МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. Н. П. ОГАРЕВА АГРАРНЫЙ ИНСТИТУТ КАФЕДРА ВЕТЕРИНАРНОЙ ПАТОЛОГИИ АКУШЕРСТВО, ГИНЕКОЛОГИЯ И БИОТЕХНИКА РАЗМНОЖЕНИЯ ЖИВОТНЫХ РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ С МЕТОДИЧЕСКИМИ УКАЗАНИЯМИ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНО-ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ ПО РАЗДЕЛУ: «БИОТЕХНИКА РАЗМНОЖЕНИЯ ЖИВОТНЫХ» САРАНСК Составитель: Кирдяев В. М., кандидат ветеринарных наук Рабочая тетрадь по разделу «Биотехника размножения животных» предназначена для студентов Аграрного института очной формы обучения специальностей «Ветеринария», «Зоотехния», «Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции» Печатается в авторской редакции Бумага офсетная. Формат 60х84 1/16. гарнитура Тайме. Печать способом ризографии. Усл. печ. л. Уч.-изд. л. Тираж 50 экз. Заказ №??? Отпечатано в типографии «Полиграф» (ИП Ковалева Е.Н.), г. Саранск, ул. Рабочая, 155 © Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………….. Занятие 1. Анатомические особенности строения половых органов сельскохозяйственных животных………………………... Занятие 2. Подготовка инструментов, растворов и материала, используемых при искусственном осеменении самок сельскохозяйственных животных….……………………………..... Занятие 3. Устройство и подготовка искусственной вагины. Способы получения спермы и использование племенных производителей……………………………………………………... Занятие 4. Макроскопическая оценка качества спермы.………..... Занятие 5. Микроскопическая оценка качества спермы ...………. Занятие 6. Определение густоты и концентрации спермиев…….. Занятие 7. Разбавление и хранение спермы. Компоненты разбавителей. Способы хранения спермы. Правила ТБ при работе с жидким азотом……………………………………….. Занятие 8. Изучение влияния температуры, рН, осмотического давления и химических веществ на жизнеспособность спермиев. Занятие 9. Учет и отчетность на племстанциях и пунктах искусственного осеменения……………………………. Занятие 10. Устройство и организация работы на ОАО «Мордовиягосплем»………….…………………………… Занятие 11. Особенности половой цикличности самок сельскохозяйственных животных………………………………….. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ…………… 3 4 9 12 16 18 25 29 34 37 40 40 42 ВВЕДЕНИЕ Искусственное осеменение – крупнейшее достижение биологической науки ХХ века. В течение последних 50 лет искусственное осеменение является основным зоотехническим методом воспроизводства сельскохозяйственных животных. Он широко используется как для контроля заболеваний скота, передающихся половым путем, так и для улучшения генетических показателей сельскохозяйственных животных. Использование криоконсервантов для глубокого замораживания спермы позволило продлить жизнь спермиев, полученных от высокоценных племенных производителей, открыло возможности для транспортировки семени в отдаленные регионы России и за рубеж. Прогресс эндокринологической науки в области размножения самок сельскохозяйственных животных привел к развитию методов синхронизации эструса с использованием простагландинов или прогестагенов. Это позволило внедрить в зооветеринарную практику метод трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных. Несмотря на прогресс, достигнутый в области искусственного осеменения, существуют проблемы с использованием замороженного семени в свиноводстве и овцеводстве. Большой интерес представляет изучение морфологии и биохимии спермиев, рассмотрение влияния семенной плазмы на жизнеспособность спермиев, изучение механизмов акросомной реакции и капацитации спермиев. Данные методические указания разработаны для приобретения навыков практической работы в области искусственного осеменения в соответствии с программой курса «Акушерство, гинекология и биотехника размножения животных». Занятие 1 Анатомические особенности строения половых органов сельскохозяйственных животных Цель: изучить анатомию половых органов животных, определить видовые морфологические особенности половых органов Материалы и оборудование: половые органы убитых самок и самцов, рисунки, плакаты, муляжи половых органов самок и самцов, анатомические и хирургические пинцеты, ножи, скальпели, ножницы прямые и изогнутые, линейки, кюветы. Половые органы самок сельскохозяйственных животных подразделяются на наружные и внутренние. К наружным относятся: вульва (половые губы и половая щель), клитор и преддверие влагалища; к внутренним: влагалище, матка (место развития плода), яйцепроводы (место оплодотворения), яичники (основные половые железы). Половые органы самцов состоят из семенников (парные половые железы),, которые находятся в мошонке, выводящих половых путей (придатки семенников и семяпроводы), придаточных половых желез (пузырьковидная, предстательная и луковичная), мочеполового канала и полового члена, головка которого находится в препуции (кожный мешок на нижней стенке живота). Задание № 1: Изучить форму, размеры, консистенцию яичников, установить на поверхности и на разрезе яичников наличие фолликулов или желтого тела. Осмотреть яйцепроводы, установить их извитость, расположение воронки, провести продольный разрез яйцепроводов и рассмотреть слизистую, установить длину яйцепроводов. Для изучения матки провести продольный разрез ее рога, тела и шейки. На слизистой матки жвачных животных найти карункулы. Изучить форму шейки матки, ее консистенцию и размеры, форму и размеры влагалища и преддверия влагалища, найти отверстие мочеиспускательного канала, осмотреть вульву. Описать морфологические особенности: вульвы, влагалища, матки (шейки, тела и рогов) и яичников с последующим внесением данных в таблицу 1. Задание № 2: На боенском материале отпрепарировать органы размножения самцов сельскохозяйственных животных. Описать морфологические особенности: семенников, их придатков, семяпроводов, полового члена, придаточных половых желез (пузырьковидной, луковичной, предстательной), мошонки и препуция. Полученные данные занести в таблицу 2. Таблица 1 - Анатомические особенности строения половых органов самок сельскохозяйственных животных Вид животного 1 Вульва Влагалище 2 3 шейка 4 Матка тело 5 рога 6 Яичники 7 1 2 3 4 5 6 7 Таблица 2 - Анатомические особенности строения половых органов самцов сельскохозяйственных