Клатратная криоконсервация
реклама
КЛАТРАТНАЯ КРИОКОНСЕРВАЦИЯ БИООБЪЕКТОВ (КЛАТОБИОЗ) Тельпухов Владимир Иванович Щербаков Павел Васильевич Хохлов Алексей Валерьевич Люндуп Алексей Валерьевич В задачи криобиологии входит разработка способов длительного консервирования биологических объектов в жизнеспособном состоянии путём их глубокого замораживания. КОНЕЧНАЯ ЦЕЛЬ — АНАБИОЗ ЧЕЛОВЕКА Четверть века назад нами была обнаружена закономерность, указывающая на существовании в природе такого, ещё неизвестного науке проявления жизнеспособности как КЛАТОБИОЗ Его достоверность подкреплена рядом успешных и независимых исследований Уже сегодня в рамках самой криобиологии происходит формирование совершено нового направления под общим названием «Клатратная криоконсервация» Что можно отметить и по заинтересованности в проведении семинара «Криоконсервация органов и тканей», организованного Фондом перспективных исследований 20.02.14 года Ещё в 1912 году русский учёныйботаник Максимов Н.А. (1880— 1952) при переохлаждении биологической ткани растительной природы открыл защитное действие глицерина. Это судьбоносное событие и положило начало науке, которая сформировалась в известную всем нам сегодняшнюю криобиологию лишь к средине ХХ века К настоящему времени уже выработалось понимание того, что коль речь заходит вообще о «криоконсервации», то сразу же подразумевается — биологические объекты (клетки, ткани, органы, простейшие организмы) пребывают именно в анабиозе АНАБИОЗ ШИРОКО-РАСПРОСТРАНЁННОЕ ПРИРОДНОЕ ЯВЛЕНИЕ Микроскопические черви коловратки легко переходят к анабиозу Плоские черви нематоды впадают в анабиотическое состояние посезонно Тихоходки способны пребывать в состоянии анабиоза веками Способностью впадать в анабиоз обладают спорообразующие бактерии Анабиоз — это существование организмов и их частей в состоянии временного обратимого прекращения жизнедеятельности в результате выведения свободной (биологически активной) воды из биохимических взаимодействий в клетке. Так человеческий организм на 78% состоит из воды. Самая большая насыщенность водой в тканях головного мозга, печени, паренхиматозных органах. Даже кости на 20% состоят из воды, а зубы на 10% Необходимым условием жизнедеятельности любого организма является транспорт воды. Вода задействована в перемещении различных питательных веществ и продуктов обмена. Она проходит сквозь клеточную мембрану совершенно свободно путем осмоса. Вода составляет основу организма. Клетки буквально «плавают» в водном растворе межклеточной жидкости. В самой же клетке вода находится в двух формах: свободной и связанной. Вода составляет до 80% её массы. Из всей этой клеточной воды свободная вода составляет 95 % Свободная вода участвует в биохимических реакциях. В ней растворены органические и минеральные вещества. При высушивании и замораживании свободная вода легко удаляется. При удалении свободной воды гибели клетки не происходит. Связанной называют воду, молекулы которой физически или химически соединены с другими веществами. Она не растворяет кристаллы, не активизирует многие биохимические процессы. Связанная вода входит в состав коллоидов клетки и с трудом высвобождается из них. С потерей связанной воды нарушаются клеточные структуры, и наступает гибель клетки. По сути все биохимические процессы в живой клетке сводятся к химическим реакциям в водном растворе Снижение содержания свободной (биологически активной) воды и есть физико-химическая основа перехода к любому из трёх известных на сегодня видов анабиоза. А это есть «анабиоз в результате высыхания», «анабиоз в результате глубокого охлаждения», «анабиоз в результате нахождения в среде с высокой концентрацией солей и высоким