Загрузил ivanova.m.o.r

Молекулярная биология лекция

Баллы и способы их зарабатывания
o Максимальное количество баллов за курс –
100, нормируемое к требуемому количеству
баллов (в зависимости от того, зачет или
экзамен будет в конце курса)
o Источники баллов:
n Работа на лекциях/семинарах (интересные вопросы,
замечания, предложения, идеи и т.д.)
n Выполнение он-лайн курса «Основы генетической
инженерии» (в разработке)
n Написание спецрефератов
n Написание манускриптов
Манускрипт
o Ру́копись — собирательное название текстов,
написанных от руки, синоним термина манускрипт
(позднелат. manuscriptum, от лат. manus — рука и
scribo — пишу). Как правило, рукописью называют
черновики литературных произведений, либо их
образцы, написанные автором от руки.[ определение
взято из Рукопись // Энциклопедический словарь
Брокгауза и Ефрона: в 86 т. (82 т. и 4 доп.). — СПб.,
1890—1907]
o В науке: манускрипт – текст статьи, посылаемый
авторами для публикации в рецензируемом научном
журнале.
Лекция 2 Методы очистки и детекции
нуклеиновых кислот и белков
Начало генетической инженерии
Очистка ДНК
Очистка РНК
Очистка белка
Полимеразная цепная реакция
Синтез кДНК
Саузерн-, Нозерн-, Вестерн-блоттинг
анализы
o Ферменты для манипуляций с нуклеиновыми
кислотами и белками in vitro
o
o
o
o
o
o
o
Генетическая инженерия
Экспериментальный раздел молекулярной
генетики, совокупность приемов, методов и
технологий для целенаправленного создания
новых комбинаций и внесения изменений в
генетический материал как in vitro так и in vivo.
Открытие антибиотиков
o В 1928 г британский бактериолог Александр Флеминг обнаружил
антимикробные свойства пенициллина
o
o
В 1940 г. Эрнст Борис Чейн и
Ховард Вальтер Флори
предложили способ очистки
пенициллина
В 1945 г. Флеминг, Флори и
Чейн удостоены Нобелевской
премии за «открытие
пенициллина и его лечебный
эффект на различные
инфекционные болезни»
Открытие антибиотиков
o В 1928 г британский бактериолог Александр Флеминг обнаружил
антимикробные свойства пенициллина
o
o
В 1940 г. Эрнст Борис Чейн и
Ховард Вальтер Флори
предложили способ очистки
пенициллина
В 1945 г. Флеминг, Флори и
Чейн удостоены Нобелевской
премии за «открытие
пенициллина и его лечебный
эффект на различные
инфекционные болезни»
Казалось, что мы близки к полной победе над бактериальными
эпидемиями…
R-факторы
o
В 1960х годах обнаружены штаммы патогенных бактерий устойчивых
к одному или нескольким антибиотикам.
o
Факторы устойчивости к антибиотикам (resistance factors, Rfactors) – были идентифицированы как отдельные единицы
наследственности (гены), но они не картировались на хромосомы
бактерий.
R-факторы могли передаваться от одной бактерии к другой. Долгое
время их структура была неясна.
o
Плазмиды
В 1952 г. Джошуа Ледеберг (Joshua Ledeberg)
предложил термин плазмида (plasmid) [ гибрид слов
цитоплазма (cytoplasm) и ИД (id)], обозначающий
любой фактор внехромосомной наследственности
(включая и R-факторы).
В 1958 г Эли Жакоб (Élie Jacob) и Франсуа Волман
(François Wollman) предложили термин эписома,
обозначающий не важный генетический элемент,
который может существовать автономно или быть
встроенным в хромосому.
В 1968 г. на симпозиуме, посвященном плазмидам и
эписомам, предложено использовать только термин
плазмида.
Джошуа Ледеберг
(1925-2008 гг)
Современное определение плазмиды
□ Плазмида - небольшая молекула ДНК
физически отделимая от хромосом и способная
реплицироваться автономно.
\
//
Ыа promoter
CMV prom oter
Amp(R|
.»
CMV forward primer
T7 primer
17 promoter
7K
pUC origin
/
X,
CE
LNC
Я и Г (и о з)
pR SVlucM S
SV40 pA
Neo(R)
74«bp
NS1 NC
. -
■
\ \ \ NT7TERM
SV40 early promoter
\
BOH reverse primer
\
i
Origin of Replication
BGHpA
M origin
Начало генетической инженерии
In vitro получена плазмида, состоящая из фрагментов ДНК вируса
SV40, E.coli и фага λ. Показано, что такая гибридная молекула
может реплицироваться в клетках млекопитающих.
