function and cardiovascular protection / D. Grassi, G. Desideri, G. Croce et al. // Curr. Pharm. Des. – 2009. – Vol. 15. – P. 1072– 1084. 85. Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues / J. Folch, M. Lees, G. H. Sloane-Stanley // J. Biol. Chem. – 1957. – Vol. 226, № 1. – P. 497–509. 86. Fu, Z. D. Atorvastatin induces bile acid-synthetic enzyme Cyp7a1 by suppressing FXR signaling in both liver and intestine in mice / Z. D. Fu, J. Y. Cui, C. D. Klaassen // J. Lipid. Res. – 2014. – Vol. 55, № 12. – P. 2576– 2586. 185 87. Galani, V. J. Sphaeranthus indicus Linn.: A phytopharmacological review / V. J. Galani, B. G. Patel, D. G. Rana / Int J Ayurveda Res. – 2010. – Vol. 1, № 4. – P. 247–253. 88. García-Ruiz, I. In vitro treatment of HepG2 cells with saturated fatty acids reproduces mitochondrial dysfunction found innonalcoholic steatohepatitis / I. García-Ruiz, P. Solís-Muñoz, D. Fernández-Moreira et al. // Dis. Model Mech. – 2015. – Vol. 8, № 2. – P. 183–191. 89. Gbaguidi, G. F. The inhibition of the human cholesterol 7alpha-hydroxylase gene (CYP7A1) promoter by fibrates in cultured cells is mediated via the liver x receptor alpha and peroxisome proliferator-activated receptor alpha heterodimer // G. F. Gbaguidi, L. B. Agellon // Nucleic. Acids Res. – 2004. – Vol. 32, № 3. – P. 1113–1121. 90. Getz, G. S. Animal models of atherosclerosis / G. S. Getz, C. A. Reardon // Atheroscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2012. – Vol. 35, № 5. – P. 1104-1115. 91. Getz, G. S. Diet and murine atherosclerosis / G. S. Getz, C. A. Reardon // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2006. – Vol. 26. – P. 242–249. 92. Gleissner, C. A. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages / C. A. Gleissner, I. Shaked, K. M. Little, K. Ley // J Immunol. – 2010. – Vol. 184. – P. 4810–4818. 93. Goldstein, J. L. Protein sensors for membrane sterols / J. L. Goldstein, R. A. Bose-Boyd, M. S. Brown // Cell. – 2006. – Vol. 124. – P. 35–46. 94. Goto, D. Upregulation of low density lipoprotein receptor by gemfibrozil, a hypolipidemic agent, in human hepatoma cells through stabilization of mRNA transcripts / D. Goto, T. Okimoto, M. Ono et al. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 1997. – Vol. 17, № 11. – P. 2707–2712. 95. Green tea consumption improves endothelial function but not circulating endothelial progenitor cells in patients with chronic renal failure / C.S. Park, W. Kim, J.S. Woo et al. // International Journal of Cardiology. – 2010. – Vol. 145. – P. 261-272. 186 96. Gurevich, V. S. Influenza, autoimmunity and atherogenesis / V. S. Gurevich // Autoimmun. Rev. – 2005. – Vol. 4, № 2. – P. 101–105. 97. Guyton, J. R. Benefit versus risk in statin treatment / J. R. Guyton // Am. J. Cardiol. – 2006. – Vol. 97. – Р. 96–99. 98. Haglund, O. The effects of fish oil on triglycerides, cholesterol, fibrinogen and malondialdehyde in humans supplemented with vitamin E / O. Haglund, R. Luostarinen, R. Wallin // J. Nutr. – 1991. – V. 121. – P. 165–169. 99. Hennekens, C. H. Current perspectives on lipid lowering with statins to decrease risk of cardiovascular disease / C. H. Hennekens // Clin Cardiol. – 2001. – Vol. 24, № 7. – P. 2–5. 