осмотическим давлением» Таким образом, переход к какому-либо виду анабиоза всегда происходит или при отнятии воды из клеток (высушивание и осмос), или при её иммобилизации (замораживание) При анабиозе в результате глубокого охлаждения (подругому — это «криоанабиоз»), иммобилизация свободной воды происходит только путём образования обычного льда (в виде кристаллов или в аморфном стеклообразном состоянии). Кристаллизация — процесс перехода вещества из жидкого состояния в кристаллическое Кристаллическая структура обычного льда (гексагонального): молекулы воды соединены в правильные шестиугольники Образование кристаллов льда внутри клеток — самый важный повреждающий фактор при криоконсервации ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ КРИСТАЛЛООБРАЗОВАНИЕ 1. ФОРМИРОВАНИЕ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ : ЦЕНТРОВ — Оптимальная температура -40оС 2. РОСТ КРИСТАЛЛОВ : — Максимальная скорость роста при -2…-10оС — Очень малая скорость роста при -30оС — Вообще нет роста при -130оС Присутствует некое естественное природное рассогласование: для интенсивного роста кристаллов льда необходимы температуры в −2…−10 °C, но наиболее благоприятная для этого процесса температура формирования самих центров кристаллизации ещё не достигнута (−40 °С) Вещества, способные снизить повреждающее действие физикохимических факторов при криоконсервации — это криопротекторы КРИОПРОТЕКТОРЫ (~100) ПРОНИКАЮЩИЕ — ЭНДОЦЕЛЛЮЛЯРНЫЕ (диметилсульфоксид, глицерин, глюкоза, …): НЕПРОНИКАЮЩИЕ — ЭКЗОЦЕЛЛЮЛЯРНЫЕ (полиэтиленоксид, поливинилпирролидон, …) : — Снижают температуру замерзания — Образуют водородные связи с молекулами воды, чем и препятствуют формированию кристаллов льда — Связывают часть свободной воды, что уменьшает общую дегидратацию клеток — Разбавляют образующийся при кристаллизации «рассол», не давая белкам денатурироваться — Стабилизируют структуру макромолекул клетки за счёт образования с ними водородных связей — Препятствуют росту кристаллов внеклеточного льда — Препятствуют осмотическим перепадам — Способствуют снижению концентрации ПРОНИКАЮЩИХ, а значит и токсичности последних — Защищают плазматические мембраны ФОРМИРОВАНИЕ КРИСТАЛЛОВ ЛЬДА БЕЗ КРИОПРОТЕКТОРОВ Криопротекторы подавляют рост кристаллов льда в растворе НЕДОСТАТКИ КРИОПРОТЕКТОРОВ — Токсичны: в концентрациях для достижения сколь-либо явного эффекта ядовиты — Недостаточно эффективны — Проблематична их эвакуация Подбор криопротекторов проводят эмпирически по принципу наименьшей токсичности и оптимального эффекта (метод — «пальцем в небо») КРИОКОНСЕРВАЦИЯ МЕЛКИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ, НАХОДЯЩИХСЯ В КРИОАНАБИОЗЕ — УЖЕ СЕГОДНЯШНЯЯ РЕАЛЬНОСТЬ Наибольшая по размеру клетка в человеческом организме — это яйцеклетка. По своему диаметру она, приблизительно, 130 мкм Самая же маленькая клетка — это сперматозоид. Приблизительная толщина сперматозоида — 55 мкм, по ширине она — 5 мкм, в длину же достигает 3,5 мкм Эмбрион мыши в стадии бластоцита (0,1 мм) Эмбрион морской звезды на четвертом клеточном этапе при увеличении в 60 раз Эмбрион человека (0,1 мм) КОНСЕРВАЦИЯ ЗАМОРАЖИВАНИЕМ ОТРАБОТАНА ДЛЯ ЭРИТРОЦИТОВ, КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА, СПЕРМАТОЗОИДОВ, РАННИХ (ПРЕИМПЛАНТАЦИОННЫХ) ЭМБРИОНОВ, ФРАГМЕНТОВ ЩИТОВИДНОЙ И ПОДЖЕЛУДОЧНЫХ ЖЕЛЁЗ КРИОКОНСЕРВАЦИЯ КРУПНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ, ПРЕБЫВАЮЩИХ В СОСТОЯНИИ АНАБИОЗА — ПОКА ЕЩЁ ФАНТАСТИКА За долгие десятилетия своего существования, криобиология не оправдала самого главного от неё ожидания – эффективной криоконсервации органов Криоконсервация хорошо отработана лишь на объектах, имеющих радиус не более 1-го миллиметра. Ведь