Министерство образования и науки Украины Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина Факультет радиофизики, биомедицинской электроники и компьютерных систем Реферат по курсу «Биосенсорика» на тему ТКАНЕВЫЕ БИОСЕНСОРЫ студента группы РЕ-41 Козынко А.Л. Харьков 2019 БИОСЕНСОРЫ. Биосенсоры - аналитические устройства, конструктивно состоящие из двух блоков: биологического, включающего ферменты или антитела, целые клетки либо их органеллы, срезы тканей и т. п., и физико-химического датчика (трансдуктора) для регистрации сравнительно небольшого числа величин (температуры, интенсивности светового потока, электрический ток или потенциал) или концентрации простых химических соединений (кислорода, углекислого газа, аммиака). На входе первого блока протекает специфическая биологическая реакция, а на выходе формируется сигнал, который преобразуется трансдуктором в физически измеряемую величину. В литературе тип биосенсора определяется либо биологическим материалом, использующимся для определения концентрации аналита, либо применяемым трансдуктором. Так, если на поверхности трансдуктора иммобилизованы антитела или ферменты, то говорят о иммунологических или ферментативных биосенсорах, если микроорганизмы или целые клетки - то о микробных или клеточных биосенсорах. Если же сделан акцент на тип трансдуктора, то речь идет об оптических, потен-циометрических, амперометрических или гравиметрических биосенсорах. Количество различных типов биосенсоров как сочетание какой-либо специфической биологической системы и определенного вида трансдуктора практически не ограничено. Расширение сферы применения биосенсоров в настоящее время обусловлено не только высокой чувствительностью этих систем, но и тем, что биосенсор, как правило, содержит весь набор реагентов, необходимых для определения концентрации какого-либо вещества, а это позволяет свести процедуру анализа к одному этапу. Можно говорить о своего рода автоматизации определения химических параметров тестируемых образцов, поскольку структура сенсоров, создаваемых методами биотехнологии, реализует алгоритм биохимического анализа. ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ БИОСЕНСОРОВ. Благодаря своим свойствам биосенсоры находят применение во многих областях человеческой деятельности. В сельском хозяйстве и пищевой промышленности биосенсоры используются для контроля качества продукции (например, биосенсор на основе тиллакоидов шпината для определения концентрации гербицидов - атразина и диурона или биосенсор для определения гипоксантина при оценке качества рыбы). В экологии биосенсоры используются для мониторинга параметров окружающей среды, например, биосенсор для определения химического состава сточных вод. Датчик позволяет определять концентрации органических веществ в воде и детектировать наличие в среде гербицидов и мутагенов. Для определения концентраций фосфорорганических пестицидов на основе электрода Кларка разработаны биосенсоры, в которых чувствительным элементом является иммобилизованная в целлюлозную мембрану холиноксидаза либо бутирилхолиноксидаза. Разработаны амперометрические микробные биосенсоры, в которых уровень загрязнения окружающей среды определяется по влиянию вредных веществ на дыхание микробной компоненты. ПРИМЕНЕНИЕ БИОСЕНСОРОВ В МЕДИЦИНЕ. В медицине биосенсоры применяются при биохимическом скрининге жидких сред организма во время массовых обследований, для непрерывного мониторинга физиологических параметров больных, как первичные датчики при разработке систем биохимического протезирования. Спектрофотометрические и храматографические методы, которые традиционно используются в клинике для определения органических веществ, малопригодны для измерений в режиме on-line. Этим обусловлены интенсивные исследования и разработки биосенсоров на физиологические значимые соединения, ответ которых составлял бы минуты, а при использовании кинетических методов - секунды. Такие датчики можно будет применять для непрерывного контроля биохимических показателей жидких сред организма. Например, разрабатываются имплантируемые ферментные датчики на глюкозу, которые предполагается использовать при лечении диабета с помощью компенсаторных устройств, управляемых микропроцессорами, поддерживающих нормальную концентрацию инсулина в крови. Характеристики биосенсоров - чувствительность, время отклика, линейный диапазон, предел обнаружения, селективность и специфичность совпадают с таковыми для физических химических датчиков. Относительно специфической характеристикой биосенсора является время его жизни; чувствительность биосенсоров со временем уменьшается из-за деструкции биологического материала. Понятно, что время жизни зависит от условий хранения и эксплуатации датчика (температуры, рН, применяемых консервантов). Применение техники в медицине налагает специальные требования, которые неизбежно меняются в зависимости от того, соседствует ли прибор с тканями человека, насколько его выходной сигнал, несущий информацию или воздействующий на организм, важен для обеспечения жизненных функций. Во многих ситуациях детектирующие и измерительные приборы, хотя и могут предупреждать об отклонениях от нормы, но не обеспечивают модификации лечения без вмешательства