Химический факультет МГУ им.М.В.Ломоносова, Институт

ЭНЗИМАТИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ КОНВЕРСИИ БИОМАССЫ:
СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ
Аркадий П.Синицын
Химический факультет МГУ
им.М.В.Ломоносова
Институт биохимии
им.А.Н.Баха РАН
Виды возобновляемого сырья
 Сахароза, меласса (из сахарного тростника и
сахарной свеклы)
 Отходы пищевой промышленности (переработки
яблок, цитрусовых, сои, молока, и т.д.)
 Крахмалосодержащее сырье (зерно, картофель)
 Топинамбур (полифруктан)
 Растительная биомасса
 Древесина и отходы ее переработки
 Однолетние растения, солома, трава,
водоросли, и т.п.
 Целлюлозосодержащие отходы
промышленности и сельского хозяйства
Получение спиртов из отходов
пищевой промышленности
Отходы
переработки
сои
(галактоолиго
сахариды)
Отходы
переработки
молока
(лактоза)
Сбраживаемые сахара
Ферментация
α-Галактозидаза
Глюкоза,
галактоза
Дистилляция,
дегидратация
β-Галактозидаза
Меласса
из сахарной свеклы
и тростника
(сахароза)
Ферментация
Этанол,
бутанол
Получение спиртов из отходов
пищевой промышленности
Отходы
переработки
яблок
ПЕК, ГМЦ, ЦЕЛ
Отходы
переработки
цитрусовых
ЦЕЛ, ПЕК
Сбраживаемые
сахара
Целлюлазы,
пектиназы,
гемицеллюлазы
Ферментация
Дистилляция,
дегидратация
Сбраживаемые
сахара
Целлюлазы,
пектиназы
Этанол,
бутанол
Получение спиртов из
топинамбура
Топинамбур
Полифруктан
ПЕК
Фруктоза
Эндо-инулиназа,
Экзо-инулиназа,
Пектиназы
Ферментация
Дистилляция,
дегидратация
Этанол,
бутанол
Получение спиртов из
крахмалистого сырья
Этанол,
бутанол
Зерно,
в т.числе
низкосортное,
картофель
Разжижение,
декстринизация
Утилизация
отходов
Глюкоамилаза
Осахаривание
Термостабильная
α-амилаза
Дистилляция,
дегидратация
Глюкоза
Ферментация
Получение спиртов из
целлюлозосодержащего сырья
(раздельные гидролиз и сбраживание)
Утилизация
лигнина
Сбор и
транспортировка
ЦСМ
Предобработка
ЦСМ
Целлюлазы,
Гемицеллюлазы
Ферментативный
гидролиз
(осахаривание)
Этанол,
бутанол
Дистилляция,
дегидратация
Сахара
(глюкоза,
ксилоза)
Ферментация
Получение спиртов из
целлюлозосодержащего сырья
(одновременный гидролиз и сбраживание)
Утилизация
лигнина
Сбор и
транспортировка
ЦСС
Предобработка
ЦСС
Целлюлазы,
Гемицеллюлазы
Ферментативный
гидролиз
(осахаривание)
Этанол,
бутанол
Дегидратация.
дистилляция
Сахара
Ферментация
Одновременный гидролиз и ферментация
Выбор ферментов для гидролиза растительного сырья
Спиртовая
барда
Зерновая
шелуха
Кукурузные
стебли
Солома
Древесина
Стебли
Тростника
(багасса)
Сельскохоз.
отходы
Предобработка
Выбор ферментов для гидролиза
EG
CBH
β-G
Ксиланазы
Дополнит.
ферменты
Высокий выход сбраживаемых сахаров (C5 и C6)
Ферментативный гидролиз целлюлозы
After Teeri 1997
ЦЕЛЛЮЛОЗА
Частично
деградированная
ЦЕЛЛЮЛОЗА
Эндоглюканазы
(EG)
ЦЕЛЛОБИОЗА
Целлобиогидролазы
(CBH)
ГЛЮКОЗА
ß-Глюкозидазы
(ß-G)
Сравнение эффективности различных методов
предобработки лигноцеллюлозного сырья
10 FPU / 1 г субстрата + 20 bGU / г, [S] = 100 г/л, pH 5, 50ºC, 24 h
Before Prt
1.
After Prt
2.
Relative glucose
yield, %
100
3.
80
60
4.
40
5.
20
6.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
7.
8.
Багасса / паровой
взрыв
Пшеничная солома /
паровой взрыв
Овсяная шелуха /
паровой взрыв
Рисовая шелуха /
паровой взрыв
Хвойная древесина /
сухое измельчение
Лиственная древесина /
паровой взрыв
Лиственная древесина /
органозольв
Целлюлоза (ЦБК)
ПРЕДОБРАБОТКА
 Предобработка лигноцеллюлозного сырья
играет важную роль для увеличения его
реакционной способности
 Метод сухого измельчения существенно
увеличивает реакционную способность
лигноцеллюлозного сырья
Наличие ферментов,
штаммов-продуцентов,
систем экспрессии генов (грибы)
Штаммы супер-продуценты ферментов:

Различные штаммы Trichoderma sp.

Различные штаммы Penicillium sp.