100. Hepatocurative potential of sesquiterpene lactones of Taraxacum officinale on carbon tetrachloride induced liver toxicity in mice / A. Mahesh, R. Jeyachandran, L. Cindrella // Acta Biol Hung. – 2010. – Vol. 61, № 2. – P. 175–190. 101. Herbal Medicine: Biomolecular and Clinical Aspects, Second Edition / eds. I. F. F. Bezie, S. Wachtel-Galor. – CRC Press, 2011. – 499 p. 102. Huang, Z. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-alpha in mice induces expression of the hepatic low-density lipoprotein receptor / Z. Huang, X. Zhou, A. C. Nicholson et al. // Br. J. Pharmacol. – 2008. – Vol. 155, № 4. – P. 596–605. 103. Hypolipemic and hypoglycaemic activity of bergamot polyphenols: from animal models to human studies / V. Mollace, I. Sacco, E. Janda et al. // Fitoterapia. – 2011. – Vol. 82. – P. 309-316. 104. Hypolipidemic properties of triterpenoids / Yu. K. Vasilenko, L. I. Lisevitskaya, L. M. Frolova et al. // Farmakol Toksikol. – 1982. – Vol. 45, № 5. – P. 66–70. 105. Ilan, E. Triacylglycerol-mediated oxidative stress inhibits nitric oxide production in rat isolated hepatocytes / E. Ilan, O. Tirosh, Z. Madar // J. Nutr. – 2005. – Vol. 135, № 9. – P. 2090–2095. 187 106. In vitro antihyperlipidemic potential of triterpenes from stem bark of Protorhus longifolia / R. A. Mosa, J. J. Naidoo, F. S. Nkomo et al. // Planta Med. – 2014. – Vol. 80, N 18. – P. 1685–1691. 107. In vivo anti-hyperlipidemic activity of the triterpene from the stembark of Protorhus longifolia (Benrh) Engl / K. E. Machaba, S. Z. Cobongela, R. A. Mosa et al. // Lipids Health Dis. – 2014. – Vol. 13, N 131. – P. 1–7. 108. Inhibitory mechanism of costunolide, a sesquiterpene lactone isolated from Laurus nobilis, on blood-ethanol elevation in rats: involvement of inhibition of gastric emptying and increase in gastric juice secretion / H. Matsuda, H. Shimoda, K. Ninomiya et al. // Alcohol Alcohol. – 2002. – Vol. 37, № 2. – P. 121–127. 109. Itoh, M. HPLC analysis of lipoproteins in culture medium of hepatoma cells: an in vitro system for screening antihyperlipidemic drugs / M. Itoh, Y. Abe, Y. Iwama et al. // Biotechnol. Lett. – 2009. – Vol. 31, № 7. – P. 953–957. 110. Ivanescu, B. Sesquiterpene lactones from Artemisia genus: biological activities and methods of analysis / B. Ivanescu, A. Miron, A. Corciova // Journal of Analytical Methods in Chemistry. – 2015. – doi: 10.1155/2015/247685. 111. Ji, W. Hypolipidemic effects and mechanisms of Panax notoginseng on lipid profile in hyperlipidemic rats / W. Ji, B. Q. Gong // J Ethnopharmacol. – 2007. – Vol. 113, № 2. – P. 318–324. 112. Johansson, M. E. Haemodynamically significant plaque formation and regional endothelial dysfunction in cholesterol-fed ApoE-/-mice / M. E. Johansson, U. Hägg, J. Wikström et al. // Clin. Sci. (Lond.). – 2005. – Vol. 108, № 6. – P. 531–538. 113. Kaneko, M. Effect of farnesol on mevalonate pathway of Staphylococcus aureus / M. Kaneko, N. Togashi, H. J. Hamashima // Antibiot (Tokyo). – 2011. – Vol. 64, № 8. – P. 547–549. 114. Kapourchali, F. R. Animal models of atherosclerosis / F. R. Kapourchali, G. Surendiran, L. Chen et al. // World J. Clin. Cases. – 2014. – Vol. 2, № 5. – P. 126–132. 188 115. Kim, S. H. Effects of Panaxginseng extract on lipid metabolism in humans / Kim S. H., Park K. S. // Pharmacol Res. – 2003. – Vol. 48, № 5. – P. 511–513. 116. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation // Methods Mol. Biol. – 1994. – Vol. 32. – P. 9–15. 117. Lee, M. K. Naringenin 7-O-cetyl ether as inhibitor of HMG-CoA reductase and modulator of plasma and hepatic lipids in highcholesterol-fed rats / M. K. Lee, S. S. Moon et al. // Bioorg. Med. Chem. – 2003. – Vol. 11, № 3. – P. 393–398. 118. Lee, S. M. Onion peel extract increases hepatic low-density lipoprotein receptor and ATP-binding cassette transporter A1 messenger RNA expressions in Sprague-Dawley rats fed a high-fat diet / S. M. Lee, J. Moon, H. J. Do, J. H. Chung, K. H. Lee, Y. J. Cha, M. J. Shin // Nutr. Res. – 2012. – Vol. 32, № 3. – P. 210–217. 119. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis: transition from theory to practice / P. Libby, Y. Okamoto, V. Z. Rocha, E. Folco // Circ. J. – 2010. – Vol. 74, № 2. – P. 213–220. 120. Lipid-lowering effects of curcumin in patients with metabolic syndrome: A randomized, double-blind, placebo-controlled trial / Y.S. Yang, Y.F. Su, H.W. Yang et al. // Phytotherapy Research. – 2014. – Vol. 28. – P. 1770-1777. 121. Lipid-lowering effects of zerumbone, a natural cyclic sesquiterpene of Zingiber zerumbet Smith, in high-fat diet-induced hyperlipidemic hamsters / T. F. Tzeng, H. J. Lu, S. S. Liou et al. // Food Chem. Toxicol. – 2014. – Vol. 69, N 2. – P. 132–139. 122. Lipid-lowering, hepatoprotective, and atheroprotective effects of the mixture Hong-Qu and gypenosides in hyperlipidemia with NAFLD rats / S.H. Goua, H.F. Huanga, X.Y. Chen et al. // Journal of the Chinese Medical Association. – 2016. – Vol. 79. –№3 – P. 111-121. 123. Marrapodi, M. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) and agonist inhibit cholesterol 7alpha-hydroxylase gene (CYP7A1) transcription / M. Marrapodi, J. Y. Chiang // J. Lipid. Res. – 2000. – Vol. 41, № 4. – P. 514–520. 189 124. Merfort, I. Perspectives on sesquiterpene lactones in inflammation and cancer / I. Merfort // Curr Drug Targets. – 2011. – Vol. 12, № 1. – P. 1560–1573. 125. Meta-analysis of the effect and safety of berberine in the treatment of type 2 diabetes mellitus, hyperlipemia and hypertension / J. Lan, Y. Zhao, F. Dong et al. // Journal of Ethnopharmacology. – 2015. – Vol. 161. – P. 69-81. 126. Miyazaki, A. Acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase inhibitors for controlling hypercholesterolemia and atherosclerosis / A. Miyazaki, M. Sakai, Y. Sakamoto, S. Horiuchi // Curr. Opin. Investig. Drags. – 2003. – Vol. 4, № 9. – P. 1095–1099. 127. Molecular mechanisms of lipid- and glucose-lowering activities of bergamot flavonoids / E. Jandaab, A. Lascalaab, C. Martino et al. // PharmaNutrition. – 2016. – Vol. 4. – P. 8-18. 128. Moutzouri, E Management of dyslipidemias with fibrates, alone and in combination with statins: role of delayed-release fenofibric acid / E. Moutzouri, A. Kei, M. S. Elisaf, H. J. Milionis // Vasc Health Risk Manag. – 2010. – Vol. 6. – P. 525–539. 129. Mozzicafreddo, M. Rapid reverse phase-HPLC assay of HMG-CoA reductase activity / M. Mozzicafreddo, M. Cuccioloni, A. M. Eleuteri, M. Angeletti // J. Lipid. Res. – 2010. – Vol. 51, № 8. – P. 2460–2463. 