человека. Так, например, отклонения частоты сердечных сокращений сами по себе, без врача, не вызывают импульсы постоянного тока, стимулирующие работу сердца (кардиоверсия). В более сложных случаях это связующее звено может быть утеряно, и его невозможно восстановить. Наиболее известный пример водители ритма сердца, выходной сигнал которых может спасти жизнь, но может быть и фатальным. Эти различия приводят к тому, что выдвигаются самые разные требования к надежности, точности, биосовместимости, безвредности для пациента и взаимодействию с ним. С инженерной точки зрения прибор для внешних измерений, проходящий обычный контроль качества, может быть сконструирован немногим надежнее, чем требуют обычные потребительские стандарты; постоянно используемые дома приборы, от которых зависит жизнь пациента, должны удовлетворять техническим условиям уровня военной и аэрокосмической промышленности. ХАРАКТЕРИСТИКИ БИОСЕНСОРОВ. Совершенно очевидно, что любой измерительный прибор должен давать результат, близкий к реальному значению измеряемой величины (правильность) и с достаточной воспроизводимостью, чтобы можно было доверять его показаниям. Обычно правильность не является проблемой для приборов, градуируемых по известным эталонным методам, если только отсутствует дрейф градуировки. Клиническая медицина удивительно нетребовательна к воспроизводимости в отличие от, например, химической технологии. По крайней мере врачи, принимая решение на месте, обычно не реагируют на различия в ±10 %, хотя при последовательных измерениях такая разница вполне может быть значимой и отражать тенденцию, обуславливаемую лечением. В некоторых обстоятельствах (определение мочевой кислоты в сыворотке или, например, высоких концентраций амилазы или парацетамола в крови) достаточно даже меньшей воспроизводимости. Необходимо, однако, с осторожностью интерпретировать клинические требования в свете современной медицинской практики. Сейчас многие пациенты сами определяют содержание глюкозы в крови по индикаторным полоскам с точностью ±30 % (что соответствует шагу эталонной шкалы цветности) и представляют данные своим врачам, которым вполне достаточно этих данных для уточнения дозировки инсулина. Такая неточность, однако, неприемлема, если каждое измерение используется для регулировки дозы инсулина, поддерживающей постоянную физиологическую концентрацию глюкозы в крови. Это возможно в случае, когда терапевтически более эффективно подкожное введение инсулина. Можно предполагать, что если данные по содержанию глюкозы используются для решения более сложных задач (расчет дозы, установление связи между поглощением пищи и инсулиновой чувствительностью, введение обратной связи в управление внутривенной подачей инсулина), то требуется большая воспроизводимость. Важно понимать, что рабочий диапазон измерительного прибора, предназначенного для использования в клинической медицине, определяется в общем случае патофизиологическим, а не физиологическим диапазоном измерения измеряемой величины. В норме концентрация глюкозы поддерживается между 3,5 и 5,5 ммоль/л, но важно и чтобы \ прибор мог различить 1 ммоль/л и 2 ммоль/л. При этом следует иметь в виду, что зарегистрированное изменение от 50 до 40 ммоль/л вполне реально. При низкой активности щитовидной железы большое значение имеет контроль за содержанием гормона тиреотропина, которое при данном обстоятельстве возрастает. Эндокринологи же долгое время использовали метод анализа, который не позволяет различать концен трации тиреотропина ниже верхнего предела его физиологического диапазона. Следовательно, чувствительность прибора необходимо специально "подгонять" к его назначению в медицине. Создание все более портативных, точных и надежных измерительных приборов неизбежно будет дальнейшим стимулом к увеличению спроса на эти приборы в исследовательской медицине. От разработчиков биосенсоров можно ожидать новых приборов, обладающих высокой правильностью и воспроизводимостью, пригодных для клинической практики и фундаментальных физиологических исследований. ВРЕМЯ ОТКЛИКА. Результаты анализа проб крови, посланных в обычную больничную лабораторию, получают обычно в пределах от 30 мин до нескольких дней. В течение этого времени врач продолжает лечение, исходя из клинического диагноза. Парадоксально, но при проведении анализа у постели больного время отклика прибора приобретает большое значение, поскольку здесь обычно приходится принимать немедленное решение. Как уже отмечалось, именно в этом отношении биосенсоры должны влиять на организацию работы в клинике. Дело в том, что в ожидании получения результатов анализа от прибора сенсорного типа персоналу не хватит времени, чтобы заняться какой-либо другой деятельностью. Поэтому общее время измерения (включая и градуировочные и подготовительные процедуры) не должно превышать 120 с. Желательно, чтобы время отклика сенсора составляло 30 с. Важно также, чтобы до истечения этого времени не было возможности считывать промежуточные результаты. ГРАДУИРОВКА. В настоящее время трудно представить себе биосенсоры, которые могли бы сохранять необходимую точность при периодическом или непрерывном использовании в течение длительного времени. Конечно, такой проблемы не