животных Вид животного 1 Мошонка Препуций Половой член 2 3 4 Придаточные половые железы пузырьковидная луковичная предстательная 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Занятие 2 Подготовка инструментов, растворов и материала, используемых при искусственном осеменении самок сельскохозяйственных животных Цель: изучить способы подготовки инструментов, используемых при искусственном осеменении, изучить какие растворы применяют для подготовки инструментов и методику их приготовления, освоить технику приготовления стерильных ватных тампонов и марлевых салфеток. Приборы и материалы: Вода дистиллированная и водопроводная, спирт этиловый 96%-ный, сода двууглекислая, натрий хлористый (в таблетках), натрий лимоннокислый, фурацилин и фурозолидон, вазелин медицинский, марля и гигроскопическая вата, весы с разновесами, цилиндр мерный, мензурки емкостью 100-250 мл и 500 мл, спиртометр, тампонницы с притертыми крышками, плитка электрическая, водяная баня, ножницы и пинцеты, фильтровальная бумага; сушильный шкаф, стерилизатор. Задание № 1: Освоить методику обработки инструментов и посуды. Порядок работы при использовании разных методов обеззараживания посуды и инструментов. Порядок мойки новой посуды и инструментов. Порядок мойки использованной посуды и инструментов. Обеззараживание сухим жаром. Автоклавирование. Кипячение. Фламбирование. Обеззараживание спиртом. Обеззараживание ультрафиолетовым облучением (УФО). Задание № 2: Изучить и освоить технику приготовления растворов используемых на пунктах искусственного осеменения. Приготовление 70%-ного спирта из 96%-ного. Приготовление раствора фурацилина. Приготовление 0,9%-ного раствора хлористого натрия. Приготовление 2,9 %-го раствора лимоннокислого натрия. Приготовление 1%-го раствора бикарбоната натрия. Задание № 3: Описать и отработать технику приготовления стерильных тампонов и марлевых салфеток. Занятие 3 Устройство и подготовка искусственной вагины. Способы получения спермы и использование племенных производителей Цель: изучить устройство искусственной вагины, освоить правила и последовательность сборки и подготовки искусственной вагины, ознакомиться с техникой получения спермы от производителей. Приборы и материалы: Цилиндры к вагинам (для быка, барана, хряка, жеребца), резиновые камеры, спермоприемники, эбонитовые краники, ерши для мытья вагин, резиновые кольца, корнцанги, пинцеты, ножницы, эбонитовые и стеклянные палочки, шары Ричардсона, подставки для вагин, 0,9%-ный раствор натрия хлористого, 1%-ный раствор бикарбоната натрия, 70%-ный спирт, ватные тампоны, синтетическая среда, термометры, мерные стаканы, воронки, горячая и холодная вода, сливные чашки. Задание № 1: Изучить устройство искусственной вагины. Цилиндр (особенности для разных видов с/х животных). Таблица 3-Размеры цилиндра искусственной вагины для разных видов животных Вид животного Длина (см) Диаметр (см) Баран 20 5,5 Бык 50 8-9 Жеребец 54 13 Хряк 30-35 6-9 Резиновая камера. Эбонитовый краник. Резиновые кольца. Спермоприемник (особенности для разных видов с/х животных). Задание № 2: Опишите последовательность, условия сборки и подготовки вагины к использованию. Зарисуйте правильно собранную вагину для быка. Задание № 3: Укажите этапы и условия взятия спермы от производителей. Опишите особенности взятия спермы у быка, хряка и жеребца. Занятие 4 Макроскопическая оценка качества спермы Цель: овладеть методикой визуальной (макроскопической) оценкой качества спермы. Приборы и материалы: свежеполученная сперма, спермоприемники, пипетки (градуированные через 0,1 мл), мерные цилиндры (мензурки) емкостью 10, 100, 250, 500 мл, марлевые салфетки. Задание № 1: Провести органолептическое исследование свежеполученной спермы быка (хряка). Результаты занести в таблицу, сделать вывод о пригодности спермы к использованию. Оценка качества спермы – важное звено технологического процесса на стациях и пунктах. От качества спермы в значительной мере зависит оплодотворяемость самок, поэтому до осеменения необходимо иметь представление о ее качестве. Главным методом исследования в производственных условиях являются: визуальная оценка спермы, оценка по густоте и подвижности спермиев, определение концентрации спермиев, процента живых и патологических форм спермиев и переживаемость спермиев вне организма. Цвет, консистенцию, запах спермы, а также отсутствие или наличие в сперме гноя, крови, мочи определяют по эякуляту непосредственно в спермоприемнике. Цвет спермы характерен для каждого вида животных, зависит от насыщенности спермы спермиями, от качества секретов придаточных половых желез. Нормальная сперма барана белая или слегка желтоватая, быка - белая, жеребца и хряка - серовато-белая, цвета разбавленного молока. Запаха нормальная сперма не имеет, иногда сперма быков имеет запах парного молока, у баранов - жиропота. Консистенция спермы у барана - сметанообразная, быка - сливкообразная, у жеребца и хряков водянистая. Консистенцию определяют при переливании спермы в мензурку для определения объема эякулята. По изменению цвета, запаха и консистенции спермы судят о наличии в ней посторонних примесей, снижающих ее качество, указывающих на те или иные патологические процессы в половой сфере самца. Розовый или красный цвет указывает на попадание крови из свежей травмы, бурый цвет на травму давнего происхождения. О наличии в сперме мочи судят по желтому цвету и специфическому запаху, зеленоватый цвет указывает на наличие гноя, хлопья в сперме бывают при воспалении придаточных половых желез. Объем эякулята проверяют при помощи градуированной предварительно подогретой мензурки. Сперму хряков и жеребцов фильтруют через 2-3 слоя стерильной марли, объем густого секрета определяется отдельно. Определение объема сгустка секрета куперовых желез проводят лишь с научной целью. Таблица 4 - Объем эякулята производителей разных видов сельскохозяйственных животных Вид животного Баран Бык Жеребец Хряк минимальный 0,6 2 40-50 150 Объем эякулята (мл) средний 1,0-1,5 4-6 60-80 250-400 максимальный 3-4 10-15 200-300 600-1000 Сперму, имеющую отклонения в показателях внешних признаков, бракуют. Производителей, выделяющих ненормальную сперму, подвергают всестороннему клиническому исследованию. Таблица 