130. Munday, M. R. The regulation of acetyl-CoA carboxylase – potential targer for the action of hypolipidemic agents / M. R. Munday, Ch. J. Hemingway // Advan. Enzyme Regul. – 1999. – Vol. 39. – P. 205–234. 131. Nakashima, Y. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree / Y. Nakashima, A. S. Plump, E. W. Raines et al. // Arterioscler. Thromb. – 1994. – Vol. 14, № 1. – P. 133– 140. 132. Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease / R. H. Nelson // Prim. Care. – 2013. – Vol. 40, № 1. – P. 195–211. 190 133. New fibrate use and acute renal outcomes in elderly adults: a population-based study / Y. Y. Zhao, M. A. Weir, M. Manno et al. // Ann Intern Med. – 2012. – Vol. 156, № 8. – P. 560–569. 134. Normo-glycemic and hypolipidemic effect of costunolide isolated from Costus speciosus (Koen ex. Retz.) Sm. in streptozotocin-induced diabetic rats / J. Eliza, P. Daisy, S. Ignacimuthu, V. Duraipandiyan // Chem Biol Interact. – 2009. – Vol. 179, № 2–3. – P. 329–334. 135. O’Driscoll, G. Simvastatin, an HMG-CoA reductase inhibitor, improves endothelial function within 1 month / G. O’Driscoll, D. Green, R. R. Taylor // Circulation. – 1997. – Vol. 95. – P. 1126–1131. 136. Ozansoy, G. Effects of gemfibrozil treatment on vascular reactivity of streptozotozin-diabetic rat aorta / G. Ozansoy, F. B. Akin // J. Pharm. Pharmacol. – 2004. – Vol. 56. – P. 241–246. 137. Pectin feeding influences fecal bile acid excretion, hepatic bile acid and cholesterol synthesis and serum cholesterol in rats / F. Garcia-Diez, V. GarciaMediavilla, J.E. Bayon et al. // J. Nutr. – 1996. – Vol. 126. – P. 1766-1771. 138. Peffley, D. M. Plant-derived monoterpenes suppress hamster kidney cell 3hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase synthesis at the posttranscriptional level / D. M. Peffley, A. K. Gayen // J Nutr. – 2003. – Vol. 133, № 1. – P. 38-44. 139. Peluso, M.R. Flavonoids attenuate cardiovascular disease, inhibit phosphodiesterase, and modulate lipid homeostasis in adipose tissue and liver / M.R. Peluso // Exp. Biol. Med. – 2006. – Vol. 231. – P. 1287-1299. 140. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR / M. W. Pfaffl // Nucleic. Acids. Res. ‒ 2001. ‒ V. 29, № 9. ‒ P. 45. 141. Phase II study of high-dose lovastatin in patients with advanced gastric adenocarcinoma / W. S. Kim, M. M. Kim, H. J. Choi et al. // Invest New Drugs. – 2001. – Vol. 19, № 1. – P. 81–83. 191 142. Phinikaridou, A. A robust rabbit model of human atherosclerosis and atherothrombosis / A. Phinikaridou, K. J. Hallock, Y. Qiao, J. A. Hamilton // J. Lipid. Res. – 2009. – Vol. 20, № 5. – P. 787–797. 143. Pinder, A. R. The Chemistry of the Terpenes / A. R. Pinder. – Wiley, New York, 1970. – 585 p. 144. Pirillo, A. Berberine, a plant alkaloid with lipid- and glucose-lowering properties: From in vitro evidence to clinical studies / A. Pirillo, L. Catapano // Atherosclerosis. – 2015. – Vol. 2. – P. 449–461. 145. Pirillo, A. Postprandial lipemia as a cardiometabolic risk factor / A. Pirillo, G. D. Norata, A. L. Catapano / Curr. Med. Res. Opin. – 2014. – Vol. 30, № 8. – P. 1489–1503. 146. Polysaccharides from Cyclocarya paliurus: Chemical composition and lipidlowering effect on rats challenged with high-fat diet / H. Wen-Bing, Z. Jing, H. Chen et al. // Journal of Functional Foods. – 2017. – Vol. 36. – P. 262-273. 