Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса

Физико-химические основы биокатализа в иллюстрациях
3. Стационарная кинетика ферментативных
реакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен.
Физический смысл параметров уравнения
Михаэлиса (KM, Vmax). Значение параметра
kcat/KM. Порядок величин. Методы их
определения
Стационарная кинетика ферментативных реакций.
Уравнение Михаэлиса-Ментен
E << S
v=
k cat [E 0 ][S]
K M  [S]
при [S]<<KM v=[E0][S](kcat/KM)
Леонор Михаэлис
1875—1949
Берлин, Германия - Нью-Йорк, США
биохимик и химик-органик
Мауд Леонора Ментен
1879 – 1960, Канада
биохимик и физиолог
Интерпретация кинетических параметров для
односубстратных реакций: механизм Михаэлиса-Ментен
V
V
kcat
kcat
Последующие модификации механизма Михаэлиса-Ментен
1) Механизм Бриггса-Холдейна (КM>KS)
Промежуточное соединение, образующееся вслед
за образованием ES: КM<KS
Если в ходе реакции происходит образование дополнительных
ковалентно или нековалентно связанных промежуточных
соединений, уравнение Михаэлиса-Ментен применимо при
медленной конечной каталитической стадии и КM<KS, хотя
теперь KM и kcat представляют собой комбинацию различных
констант скорости и констант равновесия:
[ES΄]=K΄[ES], [ES΄΄]=K΄΄[ES΄].
KM= KS/(1+K΄+K΄K΄΄)
kcat= k4K΄K΄΄(1+K΄K΄΄)
Порядок величин параметров
kcat, KM, kcat/KM
– Константа kcat [cек-1] характеризует число оборотов ферментативной
реакции. Как правило, ферменты без кофакторов (например, трипсин,
химотрипсин) работают с медленной скоростью, их kcat от 102 cек-1.
Ферменты, использующие для катализа реакции кофакторы (например,
оксидоредуктазы), работают с большей эффективностью, их kcat до 107
cек-1.
– Константы скорости связывания (k1) в ферментативной кинетике обычно
порядка 106-108 с-1.
Сродство субстрата к ферменту определяется величиной константы
диссоциации (Kd) комплекса фермента с субстратом. Kd=k-1/k1 [моль/л=М]
Чем ниже величина Kd, тем выше сродство субстрата к ферменту, то есть
прочнее фермент-субстратный комплекс. Величина Kd может варьировать
от 10-3 М (неэффективное связывание субстрата с ферментом, таким
образом, низкое сродство субстрата к ферменту), до 10-10 М (высоко
эффективное связывание, практически такое же прочное, как
ковалентное).
– Для механизма Бриггса-Холдейна отношение kcat/KM равно ~107-108 М-1с-1.
Физический смысл параметров уравнения
Михаэлиса-Ментен А) Константа kcat
-
-
Параметр kcat – число оборотов фермента, определяет
максимальное число молекул субстрата, превращающихся в продукт
одним активным центром в единицу времени
В том случае, когда имеется один фермент-субстратный комплекс и
все стадии связывания достаточно быстрые, kcat – константа скорости
первого порядка для превращения комплекса ES в комплекс ЕР.
В более сложных случаях kcat – функция всех констант скорости
первого порядка. Например, для механизма, когда комплекс ЕР
диссоциирует достаточно быстро, kcat=k2:
Для следующей схемы kcat является функцией констант k2 и k3
(kcat= k2k3/(k2+k3)):
Однако, если одна из этих констант много меньше другой, kcat
становится равной меньшей константе. Например, если k3<k2, то
kcat=k3. Из этого следует, что kcat не может превышать ни одной из
констант скорости первого порядка для реакционного пути в прямом
направлении и представляет собой, таким образом, нижний предел
для констант скорости химических реакций.
Физический смысл параметров уравнения
Михаэлиса-Ментен Б) Величина KM
KM=KS для простого механизма Михаэлиса-Ментен.
В некоторых других случаях:
[E][S]
KM =
 [ES]
где ∑[ES] – сумма концентраций всех фермент-содержащих форм.
Для механизма действия химотрипсина:
[ES΄] = [ES]k2/k3
При k2>>k3, [ES΄]>>[ES], и [ES΄] вносит в величину KM больший
вклад, чем [ES], являясь преобладающей ферментсодержащей
формой. KM меньше KS приблизительно в k3/k2 раз:
KM≈KS(k3/k2)
Физический смысл параметров уравнения
Михаэлиса-Ментен В) Параметр kcat/KM
• Отношение kcat/KM не может превышать ни одну из констант
скорости второго порядка для последовательности реакций,
идущих в прямом направлении, и представляет собой нижний
предел для константы скорости при связывании фермента с
субстратом.
• Скорость реакции при низких концентрациях субстрата
определяется уравнением v=(kcat/KM)[E]0[S], т.е. отношение
kcat/KM представляет собой кажущуюся константу скорости
второго порядка. Этот параметр не является истинной
микроскопической константой, за исключением крайнего случая,
когда реакция лимитируется столкновением фермента с
субстратом.
• Параметр kcat/KM связывает скорость реакции с концентрацией
свободного фермента, а не с его общей концентрацией. При
низкой концентрации субстрата фермент находится
преимущественно в свободном состоянии ([Е]≈[Е]0), и,
следовательно, скорость реакции есть v=(kcat/KM)[E][S].
Графическое представление данных
1. График Лайнуивера-Берка
2. График Эдди-Хофсти
v = Vmax - vKM/[S]
3. График зависимости Vmax от KM
Vmax = v + KMv/[S]