5 – Результаты макроскопической оценки качества спермы Вид животного Цвет Запах Консистенция Объем Отклонения от нормы Вывод: ____________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ Занятие 5 Микроскопическая оценка качества спермы Цель: освоить технику исследования спермы по различным показателям с помощью микроскопа Приборы и материалы: микроскопы, обогревательные столики, предметные и покровные стекла, растворы красок (1 – 2%-ный и 5%ный растворы эозина, 0,1%-ный раствор метиленовой сини), стекла с шлифованными краями для приготовления мазков, термометры, стеклянные палочки, сливные чашки, горячая и холодная вода, марлевые салфетки, пробирки, 1%-ный раствор хлористого натрия, 70%-ный раствор спирта. После визуальной оценки качества спермы производят оценку по микроскопическим показателям: густоте, подвижности, подсчитывают процент живых и мертвых спермиев, количество патологических форм, определяют концентрацию спермиев в 1 мл эякулята. Методика приготовления раздавленной капли: на чистое сухое предметное стекло наносят небольшую каплю свежеполученной спермы и накрывают покровным так, чтобы между покровным и предметным стеклами не образовались пузырьки воздуха. Для этого покровное стекло ставят ребром рядом с каплей спермы и осторожно опускают. Если капля спермы большая. То из-под покровного стекла будут выдавливаться излишки, при этом микроскопия будет затруднена, т.к. капля будет слишком толстой. Определение активности Оплодотворяемость самок находится в прямой зависимости от количества спермиев способных к прямолинейно-поступательному движению. Поэтому в практике искусственного осеменения обязательно проводят оценку спермы на подвижность сразу после получения спермы, после разбавления, перед замораживанием и после, перед отправкой спермы в хозяйство и при приеме ее в хозяйстве, а также непосредственно перед осеменением. Оценка спермы по подвижности спермиев дает возможность очень быстро определить качество полученного от производителя эякулята и пригодность его для искусственного осеменения. Порядок работы Оценку качества спермы по подвижности спермиев проводят под микроскопом в раздавленной капле. Работа с микроскопом. Поставив микроскоп на стол и придав предметному столику горизонтальное положение (при наклонном положении сперма будет стекать к одному краю покровного стекла), регулиру- ют освещение поля зрения. Лучшее освещение светло-серое, слегка затемненное; этого добиваются, несколько уменьшив диафрагму и опустив конденсор микроскопа. Если их нет, то ослабление яркости поля зрения достигается незначительным поворотом зеркала или всего микроскопа. При ярком освещении спермии просвечиваются и становятся плохо заметными. В настоящее время имеются обогревательные столики оснащенные источником света необходимой силы. При исследовании раздавленной капли лучше пользоваться увеличением 280 (объектив 40, окуляр 7Х). Можно работать при увеличении в 120 раз (объектив 8,окуляр 15Х), но при этом рассмотреть отдельные спермии труднее. Обязательным условием при определении активности – температура. Она должна быть 38 – 400С. Для достижения такой температуры применяют обогревательные столики, которые постоянно поддерживают необходимый температурный режим. При исследовании раздавленной капли под микроскопом различают следующие виды движения спермиев: прямолинейно – поступательное (нормальное), манежное и колебательное (ненормальные), а также спермии могут быть неподвижными. Прямолинейно-поступательное движение спермиев характеризуется довольно правильным линейным перемещением их в поле зрения микроскопа по направлению продольной оси спермия. Только спермии, обладающие прямолинейно-поступательным движением, способны передвигаться в половых путях самки навстречу яйцеклетке и, следовательно, участвовать в процессе оплодотворения. Манежное (круговое) движение характеризуется вращением спермия вокруг своей головки или по небольшому кругу, радиус которого примерно равен длине спермия. Такой вид движения спермиев считается ненормальным, оно свидетельствует о неполноценности спермия, дефектах отдельных его частей (изменяется форма головки – происходит ее набухание), оболочки или электрического потенциала. Колебательное движение характеризуется конвульсивными вздрагиваниями спермия и слабыми движениями его хвоста, не приводящими к перемещению. Колебательное движение – признак неполноценности или наступающей гибели спермиев. Но при снижении температуры или рН движение спермиев замедляется и становится колебательным – такой процесс обратимый. Задание 1: Записать порядок визуальной оценки спермы по ее активности. 1. Температура воздуха в помещении: 2. Температура обогревательного столика: 3. Кратность увеличения микроскопа: 4. Яркость освещения поля зрения: Задание 2: Описать виды движения спермиев. 1. Прямолинейное поступательное. 2. Манежное. 3. Колебательное. 4. Отсутствие движения. Оценку спермы по подвижности спермиев проводят по десятибалльной системе. Оценка спермы в баллах отражает процент подвижных спермиев. Наивысшую оценку – 10 баллов дают сперме в том случае, если все спермии обладают поступательным движением; при оценке 9 баллов 90% спермиев обладают прямолинейно-поступательным движением, при оценке 8 баллов – 80% и так далее. Для искусственного осеменения используют свежеполученную и сохраненную при 00С сперму производителей с подвижностью в баллах: баран - 10-8 жеребец - 10-6 бык - 10-8 хряк - 10-7 Сперма быка, хранившаяся при температуре –1960С в жидком азоте, должна иметь активность не ниже 4 баллов. Задание 3: Определить активность и установить пригодность спермы в представленной пробе. № пробы Проба №1 Проба №2 Активность, баллы Примечания Определение резистентности спермиев Резистентность спермы - устойчивость спермиев к 1%-ному раствору хлорида натрия - измеряется тем количеством этого раствора, которое израсходовано для прекращения их прямолинейно-поступательного движения. Порядок работы В три флакончика вместимостью по 20 - 25 мл под номерами 1, 2, 3 наливают 1%-ный раствор хлорида натрия; в 1-й - 10,0 мл, во 2-й - 0,5, в 3-й - 0,25 мл. Микропипеткой вносят в первый флакон 0,02 мл спермы и промывают пипетку раствором из флакона. Перемешивают