КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ КАФЕДРА ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ БИОХИМИИ Лекция по теме: «Обмен нуклеотидов и нуклеиновых кислот» Краснодар 2019 Составители: проф. И.М.Быков доц. Е.Е. Брещенко Нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) – это биополимеры (полинуклеотиды), состоящие из мононуклеотидов, соединѐнных фосфодиэфирными связями. ДНК хранит наследственную информацию, т.е. информацию о первичной структуре белков данного организма, а РНК (мРНК, тРНК и рРНК) еѐ реализуют, т.е. участвуют в синтезе белков Функции РНК: м-РНК является копией гена и матрицей (планом) для синтеза белка т-РНК осуществляет транспорт аминокислот к месту синтеза белка и встраивает аминокислоту в полипептидную цепочку в соответствии с кодоном р-РНК вместе с белками формирует рибосому – место синтеза белка Строение мононуклеотида Пуриновые основания нуклеиновых кислот NH2 N N N1 2 6 3 5 N 7 4 9 N N NH аденин (А) 8 Входят в состав и ДНК, и РНК NH OH пурин N N H2N N гуанин (G) NH Пиримидиновые основания нуклеиновых кислот OH Только в РНК N HO N3 2 N урацил (U) 4 5 1 OH CH3 N 6 HO N NH2 пиримидин тимин (Т) Только в ДНК N HO N N цитозин (С) Входит в состав и ДНК, и РНК Углеводы нуклеотидов (пентозы) рибоза (РНК) дезоксирибоза (ДНК) В организм в составе пищи поступают нуклеиновые кислоты в виде нуклеопротеинов, т.е. связанные с гистоновыми и негистоновыми белками. Переваривание нуклеопротеинов происходит в желудочно-кишечном тракте под действием специфических гидролитических ферментов Гидролиз нуклеопротеинов ротовая полость ДНП и РНП пищи белки НСl, пепсин желудок (протамины, гистоны) ДНК, РНК (полинуклеотиды) РНК-азы, ДНК-азы ДПК (эндонуклеазы) аминокислоты Н2О олигонуклеотиды фосфодиэстеразы (экзонуклеазы) Н2О мононуклеотиды тонкий кишечник ткани (преимущественно клетки кишечника) нуклеотидазы (фосфатазы) Н2О Н3РО4 нуклеозиды нуклеозидазы пурины, пиримидины (азотистые основания) рибоза, дезоксирибоза (пентозы) пентозофосфатный путь Пути обмена экзогенных азотистых оснований Полинуклеотиды и, тем более, нуклеиновые кислоты пищевых продуктов не поступают из кишечника в кровоток, не выступают в роли поставщика предшественников ДНК и РНК клеток организма. И хотя млекопитающие потребляют значительные количества нуклеиновых кислот и нуклеотидов, их жизнедеятельность не зависит от всасывания этих веществ или соответствующих продуктов распада. Экзогенные азотистые основания – и пуриновые, и пиримидиновые – вступают в метаболизм почти исключительно по пути катаболизма. Азотистые основания эндогенного происхождения в небольшом количестве используются повторно (реутилизируются), но бóльшая часть так же включается в катаболические процессы Катаболизм пуриновых оснований Нарушения обмена пуринов Превышение концентрации мочевой кислоты в крови свыше 0,5 ммоль/л называется гиперурикемия. Поскольку мочевая кислота и еѐ соли (ураты) плохорастворимые вещества, то при гиперурикемии они начанают выпадать в осадок в мелких суставах, почечных лоханках и под кожей, вызывая тяжѐлое заболевание – подагру Ингибитор ксантиноксидазы Для лечения подагры используют структурный аналог гипоксантина (пуринола) – аллопуринол. Аллопуринол по принципу конкурентного ингибирования связывается с активным центром ксантиноксидазы, предотвращая образование мочевой кислоты. Ксантин и гипоксантин имеют лучшую растворимость, чем мочевая кислота и еѐ соли, и легче выводятся из организма OH OH N N N N H гипоксантин N N N H N аллопуринол Распад пиримидиновых оснований OH NH2 H2O N HO N цитозин NН3 HO OH HАДФН+Н+ НАДФ+ N N урацил СН2 N HO N СН2 дигидроурацил Н2О HOOC O NH2 CH2 C CH2 NH карбамоил-бета-аланин Н2О NН3 + CО2 + H2N CH2 CH2 COOH бета-аланин Особенности синтеза нуклеотидов 1. 2. 3. 4. 5. Синтез идѐт из обычных простых предшественников (ак, углекислого газа и т.