Лекция 5: •Репарация мтДНК •Транскрипция мтДНК 1 Double-strand break repair Есть доказательства наличия в митохондриях обоих механизмов: NHEJ (non-homologous end joining) и HR (homologous recombination). : RAD51 – основной фермент HR в ядре – локализован также в человеческих митохондриях 2 Доказательства наличия гомологичной рекомбинации у эукариот: •Гомологичная рекомбинация показана у дрожжей. MTG1/CCE1 ген кодирует резольвазу, локализованную в митохондриях. •В лейкоцитах человека (особенно при лейкемиях) и некоторых линиях клеток существенная часть мтДНК образует кольцевые димеры и мультимеры. Они могут образоваться в результате гомологичной рекомбинации. 3 •В сердечной мышце человека, мозге человека и мыши мтДНК линейна и образует структуры, в которых возможна рекомбинация. 4 PMID: 21290399 •Попадание отцовской мтДНК в зиготу и её рекомбинация с материнской показана у ящериц, лосося и нематод. •Есть данные, что у человека может также происходить попадание отцовской мтДНК в зиготу: у одного пациента в мышцах были обнаружены гибриды отцовской и материнской мтДНК. PMID:15143273 5 PMID:24006472 Ферменты-кандидаты на участие в гомологичной рекомбинации в митохондриях человека: •Хеликазы (Twinkle или Pif1) •Белки, связанные с ДНК (TFAM) •SSB (mtSSB) •Экзонуклеаза (MGME1) •Комплекс Rad51/RecA •Медиатор Rad52 (MGM101 у дрожжей) 6 TFAM и Twinkle участвуют в образовании структур Холлидея => могут участвовать в гомологичной рекомбинации 7 MGME1(mitochondrial genome maintenance exonuclease 1): •локализована в митохондриях •ssDNA 5’->3’ exonuclease PMID:23313956 8 •Мутации в экзонуклеазе MGME1 вызывают митохондриальные болезни и множественные делеции в мтДНК •При снижении количества MGME1 в клетках нарушается репликация в митохондриях: накапливаются короткие продукты, увеличивается кол-во 7S ДНК 9 Rad 51 переходит в митохондрии в ответ на окислительный стресс. Для перехода Rad 51 необходима репликация. PMID:23591384 10 MGM101 участвует в гомологичной рекомбинации в митохондриях дрожжей 11 PMID:24006472 Ферменты-кандидаты на участие в гомологичной рекомбинации в митохондриях человека: •Хеликазы (Twinkle или Pif1) •Белки, связанные с ДНК (TFAM) •SSB (mtSSB) •Экзонуклеаза (MGME1) •Комплекс Rad51/RecA •Медиатор Rad52 (MGM101 у дрожжей) 12 1. Вероятно, в митохондриях происходит репарация двуцепочечных разрывов. 2. Существуют косвенные доказательства гомологичной рекомбинации в митохондриях Млекопитающих, но детали этого процесса пока неясны. 3. Несколько белков являются кандидатами на участие в гомологичной рекомбинации в митохондриях: mtSSB, экзонуклеаза MGME1, Rad51, хеликазы Twinkle и Pif1, TFAM. 4. У дрожжей Rad52-подобный белок MGM101 участвует в гомологичной рекомбинации. 5. Какой фермент выполняет функции Rad52 в митохондриях Млекопитающих неизвестно. В митохондриях некоторых растений работает 13 изоформа Rad52. Direct repair (без разрезания фосфодиэфирной связи) Повреждения ДНК УФ излучением в ядре репарирует фотолиаза, её активность не показана в митохондриях Млекопитающих. У дрожжей фотолиаза работает в митохондриях. O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) – основной фермент прямого репарирования алкилированных оснований в ядерной ДНК. Есть данные, что MGMТ присутствует в митохондриях, но может репарировать только метилированные и этилированные основания. 14 NER – nucleotide excision repair Долгое время считалось, что этот механизм отсутствует в митохондриях. •В митохондриях дрожжей индуцированные УФ пиримидиновые димеры репарируются эндонуклеазой Rad2. Этот механизм UVER (UV excision repair) одновременно похож и на BER, и на NER. •Белки, участвующие в ядерной NER CSA (от Cockayne Syndrome) и CSB найдены в митохондриях Млекопитающих в условиях окислительного стресса. Они связываются с мтДНК и компонентами BER. Возможно, в митохондриях есть отличный от ядра механизм NER, который еще будет исследован. 