Раздел 11. Механизмы специфического отбора субстратов
реклама
CH3 N Физическая химия биополимеров Лаврик О.И. НГУ-2012 O 11. Механизмы специфического отбора субстратов. Коррекция ошибок в реакциях, катализируемых аминоацил-тРНК-синтетазами и ДНК-полимеразами Что происходит в ходе ферментативной реакции? Связывание субстрата с активным центром происходит за счет достаточно слабых взаимодействий (электростатических контактов, гидрофобного связывания, водородных связей). Если взаимодействие многоточечное, то расположение активных группировок в молекуле субстрата должно точно соответствовать расположению активных групп в молекуле фермента. Если эти группировки расположены так, что необходимые контакты не формируются, то это влияет на величину Kd=k-1/k1. Возможно влияние на величину KM. Каталитические группы активного центра должны также быть ориентированы необходимым для катализа образом. В противном случае смещение электронов будет неэффективным, что приводит к понижению величины kcat. Специфичность ферментов в отношении превращаемых субстратов – важнейшая особенность ферментативных реакций Некоторые из ферментов обладают очень широкой специфичностью (например, щелочная фосфатаза). Другой крайний случай – строгая стереоспецифичность. – Дрожжи содержат два определенных фермента L-лактат и D-лактатдегидрогеназу. – Аминоацил-тРНК-синтетазы проявляют высокую стереоспецифичность: D-аминокислоты не являются субстратами, за исключением D-тирозина. Возможно образование D-тирозил-тРНК, и по этой причине для гидролиза нежелательного продукта существует фермент D-тирозил-гидроксилаза. Ферменты снижают энергию активации катализируемой реакции Джон Бердон Сандерсон Холдейн 1892 Оксфорд, Англия – 1964, Индия Английский биолог и философ Дж.Б.С. Холдейн, 1930 г.: «Энергия связывания субстрата используется для деформации субстрата до структуры продукта» В теории переходного состояния не учитываются процессы столкновения реагентов. Теория рассматривает сами реагенты (основное состояние) и наиболее нестабильные соединения, которые образуются в ходе реакции (переходное состояние). Переходному состоянию соответствует максимум на кривой изменения энергии реагентов вдоль координаты реакции. График изменения энергии Гиббса в ходе реакции Состояние 1 – переходное состояние (ES≠), Состояние 2 – промежуточное состояние. В переходном состоянии химические связи непрерывно образуются и разрываются. Соединениям со стабильными химическими связями соответствуют минимумы на графике. Допущение о существовании термодинамического равновесия между основным и переходным состоянием используется для расчета скорости реакции. В этом случае концентрацию переходного состояния можно рассчитать из разности энергии этих состояний. Общую скорость реакции получают умножением концентрации переходного комплекса и константы скорости его распада. Для мономолекулярной реакции: Разность энергий Гиббса для переходного (Х≠) и основного (Х) состояний равна ∆G≠. Воспользуемся известным соотношением равновесной термодинамики: ∆G≠ = -RT lnK [Х≠]=[X]exp(-∆G≠/RT) Частота распада переходного комплекса = частота колебаний разрываемой связи Частота получена из равенства энергий возбужденного осциллятора, рассчитанных на основе квантовой теории (E=hω) и классической физики (Е=kT), где h – постоянная Планка, ω – частота колебаний, k – постоянная Больцмана: ω=kT/h. Скорость распада молекул Х определяется уравнением: d[X] kT exp(-∆G≠/RT) [ X ] [ X ] dt h Константа скорости первого порядка для распада молекул Х равна: k1= kT exp(-∆G≠/RT) h Энергия активации Гиббса ∆G≠ может быть подразделена на энтальпийную и энтропийную составляющие: ∆G≠ =∆Н≠ -Т∆S≠ k1= kT exp(-∆H≠/RT) exp(∆S≠/R) h Применение теории переходного состояния для анализа механизмов ферментативного катализа В случае простого механизма Михаэлиса-Ментен (КS=КM) энергия связывания уменьшает энергию активации перехода, определяемого кажущейся константой скорости второго порядка kcat/KM. Смысл параметра kcat/KM, где kcat - число оборотов реакции, поскольку эта величина определяет максимальное число молекул субстрата, превращаемых в продукт одним активным центром в единицу времени: – KM в простейшем варианте можно рассматривать как кажущуюся константу диссоциации: v=kcat[E]/(1+KM/[S]). – При малых концентрациях субстрата v=kcat/KM[E][S], то есть kcat/KM представляет собой кажущуюся константу скорости второго порядка. Ценность параметра kcat/KM в том, что он связывает скорость реакций с концентрацией свободного фермента, а не с его общей концентрацией. Это справедливо для низкой концентрации субстрата, т.