возникает в случае одноразовых устройств. Более того, если физические приборы, например рефлектометры, можно градуировать, используя подготовленные заранее сухие индикаторные полоски или фильтры, биосенсоры нуждаются в градуировке по растворам, содержащим определенное вещество. При необходимости в растворы приходится вводить фиксированные количества мешающих веществ. Даже при малых временах отклика проводить градуировку сенсора при каждом его использовании было бы неудобно. Очень желательно, чтобы приборы заранее программировались на градуировку после фиксированного числа анализов и через фиксированные интервалы времени. Сенсор, используемый для серийных анализов, непрактично подвергать внешней градуировке с использованием лабораторного оборудования. Следует, однако, предусмотреть возможность контроля качества работы прибора клиническим или лабораторным персоналом. При измерениях in vivo возникают новые проблемы. В частности срок службы сенсора нередко ограничивается падением точности показаний. Вообще предполагается, что любая вводимая внутривенно или подкожно игла должна работать как минимум 24 часа (подкожные проводники или канюли обычно необходимо заменять максимум через 3 дня). В больничных условиях обычно предпочитают внешнюю градуировку по пробе крови. Однако необходима осторожность, если концентрации определяемых веществ в крови связывают с концентрациями в тканях больных. Глядя в будущее, можно предположить, что внешнюю градуировку имплантированного на длительный срок сенсора будут проводить с помощью капли капиллярной крови (вероятно, через специальное внешнее устройство). Однако такую градуировку нельзя проводить чаще одного раза в сутки (самим пациентом). МЕШАЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА. Проблема неспецифичности биосенсоров в связи с анализом биологических жидкостей общеизвестна. Биоинженерам важно понять, что концентрационный диапазон любого мешающего вещества в крови не совпадает с его физиологическим диапазоном. В крови тяжелобольных людей могут содержаться очень далекие от нормы количества глюкозы, кислорода, органических кислот, солей мочевой кислоты и т.д., а именно для таких пациентов прежде всего предназначен мониторинг in vivo. Кроме того, в медицине стало почти правилом применять множество лекарственных средств. Лекарственные препараты (и их метаболиты) являются еще одним потенциальным источником помех. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ПРОБЫ. Клиницисты используют для анализа любые жидкие пробы, которые они могут получить из организма пациента, - мочу, спинномозговую жидкость, слюну, пот, выпоты и экссудаты, - но чаще всего кровь. Кровь - это биологическая жидкость, которую легче всего получить, особенно в экстренных ситуациях, и состав которой отражает химические изменения, происходящие в теле. К сожалению, при работе с кровью возникают две частные проблемы. Во-первых, переменная доля объема крови приходится на эритроциты (которые сами примерно на 30 % состоят из белка гемоглобина), внутренний состав которых отличается от состава плазмы. Во-вторых, кровь содержит ряд веществ, отобранных в ходе эволюции специально для взаимодействия с поверхностями. Эритроциты молено отделить от плазмы центрифугированием, но это требует времени и специального оборудования, а также может быть затруднен при малых объемах проб. Кроме того, механическое разрушение центрифужных пробирок может представлять реальную опасность для здоровья вследствие образования аэрозолей плазмы. Таким образом, сенсоры следует включать в системы, в которые поступает кровь; это позволяет оценивать содержание в плазме веществ, для которых не устанавливается быстрое равновесие через мембраны эритроцитов. БЕЗОПАСНОСТЬ И НАДЕЖНОСТЬ. Казалось бы, можно сказать, что прибор пригоден для медицины, если шансы спасения жизни с его помощью выше его опасности для жизни. Однако на практике эта простая идея не приемлема, даже если риск поддается количественной оценке, что обычно сделать трудно. Кроме того, в медицине лечение часто направлено на облегчение болезни (страданий), а не устранение угрозы смерти. Введение опасности для здоровья (жизни) вместо такого лечения или в качестве средства лечения чревато этическими и социальными осложнениями. Вообще, чтобы любой новый способ лечения или прибор стал приемлемым для медицины, выгоды от его использования должны намного перевешивать возможные проблемы. Ошибочные результаты Необходимо всегда иметь в виду возможность отказа любого сенсора. Отказ может приводить к ошибочному результату, а затем к неверному автоматическому срабатыванию или информационному отклику сенсорной системы. Примером опасного отклика может быть чрезмерное усиление сигнала глюкозного in vivo сенсора, управляющего! системой подачи инсулина. Использование дома прибора для определения глюкозы в крови, дающего такую же ошибку, может привести к тому, что пациент предпримет опасные действия, корректируя обнаруженное "отклонение" от нормы. Точно так же, если из-за отказа прибора не обнаружено реальное отклонение от нормы, может случится, что врач не предпримет соответствующих мер в опасных для жизни обстоятельствах. Подходящими примерами здесь могут быть также случаи высокого