п.) Синтезируются не отдельные азотистые основания, а сразу нуклеотиды. Синтезируются общие предшественники (для пуриновых нуклеотидов инозинмонофосфат – ИМФ, для пиримидиновых – уридинмонофосфат – УМФ). Бóльшая часть нуклеотидов синтезируется de novo, т.е. заново от начала и до конца, лишь некоторая часть их реутилируется для повторного их использования. Реутилизация может происходить во всех тканях, но особенно актуальна в быстрорастущих тканях (эмбриональная, регенерирующая, опухолевая), когда активно идет процесс синтеза нуклеиновых кислот и недопустима потеря их предшественников. Синтез протекает ферментативно, с большой затратой энергии. Синтез пуриновых нуклеотидов (фосфорибозиопирофосфат) … Происхождение атомов пуринового кольца СНТГФК Синтез пуриновых нуклеотидов Синтез пиримидиновых нуклеотидов Синтез пиримидиновых нуклеотидов Синтез дезоксирибонуклеотидов Ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот Действие ингибиторов Препарат Фторурацил Механизм действия Превращается в рибо- и дезоксирибонуклеотиды, которые ингибируют тимидилатсинтазу и рост цепей ДНК Метотрексат Структурный аналог фолиевой кислоты, ингибирует дигидрофолатредуктазу, нарушает синтез пуриновых нуклеотидов и превращение дУМФ в дТМФ Ацикловир Превращается в (ациклосоответствующий НТФ и гуанозин) ингибирует синтез вирусной ДНК Азидотимидин Фосфорилируется с (АЗТ) образованием АЗТ-ТФ и блокирует репликацию вируса иммунодефицита Область применения Лечение опухолей желудка, желудочнокишечного тракта, молочной железы, лѐгких и др. Химиотерапия опухолей Лечение герпетических инфекций Лечение СПИДа Нарушения обмена нуклеотидов Нарушение синтеза пиримидинов – оротацидурия – дефект ОМФ-декарбоксилазы (недостаток синтеза пиримидиновых нуклеотидов, снижение синтеза нуклеиновых кислот) Нарушения обмена пуринов: – ксантинурия – дефект ксантиноксидазы (увеличение содержания ксантина в моче,иногда протекает практически бессимптомно, иногда могут образовываться ксантиновые камни в почках) – подагра – синдром Лѐша-Нихана – наследственное заболевание, характеризующееся сверхобразованием мочевой кислоты, умственной отсталостью, самотравмирующим поведением (встречается только у мальчиков). Первичная структура нуклеиновых кислот – линейная последовательность мононуклеотидов, соединѐнных прочной ковалентной фосфодиэфирной связью. Начало молекулы - 5′-конец, где к пятому атому углерода в пентозе присоединено три остатка фосфорной кислоты. У последнего нуклеотида в полинуклеотидной цепочке у третьего атома углерода в пентозе свободная ОН-группа. Эта часть называется 3′ -конец Вторичная структура НК Вторичная структура РНК – одна полинуклеотидная цепь, м.б. в виде спирали, петель, «клеверного листа», сферы: р-РНК т-РНК Вторичная структура ДНК – две полинуклеотидные цепи, комплиментарные друг другу Вторичная структура нуклеиновых кислот формируется за счѐт водородных связей между комплиментарными азотистыми основаниями (между аденином и тиминой (урацилом в РНК) две водородные связи, между гуанином и цитозином – три). Вторичная структура ДНК Вторичная структура р-РНК Вторичная структура т-РНК Компактизация ДНК В хроматине дезоксирибонуклеиновая кислота связана с разнообразными белками, среди которых можно выделить две основные группы – гистоны и негистоновые белки. Начальный этап упаковки ДНК осуществляют гистоны, более высокие уровни обеспечиваются другими белками. Гистоны представляют собой маленькие (ММ 10000-12000 Да) белки, содержащие большое количество положительнозаряженных аминокислот – лизина и аргинина. Существует пять различных типов гистонов, названных H1, H2A, H2B, H3, H4. Гистоны H2A, H2B, H3, H4, называемые кóровыми гистонами (от англ. core — сердцевина), формируют нуклеосому, представляющую собой белковую глобулу, вокруг которой накручена нить ДНК (146 пар нуклеотидов, т.