147. Post, S. M. Fibrates suppress bile acid synthesis via peroxisome proliferatoractivated receptor-alpha-mediated downregulation of cholesterol 7alphahydroxylase and sterol 27-hydroxylase expression / S. M. Post, H. Duez, P. P. Gervois et al. //Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2001. – Vol. 21, № 11. – P. 1840–1845. 148. Potential role of bioactive compounds of Phaseolus vulgaris L. on lipidlowering mechanisms / A.K. Ramírez-Jiméneza, R. Reynoso-Camachoa, M. E. Tejero et al. // Food Research International. – 2015. – Vol. 76. –№1 – P. 92104. 149. Prieur, X. Congenital lipodystrophirs and dyslipidemia / X. Prieur, C. Le May, J. Magré, B. Cariou // Curr. Atheroscler. Rep. – 2014. – Vol. 16, № 9. – P. 437 (1–11). 150. Probucol prevents the progression of atherosclerosis in Watanabe heritable hyperlipidemic rabbit, an animal model for familial hypercholesterolemia / T. Kita, Y. Nagano, M. Yokode et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. – 1987. – Vol. 84. – P. 5928–5931. 192 151. Qin, W. Regulation of HMG-CoA reductase, apoprotein B and LDL receptor gene expression by the hypocholesterolemicdrugs simvastatin and ciprofibrate in Hep G2, human and rat hepatocytes // W. Qin, J. Infante et al. // Biochim. Biophys. Acta. – 1992. – Vol. 1127, № 1. – P. 57–66. 152. Quantitative structure-activity relationship of sesquiterpene lactones as inhibitors of the transcription factor NF-kappaB / B. Siedle, A.J. GarcíaPiñeres, R. Murillo // J Med Chem. – 2004. – Vol. 47, № 24. – P. 6042-6054. 153. Quintero, A. Antitumoral activity of new pyrimidine derivatives of sesquiterpene lactones / A. Quintero, A. Pelcastre, J. D. Solano // J Pharm Pharm Sci. – 1999. – Vol. 2, № 3. – P. 108–112. 154. Rajendran, P. The vascular endothelium and human diseases / P. Rajendran, T. Rengarajan, J. Thangavel // Int. J. Biol. Sci. – 2013. – Vol. 9, № 10. – P. 1057–1069. 155. Regulatory efficacy of fermented plant extract on the intestinal microflora and lipid profile in mildly hypercholesterolemic individuals / H.F. Chiua, Y.J. Chenb, Y.Y. Lu et al. // Journal of Food and Drug Analysis. – 2017. – Vol. 25. –№4 – P. 819-827. 156. Repetto, M. G. Bioactivity of sesquiterpenes: compounds that protect from alcohol-induced gastric mucosal lesions and oxidative damage / M. G. Repetto, A. Boveris // Mini Rev Med Chem. – 2010. – Vol. 10, № 7. – P. 615–623. 157. Roberts, C. K. HMG-CoA reductase, cholesterol 7alpha-hydroxylase, LDL receptor, SR-B1, and ACAT in diet-induced syndrome X / C. K. Roberts, K. Liang, R. J. Barnard, C. H. Kim, N. D. Vaziri // Kidney Int. – 2004. – Vol. 66, № 4. – P. 1503–1511. 158. Roglans, N. Fibrates modify the expression of key factors involved in bile-acid synthesis and biliary-lipid secretion in gallstone patients / N. Roglans, M. Vázquez-Carrera et al. // Eur. J. Clin. Pharmacol. – 2004. – Vol. 59, № 12. – P. 855–861. 193 159. Roglans, N. Increase in hepatic expression of SREBP 2 by gemfibrozil administration to rats / N. Roglans, C. Peris, J. C. Verd, M. Alegret et al. // Biochem. Pharmacol. – 2001. – Vol. 62, № 6. – P. 803–809. 