сперму круговыми движениями. Чистой пипеткой переносят 0,5 мл смеси из 1-го флакона во 2-й. Перемешивают смесь во 2-м флаконе, берут из него 0,25 мл смеси и переносят в 3-й флакон. Сперма оказывается разбавленной в 1-м флаконе - в 500 раз, во 2-м - в 1000, в 3-м - в 2000 раз. После 3 мин выдерживания во всех трех флаконах определяют наличие или отсутствие поступательно движущихся спермиев. Для этого из каждого флакона палочкой берут каплю спермы на предметное стекло и исследуют (без покровного стекла) под микроскопом при увеличении в 120 раз при 38 - 40°С. Если в одной из капель не оказалось поступательно движущихся спермиев, то резистентность равна степени разбавления спермы в данном флаконе. В противном случае добавляют пипеткой в 3-й флакон раствор порциями по 0,5 мл до прекращения прямолинейного движения спермиев. Задание 4: Определить резистентность спермиев в представленной пробе, сделать вывод о пригодности спермы к использованию. ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ Определение процента живых спермиев Оболочка спермиев, у которых энергично протекают обменные процессы, не пропускает в протоплазму некоторые лабораторные краски, поэтому живые спермии не окрашиваются (в поле зрения микроскопа они хорошо отличаются бледной, неокрашенной головкой). Мертвые и ослабленные с колебательным движением спермии легко пропускают краску внутрь клеток и, следовательно, окрашиваются этой краской. Определение процента живых и мертвых спермиев состоит из: приготовления и окраски мазка; подсчета и вычисления процента живых спермиев. Приготовление и окраска мазка Мазки делают на чистых и обезжиренных стеклах. Стекла хорошо промывают, а бывшие в употреблении предварительно кипятят в содовом растворе. Вытертые чистой салфеткой стекла помещают в смесь 96° спирта и эфира (1:1). Перед началом работы необходимое количество стекол вынимают пинцетом из банки и насухо вытирают чистой марлевой салфеткой или полотенцем. На обезжиренное предметное стекло ближе к одному концу глазной пипеткой или стеклянной палочкой наносят маленькую каплю свежеполученной спермы и добавляют к ней такую же каплю 5%-ного водного раствора эозина. Вместо эозина можно употреблять 1%-ный раствор краски конго-рот или водную смесь эозина с нигрозином (10 г нигрозина и 0,5 г эозина на 100 г воды). Капли спермы и краски перемешивают стеклянной палочкой и плавным движением покровного или шлифованного стекла вдоль предметного приготовляют мазок. Предметное стекло зажимают между большим и средним пальцами левой руки. Угол между стеклами не должен превышать 45 - 50°, а один или оба пальца правой руки касаться предметного стекла. Капля при приготовлении мазка должна равномерно растечься по всему нижнему краю покровного стекла. Мазок должен быть тонким с ровными краями. Все операции по приготовлению мазка нужно делать быстро, чтобы живые спермии не погибли раньше чем высохнет мазок. Если мазок приготовлен неправильно (рис. 1), особенно когда он очень толстый, спермии погибнут раньше, чем подсохнет мазок и большая часть их окрасится, вследствие чего результаты определения окажутся неточными. Высушенный на воздухе в течение 2 - 3 минут мазок микроскопируют при увеличении в 400 - 600 раз. Мертвые спермии обычно полностью окрашиваются в розовый цвет, а спермии, бывшие в момент окраски живыми, выделяются на розовом фоне своей белой неокрашенной головкой. Рис. 1 правильное (последний справа и неправильное приготовление мазка) Подсчет и вычисление процента живых спермиев Для определения процента живых спермиев в нескольких полях зрения подсчитывают 400 - 500 спермиев, учитывая при этом в каждом поле зрения окрашенных - мертвых спермиев и неокрашенных - живых. Процент живых спермиев вычисляют к общему числу подсчитанных по формуле: П= Н *100 , 500 где П - процент живых спермиев, а Н - число подсчитанных живых спермиев. Пример: Подсчитано всего 500 спермиев, в том числе 450 неокрашенных и 50 окрашенных. Процент живых будет: П= 450*100 =90% 500 Зная процент живых спермиев, можно точно определить активность спермы в баллах. Задание 5: Провести подсчет живых спермиев в представленной пробе и определить пригодность спермы к использованию. …..*100 П= =…..% 500 Вывод: ____________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ Подсчет патологических форм спермиев При микроскопическом исследовании окрашенных мазков спермы в ней нередко выявляются спермии различной ненормальной (патологической) формы. Наличие в сперме спермиев с ненормальной, уродливой формой называется тератоспермией. Появление в эякуляте и увеличение количества спермиев с патологической формой связано с нарушением спермиогенеза, вызванного воспалительными процессами в семенниках и придаточных половых железах, нарушением терморегулирующей функции мошонки (при чесотке, экземе, обморожении и т.п.), нарушением кормового режима (при недостатке витаминов А и Е). Нередко в сперме находят спермиев с особым утолщением в области шейки, тела или хвоста - протоплазматической каплей. Между клиническими признаками при поражениях половых органов производителей и появлением в эякуляте патологических форм спермиев имеется прямая связь. Так, нарушение функции придатка семенника ведет к деформации хвостов и распаду спермиев. Поэтому подсчет патологических форм спермиев в сперме может служить дополнительным материалом при установлении заболевания органов размножения у производителя. Порядок работы Подсчет патологических форм спермиев проводят по следующим этапам: а) разбавление спермы; б) приготовление мазка; в) окраска мазка; г) микроскопирование и подсчет спермиев. Исследуемую свежеполученную сперму, особенно быка и барана, для уменьшения концентрации спермиев и удобства их подсчета в мазке необходимо разбавить 1%-ным раствором хлористого натрия. Сперму барана разбавляют в 20 - 30, а сперму быка - в 10 - 15 раз. Для этого к 1 мл (или капле) спермы градуированной или глазной пипеткой прибавляют соответствующее число миллилитров (или капель) 1%-ного раствора хлористого натрия. Сперму жеребца и хряка разбавляют в 2 - 3 раза или используют для приготовления мазков без разбавления. Мазок делают с помощью покровного стекла или методом стекающей капли, держа стекло под углом 40 - 50°. Изменения форм спермиев при этом не наблюдается. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и затем фиксируют. Подсушивать мазки над пламенем спиртовки не рекомендуется, так как при этом спермин деформируются. Фиксация мазков преследует цель закрепить спермии в таком виде, в каком они выделились из половых путей самца, и не допустить изменения их форм. Для этого предметное стекло с мазком кладут горизонтально на специальные подставки над кюветкой или стеклянной чашкой и непосредственно на мазок с помощью глазной пипетки на 1 - 2 минуты наслаивают 96° спирт-ректификат. Мазки можно фиксировать и 5%ным раствором хлористого аммония (нашатыря) в течение часа. Зафиксированный мазок споласкивают водой и окрашивают. Окраску мазков проводят фуксином Пфейфера, 0,1%-ным раствором метиленовой синьки, 1 - 2%-ным раствором эозина, фиолетовыми чернилами или какой-либо другой краской. Глазной пипеткой краску толстым слоем наносят на поверхность мазка на 3 - 5 минут; по истечении указанного времени краску смывают дистиллированной или просто кипяченой водой. Мазок высушивают на воздухе, поставив его вертикально, или подсушивают фильтровальной бумагой. Микроскопирование и подсчет спермиев проводят при увеличении в 400 - 600 раз. Передвигая мазок, подсчитывают в каждом поле зрения всех спермиев, учитывая отдельно нормальные и патологические формы спермиев, после чего вычисляют процент патологических. Общее количество подсчитанных спермиев должно быть не менее 500. Пример: Было подсчитано 500 спермиев, в том числе 50 патологических. Составив пропорцию, вычисляют процент патологических форм спермиев. 500 – 100 50 - х х= 50*100 500 =10% Чем меньше в эякуляте производителя патологических спермиев, тем выше оплодотворяющая способность спермы. При нормальном состоянии и функционировании половых органов производителя количество патологических форм спермиев редко достигает у барана 10 - 14%, быка 14 - 18%, жеребца и хряка 16 - 20% общего числа их. Следует учитывать, что чем больше патологических спермиев, тем меньше должна быть степень разбавления спермы. Задание 6: Провести подсчет живых спермиев в представленной пробе и определить пригодность спермы к использованию. …..*100 х= =…..% 500 Вывод: ____________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ Занятие 6 Определение густоты и концентрации спермиев Цель: отработать навыки глазомерной оценки насыщенности эякулята спермиями, научиться проводить подсчет спермиев при помощи камеры Горяева. Приборы и материалы: исследуемая сперма, микроскопы, счетная камера Горяева, предметные и покровные стекла, лейкоцитарный и эритроцитарный меланжеры, стеклянные палочки, 3%-ный раствор хлорида натрия, 70%-ный раствор спирта, дистиллированная вода, салфетки. Задание 1: Определить густоту спермы быка. Описать сперму разной густоты. На рис. 2 отразить различия спермы разной густоты. указать приблизительное количество спермиев в 1 мл эякулята. По густоте оценивают только свежеполученную сперму. Различают сперму густую – обозначают буквой Г, среднюю – буквой С и редкую – буквой Р. Порядок работы Оценка по густоте производится под микроскопом методом раздавленной капли под увеличением в 120 – 280 раз. густая средняя редкая Рис. 2. Густота спермы быка Определение густоты спермы дает приблизительное представление о количестве спермиев, кроме того, при определении густоты возможны большие ошибки. Чтобы точно рассчитать степень разбавления свежеполученной спермы, необходимо определить концентрацию спермиев, т.е. их количество в 1 мл эякулята. Концентрацию принято обозначать буквой С. Таблица 6 - Концентрация спермиев производителей разных видов Концентрация, млрд./мл Производитель Баран Бык Жеребец Хряк минимально допустимая 2 0,6 0,05 0,1 средняя максимальная 2,5-3,5 0,8-1,2 0,1-0,15 0,15-0,2 8 6 0,8 1 Как и другие показатели качества спермы, концентрация спермиев подвержена значительным колебаниям, зависящим от условий содержания и кормления, режима эксплуатация производителя, а также от его индивидуальных особенностей. Задание 2: Провести подготовку смесителя для определения концентрации спермиев. Порядок работы Определение концентрации спермиев с помощью счетной камеры Горяева производят в следующей последовательности: – подготовка счетной камеры; –разбавление спермы в смесителе; –зарядка счетной камеры разбавленной спермой; –подсчет спермы в счетной камере; –вычисление концентрации спермиев в исследуемой сперме. 1. Подготовка счетной камеры. Камеру и покровное стекло предварительно моют водой, насухо вытирают чистой салфеткой и обезжиривают спиртом - эфиром. Затем сетку счетной камеры накрывают шлифованным покровным стеклом и притирают его к опорным пластинам камеры до появления радужных колец. 2. Разбавление спермы. Для облегчения подсчета спермиев их необходимо обездвижить. С этой целью применяют 3%-ный раствор поваренной соли. Разбавление проводят в смесителе (меланжере). Для разбавления спермы барана и быка используют эритроцитарный смеситель, для разбавления спермы жеребца и хряка – лейкоцитарный. Степень разбавления см. в таблице 7. Таблица 7 - Степень разбавления спермы Сперма Барана Быка Жеребца хряка смеситель эритроцит. эритроцит. лейкоцит. лейкоцит. До какой отметки набирают сперму раствор 0,5 101 1 101 0,5 11 0,5 11 Степень разбавления 200 100 20 20 Смесители должны быть чистыми и сухими (показателем чистоты и сухости является свободное перемещение бусинки без прилипания к стенкам). После того как набрали в смеситель необходимое количество спермы и 3%-ного раствора поваренной соли, концы смесителя зажимают указательным и большим пальцами и быстро в течение 2-3 минут переворачивают для перемешивания спермы с раствором. 3. Зарядка счетной камеры. Счетную камеру заряжают разбавленной спермой сразу же после перемешивания. Задержка может привести к грубым ошибкам при подсчете, так как сперматозоиды быстро оседают. Первые 3-4 капли из меланжера удаляют на тампон, чтобы удалить раствор из капилляра, где он почти не смешивается со спермой. Следующую каплю пускают под край притертого стекла. Капля вследствие капиллярности втягивается под покровное стекло на сетку, и смесь равномерно распределяется в камере. Неправильно заряженной камеру считают в том случае, если там оказались пузырьки воздуха. Заряженную камеру кладут на столик микроскопа, настраивают свет и резкость, подбирают необходимое увеличение (300 – 400 раз). 