отношение поверхности и объема у органов очень далеко от необходимого для этого оптимума. Чем больше орган, тем меньше соотношение поверхности и объема. В КРИОБИОЛОГИИ ВСЁ, ЧТО БОЛЕЕ 1-ГО МИЛЛИМЕТРА ОТНОСИТСЯ К «КРУПНЫМ» БИОЛОГИЧЕСКИМ ОБЪЕКТАМ Таким образом, вне зависимости от используемых методов и скоростей замораживания невозможно криоконсервировать, а затем вернуть к жизни целый организм человека А ЕСТЬ ЕЩЁ СВОЯ — «ПЕРСОНАЛЬНАЯ» ПРОБЛЕМА ПРИ ЗАМОРАЖИВАНИИ ВЫСШЕГО МЛЕКОПИТАЮЩЕГО Защитой нервных клеток от вредных веществ (в том числе и криопротекторов) служит гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Поэтому при замораживании всего организма, эти клетки, как наиболее слабое звено, разрушатся в первую очередь. Криопротекторы просто не в состоянии сюда проникнуть ! ИТАК. ЗАМОРОЗИТЬ ОБЪЁМНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОБЪЕКТЫ ПУТЁМ ПРОСТОГО ТЕПЛОСЪЁМА БЕЗ ПОВРЕЖДЕНИЙ В НИХ В ПРИНЦИПЕ НЕВОЗМОЖНО — НЕ ПОЗВОЛЯЮТ ЗАКОНЫ ТЕПЛОФИЗИКИ: НИЗКОЕ ОТНОШЕНИЕ ПОВЕРХНОСТИ ОБЪЕКТА К ЕГО ОБЪЁМУ НАСТУПАЮЩАЯ КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ («ФРОНТ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ») РАСПРОСТРАНЯЕТСЯ ОТ ПЕРЕФЕРИИ К ЦЕНТРУ НЕРАВНОМЕРНО, ЧТО ВЕДЁТ К РАСТРЕСКИВАНИЮ РАНЕЕ ЗАМЁРЖШИХ ПРЕДЫДУЩИХ СЛОЁВ ВЕДЬ ИЗВЕСТНО, ЧТО ПРЕВРАЩАЯСЬ В ОБЫЧНЫЙ ГЕКСАГОНАЛЬНЫЙ ЛЁД, ВОДА ЗНАЧИТЕЛЬНО УВЕЛИЧИВАЕТСЯ В ОБЪЁМЕ А ПРИ ЗАМЕРЗАНИИ ДАЖЕ В СТАЛЬНЫХ ВОДОПРОВОДНЫХ ТРУБАХ ЛЁД ЛЕГКО РАЗРЫВАЕТ ИХ К ТОМУ ЖЕ ХОЛОД НЕ РАСПРОСТРАНЯЕТСЯ В ТКАНЯХ МГНОВЕННО Простой пример значительной инерционности процесса замораживания до криогенных температур. Охлаждать дверной замок жидким азотом до −196 °C, что бы потом расколоть его одним ударом молотка, потребуется не менее 5 минут. Даже для замораживания самого обычного цветка необходимо достаточно продолжительное время его пребывания в жидком азоте Отчасти это связано и с весьма низкой теплоёмкостью азота Низкое отношение поверхности замораживаемого органа к его объёму создаёт существенные затруднения для теплопереноса в процессе охлаждения и приводит к появлению высоких температурных градиентов и ими обусловленных градиентов давления по всему объёму органа Да и сами жидкие криопротекторы неравномерно распределяются в объёме крупного биообъекта (например, в органе млекопитающего) и потому плохо защищают от повреждений значительную часть его клеток НЕСОСТОЯТЕЛЬНОСТЬ ОБЫЧНЫХ КРИОПРОТЕКТОРОВ ДЛЯ ОРГАННОГО СЛУЧАЯ ВПОЛНЕ ОЧЕВИДНА «КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ОРГАНОВ ЯВЛЯЕТСЯ ПРОБЛЕМОЙ, НЕ РАЗРЕШЁННОЙ НИ В ТЕОРЕТИЧЕСКОМ, НИ В ПРАКТИЧЕСКОМ ОТНОШЕНИИ» [ШУМАКОВ], А «ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПРИЧИНАХ И МЕХАНИЗМАХ КРИОПОВРЕЖДЕНИЯ И КРИОЗАЩИТЫ ПРЕДСТАВЛЯЮТ СОБОЙ СОВОКУПНОСТЬ РАЗРОЗНЕННЫХ КОНЦЕПЦИЙ С ОГРАНИЧЕННОЙ ОБЛАСТЬЮ ПРИМЕНЕНИЯ» [БЕЛОУС] ПУТЬ РАЗРЕШЕНИЯ ДАННОЙ ПРОБЛЕМЫ — ОБРАЗОВАНИЕ КЛАТРАТНЫХ ГИДРАТОВ КЛАТРАТЫ — ТИП ГИДРАТОВ, СОСТОЯЩИХ ИЗ МОЛЕКУЛ ГАЗОВ, ЗАКЛЮЧЁННЫХ В ЯЧЕЙКИРЕШЁТКИ ИЗ МОЛЕКУЛ ВОДЫ В ПРИРОДЕ НАИБОЛЕЕ ШИРОКО РАСПРОСТРАНЁН ГИДРАТ МЕТАНА. ОДИН КУБИЧЕСКИЙ МЕТР ГИДРАТА СОДЕРЖИТ 164 КУБИЧЕСКИХ МЕТРА ПРИРОДНОГО ГАЗА ГАЗОВЫЕ ГИДРАТЫ НЕ ОТНОСЯТСЯ НИ К ОДНОМУ ИЗ 11 ТИПОВ ЛЬДА, ХОТЯ ВНЕШНЕ ПОХОЖИ ГИДРАТНЫЕ ПРОБКИ МОГУТ ПОЛНОСТЬЮ ПЕРЕКРЫТЬ ПРОТОК В МАГИСТРАЛЬНЫХ ТРУБОПРОВОДАХ, НО СОВЕРШЕННО БЕЗ ПОСЛЕДСТВИЙ ДЛЯ САМИХ ТРУБ Гидрат метана стабилен при температуре 0 °C и давлении порядка 25 бар и выше. Такое давление имеет место на глубине океана около 250 м. При атмосферном давлении гидрат метана сохраняет устойчивость при температуре −80 °C. ОБРАЗОВАНИЕ ГАЗОВОГО ГИДРАТА В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ ФАЗА 1 ФАЗА 2 НЕБОЛЬШОЙ ЭКСКУРС В ИСТОРИЮ Британский естествоиспытатель