15 Белки CSA и CSB (Cockayne syndrome) Синдром Кокейна - аутосомное рецессивное нейродегенеративное заболевание проявляющееся в нарушении роста, неврологических отклонениях, гиперчувствительности кожи к УФ. 16 Белки CSA и CSB (Cockayne syndrome) Синдом Кокейна связан с кодирующих белки CSA и CSB. дисфункцией генов, Эти белки участвуют во многих ядерных процессах: •инициации транскрипции •репарации (NER и BER) •Уровень CS белков в митохондрии в норме низкий, но при обработке клеток перекисью он резко возрастает: СS белки импортируются в митохондрию и связываются с мтДНК. 17 CSA принадлежит к семейству белков с WD40 доменами. PMID:21468892 WD40 – повтор: около 40 аминокислот с WD на конце. Такой домен имеет структуру ßпропеллера, обычно с 7-ю лопастями. 18 PMID:25653723 19 Структура CSA 40 кДа https://openaccess.leidenuniv.nl/handle/1887/19938 PMID:21468892 20 CSB принадлежит к семейству SNF2/SWI2 ATФаз 168 кДа PMID:23422418 •У SNF2/SWI2 ATФаз имеется центральный АТФазный домен с 7-ю хеликазными мотивами. •Они способны разъединять цепи дцНК, но настоящей хеликазной активностью не обладают. •Участвуют в регуляции структуры хроматина. 21 Функции CS белков в митохондриях •Уровень CS белков в митохондриях при окислительном стрессе резко возрастает: СS белки импортируются в митохондрию и связываются с мтДНК и некоторыми белками •СS белки защищают мтДНК от образования common deletion 22 Сommon deletion Делеция 4978 bp, фланкированных короткими прямыми повторами. Делеция захватывает > 30% митохондриального генома. Делеции в мт ДНК возникают при множестве различных заболеваний. В том числе: •в нейронах пожилых людей •у пациентов с болезнью Паркинсона (32-80% мт ДНК в черной субстанции несут делеции) 23 Common deletion может образоваться в ходе репликации PMID:18305478 24 Common deletion может образоваться в ходе репарации двуцепочечных разрывов PMID:18305478 25 Функции CSB в мт-транскрипции •CSB способен освобождать мтДНК из комплекса мтДНК- СSB способствует мтДНК с POLRMT TFAM => связыванию •В клетках csb -/csb- падает транскрипционная активность •in vitro CSB снижает инициацию транскрипции, увеличивает количество длинных транскриптов => CSB увеличивает процессивность POLRMT, действуя как фактор элонгации 26 Функции CSB в мт-репарации •CSB взаимодействует с OGG1 и mt SSB •В клетках мышей csb-/csb- возрастает уровень окислительных повреждений ДНК (8oxoG) и нарушается работа дыхательной цепи •В клетках мышей csb-/csb- ogg1-/ogg1- уровень 8oxoG не меняется. Предполагается, что NEIL1 может компенсировать потерю OGG1 •Потеря CSB снижает активность BER в митохондриях Возможно, CSB участвует в BER, изменяя структуру комплекса TFAM-мтДНК, чтобы обеспечить доступ ферментов репарации к 27 ДНК. PMID:23562423 l 28 •В митохондриях происходит репарация двух типов: •BER – base excision repair •MMR – mismatch repair 2. В митохондриях не показана NER – nucleotide excision repair, хотя белки CSA и CSB импортируются в митохондрию при окислительном стрессе. Вероятно, CSB участвует в регуляции транскрипции и BER 3. Наличие репарации двуцепочеченых повреждений мтДНК не изучено, но Rad 51 поступает в митохондрии в условиях окислительного стресса и участвует в репликации. 29 Топология репарации в митохондриях •CSB рекрутирует факторы BER к мембране; СSB способствует связыванию мтДНК с POLRMT •CSA and CSB взаимодействуют с SSB и гликозилазой OGG1; •p53 стимулирует гликозилазу и POLγ; •PARP-1 участвует в BER? PARP1 – Poly (ADP-ribose) polymerase – ключевой ядерный фермент репарации однонитевых разрывов. Такие разрывы образуются при BER, поэтому PARP1 влияет и на BER. PARP1 локализована в митохондрии и участвует в поддержании целостности мтДНК. PARP1 входит в комплекс, включающий мтДНК и лигазу 3. 