4. Подсчет спермиев. После установки камеры на столик микроскопа необходимо выждать 2-3 минуты, пока сперматозоиды осядут, и приступают к их подсчету. Спермии подсчитывают в 5 больших квадратах (80 малых) по диагонали. Считают головки спермиев внутри малых квадратов, а также на левых и верхних линиях. Подсеет ведут в направлении слева направо, затем справа налево. 5. Вычисление концентрации спермиев. Результаты подсчета суммируют. Концентрацию определяют по формуле: C = (N * D * 400 * 1000) / (n * p), где C – концентрация спермиев (млрд.) в 1 мл спермы; N – количество подсчитанных спермиев; D – степень разбавления спермы (20, 100, 200); n – число малых квадратов, в которых проводился подсчет (обычно 80); p – глубина счетной камеры (0,1 мм) Множитель 400 введен для пересчета на 1 мм2, 1000 – число перевода на миллилитр (мл). Задание 3: Определить концентрацию спермы в счетной камере Горяева. Результаты подсчетов записать в соответствующие клетки квадратов. Сетка № 1 1 2 4 3 5 Задание 4: Сравнить результаты, полученные при выполнении заданий 1 и 3. Сделать заключение о целесообразности дальнейшего использования представленного эякулята. __________________________________________________________ __________________________________________________________ __________________________________________________________ __________________________________________________________ __________________________________________________________ __________________________________________________________ Занятие 7 Разбавление и хранение спермы. Компоненты разбавителей. Способы хранения спермы. Правила ТБ при работе с жидким азотом Цель: изучить состав разбавителей и значение компонентов разбавителей, способы, условия и сроки хранения спермы, технику приготовления разбавителей. Ознакомиться с правилами техники безопасности при работе с жидким азотом и криогенным оборудованием. Приборы и материалы: дистиллированная вода, свежие куринные яйца, молоко, химические стаканы, градуированный цилиндр на 50 – 100 мл, шприц стеклянный на 20 мл, весы с разновесами, пипетки градуированные для спермы и разбавителя, палочки стеклянные, чашки Петри, скальпели, пинцеты, термометр, спиртовые и сухие тампоны, фильтры бумажные стерильные, водяная баня. Задание 1: Опишите цели, условия и сроки разбавления спермы. Задание 2: В таблице 8 укажите напротив каждого компонента разбавителя его значение для спермиев Таблица 8 – значение отдельных компонентов разбавителя Компонент Значение Сахара Желток куриного яйца Глицерин Антибиотики Хелатон Соли слабых кислот: цитраты фосфаты, сульфаты Дист. вода Задание3: Опишите технику и получите стерильный желток куриного яйца. Задание 4: Заполните таблицу Таблица 9 - Способы и условия хранения спермы Вид животного Фасовка Условия t0 Сроки использования Короткосрочный способ Бык Баран Хряк Жеребец Долгосрочный способ Бык Жеребец Задание 5: Ознакомиться и изучить правила техники безопасности при работе с жидким азотом и криогенным оборудованием. Внедрение на госплемстанциях, племпредприятиях и пунктах искусственного осеменения сельскохозяйственных животных прогрессивного метода длительного хранения спермы в жидком азоте требует от специалистов и всех работников этих предприятий безусловного соблюдения техники безопасности при работе с криогенным оборудованием и сжиженными газами. Жидкий азот - прозрачная, бесцветная, легкоиспаряющаяся жидкость. Массовая плотность его 0,804 кг/л при давлении 760 мм рт. ст., в обычных условиях химически инертен. Производят его путем сжижения газообразного азота, получаемого с воздухоразделительных установок. Попадая на открытые участки тела, он вызывает ожоги. Доставляется жидкий азот до потребителей с заводов-поставщиков транспортными цистернами типа ЦТК различной гидравлической емкости, установленными на соответствующих автомобилях. Транспортировка замороженной спермы, сохраняемой в жидком азоте, до потребителя и хранение ее там осуществляются в сосудах Дьюара различной емкости. Персонал, работающий с сосудами Дьюара (заливка жидкого азота, загрузка и выгрузка канистр со спермой, опорожнение сосуда и т.д.), обязан надевать защитные очки (лучше щитки из органического стекла) и рукавицы. Одежда не должна оставлять открытым кожный покров. Необходимо избегать соприкосновения открытых участков тела с металлическими предметами, извлеченными из жидкого азота они также могут вызвать ожоги. Брюки должны быть без манжет и закрывать верх обуви. Рукавицы должны надеваться на руки свободно, чтобы при необходимости их можно было легко сбросить. Заливать жидкий азот в теплый сосуд Дьюара (имеющий температуру внутри сосуда, равную температуре окружающего воздуха) надо медленно. Если заливка ведется через гибкий шланг диаметром 20 мм, давление в транспортном резервуаре должно быть не более 0,5 атм. Если азот заливается из другого сосуда Дьюара, эта процедура должна производиться через широкую металлическую воронку. Быстрое заполнение теплого сосуда Дьюара азотом приводит к выбросам жидкости из сосуда вследствие чрезмерно большого количества образующихся паров (особенно у сосудов с узкой горловиной). Помещение, в котором находятся сосуды Дьюара (в том числе и стационарные хранилища спермы) с жидким азотом, должно быть оборудовано приточно-вытяжной естественной или принудительной вентиляцией. Курение в этих помещениях категорически запрещается. При симптомах обморочного состояния пострадавшего необходимо вывести из помещения на свежий воздух. Заправку сосудов и хранилищ жидким азотом запрещается производить одному человеку. Категорически запрещается оставлять на отогрев после испытаний сосуды Дьюара, потерявшие вакуум (покрывшиеся слоем инея) в помещении, где могут находиться (или проходить) люди. Отогревать (не менее 3 суток) такие сосуды следует в изолированных помещениях, в которые на это время должен быть запрещен доступ людям. При заливке сосудов Дьюара жидким азотом из транспортных резервуаров необходимо следить за тем, чтобы гибкий шланг был опущен в