содержания кетонов в крови (диабетический кетацидоз) или отравление парацетамолом. Сложные приборы для мониторинга in vivo могут включать схемы для обнаружения отказов электроники, хотя не может быть гарантий против ошибочного сигнала сенсора, если только не используются дублирующие сенсоры. В некоторых пределах сенсорные устройства можно программировать на определенные скорости изменения измеряемогопараметра с выдачей сигнала тревоги, если эти изменения выходят за допустимые границы. Следует, однако, учитывать, что ошибка измерения обычно растет быстрее, чем ожидаемые вследствие болезни изменения. Таким образом, при проектировании всех частей сенсорных приборов необходимо постоянно обращать внимание на надежность, ориентируясь при этом на самые высокие технические стандарты. Вынести суждение о приборах, предназначенных для работы у постели больного или управляемых им самим, значительно труднее. Частично это связано с тем, что для массового использования таких приборов они должны продаваться по разумной цене. Частично ответ находится в руках самих врачей, которые должны убедить пациентов не реагировать на одиночный результат, который может привести к опасному изменению намеченного лечения, без обдумывания и, возможно, дополнительной проверки. ТОКСИЧНОСТЬ. Совершенно очевидно, что приборы для мониторинга in vivo должны быть сделаны из нетоксичных материалов. Значительный коммерческий опыт накоплен в отношении композиционных материалов (металлов и пластиков), используемых в сердечных клапанах, водителях ритма сердца, протезных костей и кровеносных сосудов. Следует также обратить внимание на новые органические вещества, в том числе ферменты, которые могут выщелачиваться из сенсоров или так или иначе захватываться клетками "сборщиками мусора" (макрофагами). Вполне вероятно, что при использовании биосенсоров может возникнуть и проблема активации иммунной системы - появления антител, приводящих к повреждению органов вследствие нарушения иммунной системы или амилоидоза. Эти проблемы можно частично решить, используя лишь допустимые для организма количества токсичных или антигенных веществ и удерживая большинство из них за диффузионными барьерами. МЕХАНИЧЕСКИЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ. Каждый разрез или прокол кожи есть нарушение анатомической целостности, а любое продвижение в глубь тела сопряжено еще с большим риском нарушения жизненных функций. Сенсоры, помещенные в подкожную ткань и связанные с проходящими через кожу проводами, являются "входными воротами" для инфекции. Поэтому они должны быть стерильными и заменяться каждые 1-3 дня. Риск инфекции еще выше для приборов, помещенных в кровеносную систему. Однако из-за сложности процедуры введения таких приборов в вену их регулярная замена возможна практически только в отделении интенсивной терапии или операционной. Следовательно, такие приборы следует имплантировать целиком и рассчитывать на большой срок службы (более двух лет). Кроме того не до конца выяснена опасность тромбоза. Из опыта применения проводников водителей ритма сердца вытекает, что в кровеносный сосуд нельзя вводить что-либо выступающее за его стенки. Это может серьезно ограничить возможности сенсора! При внутримышечном использовании сенсорных приборов имеется риск их механического разрушения вследствие длительного пребывания в постоянно движущейся среде при 37 °С. По всем этим причинам сенсоры, предназначенные для постоянного нахождения в мышечной ткани человека, должны испытываться в течении ряда лет на собаках и свиньях; лишь тогда они могут быть одобрены контролирующими органами. ТКАНЕВЫЕ БИОСЕНСОРЫ. В данной работе рассматриваются в основном тканевые биосенсоры, которые появились сравнительно недавно, однако привлекают все большее внимание исследователей простотой конструкции, низкой стоимостью, высокой каталитической активностью и сравнительно продолжительным временем жизни. При разработке такого типа биосенсоров используются данные о том, что растительные и животные ткани содержат специфические наборы ферментов, которые могут быть использованы как катализаторы соответствующих химических реакций. Например, листья, цветки и плоды растений (структуры, связанные с ростом, репродукцией и накоплением питательных веществ) не только богаты каталитическими веществами, но и различаются по качественному составу. Для иммобилизации используют гомогенаты или срезы тканей, фиксируя их на поверхности трансдуктора. В результате ферментативной реакции, протекающей в ткани, выделяются вещества, концентрация которых определяет величину выходного сигнала трансдуктора, в качестве которого чаще всего используется газочувствительный хемосенсор. Селективность тканевых сенсоров иногда снижается за счет присутствия в тканях не одного а нескольких ферментов. Однако влияние "лишних" ферментов в каждом конкретном случае можно исключить или значительно ослабить подбором рН, температуры среды либо с помощью соответствующих ингибиторов и стабилизирующих компонентов ферментативной активности. С другой стороны, наличие в ткани разных ферментов позволяет в некоторых случаях использовать один биосенсор для измерения концентрации нескольких субстратов. К настоящему времени разработаны