30 Мт ДНК связана с внутренней мембраной. Один из белков, связывающих ДНК с мембраной – М19, вероятно, участвуют также РНВ1 (prohibitin1) и ATAD3 (белок внутренней мембраны, ответственный за перемещения D-loop). Большинство компонентов BER связаны с внутренней мембраной (кроме АРэндонуклеазы). Но стабильного комплекса компоненты BER не образуют. Есть данные, что CSB вовлечен в сборку и сохранение комплекса мтДНК и компонентов BER: он связывает SSB и OGG1 в один комплекс с мтДНК. 31 Есть две модели: •мтДНК мобильна и проходит через комплексы, расположенные на внутренней мембране, для репликации, репарации и. т. д. •мтДНК заякорена мембране. на внутренней 32 Регуляция репарации мтДНК Мт изоформы многих ферментов мт репарации образуются с помощью альтернативного сплайсинга, а, значит, возможна посттранскрипционная регуляция. Есть данные по NTG1 дрожжей. NTG1 динамично перераспределяется между ядром и митохондриями при окислительном стрессе. Переход NTG1 в митохондрии зависит от окислительных повреждений, но не от уровня ROS. Значит, есть специфичные сигналы об этих повреждениях, исходящие из митохондрий. Некоторые белки с двойной ядерной и митохондриальной локализацией обнаруживаются в митохондриях только в условиях окислительного стресса: Rad51, APEX1, CSA и CSB. Многие белки имеют сигналы как ядерной, так и митохондриальной локализации: NTG1, UNG1, APE1 у дрожжей и hOGG1a, hNTHL1 у Млекопитающих. Возможно, механизм, показанный для NTG1, является общим. Окислительный стресс вызывает переход р53 в митохондрии. 33 34 Транскрипция мтДНК PMID: 22137970 Три транскрипта: 1) C HSP1 – в D-loop 2) C HSP2 – upstream 5’-конца 12 S rRNA (частота инициации в 20 раз ↓) 3) С LSP – в D-loop 35 В транскрипции участвуют: •POLRMT •TFAM (h-mtTFA – transcription factor A) •TFBM1 (h-mtTFB1) •TFBM2 (h-mtTFB2) образует гетеродимер с POLRMT •MTERF1 (mitochondrial termination factor) – терминирует транскрипцию PMID: 17189185 •TFEM (transcriptional elongation factor mitochondrial) ↑ процессивность POLRMT, осуществляет переключение между транскрипцией и репликацией. 36 •TFAM – регулирует число копий мтДНК и участвует в регуляции транскрипции. •TFBM1 (h-mtTFB1) и TFBM2 (hmtTFB2) имеют сходство с рРНКметилтрансферазами, которые диметилируют аденозин около 3’конца 12S pРНК. Эта модификация консервативна для про- и эукариот, за исключением дрожжей. TFAM PMID: 17189185 Филогенетический анализ показал, что они происходят от рРНК метилтрансферазы эндосимбионта. •TFBM1 и TFBM2 способны связывать РНК или оцДНК. 37 TFB1M и TFB2M диметилируют А936 и А937 в 12S rRNA Отсутствие TFB1M: PMID: 22642575 •приводит к потере диметилирования • снижает уровень 12S rRNA •ведет к невозможности трансляции в митохондриях. 38 TFB M1 имеет 2 функции: •Участвует в транскрипции (не ясно как именно) •рРНК-метилтрансфераза (MT) Мутации в МТ-мотиве не приводят к отсутствию транскрипции in vitro. Нокдаун TFB M1с помощью iRNA у дрозофилы не меняет число транскриптов, но ↓ синтез белка в митохондриях => TFB M1 участвует в трансляции TFB M1 играет роль транскрипционного фактора в неких специфических условиях или при транскрипции только определенных мРНК. 39 TFBM2: •рРНК-метилтрансферазная активность менее выражена •Специализированный транскрипционный фактор: нокдаун с помощью iRNA у дрозофилы ↓ число транскриптов в 2-8 раз. Возможны 2 функции: •Связывает оцДНК, стабилизируя область промотора в частично расплетенном состоянии во время инициации транскрипции •Связывает новую цепь РНК, предотвращая образование ДНК-РНК гибридов, способных ингибировать промотор. 