Лекция 4: •Репарация мтДНК 1 Репарация мт ДНК •За день в каждой клетке человека происходит 103-106 повреждений ДНК. •В человеческом организме около ~1013 клеток. •За сутки каждый из нас получает ~1017 повреждений ДНК. 2 МтДНК мутирует быстрее ядерной Почему? •в митохондриях повышенное содержание ROS • в митохондриях репарации более слабый аппарат •в митохондриях репликации менее точный аппарат 3 С возрастом частота мутаций в мтДНК увеличивается примерно в 5 раз к 80-ти годам. PMID: 24086148 4 Наиболее распространенные продукты окислительного стресса: 8охоG и 8охоА В нормальной человеческой клетке: 0.3-4.2 8oxoG/106 G, что соответствует 7.7х104 – 1х105 8oxoG в одной клетке 5 Вместо канонической пары G-C 8oxoG образует пару с А. Это приводит к трансверсиям G ->T и С ->А 6 Частота разных типов мутаций в мтДНК PMID: 24086148 Частота трансверсии G->T практически не увеличивается с возрастом также как и все остальные трансверсий, в отличии от транзиций. •Транзиция — одно пуриновое основание замещается на другое пуриновое (аденин на гуанин или наоборот), либо происходит аналогичная перестановка пиримидиновых оснований (тимин с цитозином). •Трансверсия — пуриновое основание замещается на пиримидиновое основание или наоборот. 7 Количество мутаций в мтДНК увеличивается с возрастом не за счет образования 8охоG под действием окислительного стресса. 1. G→A/C→T: Ошибка DNA polymerase γ Дезаминирование цитозина с образованием урацила 2. T→C/A→G: Ошибка DNA polymerase γ Дезаминирование аденозина инозина с образованием 8 Как распределены мутации по мт геному? В области D-loop мутаций больше, чем в остальном геноме. Но относительное количество каждого типа мутаций одинаково по всему мт геному и не меняется с возрастом. Видимо, уже при рождении мутаций в D-loop больше. 9 Как распределяются мутации по цепям мт ДНК? Замены G ->A и Т ->С чаще происходят в L-цепи, чем в Н-цепи по всему мт-геному, но не D-loop. 10 Это можно объяснить асинхронной репликацией мтДНК: материнская Н-цепь остается в оц состоянии, когда с oriH идет синтез Н-цепи на матрице L-цепи. В одноцепочечном состоянии в Н-цепи происходит спонтанное дезаминирование цитозина с образованием тимина и аденина с образованием гуанина. 11 За счет чего растет частота мутаций в митохондриях? •Возникает спонатнное дезаминирование С и А особенно в одноцепочеченых участках ДНК в ходе репликации •ДНК полимераза γ ошибается в репликации Возможно, 8охоG удаляется до репликации или 12 его репарация усиливается с возрастом Виды репарации Изменение в одной цепи ДНК: 1. BER – base excision repair: замена измененного в результате окисления, алкилирования, гидролиза или дезаминирования азотистого основания 2. MMR – mismatch repair: удаление неспаренных нуклеотидов 3. NER – nucleotide excision repair: исправление нарушений правильной двуцепочечной структуры ДНК (например, пиримидиновых димеров) 13 Изменения в обеих цепях ДНК (Double-strand break repair): 1. NHEJ – nonhomologous end joining: DNA ligase IV использует ближайшие выступающие концы ДНК для присоединения к месту разрыва и его сшивания. Этот процесс приводит к серьезным нарушениям в геноме 2. HR – homologous recombination: для восстановления структуры ДНК в качестве матрицы используются гомологичные хромосомы 14 PMID:20950654 15 Репарация митохондриальной ДНК. •BER – base excision repair •MMR – mismatch repair •NER – nucleotide excision repair • NHEJ – nonhomologous end joining •HR – homologous recombination PMID: 22138376 16 Основные пути репарации в ядре PMID:23050036 17 Основные пути репарации в митохондриях 18 Base excision repair (BER) в митохондриях: • SN (single nucleotide) or SP (short patch) BER – заменяется 1 нуклеотид • LP (long patch) BER – заменяется 2-6 нуклеотидов 19 Base excision repair (BER) в митохондриях: PMID:20950654 1. Специфичная ДНКгликозилаза перемещает поврежденное основание ДНК 2. АP-эндонуклеаза (от apurinic or apyrimidinic site) расщепляет цепь ДНК, оставляя единичный разрыв, содержащий 5’-dRPгруппу. 3. Вместо удаленного нуклеотида ДНКполимераза вставляет новый (ые). 