Начало генетической инженерии
В плазмиду E.coli pSC101, несущую ген устойчивости к антибиотику
тетрациклину, авторы встроили ген устойчивости к антибиотику –
канамицину из другой плазмиды E.coli pSC102. Полученная химерная
плазмида обеспечивала устойчивость E.coli к обоим антибиотикам, т.е.
гибридная плазмида не только реплицировалась, но и работала.
Начало генетической инженерии
В работе показано, что можно «пересадить» гены из плазмид
стафилококка в плазмиды E.coli и эти гены в составе химерных
межвидовых плазмид нормально работают в E.coli.
Начало генетической инженерии
В работе показано, что эукариотические гены можно встроить в
бактериальную плазмиду и они будут экспрессироваться.
Базовый принцип генетической
инженерии
Модульность
генетических
конструкций
Наследственный материал (ДНК) может быть разделен на
структурно и функционально независимые фрагменты
(модули), которые можно соединять с другими
фрагментами различного происхождения в более сложные
конструкции с сохранением активности всех частей
конструкции.
Очистка геномной ДНК
o Выделение всех нуклеиновых кислот со
смесью фенол-хлороформ (pH = 8.0).
Удаление РНК при помощи РНКазы.
o Выделение методом щелочного лизиса
с нагреванием. При нагревании в
щелочных условиях происходит
автогидролиз РНК.
o Использование коммерческих наборов.
Осаждение ДНК, носители
o ДНК формирует осадок в присутствие одновалетных
ионов, нейтрализующих заряд фосфатных групп, и
спирта, отбирающего воду. Пример, 0,1 объема 3М
NaOAc и 2 -2,5 объема этилового спирта или 0,8 – 1,0
объема изопропилового спирта.
o Для осаждения малых количеств ДНК в смесь
добавляют носители:
Гликоген
o тРНК
o Полиамины (спермин)
o Линейный полиакриламид
Задача носителя сформировать основу, к которой
прилипнут фрагменты нуклеиновых кислот.
Очистка плазмидной ДНК
методом щелочного лизиса
Метод основан
на создании
условий для
денатурации
геномной ДНК,
белков, с
последующим
выпадением их
в осадок
Наборы для выделения
плазмидной ДНК
Основной принцип
работы: сорбция ДНК
на силикатной
мембране или
фильтре, промывка
этанолом и элюция
водой или лучше
буферным раствором
(Tris pH8.0)
Не элюируйте
буфером, содержащим
EDTA!!!
Электрофорез в агарозном геле
В электрическом поле
нуклеиновые кислоты
движутся в направлении
к катоду (+).
В агарозном геле
фрагменты нуклеиновых
кислот разделяются в
геле в соответствии с их
длиной.
Флуоресцентные красители
нуклеиновых кислот in vitro
Бромистый этидий
SYBR Green I
Очистка ДНК из агарозного
геля
Основана на ферментативном
(агараза) или химическом
(перхлорат натрия) расщеплении
агарозы.
Определение концентрации ДНК
□
Спектрофотометрически. Прибор
NanoDrop. Показатель чистоты:
отношение O D 260/O D 280 = 1.8 1.9. Дает завышенные показания
из-за примесей.
□
При помощи флуоресцентных
красителей. Прибор Qubit. Не дает
информации о чистоте препарата.
□
При помощи ПЦР. Для оценки
количества конкретного фрагмента
ДНК. В качестве контроля
используется серия стандартов с
известной концентрацией.
Выделение тотальной РНК
o Выделение при
помощи фенолхлороформ, имеющей
кислый pH (pH =
4.0). ДНК в этих
условиях находится в
интерфазе.
Расщепление примесей
ДНК при помощи
ДНКазы I.
o Выделение при
помощи коммерческих
наборов
Очистка фракции
полиаденилированной РНК
o При помощи
коммерческих
наборов.
Принцип работы:
аффинная
хроматография
на сорбенте с
олиго-dT
Определение концентрации РНК
□
Спектрофотометричес
ки. Показатель
чистоты: отношение
O D 260/O D280 > 2 .0 .
□ При помощи
флуоресцентных
красителей. Прибор
Qubit
□ ОТ-ПЦР-РВ. Оценка
количества
определенной РНК.
Вместе со стандартами
количества очищенной
РНК.