е. примерно 1, 75 витка). Гистон H1 называемый линкерным гистоном (от англ. link — связь), связывается с внешней стороной нуклеосомы, фиксируя на ней нить ДНК. Строение нуклеосомы Сформированная таким образом нуклеосомная нить напоминает бусы, которые складываются в суперспираль (хроматиновая фибрилла) и суперсуперспираль (хромонемма интерфазы). Благодаря гистонам и другим белкам в конечном итоге размеры ДНК уменьшаются в тысячи раз: длина ДНК достигает 6-9 см (10-1), а размеры хромосом – всего несколько микрометров (10-6). Денатурация и ренативация ДНК Гибридизация – ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот — соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу. При полной комплементарности объединение происходит легко и быстро, а в случае частичной некомплементарности слияние цепочек замедляется, что позволяет оценить степень комплементарности. Чем ближе виды, ДНК которых используется при гибридизации, тем больше комплементарных участков в гибридизованной молекуле. Возможна гибридизация ДНК-ДНК и ДНК-РНК. Репликация и клеточный цикл Репликация (синтез) ДНК происходит не беспорядочно, а в строго определенный период жизни клетки. Всего выделяют 4 фазы клеточного цикла: митоз (М), синтетическую (S), пресинтетическую (G1, от англ. gap – интервал), постсинтетическую (G2). Важное участие в регуляции смены фаз клеточного цикла занимают циклины – белки массой 35-90 кДа, содержание которых в клетке меняется в ходе клеточного цикла. По функции циклины – это активаторные субъединицы ферментов циклинзависимых киназ (ЦЗК). Активные комплексы циклин-ЦЗК фосфорилируют внутриклеточные белки, изменяя их активность. Этим обеспечивается продвижение по клеточному циклу. Синтез (репликация, удвоение) ДНК происходит в S-фазу клеточного цикла, когда клетка готовится к делению. Матрица – цепь ДНК Растущая цепь НК 3' Принцип биосинтеза НК 5' х 3' х х Поступающийоннуклеотид Направление роста цепи 5' →3' 5' Биосинтез ДНК (репликация) является: матричным (матрица – обе нити ДНК); Комплиментарным; фрагментарным (нити ДНК синтезируются в виде фрагментов, которые затем соединяются между собой); полуконсервативным (в каждой из образовавшихся молекул ДНК одна нить исходная – материнская, а одна – вновь синтезированная – дочерняя). Полуконсервативность биосинтеза ДНК РЕПЛИКАТИВНАЯ СИСТЕМА 1. МАТРИЦА – ОБЕ НИТИ ДНК НА ВСЕМ ПРОТЯЖЕНИИ 2. СТРОИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ: ДЛЯ СИНТЕЗА ПРАЙМЕРА – АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ ДЛЯ СИНТЕЗА ДНК – дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ 3. ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ БЕЛКИ ТОПОИЗОМЕРАЗА (ГИРАЗА) ХЕЛИКАЗА ДНК - ПОЛИМЕРАЗЫ α - праймаза β - фермент репарации γ - митохондриальный фермент δ - строит ведущую цепь ε - строит отстающую цепь ДНК –ЛИГАЗА - сшивает фрагменты Оказаки 4. ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ (SSB-белки) 5. РЕГУЛЯТОРНЫЕ БЕЛКИ: факторы инициации, элонгации, терминации Особенности репликации ДНК-полимеразы δ и ε не могут соединять между собой два мононуклеотида, а только достраивают имеющуюся нить Синтез идѐт только в направлении от 5´- к 3´-концу (т.е. в разных направлениях на разных нитях материнской ДНК) Репликативная вилка движется только в одном направлении Синтез ДНК начинается одновременно в нескольких точках (ориджинах репликации), участок ДНК между двумя ориджинами называется «репликон» Этапы репликации 1. Инициация: • Топоизомераза находит точку начала репликации, гидролизует одну фосфодиэфирную связь и даѐт возможность компоненатам репликативной системы разомкнуть нити ДНК и образовать репликативную «вилку», а затем вновь соединяет связь между мононуклеотидами • Хеликаза разрывает водородные связи между нитями ДНК Этапы репликации • • ДНК-связывающие белки (SSB-белки) стабилизируют репликативную вилку, не давая восстанавливаться водородным связям между комплиментарными нуклеотидами ДНК-полимераза α (праймаза) строит праймер («затравку») из 8-10 рибонуклеотидов и 40-50 дезоксирибонуклеотидов, а ДНК-полимераза δ достраивает нить из дезоксирибонуклеотидов на лидирующей (ведущей) нити, а ДНКполимераза ε – на отстающей нити ДНК (т.