160. Rosenson, R. S., Tangney C. C. Antiatherothrombotic properties of statins. Implications for cardiovascular event reduction / R. S. Rosenson, C. C. Tangney // JAMA. – 1998. – Vol. 279. – P. 1643–1650. 161. Russell, D. W. Bile acid biosynthesis / D. W. Russell, K. D. Setchell // Biochemistry. – 1992. – Vol. 31, № 20. – P. 4737–4749. 162. Russell, J. C. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis / J. C. Russell, S. D. Proctor // Cardiovasc. Pathol. – 2006. – Vol. 15, № 6. – P. 318–330. 163. Sahebkar, A. A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials investigating the effects of curcumin on blood lipid levels / A. Sahebkar // Clinical Nutrition. – 2014. – Vol. 33. – P. 406-414. 164. Sanan, D. A. Low density lipoprotein receptor negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a) / D. A. Sanan, D. L. Newland, R. Tao et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1998. – Vol. 95, № 8. – P. 4544–4549. 165. Sesquiterpene farnesol as a competitive inhibitor of lipase activity of Staphylococcus aureus / M. Kuroda, S. Nagasaki, R. Ito et al. // FEMS Microbiol Lett. – 2007. – Vol. 273, № 1. – P. 28–34. 166. Sesquiterpene lactone fraction from Artemisia khorassanica inhibits inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 expression through the inactivation of NF-κB / S. A. Emami, S. Z. Taghizadeh Rabe, M. Iranshahi // Immunopharmacol Immunotoxicol. – 2010. – Vol. 32, № 4. – P. 688–695. 167. Sesquiterpene lactone, a potent drug molecule from Artemisia pallens wall with anti-inflammatory activity / A. D. Ruikar, A. V. Misar, R. B. Jadhav // Arzneimittelforschung. – 2011. – Vol. 61, № 9. – P. 510–514. 194 168. Sesquiterpene lactones from Artemisia species / H. Z. Khathlan et al. // Jour. Chem. Soc. Pak. – 1992. – Vol. 4, № 2. – P. 151–165. 169. Shandilya, L. N. Hypolipidemic effects of gossypol in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) / L. N. Shandilya, T. B. Clarkson // Lipids. – 1982. – Vol. 17, № 4. – P. 285–290. 170. Shen, Ch. Gel entrapment culture of rat hepatocytes for investigation of tetracycline-induced toxicity / Ch. Shen, Q. Meng, E. Schmelzer, A. Bader // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 2009. – Vol. 238. – P. 178–187. 171. Singh, S. Lipid lowering agents of natural origin: An account of some promising chemotypes / S. Singh, V. Koneni // European Journal of Medicinal Chemistry. – 2017. – Vol. 140, N 10. – P. 331–348. 172. Singh, V. Models to study atherosclerosis: a mechanistic insight // V. Singh, R. L. Tiwari, M. Dikshit, M. K. Barthwal // Curr. Vasc. Pharmacol. – 2009. – Vol. 7, № 1. – P. 75–109. 173. Srinivasan, K. Animal models in type 2 diabetes research: an overview / K. Srinivasan, P. Ramarao // Indian J. Med. Res. – 2007. – Vol. 125, № 3. – P. 451–472. 174. Staeles, B. Fibrates downregulate apolipoprotein expression independent of induction of peroxisomal acyl coenzyme A oxidase: a potential mechanism for the hypolipidemic action of fibrates / B. Staeles, N. Vu-Dac, V. Kosykh et.al. // J. Clin. Invest. – 1995. – Vol. 95. – P. 705–712. 175. Staels, B. Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism / B. Staels, J. Dallongeville et al. // Circulation. – 1998. – Vol. 98, № 19. – P. 2088–2093. 