Джозеф Пристли (1733 — 1804) ещё в 1778 году получил «совершенно необычный лёд», как результат взаимодействия сернистого газа с водой. Советский учёный-химик Никитин Борис Александрович (1906— 1952) в 1936 году приступил к изучению гидратов инертных газов. Основатель токсикологии в СССР Лазарев Николай Васильевич (1895—1974) впервые предсказал наркотические свойства криптона и ксенона, показал, что при небольших давлениях в среде инертных газов задерживаются скисание молока и гниение мяса. Лауреат Нобелевской премии по химии Полинг Лайнус Карл (1901 – 1994) взял за основу многообещающие русские исследования и разработал в 1961 году свою Новую молекулярную теорию наркоза. Он предположил, что образующиеся при нормальной температуре в водной среде организма так называемые «микрокристаллогидраты» инертных газов тормозят биоэлектрическую активность и клеточный метаболизм. Американский химик Миллер Стэнли Ллойд (1930 — 2007), сотрудник известного Калифорнийского университета, обнаружил в Антарктиде огромные залежи необычного льда. Он сам же назвал этот минерал – «клатратный лёд». В 1970-е годы выдающийся микробиолог Абызов Сабит Салахутдинович с соавторами провели микробиологические исследования кернов льда, взятых с различных глубингоризонтов Антарктиды, пользуясь специальным стерильным бурением девственного ледяного панциря. Результатом данной работы явилось научное открытие «Явление сверхдлительного анабиоза у микроорганизмов». Ещё во времена работы в академической группе академика Кованова В.В. мы обратили внимание на парадоксальную жизнеспособность микроорганизмов, пролежавших во льдах Антарктиды до одного миллиона лет, что и сопоставили с фактами существования здесь же огромных залежей «клатратного льда». Так родилось предположение, что условия низких температур и повышенных давлений, при которых появляются устойчивые клатратные соединения (в том числе и в самих микроорганизмах), вообще характерны для сохранения биологических объектов в жизнеспособном состоянии. И не только во льдах Антарктики, но и во всех других ледовых зонах Земли. Именно эти качества присущи клатратному анабиозу , обнаруженному нами ранее Бактериям, попавшим в древний лёд Земли миллионы лет назад, по всей видимости, помогли остаться в живых газы атмосферы, образовавшие в клетках клатраты ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ КЛАТРАТНОГО АНАБИОЗА Суть неизвестной ранее науке закономерности, экспериментально обнаруженной и теоретически обоснованной нашим коллективом в том, что : «биологические объекты, насыщенные способными к гидратобразованию постоянными и непостоянными составными частями атмосферного воздуха, в условиях низких температур и повышенного давления остаются в жизнеспособном состоянии» То есть, переходят к некоему анабиозу ! Это неизвестное ранее проявление жизнеспособности и получило в авторской интерпретации собственное имя — «Клатратный анабиоз» Клатратный анабиоз (от clathratus — загороженный и от anabiosis — оживление) или сокр. клатобиоз — существование организмов и их частей в состоянии временного обратимого прекращения жизнедеятельности в результате выведения свободной (биологически активной) воды из биохимических взаимодействий в клетке — путём образования клатратов ИТАК. ПО СУТИ, БЫЛ ОБНАРУЖЕН СОВЕРШЕННО НОВЫЙ ВИД АНАБИОЗА Вот как это было… В своё время Академик Шумаков Валерий Иванович (1931 — 2008) изучал в эксперименте консервацию тканей и органов в условиях пониженных температур (около-нулевые положительные температуры) и гипербарии инертными газами, основанную на эффекте Полинга. Даже после 8-ми дней консервации почки данным методом не обнаруживаются явно-выраженные гистохимические и гистоморфологические изменения ПРЕДДВЕРИЕ КЛАТРАТНОГО АНАБИОЗА — Эксперименты с глубокой о гипотермией (до 0 С) Самая первая лабораторная крио-барокамера для мелких животных (крысы). ОБРАТИМАЯ ГЛУБОКАЯ ГИПОТЕРМИЯ ЦЕЛОСТНОГО ОРГАНИЗМА КРЫС [Обратимая глубокая гипотермия целостного организма крыс / П.