сосуд до дна. При транспортировке сосудов Дьюара с жидким азотом на автомобилях и других видах транспорта необходимо надежно закреплять их во избежание падений. Сосуды Дьюара, подготавливаемые к перевозке на самолетах, надо заливать жидким азотом только на половину гидравлической емкости. Категорически запрещается во избежание взрыва удалять обогащенную кислородом жидкость из сосуда Дьюара путем выпаривания. Необ- ходимо помнить, что ацетилен, масло и другие взрывоопасные примеси, которые в незначительных количествах могут присутствовать в жидком азоте, при многократном доливании азота будут в нем накапливаться, что может привести к образованию в сосуде взрывоопасной смеси. Если уменьшить объем жидкости, в которой растворен ацетилен, до определенного минимума (что происходит, например, при выпаривании), ацетилен начинает выпадать из раствора в виде осадка, способного взрываться. Занятие 8 Изучение влияния температуры, рН, осмотического давления и химических веществ на жизнеспособность спермиев Цель: провести ряд опытов для изучения влияния на спермии некоторых физических и химических факторов. Приборы и материалы: исследуемая сперма, микроскоп, обогревательные столики, предметные и покровные стекла, пипетки, стеклянные палочки, чашка со льдом или снегом, горячая вода; гипо-, изо- и гипертонические растворы хлористого натрия, 2,9%-ный раствор цитрата натрия, 1-2%-ный раствор уксусной кислоты, раствор марганцовокислого калия (1:5000), 70%-ный спирта, 5%-ный спиртовой раствор йода, салфетки. С момента получения спермы от производителя спермии подвергаются воздействию внешней среды. Работая со спермой, необходимо хорошо знать, как влияют на спермии свет, температура, осмотическое давление, реакция среды, химические вещества и другие факторы, чтобы создавать для спермиев наиболее благоприятные условия. несоблюдение правил обращения со спермой приводит к снижению ее качества и эффективности осеменения. Внешней средой для спермиев является, прежде всего, жидкая фаза спермы (плазма), изменения в которой отражаются на спермиях с особой силой, и эти изменения могут быть как положительные (увеличение жизнеспособности и оплодотворяющей способности), так и отрицательные, вызывающие гибель спермиев. Задание 1: Определить влияние на спермии осмотического давления. Осмос – диффузия растворенных веществ через проницаемую оболочку, разделяющую раствор и чистый растворитель или два раствора разной концентрации. Давление растворенного вещества называется осмотическим. Сперма животных имеет постоянное осмотическое давление, причем осмотическое давление сыворотки спермы и протоплазмы спермиев примерно одинаковое. В том случае, когда осмотическое давление раствора равно осмотическому давлению спермиев, он является изотоническим. Гипотонический и гипертонический растворы губительно влияют на спермии. Порядок работы Оценивают исследуемую сперму на активность. Затем изучают действие на спермиев действие дистиллированной воды, изотонического и гипертонического раствора хлористого натрия. Для этого на предметное стекло наносят каплю спермы и добавляют каплю одного из растворов, накрывают покровным стеклом. Микроскопию проводят при увеличении 120-280 раз. При исследовании обращают внимание на активность спермиев, какой вид движения преобладает, а также на форму спермиев. Изотонические растворы (0,9%-ный раствор хлористого натрия, 1%ный раствор бикарбоната натрия, 2,9%-ный цитрата натрия) не влияния на активность. При изменении осмотического давления в меньшую сторону активность спермиев снижается, движение становится манежным за счет деформации спермиев. Увеличение осмотического давления вызывает обезвоживание спермиев и быструю их гибель. Движение прекращается, изменяется форма клеток. Результаты занести в сводную таблицу. Задание 2: Определить действие температурного фактора на спермии. Температура оказывает огромное влияние на жизнедеятельность спермиев. Все жизненные процессы в спермиях ускоряются при повышении температуры и замедляются при ее понижении. Температуры в пределах 25 – 400С не оказывают вредного влияния на спермии, но при этом интенсивно расходуются энергетические запасы и накапливаются вредные вещества. Поэтому спермии хранят при пониженных температурах. Повышение температуры до 420С приводит к ускорению обменных процессов, что вызывает глубокие нарушения в жизнедеятельности спермиев, а при t0 выше 450C начинается свертывание белков и спермии погибают. Порядок работы Приготовить две раздавленных капли спермы, определить активность спермиев при температуре 38 – 400С. Сперму просматривать под микроскопом при малом увеличении, для определения активности. Одно предметное стекло нагреть до 50-550С и провести микроско- пию с целью определения активности. Одно предметное стекло с приготовленной раздавленной каплей спермы поместить на лед на 1-2 мин. После чего определить активность. Результаты опыта записать в сводную таблицу. Задание 3: Определить влияние реакции среды. Реакция среды оказывает влияние на подвижность спермиев. Сильные кислоты и щелочи вызывают гибель спермиев. Слабощелочная среда активизирует движение спермиев, слабокислая – тормозит. В кислой среде спермии переходят в состояние анабиоза. Порядок работы Приготовить раздавленную каплю и определить начальную активность. Затем в каплю спермы добавить каплю 1%-ного раствора уксусной кислоты и исследуют активность. Приподнять покровное стекло и добавить 1 – 2 капли 3%-ного раствора цитрата натрия и снова определить активность. В первом случае кислота вызывает снижение активности, во втором цитрат натрия нейтрализует действие кислоты, что частично активизирует движение спермиев. Результаты опыта занести в сводную таблицу. Задание 4: Изучить действие на спермии химических веществ. Спермии чрезвычайно чувствительны к различным химическим веществам. Поэтому следует тщательно прополаскивать дистиллированной водой посуду и инструменты после мойки и дезинфекции. В помещении пункта искусственного осеменения запрещается хранить медикаменты и дезинфицирующие вещества, а также курить. Порядок работы После оценки активности выявляют влияние различных химических веществ на спермии. Для этого каждый раз на чистое предметное стекло