тканевые биосенсоры на целый ряд диагностически значимых веществ: мочевину, катехоломины, аминокислоты и др. Для некоторых из них описано несколько разных биосенсоров, как, например, для перекиси водорода. С. Lu и соавт. предложили амперометрический биосенсор на основе ткани листа кольраби. Гамогенат ткани с добавлением ферроцена (медиатора переноса электронов) иммобилизовали в графитовой смоле на угольном электроде. Содержащаяся в кольраби пероксидаза катализирует восстановление перекиси водорода до воды ферроценом, а образующийся на электроде (-200 мВ) феррициний вновь восстанавливается в ферроцен. Область определения концентрации перекиси водорода 4* 10-5 - 6*10-4 М, время отклика 2-6 с, предел определения 8,4*10-6М. Биосенсор с использованием ткани винограда позволяет измерять концентрацию перекиси водорода в диапазоне 1*10-55*10-4 М при времени отклика 1 мин. Еще один биосенсор на перекись водорода содержит эритроциты человека. Чувствительность сенсора 1*104 М, диапазон линейности 1,5*10-4-5*10-3 М, время жизни 2 мес. Разработано несколько биосенсоров на перекись водорода различающ ихся по способам иммобилизации ткани корней хрена. Проведен сравнительный анализ этих сенсоров по основным параметрам. Лучшими характеристиками обладает сенсор с растительной тканью, иммобилизованной на фотомембране на основе nазидотетрафторбензальдегида: диапазон линейности от 9*10-5 до 6*10-3М при пределе обнаружения перекиси водорода 9*10"6 М, время отклика не менее 3 мин, время жизни более 2 мес. В качестве трансдуктора был использован кислородный зонд. Описанные биосенсоры могут быть применены не только для измерения концентрации перекиси водорода. На их основе возможна разработка целого комплекса комбинированных биосенсоров для определения субстратов, в результате реакций разложения которых (катализируемых их оксидазами) образуется перекись водорода - L-аминокислоты, глюкоза, лактат и др. С помощью сенсора на основе растительной ткани корней хрена можно определять концентрацию перекисей не только в водных растворах, но и в органических растворителях. Описан также биосенсор на основе срезов ткани печени свиньи, содержащей в значительных количествах фермент разложения перекиси каталазу. Перекись водорода образующаяся в ходе многих ферментативных реакций, является токсичным веществом и в норме инактивируется каталазой и пероксидазой. При генетически детерминированных патологиях, связанных с изменением активности этих ферментов, происходит накопление Н2О2, что приводит к развитию некоторых заболеваний (например, акаталазии). Известно также, что подобным эффектом определенных фармакологических веществ является их влияние на активность ферментов, катализирующих разложение ряда субстратов (L-аминокислот, глюкозы, лактата и др.) с образованием перекиси водорода. Таким образом, определение концентрации Н2Ог необходимо при постановке диагноза, а мониторинг этого параметра требуется для контроля действия фармакологических препаратов в процессе лечения. Несколько тканевых биосенсоров создано для определения концентрации катехола. Один из них включает ткань баклажана, содержащую окислительный фермент полифенолоксидазу (ПФО). Другой сенсор основан на присутствии ПФО в картофеле. Тонкий срез картофеля (100 мкм) фиксируется на кислородном электроде. Реакция идет с потреблением кислорода. Для этого биосенсора время отклика меньше 3 мин, линейный диапазон 2,5*10-5 - 2,3*10-4 М, время жизни 3 мес. В основе еще одного биосенсора на катехол, включающего ткань листа шпината, лежит другая химическая реакция, катализируемая ферментом катехолоксидазой (КО): Время жизни этого биосенсора 18 дней. Диапазон линейности 2*10-5 - 8*104 М. L. Macholan и В. Chelikova измеряли концентрацию аскорбиновой кислоты, используя срезы ткани кабачка или огурца, прикрепленные к кислородному электроду. Ткани этих овощей богаты ферментом аскорбатоксидазой (АО), которая катализирует следующую реакцию: Этот сенсор не реагировал на другие органические кислоты, фенолы, аминокислоты и глюкозу. Его линейный диапазон 0,02 - 2*10-3М, время отклика 70-90 с. Большей чувствительностью к аскорбиновой кислоте обладает биосенсор на основе сока огурца, иммобилизованный в пористой угольной пасте. Диапазон линейности этого сенсора 2,5*10-4 -1,6*10-3 М, а время отклика 3-6 мин. Срез ткани кабачка, прикрепленный к поверхности амперометрического биосенсора, позволяет определить концентрацию дофамина и норэпинефрина в присутствии аскорбиновой кислоты, мешающее влияние которой в данном случае обусловлено близкими значениями окислительно-восстановительных потенциалов этих веществ. АО кабачка элиминирует аскорбиновую кислоту с поверхности электрода. Для измерения концентрации дофамина описан биосенсор, содержащий ткань банана, богатую ПФО. Реакция идет с потреблением кислорода Линейный диапазон 1,3*10-6 - 9*10-5 М, время отклика 12 с, время жизни 10 дней. Сенсор позволяет проводить 60 анализов в час. Описан биосенсор для определения мочевины, в котором используется мука из бобов канавалии мечевидной. Мука содержит большое количество фермента уреазы, катализирующей следующую реакцию: В качестве трансдуктора в данном биосенсоре был использован аммиачный электрод. Этот датчик