е. в противоположном направлении) Инициация репликации ДНК-полимераза α ДНК-полимераза δ ДНК-полимераза ε Инициация репликации Ориджин репликации репликон Этапы репликации 2. Элонгация ДНК-полимераза δ продолжает удлинять нить из дезоксирибонуклеотидов на лидирующей нити, а ДНК-полимераза ε – фрагменты (фрагменты Оказаки) на отстающей нити ДНК по мере движения репликативной вилки. Так продолжается до тех пор, пока репликативная вилка не достигнет предыдущего ориджена и не сольѐтся с ним. В результате этого складывается следующая ситуация: на ведущей нити дочерняя молекула построена из больших кусков ДНК, соединѐнных с праймерами, а на отстающей – из маленьких фрагментов (фрагментов Оказаки) Элонгация репликации Этапы репликации Терминация ДНК-полимераза β (фермент репарации) удаляет праймеры и достраивает фрагменты ДНК ДНК-лигаза соединяет фрагменты между собой Функции ДНК-полимеразы β Репарация ДНК Так как на геном любой неделящейся клетки постоянно оказывает влияние окружающая среда, то вполне вероятны повреждения в составе нуклеотида, также возможно встраивание неправильного нуклеотида при репликации (хотя точность репликации очень велика, но репликативная система может «ошибаться» с частотой примерно 1 раз на 105-106 пар нуклеотидов). Такие нарушения быстро определяются специальными ферментами, пораженный участок удаляется эндо- и экзонуклеазами, заполняется ДНКполимеразой β и сшивается ДНК-лигазой. Этот процесс называется репарацией («исправлением ошибок») В случае изменения структуры основания (например, его дезаминирование) это основание удаляется ДНК-Nгликозидазой, затем другими ферментами удаляется дезоксирибоза и на ее место ДНК-полимеразой β и ДНКлигазой встраивается нужный нуклеотид. Репарация ДНК Для биосинтеза РНК (транскрипции) необходимы: •МАТРИЦА – участок одной из нитей ДНК – (транскриптон) •СТРОИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ: – АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ •ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ БЕЛКИ ДНК-зависимые РНК-полимеразы I — для синтеза р-РНК II — для синтеза м-РНК III — для синтеза т-РНК •РЕГУЛЯТОРНЫЕ БЕЛКИ: факторы инициации, элонгации, терминации Биосинтез РНК В отличие от репликации при транскрипции весь биосинтез осуществляется одним ферментом – ДНК-зависимой-РНК-полимеразой, которая находит определѐнную последовательность нуклеотидов – промотор, с помощью фактора инициации σ (сигма) присоединяется к нему, раскручивает участок ДНК и разделяет водородные связи («плавит» ДНК) и обеспечивает тем самым возможность синтеза РНК на одной из нитей ДНК по принципу комплиментарности. Транскрибируется весь участок одной из нитей ДНК от промотора до сайта терминации – транскриптон. Сборка полирибонуклеотида продолжается до тех пор, пока РНК полимераза не достигнет сайта терминации. Затем вновь синтезированная молекула и РНК-полимераза отсоединяются от ДНК, в которой восстанавливаются водородные связи, и нити скручиваются в исходную форму. Молекула, которая получилась при транскрипции называется первичный транскрипт, или гетерогенная ядерная РНК (пре-РНК). Биосинтез РНК РНК-полимераза Транскрибируемая нить ДНК Нетранскрибируемая нить мононуклеотиды пре-РНК (первичный транскрипт) Сайт терминации Посттранскрипционный процессинг (созревание РНК) Первичные транскрипт – ещѐ не готовая РНК, для выполнения своих функций она должна «созреть». У эукариот процессингу подвергаются все виды пре- РНК, у прокариот – только предшественники рРНК и тРНК. Созревание матричной РНК проходит в три этапа: 1. сплайсинг (англ. splice – склеивать встык), 2. модификация 5́-конца, 3. модификация 3́-конца. Как известно, ДНК имеет «мозаичную» структуру, т.