176. Stary, H. C. A definition of initial, fatty streak, and intermediate lesions of atherosclerosis. A report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association / H. C. Stary, A. B. Chandler, S. Glagov et al. // Arterioscler. Tromb. – 1994. – Vol. 14, № 5. – P. 840–856. 195 177. Statin-like principles of bergamot fruit (Citrus bergamia): isolation of 3hydroxymethylglutaryl flavonoid glycosides / L. Di Donna, G. De Luca, F. Mazzotti et al. // J. Nat. Prod. – 2009. – Vol. 72. – P. 1352-1354. 178. Stefanello, M. É. Essential oils from neotropical Myrtaceae: chemical diversity and biological properties / M. É. Stefanello, A. C. Pascoal, M. J. Salvador // Chem Biodivers. – 2011. – Vol. 8, № 1. – P. 73–94. 179. Swirzer, J. A., Hess D. C. Statin therapy for coronary heart disease and its effect on stroke // Curr. Atheroscler. Rep. 2006. – Vol. 8. – P. 337–342. 180. Tea consumption and risk of cardiovascular outcomes and total mortality: A systematic review and meta-analysis of prospective observational studies / C. Zhang, Y.Y. Qin, X. Wei et al. // European Journal of Epidemiology. – 2015. – Vol. 30. – P. 103-113. 181. Telomerase activity and hepatic functions of rat embryonic liver progenitor cell in nanoscaffold-coated model bioreactor / Sh. Giri, K. Nieber et al. // Mol. Cell. Biochem. – 2010. – Vol. 336. – P. 137–149. 182. Tenenbaum, A. Fibrates are an essential part of modern anti-dyslipidemic arsenal: spotlight on atherogenic dyslipidemia and residual risk reduction / A. Tenenbaum, E. Z. Fisman // Cardiovasc. Diabetol. – 2012. – Vol. 11, № 125. – P. 1–10. 183. The angioprotector and hypolipemic activity of leukomizin in experimental atherosclerosis / A. G. Kirmukov, M. I. Aĭzikov, S. A. Rasulova et al. // Farmakol Toksikol. – 1991. – Vol. 54, № 3. – P. 35–37. 184. The apolipoprotein e knockout mouse: a model documenting accelerated atherogenesis in uremia // Buzello M, Törnig J, Faulhaber J. et al. // J Am Soc Nephrol. – 2003. – Vol. 14. – № 2. – P. 311–316. 185. The effect of green tea on blood pressure and lipid profile: A systematic review and meta-analysis of randomized clinical trials / I. Onakpoya, E. Spencer, C. Heneghan et al. // Nutrition Metabolism and Cardiovascular Disease. – 2014. – Vol. 24. – P. 823-836. 196 186. The search for new antimalarial drugs from plants used to treat fever and malaria or plants randomly selected: a review / A. U. Krettli, V. F. AndradeNeto, M. G. Brandao, W. M. Ferrari // Mem Inst Oswaldo Cruz. – 2001. – Vol. 96, № 8. – P. 1033–1042. 187. Tirosh, O. Nutritional lipid-induced oxidative stress leads to mitochondrial dysfunction followed by necrotic death in FaO hepatocytes / O. Tirosh, E. Ilan, S. Anavi et al. // Nutrition. – 2009. – Vol. 25, N. 2. – P. 200–208. 188. Tomé-Carneiro, J. Polyphenol-based nutraceuticals for the prevention and treatment of cardiovascular disease: Review of human evidence / J. ToméCarneiro, F. Visioli // Phytomedicine. – 2016. – Vol. 23. – P. 1145-1174. 189. Umeda, Y. Inhibitory action of gemfibrozil on cholesterol absorption in rat intestine / Y, Umeda., Yu. Kako, K. Mizutani et al. // The Journal of Lipid Research. – 2001. – V. 42. – P. 1214–1219. 190. Undas, A. Statins and blood coagulation / A. Undas, K. E. Brummel-Ziedins, K. G. Mann // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 2005. – Vol. 25. – P. 287–294. 