выделяется среди других большим временем жизни - 94 дня. Повышенный уровень мочевины может быть связан с острой почечной недостаточностью, диабетической комой, желудочно-кишечными кровотечениями, недостаточностью кровообращения. Пониженный уровень наблюдается при циррозах печени, острой желтой атрофии, отравлениях фосфором, мышьяком и другими ядами, поражающими паренхиму печени. Биосенсор, содержащий срез сахарной свеклы, прикрепленный к кислородному электроду, позволяет измерять тирозин, количественное определение которого важно при заболеваниях щитовидной железы. Время жизни сенсора 8 дней. Тирозин можно определять и с помощью биосенсора на основе тканей грибов, содержащих тирозиназу или ПФО. Известно несколько гибридных биосенсоров, в которых, кроме ткани, иммобилизован еще и фермент. Так, сенсор на фосфат и флюорит включает срез картофеля, содержащий кислую фосфатазу (КФ) и иммобилизованную глюкозооксидазу (ГО). Реакция имеет две стадии В качестве трансдуктора используется кислородный электрод. Диапазон линейности 2,5*10-5 —1*10-4 М. Биосенсор позволяет провести около 300 анализов. Время жизни 28 дней. Разработан также гибридный биосенсор на основе ткани картофеля с добавлением глюкуронидазы, позволяющий определить концентрации соответствующих субстратов в макромолекулярном диапазоне. При комнатной температуре время жизни датчика превышало 2 мес. В перспективе такого типа сенсоры могут быть использованы при диагностике мукополисахаридозов. Описан целый ряд биосенсоров на аминокислоты, содержащих в качестве биокаталитического материала компоненты цветков растений. Так, сенсор, включающий кашицу тычинок хризантемы, используют для измерения концентрации L-аргинина (до 1*10-3 М), L-орнитина (до 1*10-2 М), мочевины (2*10-3 — 3*10-4 М). Использование срезов пестика позволяет измерять, кроме этих веществ, еще и L-цитруллин и L-пролин. Очевидно, тычинки и пестик содержат ферменты, катализирующие соответствующие реакции (аргиназу, аргининсукцинатсинтетазу, аргининсукциназу) Кроме того на основе ткани цветков магнолии разработан биосент; сор на L-глутанин и L-аспарагин. Описан биосенсор на основе ткани огурца на аминокислоту цисте-ин. Реакция идет с выделением NH3. Время жизни сенсора 28 дней. В университете г. Канагава (Япония) разработан биосенсор для определения концентрации аминокислот на основе ткани семян сельдерея или петрушки. Муку семян наносили на поверхность аммоний-селективного электрода и покрывали сверху целлофаном. Таким биосенсором можно было определить концентрацию 20 аминокислот в диапазоне от 2 до 250 мг/л. Недостатком биосенсора является низкая селективность, обусловленная тем, что семена содержат несколько ферментов, разлагающих аминокислоты. Поэтому если в растворе содержится несколько аминокислот, то возможно определение лишь их суммарной концентрации. Аминокислоты имеют важное диагностическое значение при многих заболеваниях. Изменение их концентрации, в частности, может свидетельствовать об изменении содержания общего аминного азота в сыворотке и моче, что служит одним из показателей превалирования катаболических или анаболических процессов в организме, сопровождающих ряд патологических процессов. Количество аминокислот в крови увеличивается при заболеваниях печени (при тяжелых заболеваниях печени повышается содержание в крови цистеина, метионина, ти розина, глутаминовой кислоты), что связано с пониженным синтезом мочевины при экссдативном диатезе, спазмофилии, фенилкетонурии, различных инфекционных заболеваниях, опухолях, тяжелых оперативных вмешательствах и т. д. При пониженной выделительной способности почек содержание аминокислот в крови увеличивается совместно с остальными фракциями остаточного азота. Гипераминоацидурия встречается при заболеваниях паренхимы печени, что связано с нарушением в этом органе процессов дезаминирования и переаминирования, а также в связи с усиленным распадом клеток, при тяжелых инфекционных заболеваниях, злокачественных новообразованиях, тяжелых травмах, миопатии, коматозных состояниях, гипертиреозе и других патологических состояниях. При врожденном заболевании гиперпролинемии, возникающем вследствие недостатка фермента пролиноксидазы, наблюдается повышенная концентрация пролина. Увеличенное количество в моче цитруллина имеет место при цитруллинемии (врожденном нарушении цикла образования мочевины, обусловленное недостатком фермента агиниинсущинатсинтетазы. В пируватном сенсоре тонкий срез кукурузного зерна фиксировали на поверхности датчика к диоксиду углевода. Содержащаяся в зерне пируватдекарбоксилаза (ПДК) катализировала следующую реакцию: Диагностическое значение определения концентрации пирувата связано с тем, что наиболее резкое повышении его концентрации в крови отмечается при мышечной работе и недостаточностью витамина В1 при паренхиматозных заболеваниях печени, сахарном диабете, сердечной декомпенсации, токсикозах и некоторых других заболеваниях. В спинномозговой жидкости концентрация пирувата значительно повышается после травмы черепа, при воспалительных процессах (менингите, абсцессе мозга). Создано и описано несколько биосенсоров на основе животных тканей. Так в глутаминовом электроде и сенсоре на глюкозамин-6- фосфат используется