к. при [Е]≈[Е0]: KM=KD= [E][S] [ES] Константа скорости для взаимодействия свободного фермента со свободным субстратом с образованием продуктов равна kcat/KM. В терминах теории переходного состояния константа равновесия для второй реакции пропорциональна энергии активации ∆GТ≠. ∆GТ≠=∆G≠+∆GS ∆G≠ – положительная величина, отражающая энергию активации химических стадий, в ходе которых происходит образование и разрыв связей, ∆GS - отрицательная величина, отражающая использование энергии связывания k1= kT exp(-∆G≠/RT) h RTln(kcat/KM)=RTln(kT/H) - ∆G≠-∆GS Изменение энергии Гиббса для реакции E+S ES продукты ∆G≠ – положительная величина, отражающая образование и разрыв связей, ∆GS - отрицательная величина, отражающая использование энергии связывания. Фермент и субстрат комплементарны, когда каждая взаимодействующая группа субстрата контактирует с соответствующим центром связывания фермента, и энергия связывания принимает максимальное значение Комплементарность фермента исходному субстрату Допустим, максимальная внутренняя свободная энергия связывания равна ∆Gb. В рассмотренном случае она реализуется в исходном фермент-субстратном комплексе, обеспечивая прочное связывание; КM - константа диссоциации фермент-субстратного комплекса – будет мала. Образование переходного состояния будет сопровождаться изменением геометрии субстрата и ухудшением его соответствия, что приведет к уменьшению энергии связывания. ∆GR – увеличение свободной энергии, вызванное ухудшением структурного соответствия между ферментом и субстратом, ∆G0 – свободная энергия активации для образования и разрыва химических связей на стадии, определяемой константой kcat, Наблюдаемая свободная энергия активации для стадии химического превращения субстрата с константой скорости kcat равна: ∆G≠=∆G0≠+∆GR, и ∆GS=∆Gb Энергия активации Гиббса для процесса ∆GТ≠=∆G0≠+∆GR+∆Gb График изменения энергии Гиббса E+S ES продукты Пунктирная линия – фермент структурно комплементарен субстрату, сплошная – переходному состоянию (∆GS = ∆Gb - отрицательная величина, ∆G0 и ∆GR – положительны). Комплементарность фермента переходному состоянию субстрата Полная энергия связывания ∆Gb реализуется в переходном состоянии. Исходному фермент-субстратному комплексу соответствует положительный член ∆GR, который отражает возрастание энергии за счет структурного несоответствия исходного состояния переходному. Этот член увеличивает КМ, а прирост энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию увеличивает kcat. ∆G≠ = ∆G0≠ - ∆GR ∆GS = ∆Gb + ∆GR Энергия активации Гиббса для перехода, характеризующегося константой kcat/KM: ∆GТ≠=∆G ≠ + ∆GS = ∆G0 ≠ + ∆Gb ∆GR из конечного уравнения исключается. Когда фермент комплементарен переходному состоянию субстрата, а не самому субстрату, kcat/KM возрастает в exp(∆GR/RT) раз. kcat/KM не зависит от взаимодействий в исходном фермент-субстратном комплексе, поскольку член ∆GR не входит в уравнение. Наличие сильного связывания фермента с субстратом или низкое значение КМ не является необходимым условием протекания ферментативной реакции. Для катализа важны высокие значения КМ Процесс эволюции ферментов, направленный на увеличение скорости катализируемых ими реакций, можно разделить на два этапа: 1. Увеличение kcat/KM за счет повышения комплементарности фермента переходному состоянию субстрата. 2. Увеличение концентрации фермента за счет повышения КМ, направленное на то, чтобы в свободном состоянии находилось максимально возможное количество фермента. Исключение – ферменты, которые выполняют регуляторные функции. Их активность регулируется путем изменения КМ субстратов через аллостерическое воздействие. Модель «ключ-замок» Герман Эмиль Фишер 1852, Ойскирхен – 1919, Берлин Немецкий химик-органик и биохимик Нобелевская премия по химии 1902 г. Теория комплементарности при фермент-субстратном взаимодействии принадлежит Э. Фишеру, воплотившему ее в модели «ключ-замок». В 1890 г. Э. Фишер предложил модель, согласно которой специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата. Однако, хотя эта модель объясняла высокую специфичность ферментов, она не объясняла явления стабилизации переходного состояния, которое наблюдается на практике. Концепция деформации (Дж.