Электрофорез РНК в
агарозном геле
Отличия от электрофореза
ДНК:
1. Все используемые
приборы и реактивы
должны быть чистыми
от РНКаз
2. Предварительная
денатурация РНК в
формамиде
3. Краситель добавляют в
образец РНК
4. В гель добавляют
формальдегид
Синтез первой цепи кДНК
MMLV
+- +- +- +- +-
Матрица: тотальная
Применение
РНК,
полиаденилированная
фракция РНК
• Анализ экспрессии генов
Праймеры: олиго-
• Клонирование кодирующих частей
генов
dT, рассеянная
затравка
Синтез второй цепи кДНК
Матрица: тотальная РНК,
полиаденилированная фракция
РНК
Праймеры: олиго-dT, рассеянная
затравка
Применение:
1. Приготовление библиотек кДНК
для секвенирования следующего
поколения
2. Клонирование
3. Вычитающая гибридизация
Полимеразная цепная
реакция
Компоненты реакции:
1. Буфер
2. Нуклеозидтрифосфаты
3. Праймеры
4. Матрица
Стадии реакции:
1. Денатурация (95ºС)
2. Отжиг праймеров (40 – 72ºС)
3. Элонгация синтеза (72 ºС)
5. Термостабильная ДНК
полимераза
Кривая амплификации ДНК
Плато количества продуктов
реакции
o истощение субстратов (дНТФ и праймеров)
o падение активности фермента
o накопление ингибиторов, включая
пирофосфаты и двуцепочечную ДНК
o конкуренция за фермент неспецифическими
продуктами или праймер-димерами
o неполная денатурация ПЦР продуктов при
высокой концентрации.
ПЦР в реальном времени
ПЦР в присутствии
флуоресцирующего ДНК
красителя, например,
SYBR Green I.
В через равные интервалы
времени происходит
считывание уровня
флуоресценции и
строится график
накопления сигнала
Параметры реакции:
1. пороговый цикл
2. эффективность реакции
Способы генерации
флуоресцентного сигнала
Интеркалирующие красители
o SYBR green I
Неинтеркалирующие красители
o Eva Green
Гибридизационные зонды
o Taqman
o Молекулярные маяки
o Пробы FRET
Нозерн блоттинг (Nothern
blotting) анализ
Метод детекции
определенных
фрагментов РНК
путем гибридизации
фракции разделенных
РНК с меченными
зондами
Саузерн блоттинг (Southern
blotting) анализ
Метод детекции
определенных
фрагментов ДНК
при помощи
гибридизации с
меченными
зондами. Схема
метода аналогична
нозерн блоттингу.
Сэр Edwin Mellor
Southern (род. 1938 г.)
Очистка белков: виды
хроматографий
o Аффинная – связывание белка на сорбенте за
счет субстрата, антител или иных молекул,
специфично взаимодействующих с нужным
белком. Частный случай: никель-хелатная
хроматография.
o Гель-фильтрационная – разделение белков по
размеру.
o Ионо-обменная – разделение белков по заряду.
o Обратно-фазная – разделение белков по
степени гидрофобности.
Металл-аффинная хроматография белков
с гексагистидиновой меткой (6хHis) на
Ni-NTA-агарозе
Механизм действия Ni-NTA
агарозы
NTAнитрилотрехуксусная
кислота, хелатор
ионов никеля
Механизм связывания
гистидиновой метки с
Ni-NTA агарозой
основан на
образовании
координационных
связей с ионами Ni
Определение концентрации белков
Чистый белок:
o Спектрофотометрически:
(OD224 - OD233)/0.0496
o Метод Бредфорд.
o Метод Лоури.
В белковой смеси:
o Вестерн-блот анализ со
стандартами количества
данного белка
o ELISA
Разделение белков в
полиакриламидном геле (ПААГ)
o
o
o
o
Белки могут быть
предварительно
денатурированы в SDS или
мочевине
(денатурирующий ПААГ)
или разделятся без
денатурации (нативный
ПААГ).
В денатурирующем ПААГ
разделение белков идет
преимущественно в
соответствии с их массой
В нативном ПААГ белки
разделяются в зависимости
от их формы и заряда.
Окраска гелей: Coomassie,
нитрат серебра.
L
– исходный клеточный лизат
FT - фракция «проскока»
W – фракция промывки
E
– элюат
M - маркеры молекулярной массы белков
Вестерн-блот анализ белков
o
Этап 1. Разделение белков в
ПААГ
o
Этап 2. Перенос белков на
мембрану (нитроцеллюлозную,
PVDF)
o
Этап 3. Инкубация мембраны с
антителами против нужного
белка(ов), коньюгированных с
ферментом (люцифераза,
пероксидаза)
o
Этап 4. Экспозиция мембраны
с фоточувствительной
бумагой/экраном. Детекция
сигнала
Вестерн-блот анализ белков
Ожидание
Реальность
"Я знаю, как я умру. Это
будет в фотокомнате... от
инфаркта..."
Приписывается Е.Тульчинскому.
Дот-блот и слот-блот анализы
белков и белковых смесей
Слот-блот