191. Van Veldhoven, P. P. Lipase-based quntitation of triacylglycerols in cellular lipid extracts: requirement for presence of detergent and prior separation by thin-layer chromatography / P. P. Van Veldhoven, J. V. Swinnen, M. Esquent, G. Verhoeven // Lipids. – 1997. – Vol. 32. – № 12. – P. 1297–1300. 192. Wang, X. SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterolregulated proteolysis / X. Wang, R. Sato, M. S. Brown et al. // Cell. – 1994. – Vol. 77, № 1. – P. 53–62. 193. Wang, Y. M. The mechanism of dietary cholesterol effects on lipids metabolism in rats / Y. M. Wang, B. Zhang, Y. Xue, Z. J. Li, J. F. Wang, C. H. Xue, T. Yanagita // Lipids Health. Dis. – 2010. – Vol. 9, N. 4. 194. Weissglas-Volkov, D. Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol / D. Weissglas-Volkov, P. Pajukanta // J. Lipid Res. – 2010. – Vol. 51, № 8. – P. 2032–2057. 197 195. Xiangdong, L. Animal models for the atherosclerosis research: a review / L. Xiangdong, L. Yuanwu, Z. Hua et al. // Protein Cell. – 2011. – Vol. 2, № 3. – P. 189–201. 196. Xiao, C. New and emerging regulators of intestinal lipoprotein secretion / C. Xiao, S. Dash, C. Morgantini, G. F. Lewis // Atherosclerosis. – 2014. – Vol. 233, № 2. – P. 608–615. 197. Xu, S. Evaluation of foam cell formation in cultured macrophages: an improved method with Oil Red O staining and Dil-oxLDL uptake / S. Xu, Y. Huang, Y. Xie et al. // Cytotechnology. – 2010. – V. 62. – P. 473–481. 198. Yamazaki, H. Pentacecilides, new inhibitors of lipid droplet formation in mouse macrophages produced by Penicillium cecidicola FKI-3765-1: II. Structure elucidation / H. Yamazaki, S. Omura, H. Tomoda // J Antibiot (Tokyo). – 2009. – Vol. 62, № 4. – P. 207–211. 199. Yang, T. Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols pro-mote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER / T. Yang, P. J. Espenshade, M. E. Wright et al. // Cell. – 2002. – Vol. 110, № 4. – P. 489–500. 200. Yao, P. Ginkgo biloba extract prevents ethanol induced dyslipidemia / P. Yao, F. Song, K. Li et al. // Am J Chin Med. – 2007. – Vol. 35, № 4. – P. 643–652. 201. Yuan, G. Hypertriglyceridemia: its etiology, effects and treatment / G. Yuan, K. Z. Al-Shali, R. A. Hegele // CMAJ. – 2007. – Vol. 176, № 8. – P. 1113– 1120. 202. Yusuf, S. Effect of potentially modifiable risk factors associated with myocardial infarction in 52 countries (the INTERHEART study): case-control study / S. Yusuf, S. Hawken, S. Ounpuu et al. // Lancet. – 2004. – Vol. 364, № 9438. – P. 937–952. 203. Zhang, S. H. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipotein E / S. H. Zhang, R. L. Reddick, J. A. Piedrahita et al. // Science. – 1992. – Vol. 258, № 5081. – P. 468–471. 198 204. Zhang, X. Spontaneous atherosclerosis in aged lipoprotein lipase-deficient mice with severe hypertriglyceridemia on a normal chow diet / X. Zhang, R. Qi, X. Xian et al. // Circ. Res. – 2008. – Vol. 102, № 2. – P. 250–256. 205. Zhu, D. Effect of gemfibrozil of apolipoprotein B secretion and diacylglycerol acyltransferase activity in human hepatoblastoma (HepG2) cells. / D. Zhu, S. H. Ganji, V. S. Kamanna et al. // Atherosclerosis. – 2002. – Vol. 164. – № 2. – P. 221–228.