тонкой срез (около 0,05 мм) свиной почки, а в электроде, чувствительном к 5-аденозитмонофосфату, - слой мышечной ткани кролика, срез печени кролика, входящий в состав биосенсора на гуанин содержит ферменты превращения гуанина в ксантин с выделением аммиака. Время отклика 2-3 мин, диапазон линейности 1,12*10-5 -1,0* 10-4 М. Биосенсор на гуанин разработан также на мозге крысы. Линейный участок рабочей характеристики этого биосенсора от 0,02 до 0,63 мМ, время жизни 28 суток. Индикаторным электродом во всех этих биосенсорах служит аммиачный газочувствительный электрод. В биосенсоре, чувствительном к аденозину, применяют смесь клеток, выделенных из внешней слизистой оболочки тонкой кишки мыши. Время жизни описанных сенсоров 21-30 дней. Некоторые ткани животных обладают высокой активностью фермента моноаминоксидазы (МАО). В биосенсоре на основе печени крысы для определения субстратов МАО катехоламинов и индоламинов срезы толщиной 25 - 200 мкм, изготовленные на криомикротоме, помещаются на нейлоновую сетку. В процессе измерения они инкубируются вместе с образцом 20 мин. Затем пробы инжектируются в прочную термостатируемую ячейку с аммоний-селективным электродом для oпpeделения концентрации образовавшегося аммония: Диапазон измерения концентрации аммония 1-10 мМ. Сенсор жет быть использован в 20 измерениях в течение 20 - 25 дней. Чешуя определенных видов рыб (например, Labrus assifagus) coдержит специальные клетки (хроматофоры) с гранулами пигментов, которые могут быть расположены дисперсно или создавать агломераты в клетках. Степень агрегации определяется норадреналином, выделяемым симпатическим нервом, заканчивающимся в коже рыбы. Изолированная чешуя сохраняет большую чувствительность к норадреналину и другим катехоламинам в течение нескольких недель. На этой основе созданбиосенсор для определения концентрации катехоламинов в плазме крови человека. Диагностика катехоламинов представляет собой интерес, так как они обладают широким диапазоном биологических свойств, позволяющих им активизировать процессы высвобождения энергии (стимуляция гликогенолиза, липолиза, окислительных процессов), возбуждать активность нервной системы, усиливать и учащать сокращения сердца, повышать периферическое сопротивление ряда сосудистых областей и т. д. Клиническое значение определение дофамина имеет при диагностике опухолей симпатических нервных образований и хромаффинной ткани, диабета, поражений почек, цирроза печени, гепатита, гиперкортицизма и других заболеваний. Повышение уровня катехоламинов в крови наблюдается при феохроматомах, сердечной недостаточности, острой пневмонии и бронхиальной астме и других патологических состояниях. S. Hoath и соавт. рассматривают возможность использования эпидермиса млекопитающих для создания сенсоров на определенные биогенные соединения. S. Updike и I. Treichel разработали биосенсор на антидиуретический гормон. На стеклянный натрий-селективный электрод натягивается мочевой пузырь жабы. В присутствии гормона в исследуемом растворе через стенки пузыря происходит перенос ионов натрия. Отклик натриевого электрода прямо пропорционален концентрации гормона. Определение антидиуретического гормона имеет диагностическое значение при заболеваниях, связанных с нарушениями водного обмена, в частности при несахарном диабете. При недостаточной его выработке происходит избыточная потеря жидкости организмом. Основные исследования в области биосенсоров имеют целью создание коммерческих образцов, которые характеризовались бы длительным временем жизни и стабильностью своих основных характеристик. Однако если говорить об использовании тканевых биосенсоров в научных исследованиях, то необходимо отметить, что существует большое число направлений в области электрофизиологии, фармакологии, нейробиологии, где используются биологические тес-системы, некоторые из которых можно рассматривать как тканевые биосенсоры или их предшественники. Так, например, еще вначале 30-х годов W. Feldberg использовал в качестве теста на ацетилходин спинную мышцу венгерской пиявки Hirudo officinalis. Было показано, что ацетилхолин является практически единственным веществом, обнаруживаемым в крови, которое вызывает сокращение этой мышцы. В 50-х годах был разработан препарат для исследования вкусовых рецепторов мясной мухи. На вкусовые волоски, расположенные на хоботке мухи, надевалась стеклянная трубка, которая служила и для подведения тестируемых веществ к рецепторам, и одновременно являлась отводящим электродом. На основании анализа импульсной активности рецепторных клеток было установлено, что существует два типа рецепторов: одни высокоспецифичны для Сахаров, а другие, менее специфичные, реагируют на соли и целый ряд веществ, не представляющих для мухи пищевой ценности. Время отклика такой системы на химический стимул составляло несколько миллисекунд. Не так давно появились разработки нового типа биосенсора на основе хеморецепторных структур, находящихся в антеннулах крабов ("рецептрод"). Выделенные усики помещали в термостатированную проточную камеру таким образом, что хемочувствительный кончик антенул находился в протоке, а нейроны и отходящие от них аксомы были в отдельном отсеке, заполненном искусственной морской водой. Импульсную