Б.С. Холдейн и Л. Полинг) Лайнус Карл Полинг 1901, Портленд – 1994, Биг-Сюр американский химик Нобелевская премия по химии 1954 г. и мира 1962 г. Активный центр фермента структурно комплементарен не самому субстрату, а переходному состоянию. При связывании с ферментом переходное состояние субстрата взаимодействует с ферментом более эффективно, чем сам субстрат, и поэтому полная энергия связывания не реализуется до тех пор, пока не сформируется переходное состояние. Теория индуцированного соответствия Объясняет отсутствие ферментативной активности с небольшими субстратами, такими как вода, в которых нет групп, способных обеспечить связывание и энергию для приведения фермента в активное состояние. Является модификацией модели «ключ-замок» модель «рука-перчатка». Предполагается, что в отсутствии субстрата фермент структурно некомплементарен переходному состоянию. Однако, поскольку молекула фермента довольно гибкая, а субстрат имеет жесткую структуру, при образовании фермент-субстратного комплекса каталитические группы на ферменте ориентируются оптимальным для катализа образом: фермент становится комплементарным переходному состоянию только после связывания субстрата. Перестройка области активного центра при связывании Дэниэл Эдвард Кошланд 1920, Нью-Йорк – 1919, Калифорния с субстратом названа процессом конформационной адаптации. американский биохимик Гипотеза непродуктивного связывания Было предложено, что помимо продуктивного связывания в активном центре возможны другие способы связывания, когда небольшие субстраты связываются, но не подвергаются каталитическому превращению. Например, в молекуле лизоцима активный центр имеет протяженную структуру, состоящую из шести центров связывания – A, B, C, D, E, F. Для осуществления реакции необходимо, чтобы молекула субстрата заняла центры D и Е. Небольшие субстраты способны присоединяться с любой сторону вдоль вытянутого активного центра лизоцима, не связываясь с подцентром, где происходит расщепление. Деформация вносит положительный вклад в катализ при условии комплементарности фермента переходному состоянию субстрата, увеличивая kcat и KM, что приводит к увеличению скорости реакции. Индуцированное соответствие уменьшает эффективность катализа, увеличивая KM без соответствующего увеличения kcat по сравнению с ферментом, находящимся в кативной форме в отсутствие субстрата. Механизм непродуктивного связывания не затрагивает каталитического превращения специфических субстратов, однако он приводит к появлению дополнительных связывающих центров для конкурирующих между собой неспецифических субстратов. Специфичность фермента Способность фермента узнавать определенный субстрат из нескольких, конкурирующих за активный центр Функция, слагающаяся из прочности связывания каждого из субстратов и кинетической (каталитической) специфичности, характеризующейся скоростью катализа. «Суммарная» специфичность характеризуется отношением kcat/KM. Специфичность и относительная реакционная способность Центральная проблема специфичности: каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого, меньшего или равного ему по размерам (изостерического) субстрата. Такую задачу постоянно решают аминоацил-тРНК-синтетазы. Если синтетаза (ЕХ) ошибочно активирует чужую аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на «свою» тРНКХ: или если она ошибочно этерифицирует истинной субстратной аминокислотой Х чужую тРНК: то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи. Дискриминация аминокислот, меньших или изостеричных (равных по размеру) специфическому субстрату, способных разместиться в активном центре фермента, определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет незначительных различий в структуре. Изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцин валин Валил-тРНК-синтетаза валин треонин Наличие разницы в