4. Лигаза зашивает цепь ДНК. 20 •SN BER: 5’-dRP- группа удаляется, а gap заполняет DNA pol γ, затем сшивает DNA ligase III Скорость dRP-лиазной реакции у DNA pol γ ниже, чем у DNA pol β, осуществляющей BER в ядре. PMID:22992591 •LP BER проходит в экстрактах митохондрий в присутствии белков: •Хеликаза DNA2 процессирует расширяющуюся flapструктуру •Flap endonuclease FEN1 удаляет flap-структуру, замененную DNA pol γ 21 •Ligase III сшивает разрыв Основные виды повреждений азотистых оснований: •Окисление •Алкилирование •Дезаминирование 22 Base excision repair (BER) в митохондриях: Поврежденные азотистые основания удаляются специфичными гликозилазами 23 Основные продукты окисления азотистых оснований 24 Наиболее распространенные продукты окислительного стресса: 8охоG и 8охоА 25 Репарацию 8oxoG осуществляет гликозилаза OGG1 (MutM у бактерий). Альтернативный сплайсинг мРНК hOGG1 дает несколько изоформ фермента, в том числе и митохондриальную. В ядре есть другие ферменты для репарации 8oxoG, а в митохондрии их, видимо, меньше: •В экстрактах митохондрий из ogg1-/- мышей in vitro не вырезается 8oxoG • У ogg1-/- мышей в ядре содержание 8oxoG увеличивается не сильно, в митохондриях гораздо сильнее •В клетках мышей csb-/csb- ogg1-/ogg1- уровень 8oxoG не меняется Предполагается, что NEIL1 может компенсировать потерю OGG1 MYH (MutY у бактерий) перемещает аденин или гуанин, ошибочно вставленные при репликации во вторую цепь ДНК напротив 8oxoG. Альтернативный изоформы MYH. сплайсинг дает ядерную и митохондриальную 26 Репарацию окисленных азотистых оснований могут осуществлять гликозилазы NEIL1 и NEIL 2 В ядерной репарации они вырезают повреждения в структурах «Bubble»: PMID:22992591 •NEIL1 экспрессируется в Sфазе => участвует в репликации •NEIL2 экспрессируется независимо от фазы клеточного цикла => участвует в транскрипции Этим ферментам требуется polynucleotide kinase 3′phosphatase (PNKP) 27 У нокаутных по NEIL1 мышей в печени накапливаются мтДНК с делециями, что вызывает симптомы типичные для митохондриальных болезней. 28 NEIL2 и polynucleotide kinase 3′-phosphatase (PNKP) колокализованы с MT-COХ2 PMID:22130663 29 •NEIL2 и polynucleotide kinase 3′-phosphatase (PNKP) обнаружены в экстрактах митохондрий •NEIL2 и polynucleotide kinase 3′-phosphatase (PNKP) колокализованы с DNA polymerase γ. •В отсутствии NEIL2 или PNKP в клетках линии HEK293 повышается содержание окисленных азотистых оснований 30 Образование тимингликоля из тимина под действием окислительного стресса блокирует работу РНК- и ДНКполимеразы 31 Тимингликоль удаляется тимингликольгликозилазой. У дрожжей её кодируют два гена: NTG1 и NTG2. У NTG1 двойная локализация – в ядре и в митохондриях, а NTG2 образует ядерную изоформу. PMID:10207101 32 Совместно с NTG1 в дрожжевых митохондриях при BERрепарации работает хеликаза PIF1. Совместное потеря генов NTG1, PIF1 и SOD (супероксиддисмутаза) приводит к потере мтДНК. Это доказывает, что повреждения от окислительного стресса вносят вклад в геномную нестабильность митохондриального генома дрожжей. PMID:15923634 33 Для тимингликоль-гликозилазы Млекопитающих hNTHL1 данные противоречивы: •по одним данным она локализована в ядре и митохондриях, по другим – только в ядре. •Непонятно, происходит ли удаление тимингликоля в митохондриях из клеток мышей nth-/(противоречивые данные у разных групп). 34 Продукты дезаминирования 35 Удаление урацила, образованного при дезаминировании цитозина, осуществляет урацил-ДНК-гликозилаза Сущестуют ядерная и митохондриальная формы урацил-ДНКгликозилазы. Они образуются с двух разных промоторов одного гена и в результате альтернативного сплайсинга. У дрожжей одна изоформа этого фермента, в нем есть сигналы как ядерной, так и митохондриальной локализации. GFP-control UNG2 UNG1 PMID:9016624 36 Наиболее распространенные продукты алкилирования: О-4-alkylT О-6-alkylG 37 Алкилированные основания удаляет N-methylpurine-DNA-glycosylase (MPG или AAG – от alkyladenine-DNA-glycosylase или 3methyladenine-DNA-glycosylase). Этот фермент не обнаружен в митохондриях, но в митохондриях репарируются повреждения, обычно служащие субстратами этого фермента. 38 Митохондриальные гликозилазы PMID:22992591 39 Base excision repair (BER) в митохондриях: АР эндонуклеазы Основная АР эндонуклеаза Млекопитающих АРЕХ1 локализована как в ядре, так и в митохондриях. Митохондриальная форма короче ядерной. Есть и другая АР эндонуклеаза АРЕ2, частично транспортируемая в митохондрии, но её каталитическая активность низка, функции требуют дальнейшего изучения. У дрожжей основная эндонуклеаза Apn1 на N-конце имеет митохондриальную адресную последовательность и сигнал ядерной локализации на C-конце. Apn1 транспортируется в митохондрии, взаимодействуя с Pir1 – белком клеточной стенки дрожжей. Pir1 конкурирует с ядерными белками за связывание с сигналом ядерной организации, что позволяет части Apn1 импортироваться в митохондрии. 