В. Щербаков, В.И. Тельпухов, А.В. Хохлов А.В.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1989. – Т. 107. – № 5. – С. 543-545.] ВЫБОР СКОРОСТИ СОГРЕВАНИЯ ОРГАНИЗМА ПОСЛЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГЛУБОКОЙ ГИПОТЕРМИИ [Выбор скорости согревания организма после экспериментальной глубокой гипотермии / Щербаков П.В., Тельпухов В.И., Хохлов А.В. // Экспериментальное и клиническое обоснование методов криомедицины: Сб. науч. тр. / Редкол.: Сандомирский Б.П. (отв. ред.) и др. / – Харьков; Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР, 1988. – С. 160-164.] Выбор скорости согревания организма Клатратный анабиоз: эксперименты на целостном организме Клатратный анабиоз: эксперименты на изолированных органах На основе обнаруженной закономерности создано оригинальное изобретение, защищённое патентом: «Способ криоконсервации органов и тканей in situ» КЛАТРАТНАЯ КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ КЛАТРАТНОГО АНАБИОЗА (в первом приближении) Надёжность и продолжительность оригинальной криоконсервации теоретически объясняется появлением по всему объёму биологического объекта микрокристаллогидратов атмосферных газов. Имеет место быть гибридная кристаллизация Так продукт замораживания может быть значительно более легко заморожен в присутствии некоего инициатора образования центров кристаллизации льда («зародышевых кристалликов»). То есть, даже при более высокой температуре, чем при спонтанном замораживании Зародышевые кристаллики инициируют кристаллизацию Микроструктуры газогидратов — это и есть зародышевые кристаллики, инициирующие масштабную кристаллизацию свободной воды, причём сразу по всему объёму клетки А известно, как только во внутриклеточной жидкости образуются многочисленные центры кристаллизации, она мгновенно переходит в твердое состояние Для получения при 0оС зародышевых кристалликов в виде гидрата ксенона достаточно приложить 1,5 атм, гидрата криптона — 14,5 атм, гидрата аргона — 105 атм. Но для кристаллогидратов ксенона при -3,4оС, криптона при -27,8оС, аргона при -42,8оС давление диссоциации соответствует нормальному атмосферному давлению ВЗГЛЯД НА ПЕРСПЕКТИВУ Всё «искусственно-задействованное», что по шкале линейных размеров ниже величины 100 нм — относится к нанотехнологиям. Понятно, что и в нашем случае, синтетические процессы, развивающиеся в клетке, не просто напрямую зависят от воздействия внешних физических факторов (от температуры и давления), а ими можно ещё и манипулировать со стороны, варьируя этими двумя параметрами (управлять). При этом непосредственные объекты управления своими ничтожными размерами вполне вписываются в приведённое строгое ограничение. То есть — самые настоящие нанотехнологии ! Например, по клатратному принципу можно провести полезную и перспективную трансформацию, старой КРИОНИКИ — уже в НАНОКРИОНИКУ Или же попытаться осуществить криоконсервацию живого организма Барокамера БКИ-192 — вполне готовый узел для изготовления уже большой клатратной установки: аналог будущей лабораторной крио-барокамеры для крупных млекопитающих. КЛАТРАТНЫЙ АНАБИОЗ КАК СПОСОБ ПУТЕШЕСТВИЯ ВО ВРЕМЕНИ И ПРОСТРАНСТВЕ Возможный вариант клатратной установки для человека Вариант системы спасения на антарктической станции или на подводной лодке Клатратный анабиоз открывает и космические горизонты Возможный вариант компоновки на космическом корабле МАРС ЖДЁТ