энергии связывания не до конца обеспечивает в этих случаях точность работы системы аминоацилирования. Валил-тРНК-синтетаза валин треонин Треонин связывается с валил-тРНК синтетазой в 100-200 раз слабее валина, несмотря на то, что он изостеричен валину, поскольку в гидрофобный карман погружается гидроксильная группа вместо метиленовой. Энергия активации реакции представляет собой сумму двух составляющих: одна из них – энергия активации для стадии химического превращения, а вторая – энергия связывания фермента с субстратом. Различие в энергии связывания специфичного субстрата (RS) и меньшего по размерам конкурирующего соединения HS равно дополнительной энергии связывания группы R, имеющейся у специфичного субстрата и отсутствующей у меньшего субстрата по отношению к водороду. Поскольку энергия взаимодействия группы R не только входит в энергию связывания, но и понижает энергию активации стадии химического превращения, вклад заместителя R следует оценивать из сравнения параметров kcat/KM для двух субстратов: RS и HS. Например, если величину kcat для валина для активации валил-тРНКсинтетазой принять за 1, то для других аминокислот эта величина будет: для аланина 0,03, для изолейцина 0,0019, для серина 0,05. Дополнительную энергию связывания группы R по отношению к водороду можно определить по формуле: ∆Gb=RTln(kcat/KM)RS/ ln(kcat/KM)HS Изолейцил-тРНК-синтетаза изолейцин валин Для пары изолейцил-тРНК-синтетаза-валин неспецифический субстрат по критерию kcat/KM хуже в 140-200 раз. В клетках E.Coli [Ile]/[Val] = 0,18. Уровень ошибок изолейцил-тРНК-синтетазы на стадии активации 0,030,04. Экспериментально обнаружено: уровень ошибок при замене Ile на Val в биосинтезе овальбумина цыпленка и гемоглобина кролика равен 3*10-4. Чему соответствует этот уровень ошибок? Ошибочное включение одной аминокислоты на каждые 10000 остатков Одна из 20 белковых молекул длиной в 500 остатков будет содержать единственную ошибочную аминокислоту Предположив, что только около 10% всех ошибок серьезно сказываются на биологической функции белка, можно сделать заключение, что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется бесполезной (или даже вредной) в клеточном метаболизме Коррекция ошибок в реакциях, катализируемых аминоацил-тРНК- синтетазами Существование механизмов коррекции для аминоацилтРНК-синтетаз Поль Наим Берг 1926 Бруклин, США Американский биохимик Нобелевская премия по химии 1980 г. Изолейцил-тРНК-синтетаза ошибочно активирует валин. Добавление тРНК к комплексу с изолейциладенилатом приводит к образованию изолейцилтРНК, а у валиладенилат-ферментного комплекса не наблюдается образование валил-тРНК, поскольку при добавлении тРНК происходит гидролиз ошибочного аминоациладенилата: Существование механизмов коррекции для аминоацил-тРНК-синтетаз В присутствии тРНКIle изолейцил-тРНК-синтетаза непроизводительно гидролизует АТР АМР + ppi. Избыточный гидролиз АТР по отношению к синтезированному продукту за счет АТР-пирофосфогидролазной активности синтетазы является критерием существования корректирующего механизма, включающего дополнительную стадию разрушения ошибочного продукта реакции. У цистеинил- и тирозил-тРНК-синтетаз специфичность высокая и гидролиза АТР не наблюдается. В некоторых случаях, когда дискриминация аминокислот на стадии активации была недостаточной, наблюдался быстрый гидролиз ошибочного аминоациладенилата вместо переноса «неправильной» аминокислоты на субстратную тРНК. Роль тРНК в коррекции? Индуцирует ли тРНК гидролиз аминоациладенилата или же служит акцептором ошибочно активированной аминокислоты, а затем подвергается ферментативному деацилированию? Возможные последовательности реакций, катализируемых синтетазами, можно записать в виде следующей схемы (АК-аминокислота): Роль тРНК в коррекции? Предложенные механизмы коррекции можно разделить на две группы в зависимости от того, какое соединение в них гидролизуется: Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты (стадии 1, 2, 5 – гидролиз аминоацил-тРНК). Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилата (стадии 1 и 4 – гидролиз аминоациладенилата). В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь «необратимого» ответвления (реакции 4 или 5), обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений. Механизм отбраковки ошибочной аминокислоты Доказательство существования механизма гидролиза аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами было получено при изучении аминоацилирования тРНКVal треонином, катализируемого валил-тРНКсинтетазой из B.Stearothermophilus. Валил-тРНК-синтетаза образует с треонином стабильный комплекс, который быстро гидролизуется при добавлении тРНКVal. Предшествует ли гидролизу перенос аминоацильного остатка на тРНКVal? Импульсный метод «замороженной» струи: Комплекс [14С]-треонил-АМР·ЕVal + тРНК [14С]-треонил-тРНК Константа гидролиза треонил-тРНК в присутствии валил-тРНК-синтетазы 40 с-1, а для специфичной валил-тРНК 0,015 с-1, то есть более чем в 2000 раз ниже. Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилата Механизм кинетического корректирования Джон Джозеф Хопфилд 1933 Чикаго, США биофизик и молекулярный биолог Ошибочное промежуточное соединение, образующееся в ходе реакции, диссоциирует с фермента и гиролизуется быстрее, чем правильное. Для правильного аминоациладенилата скорость переноса на тРНК выше, чем диссоциация, т.е. коррекция определяется соотношением кинетических констант определенных стадий. Механизм коррекции за счет гидролиза промежуточного аминоациладенилата Экспериментальное доказательство Для валил-тРНК-синтетазы из желтого люпина в отсутствие тРНК наблюдался гидролиз: АТР АМР + ppi, зависящий от присутствия несубстратных аминокислот (Cys, Thr, Ser и α-аминомасляной кислоты). Константа скорости гидролиза для этих кислот 0,7-13 мин-1. Специфический валиладенилат-ферментный комплекс гидролизуется с константой скорости 0,018 мин-1, т.е., например, в 720 раз медленнее, чем комплекс валил-тРНК-синтетазы с цистеинил-аденилатом. Коррекция ошибок в реакциях, катализируемых ДНК-полимеразами Механизм коррекции при репликации ДНК При синтезе ДНК ошибка исправляется после полимеризации. Молекула ДНК синтезируется в направлении 5’-3’, нуклеотиды присоединяются к 3’-гидроксильной группе растущей цепи ДНК. Репликативные ДНК-полимеразы обладают корректирующей 3’-5’-экзонуклеазной активностью, выщепляющей из цепи ошибочно встроенный нуклеотид Частота мутации фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью, проявляемой ДНК-полимеразой. Частота мутации для Е.Сoli составляет 10-6-10-8 и, следовательно, точность репликации ДНК либо равна этим величинам, либо еще выше. Механизм коррекции при репликации ДНК С помощью экзонуклеазной активности исправляются ошибки, которые накапливаются в процессе биосинтеза. Однако нарушения структуры ДНК могут возникать не только по причине неточной работы в ходе синтеза, но и в результате внешних воздействий, таких как ионизирующее и ультрафиолетовое облучение, окислительный стресс. Возможна различная пострепликационная коррекция структуры ДНК (репарация). Система репарации ошибочно-встроенных нуклеотидов (mismatch repair) специально предназначена для удаления ошибок, возникших в ДНК в ходе репликации. Система эксцизионной репарации оснований исправляет повреждения в ДНК, возникающие в результате окислительного стресса, то есть модифицированные (окисленные) основания и разрывы в одной из цепей ДНК. Система эксцизионной репарации нуклеотидов удаляет из ДНК объемные повреждения: фотодимеры, возникающие под действием ультрафиолетового облучения, объемные аддукты метаболитов, попадающих из окружающей среды, таких как продукты сгорания, курения, например, антрацены и бензапирены. Синтез ДНК через повреждение (Translesion synthesis – TLS) В случае синтеза с использованием поврежденной ДНК-матрицы транслезионными (translesion) ДНК-полимеразами (например, η, ι, κ, θ, μ, ζ) также возникают искажения в структуре ДНК. TLS ДНК-полимеразы, ведущие синтез через повреждение матрицы, не обладают корректирующей активностью, поскольку их задачей является ввести во чтобы то ни стало нуклеотидное звено, дабы избежать остановки репликативной вилки на повреждении матрицы. Затем поврежденный участок ДНК восстанавливается системами репарации. Мутации, вводимые репликативными ДНК-полимеразами в ходе репликативного синтеза, играют не только вредную роль. Мутации в ДНК являются движущей силой эволюции.