40 Base excision repair (BER) в митохондриях: застраивание бреши и лигирование АР эндонуклеаза освобождает OH-группу на 3’-конце бреши, но механизм дальнейшей репарации зависит того, какая группа расположена на 5’-конце. В митохондриях застраивание бреши осуществляет ДНКполимераза γ, у неё есть и полимеразная и лиазная активность, но последняя слабее, чем у DNA pol β, осуществляющей BER в ядре. 41 В случае, если АР эндонуклеаза и ДНКполимераза может оставить на 5’-конце фосфат, репарация идет по механизму short patch BER – вставляется только один нуклеотид. PMID:22992591 В случае, если продукт вырезания устойчив к лиазной активности ДНК-полимеразы (например, при образовании 2-deoxyribonolactone) репарация идет по механизму long patch BER – вставляется 2-6 42 нуклеотидов. Base excision repair (BER) в митохондриях: Считается, что в long patch BER в митохондриях участвуют FEN1 (или EXOG1) и хеликаза DNA2. PMID:22992591 Последняя стадия BER-репарации – лигирование. В митохондриях человека лигирование проводит DNA ligase 3 (LIG3). У дрожжей в митохондриях работает LIG1. 43 Регуляция BER PMID:20950654 •ROS повреждают свободные dNTP и мтДНК •Сигнал о повреждении поступает в цитозоль, белки системы репарации транспортируются в митохондрию •Сигнал о повреждении мтДНК дополняется сигналами о повреждении ядерной ДНК • Происходит перераспределение факторов репарации: OGG1, UNG1 и NTH1, дрожжевого NTG1, CSA, CSB. 44 Основные пути репарации в митохондриях: •Уничтожение окисленных dNTPs (I) •Short-patch BER (II) •Long patch BER (III) •Регуляция репарационных процессов (IVV) PMID:20950654 Зеленым выделены главные факторы репарации; дополнительные факторы – желтым и фиолетовым; ДНК связывающие белки выделены серым. 45 TFAM участвует в репарации мтДНК •TFAM связывается с поврежденной ДНК прочнее, чем с интактной. У TFAM аффинность к ДНК, содержащей 8-охоG, выше, чем у гликозилаз OGG1 и MYH. Factors from cytoplasm •Клетки, устойчивые к циспластину (алкилирующий агент), гиперэксперессируют TFAM и TRX2 (тиоредоксин 2). •TFAM ингибирует разрезание ДНК некоторыми репарации (OGG1, UNG1, APE1) in vitro. ROS PMID:20950654 ферментами 46 TFAM снижает скорость репарации •Это может быть связано с тем, что TFAM плотнее упаковывает ДНК, что снижает доступ к ней ферментов. •р53 может ослаблять связывание TFAM с поврежденными основаниями, что увеличивает скорость репарации. •3’-5’ экзонуклеазная активность р53 может удалять 8-охоG на 3’-конце, эта реакция усиливается SSB. 47 1. В митохондриях происходит репарация BER двух типов: • SP (short patch) BER • LP (long patch) BER 2. Основные стадии BER: • Гликозилаза удаляет поврежденное азотистое основание • АР-эндонуклеаза освобождает 3’-конец бреши • В зависимости от группы на 5’-конце бреши ДНК полимераза ɣ застраивает брешь одним (SP BER) или несколькими (LP BER) нуклеотидами. • FEN1, EXOG1 и DNA2 участвуют в LP BER • LIG 3 зашивает разрыв 3. Существует регуляция BER в митохондриях: • Многие ферменты переходят в митохондрии в ответ на сигналы о повреждениях • В репарации BER участвуют TFAM и p53 48 MMR – mismatch repair Удаление несоответствий и небольших петель. Эффективность невысокая, т.к. не всегда происходит верный выбор материнской цепи, что приводит к мутациям. Удаление несоответствий некомплементарных пар G:T и G:G показано в лизатах митохондрий млекопитающих. Одним из основных факторов MMR в ядре служит YB-1, предполагается, что он является ключевым компонентом MMR и в митохондриях. 49 YB-1 в отличие от остальных участников ядерной MMR (MSH1, MSH3, MSH6) частично локализован в митохондриях. В митохондриальных экстрактах из клеток с отсутствием MSH2 наблюдается MMR => механизм MMR в митохондриях отличается от ядерного. MMR в экстрактах митохондрий снижается при уменьшении уровня YB-1 (нокдаун siRNA). PMID:19272840 50 PMID:22992591 51 Предполагается, что DNMT1 может участвовать в MMR в митохондриях •Нокдаун DNMT1 в человеческих клетках увеличивает количество мутаций в микросателлитах •Снижение экспрессии уменьшением количеств комплексов MytSa и MutLa DNMT1 белков сопровождается – компонентов 52 •Вопрос о наличии MMR в митохондриях остается открытым. •BER тоже несоответствия. может репарировать • Существует предположение, что MMR необходима для удаления маленьких петель в большей степени, чем несоответствий в парах нуклеотидах. 53