активность нервных клеток регистрировали с помощью внеклеточного стеклянного микроэлектрода. Анализируемый раствор вводили в проток, и если в пробе содержались вещества, обладающие срод-, ством к рецепторам, то по изменению импульсной активности нейронов ; можно было определить концентрацию тестируемого вещества. С помощью "рецептрода", полученного из усиков голубого краба, удалось,; определить концентрации всех 20 аминокислот. Для глутамана предел обнаружения был равен 10" М. При исследовании биосенсора на основе интактных хеморецепторов из усиков гавайских крабов было найдено, что время отклика сенсора на триметиламин-К-оксид (маркера возможной пищи крабов) состав ляет миллисекунды, а диапазон измеряемых концентраций - от 10 до 10" М. На основе хеморецепторных структур речного рака разработаны также биосенсоры для детектирования пирозинамида, 3-ацетилпиридина и определения концентраций ряда местных анестетиков. Достоинствами такого типа сенсоров является короткое время отклика (миллисекунды), высокая специфичность и чувствительность, широкий динамический диапазон, а основным недостатком - небольшое время жизни 8-24 ч. Однако разработчики этих биосенсоров полагают, что время жизни таких систем может быть увеличено до 100 - 250 дней. ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ. Концепция распознавания определяемого вещества с помощью иммобилизованного биоматериала оказалась плодотворной. В итоге исследователи приобрели новое средство, позволяющее быстро получить достоверную информацию о состоянии окружающей среды и здоровья человека. Некоторые биосенсоры уже получают распространение для индивидуального использования в домашних аптечках (чаще всего для определения сахара в крови). Интерес к биосенсорам непрерывно растет. В 1996 году состоялись четыре крупные международные конференции по биосенсорам. Если иметь в виду все разнообразие ферментов, присутствующих и действующих в живом организме и являющихся потенциальными биологическими преобразователями, то следует отметить, что существующее сегодня число конструкций биосенсоров может быть увеличено в десятки и даже сотни раз. Биосенсоры получают распространение в биотехнологии. Хотя здесь и встречаются трудности, связанные с невысокой термической устойчивостью предложенных устройств, приводящей к дезактивации биослоя, есть основания полагать, что данный недостаток будет в скором времени преодолен. Так, полагают, что для увеличения срока службы биосенсоров в обозначенных выше условиях можно использовать ферменты, выделенные из термофильных бактерий и одноклеточных водорослей - микроорганизмов, устойчивых к действию высоких температур. Определенные трудности представляют собой также проблемы градуировки биосенсоров и надежности их показаний. Для улучшения последнего показателя, в частности, предлагается использовать мультисенсорную систему, состоящую из ряда биочипов. Для получения определенной "емкости" надежных данных производится расчет необходимого числа таких датчиков. Однако в целом так называемые метрологические характеристики биосенсоров вполне приемлемы. Относительное стандартное отклонение определяемой концентрации не хуже 10-12 %, притом что нижняя граница определяемых содержаний достигает 10-10-10-15 моль/л. Некоторые биосенсоры работают по принципу да-нет, что вполне приемлемо, когда решается вопрос о присутствии ультрамалых количеств высокотоксичных веществ в объектах окружающей среды. Если определяемые компоненты находятся в сложной смеси или матрице или же близки по своим свойствам, то при анализе используют хроматографические методы разделения. Контроль за разделением осуществляют с помощью системы детекторов на основе биосенсоров. И здесь получены поразительные результаты: разделяют и количественно определяют оптические активные изомеры, различные сахара (лактозу, фруктозу, глюкозу и т.д.), сложные по структуре биологически активные соединения и т.п. Вот один из недавних примеров разработки биосенсоров, основанных на использовании природного хеморецептора. Хеморецептор, извлеченный из чувствительных антенн (органелл) голубого морского краба, был прикреплен к ультрамикроэлектроду, измеряющему потенциал. В результате был изготовлен новый тип потенциометрического детектора, чрезвычайно быстро реагирующего на ничтожные изменения состава среды, в которую он погружен. Сам голубой краб очень чувствителен к следам тяжелых металлов и живет только в чистейшей морской воде. На очереди создание биосенсоров, заменяющих рецепторы живых организмов, что позволит создать "искусственные органы" обоняния и вкуса, а также применить указанные разработки для возможно более точной и информативной диагностики ряда заболеваний. Несомненно, что в ближайшем будущем в этой смежной области биологии и химии следует ожидать новых открытий. СПИСОК ИСТОЧНИКОВ. 1. Биосенсоры: основы и приложения / Под ред. Э. Тернера и др. М.: Мир, 1992. 614 с. 2. Будников Г.К., Майстренко В.Н., Муринов Ю.И. Вольтамперометрия с модифицированными и ультрамикроэ лектродами. М.: Наука, 1994. 239 с. 3. Будников Г.К., Медянцева Э.П., Бабкина С.С. // Успехи химии. 1991. Т. 60. С. 881. 4. Э. Тёрнер, И. Карубе, Дж. Уилсон // Биосенсоры: основы и приложения. М., Мир, 1992.