40 1. TFBM1 (h-mtTFB1) и TFBM2 (h-mtTFB2) – рРНКметилтрансферазы, диметилирующие аденозин около 3’-конца 12S pРНК 2. TFBM1 и TFBM2 являются транскрипционными факторами, POLRMT может осуществлять транскрипцию только в комплексе с одним из них 3. Нокдаун TFBM1 не влияет на транскрипцию, но существенно снижает уровень трансляции 4. Основная функция TFBM1 – метилирование 12S pРНК и регуляция трансляции 5. Нокдаун TFBM2 снижает уровень транскрипции 6. Основная функция TFBM2 – участие в транскрипции 41 РНК-полимераза POLRMT •имеет высокую степень гомологии с РНК-полимеразой Т-нечетных фагов (Т3/Т7) •не имеет гомологии с мультисубъединичными РНКполимеразными комплексами прокариот. PMID:22551784 42 У человека POLRMT (mtRNAP) размером 1230ак, 134 кДа. - белок В отличие от фаговой полимеразы, POLRMT не может инициировать транскрипцию самостоятельно, ей требуются дополнительные белки 43 PMID:22551784 N-концевой домен NTE есть только в POLRMT. Он состоит из: • pentatricopeptide repeat domain (PPR domain) • протяженного участка с неизвестной структурой – остатки 42–217 • «митохондриального адреса» N-концевой домен NTD имеет слабо выраженную гомологию с T7РНК-полимеразой. Но структурное сходство высокое. Короткий богатый пролином линкер соединяет NTE и NTD Каталитический домен СТD PMID:22551784 СТD – каталитический домен: 12 консервативных блоков расположенных линейно (A-L) Кристаллическая структура: напоминает кисть руки •Пальцы – основной элемент О-helix=мотив В, важен для субстратной специфичности, катализа и транслокации. Расположена немного в разной ориентации. •Ладонь – мотивы А,С, мутации приводят к потере каталитической активности •Большой палец – α-спираль, осуществляет связь полимеразы с матрицей во время элонгации 45 PMID:22551784 Домен Пальцы •Нет finger flap – стабилизирует фермент на ДНК во время элонгации. Возможно, для POLRMT нужны дополнительные факторы для увеличения процессивности. TFEM ↑ процессивность. •Specificity loop – нет в кристаллической структуре, узнает промотор (-3 - -11) и взаимодействует с большой бороздкой ДНК, обеспечивая специфичность узнавания промотора наряду с NTD, участвует также в элонгации, ↑ процессивность. Вероятно, есть и в POLRMT (у дрожжей есть похожая структура, но обеспечивает инициацию только на оц матрице, на дц требуются дополнительные факторы). 46 NTD PMID: 22551784 •нет сходства последовательности, а структура похожа: 6 спиралей • β-hairpin – вставлена между матричной и нематричной цепью, расплавляя промотор для инициации в Т7. В POLRMT возможно роль та же, но требуются дополнительные факторы. Делеция в этой области не дает POLRMT инициировать транскрипцию с дц промотора. •AT-rich loop соединяет спирали D и E. Эти 2 спирали и петля имеют плотный контакт с PPR-доменом NTE. АТ-петля взаимодействует с малым желобком ДНК в области -13 - -17, это необходимо для 47 узнавания промотора. PMID: 22551784 NTE уникален для POLRMT вариабелен у животных, растений и грибов. PPR (pentatricopeptide repeat domain) •Содержит 2 PPR тандемных мотива. В дрожжах этого домена нет, есть у растений. •Образует 9 α-спиралей, из которых 4 включают в себя PPR-мотивы. 48 PPR-мотивы содержатся во многих белках митохондрий и хлоропластов PMID: 22051507 •PPR мотив: 35 аминокислот (повторяются от 2 до 26 раз) •РРR мотив образует 2 альфа-спирали •PPR мотив, вероятно, участвует в связывании с РНК, но механизм этого взаимодействия неизвестен 49 1. LRPPRC (leucine-rich pentatricopeptide repeat containing protein) участвует в регуляции транскрипции 2. MRPP3 (mitochondrial RNAse P protein 3) – компонент РНКазы Р, участвует в процессинге 5’– концов тРНК 3. MRPS27 (mitochondrial ribosomal protein of the small subunit 27) – компонент малой субъединицы рибосом 4. POLRMT – каталитическая субъединица РНКполимеразы 5. PTCD1 (pentatricopeptide repeat domain protein 1) - участвует в процессинге 3’– концов тРНК 6. PTCD2 (pentatricopeptide repeat domain protein 2) – участвует в процессинге мРНК 7. PTCD3 (pentatricopeptide repeat domain protein 3) – связан с 12S рРНК, не50 влияет на её стабильность и процессинг, функции неизвестны. PMID: 22551784 Участок 42-218 ак – структура не известна, к PPR примыкает α-спираль. Делеция приводит к потере транскрипции с промотора, каталитическая активность сохраняется. 51 РНК-полимераза POLRMT cпособна осуществлять транскрипцию только в присутствии TFAM и одного из транскрипционных факторов: TFBM1 или TFBM2 52