наносят новую каплю спермы и действуют на нее 5%-ным спиртовым раствором йода. 70%-ным раствором спирта. Капли перемешивают, накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом при малом увеличении. Устанавливают время, через которое прекращается движение спермиев. Результаты исследований записать в сводную таблицу 10. Таблица 10- Влияние внешних факторов на спермии № пробы Действие осмотического давления Концентрация Изменение раствора активности Изменение формы спермиев гипотонический изотонический гипертонический Влияние температуры tC Изменение активности 0 № пробы 0–5 38 – 40 45 - 50 № пробы Влияние pH Реакция среды Изменение активности pH ≤ 7,0 pH 7,0 pH≥ 7,0 № пробы Действие химических веществ Химическое Выявленные изменения спермы вещество 5%-ный спиртовой р-р йода 70%-ный р-р спирта р-р KMnO4 1:5000 Занятие 9 Учет и отчетность на племстанциях и пунктах искусственного осеменения Цель: изучить документацию, научиться правильно заполнять отчетность при проведении искусственного осеменения. Материалы: инструкция по организации и технологии работы станций и пунктов по искусственному осеменению; инструкции по искусственному осеменению коров, овец, свиней и кобыл; незаполненные формы (бланки) учета и отчетности; незаполненные бланки паспортов пункта искусственного осеменения и договоров с племстанцией. Учет и отчетность должны быть простыми, краткими, но точно отражающими всю производственную деятельность и дающими возможность оперативно контролировать работу пунктов искусственного осеменения сельскохозяйственных животных. Задание 1: Пользуясь инструкцией по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных ознакомиться с документами учета и отчетности, применяемыми на племстанциях для учета работы по воспроизводству стада. Обратить внимание на назначение и срок составления каждого документа, какие показатели учитываются и кто ведет записи. 1. Журнал использования производителя и показателей спермопродукции (форма №1 - ио) ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ 2. Лабораторный журнал учета качества спермы (форма №2 - ио) ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ 3. Ордер на отправку спермы (форма №3 - ио) ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ 4. График доставки спермы (форма №4 - ио) ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ 5. Акт ректального исследования на стельность (форма №8 - ио) с приложением (список коров и телок, прошедших ректальное исследование по результатам искусственного осеменения (форма №9 – Ио) ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ 6. Ветеринарный паспорт производителя ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ Задание 2: Изучить основные документы, используемые на пунктах искусственного осеменения. Указать их назначение, сроки заполнения. 1. Журнал учета отелов и осеменения ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ 2. Заявка на сперму ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ 3. Календарь техника - осеменатора ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ Занятие 10 Устройство и организация работы на ОАО «Мордовиягосплем» Во время экскурсии на племпредприятии ОАО «Мордовиягосплем» ознакомиться: 1. с размещением рабочих помещений на территории организации; 2. с организацией содержания и кормления быков-производителей; 3. с техникой взятия спермы; изучить половой режим производителей; 4. с технологией разбавления, замораживания и хранения спермы в необлицованных гранулах и соломинках; 5. с документами учета количества и качества спермы, хранящейся на племпредприятии. Задание: В произвольной форме сделать краткий отчет о результатах экскурсии. Занятие 11 Особенности половой цикличности самок сельскохозяйственных животных Половые циклы самок сельскохозяйственных животных имеют видовые особенности, которые необходимо знать и использовать в практике для определения оптимального времени осеменения. Выбор сроков осеменения - один из наиболее важных факторов при организации и проведении искусственного осеменения. Оптимальным временем осеменения самок является период, наиболее благоприятный для встречи спермиев с яйцеклеткой. Поэтому, чтобы определить сроки введения спермы, необходимо учитывать все признаки полноценного полового цикла. Задание: В таблице 11 отразить особенности половой цикличности самок разных видов сельскохозяйственных животных. Половой цикл – это ____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________ Половой цикл делится на стадии: ________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________ Стадия возбуждения характеризуется феноменами:_________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________ Таблица 11 - Особенности половой цикличности Сроки Вид животного Корова Кобыла Овца Свинья половой зрелости 1-го осеменения полового цикла Продолжительность стадии течки возбуждения половой охоты Время овуляции СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Заянчиковский И. Ф. Практикум по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных / И. Ф. Заянчиковский, И. В. Смирнов – М.: «Колос», 1975. – 272 с. 2. Заянчиковский И. Ф. Практикум по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных / И. Ф. Заянчиковский, В. Г. Мартынов, Е. И Селунская – М.: Сельхозиздат, 1961. – 256 с. 3. Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных – М.: «Колос», 1981. – 159 с. 4. Козло Н. Е. Воспроизводство животных / Н.Е. Козло – М.: Колос, 1984. – 224 с. 5. Козло Н. Е. Учебная книга техника по искусственному осемнению животных / Н. Е. Козло, А. Н. Варнавский, Р. И. Пихооя. – М.: Агропромиздат, 1987. – 256 с. 6. Комлык И. П. Рабочая тетрадь с методическими указаниями для лабораторно-практических занятий по курсу «Акушерство, гинекология и биотехника размножения животных» / И. П. Комлык, В. Ю.Сиротинина – Петрозаводск, 2002 – 36 с. 7. Небогатиков Г. В. Практикум по акушерству, гинекологии и биотехнике размножения животных / Г. В. Небогатиков – М.: Мир, 2005. – 272 с. 8. Шипилов В. С. Практикум по акушерству, гинекологии и искусственному осеменению сельскохозяйственных животных / В. С. Шипилов, Г. В. Зверева, И. И. Родин, В. Я. Никитин. – М.: Агропромиздат, 1988. – 335 с. Для заметок