е. в каждом гене содержатся как кодирующие (экзоны), так и некодирующие (интроны) участки. При транскрипции считывание происходит непрерывно, и в первичном транскрипте присутствуют копии и экзонов, и интронов. При сплайсинге интроны удаляются, а экзоны соединяются между собой. Этот процесс осуществляется специальными ферментами рибонуклеотидной природы – рибозимами, так называемыми «малыми ядерными РНК» - мяРНК. При спайсинге размер первичного транскрипта может уменьшится в несколько раз. Процессинг РНК (1. сплайсинг) Процессинг (2. модификация концов м-РНК) 1. Модификуация 5′-конца. «Кэпирование» (англ. cap – шапка) – происходит еще во время транскрипции. Процесс состоит в присоединении к 5'-трифосфату концевого нуклеотида премРНК 5'-углерода N7-метил-гуанозина. "Кэп" необходим для защиты молекулы РНК от экзонуклеаз, работающих с 5'-конца, а также для связывания мРНК с рибосомой и для начала трансляци. 2. Модификация 3′-конца. Полиаденилирование – при помощи полиаденилат-полимеразы с использованием молекул АТФ происходит присоединение к 3'-концу РНК от 100 до 200 адениловых нуклеотидов, формирующих полиадениловый фрагмент – поли(А)-хвост. Поли(А)-хвост необходим для защиты молекулы РНК от экзонуклеаз, работающих с 3'-конца. Процессинг (2. модификация концов м-РНК) Состав зрелой м-РНК 5'-конец "колпачок" (кэп) 5'-нетранслируемый участок инициирующий кодон кодирующая часть терминирующий кодон 3'-нетранслируемый участок 3'-конец поли(А)-фрагмент Процессинг т-РНК (также проходит в три этапа) Все транспортные РНК имеют сходную вторичную структуру – «клеверный лист». Такая форма обеспечивается особенными (минорными) модифицированными азотистыми основаниями в их составе. Минорные азотистые основания играют две роли: вопервых, формируют пространственную структуру, а во-вторых, защищают т-РНК от гидролиза внутриклеточными нуклеазами. 1. Модификация нуклеотидов (азотистых оснований) в молекуле происходит путем дезаминирования, метилирования, восстановления. Например, образование псевдоуридина , дигидроурацила Процессинг т-РНК 2. Формирование антикодоновой петли происходит путем сплайсинга и удаления интрона в средней части пре-тРНК. 3. Формирование на 3'-конце последовательности ЦЦА. Для этого у одних пре-тРНК с 3'-конца удаляются лишние нуклеотиды до "обнажения" триплета ЦЦА, у других идет присоединение этой последовательности. Контрольные вопросы по теме: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Распад нуклеиновых кислот, нуклеазы пищеварительного тракта и тканей. Распад пуриновых нуклеотидов. Биосинтез пуриновых нуклеотидов, происхождение атомов «С» и «N» в пуриновом кольце. Распад пиримидиновых нуклеотидов. Биосинтез пиримидиновых нуклеотидов. Нарушения обмена нуклеотидов. Подагра. Нуклеиновые кислоты, химический состав, строение. Первичная структура ДНК и РНК, связи, формирующие первичную структуру. Вторичная и третичная структура ДНК. Денатурация, ренативация ДНК. Гибридизация, видовые различия первичной структуры ДНК. РНК, химический состав, уровни структурной организации. Типы РНК, функции. Биосинтез ДНК, субстраты, источники энергии, матрица, ферменты. Понятие о репликативном комплексе. Этапы репликации. Синтез ДНК и фазы клеточного деления. Роль циклинов и циклинзависимых протеинкиназ в продвижении клетки по клеточному циклу. Повреждение и репарация ДНК. Ферменты ДНК-репарирующего комплекса. Биосинтез РНК. РНК-полимеразы. Понятие о мозаичной структуре генов, первичном транскрипте, посттранскрипционном процессинге. Рекомендуемая литература Основная: Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М. : «Медицина», 2016. – 704 с. Биохимия /под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЕОТАР-МЕД, 2018. – 780с. Дополнительная Клиническая биохимия / Под ред. член-корр. РАН В.А. Ткачука. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2006. – 506 с. Чиркин, А.А. Биохимия : Учебное руководство / А.А. Чиркин, Е.О. Данченко. – М.: Мед.лит., 2010. – 624 с.: ил. Биохимия : Тестовые вопросы : учебное пособие / Под ред. Д.М. Зубаирова, Е.А. Пазюк.− М. : «ГЭОТАР-Медиа», 2008.− 288 с. Биологическая химия. Ситуационные задачи и тесты : учеб.пособие / А.Е. Губарева [и др.] ; под ред. А.Е. Губаревой. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2016. – 528 с.