Различные штаммы Aspergillus sp.
Ферменты:
 Целлюлазы (CBH1, CBH2, Eg1, Eg2, Eg3, и др.)
 β-глюкозидазы (целлобиазы, экзо-β1,4/1,3-глюкозидаза)
 Гемицеллюлазы (эндо-ксиланазы, эндо-маннанзы,
β-ксилозидазы, арабиназы, α-галактозидазы,
β-галактозидазы, и др.)
 Пектиназы (пектин-лиазы, полигалактуроназы)
 Амилазы (α-амилаза, глюкоамилаза, и др.)
 Инулиназы (эндо-инулиназа, экзо-инулиназа)
Системы экспрессии генов:
 Penicillium 537
 Penicillium PCA
 Aspergillus sp.
(I) Стратегия создания
штаммов-продуцентов
 Селекция продуцента уникальных
ферментов среди диких штаммов
микроорганизмов, получение суперпродуцента с помощью мутагенеза
и селекции, оптимизация процесса
ферментации
 Проблемы – большие затраты времени,
невозможность предсказать состав
комплекса секретируемых ферментов
Выбор продуцента уникального целлюлазного комплекса.
Гидролиз пихты, обработанной паровым взрывом разными
целлюлазами
10 FPU / 1 г субстрата, [S] = 5%, рН 5, 50оС
90.0
Penicillium
80.0
Conversion, %
70.0
60.0
TR2
UBC1
Пихта
UBC2
Trichoderma
50.0
40.0
TR1
30.0
20.0
10.0
0.0
0
20
40
Time (hrs)
60
80
Созданы промышленные штаммы суперпродуценты целлюлаз
и сопутствующих ферментов
 Целлюлазы Penicillium обладают уникально
высокой осахаривающей способностью по
сравнению с Trichoderma
 Существенно, что именно на целлюлазы
Trichoderma делают ставку ведущие мировые
биотехнологические компании
Целлюлазы Penicillium и Trichoderma
 Ферменты Penicillium обладают более
высокой осахаривающей активностью,
ферменты Trichoderma
 Возможные причины:
 Более высокая удельная активность
индивидуальных ферментов
 Большая разнообразность
целлюлазного комплекса
 Наличие β-глюкозидазы (целлобиазы)
 Меньшая степень ингибирования
лигнином
Генно-инженерный подход
Реципиентный
штамм:
 Высоко
продуктивный
штамм Penicillium
537
Промоторы:
 CBH1 Penicillium
 Hist4 Penicillium
 Другие
Внеклеточная экспрессия
гомологичных и гетерологичных
грибных генов
 Целлобиаза (βглюкозидаза)
 Эндо-β1,4-глюканазы
 Целлобиогидролазы
 Энхансеры целлюлаз
 Маннанза
 Ксиланазы
 Арабиназы
 Ксилоглюканазы
 Пектин-лиаза
 α-Галактозидазы
 β-Галактозидазы
 Эндо- и экзо-инулиназы
 Другие
Методы получения
рекомбинантных штаммов
1. Получение штамма реципиента (ауксотрофный мутант,
маркерный ген)
2. Выделение целевого гена (гомологичного, гетерологичного)
3. Включение целевого гена в экспрессионную кассету (создание
вектора)
4. (Ко)трансформация протопластов реципиентного штамма
5. Регенерация протопластов, первичный скрининг
трансформантов на целевую активность (качалочные колбы,
планшеты)
6. Вторичный скрининг трансформантов (1-л, 3-л ферментеры),
получение, испытания и изучение свойств ферментных
препаратов, выделение и изучение свойств гомогенных
целевых ферментов
7. Получение штамма продуцента
(II) Стратегия создания штаммов
продуцентов
 Создание рекомбинантных штаммов
– продуцентов индивидуальных
(целевых) моно-ферментных
препаратов
 Проблема – моно-ферментные препараты
не могут осуществить эффективное
осахаривание различных видов
растительного сырья
Создание рекомбинантных штаммов –
продуцентов индивидуальных (целевых)
ферментов (II)
Экспрессия β-глюкозидазы
в Penicillium 537
(CBH1 промотор)
Экспрессия эндо-β1,4-глюканазы
В Penicillium 537
(CBH1 промотор)
β-G
Eg
Создание рекомбинантных штаммов –
продуцентов индивидуальных (целевых)
моно-ферментных препаратов (II)
Экспрессия эндо-β1,4-ксиланазы
в Penicillium 537
(CBH1 промотор)
Экспрессия эндо-β1,4-маннанзы
в Penicillium 537
(CBH1 промотор)
Man
Xyl
Раздельная ферментация рекомбинантных
штаммов Penicillium 537 – продуцентов разных
целевых ферментов (II)
Рек.
штамм
537-Cell
Рек.
штамм
537-Xyl
Рек.
Штамм
537-bGl
Ферментация
Рек.537-Cell
Ферментация
Рек.537-Xyl
Ферментация
Рек.537-bGL
Ферментный
препарат
Рек.537-Cell
Ферментный
препарат
Рек.537-Xyl
Ферментный
препарат
Рек.537-bGl
Мультиферментный
препарат
Cell + Xyl + bGl
Ферментный комплекс
для осахаривания
определенных видов
лигноцеллюлозного сырья
Одновременная ферментация различных
рекомбинантных штаммов Penicillium 537 –
продуцентов индивидуальных ферментов (II)
Рек.
штамм
537-Cell
Рек.
штамм
537-Xyl
Рек.
штамм
537-bGl
Одновременная ферментация
537-Cell + 537-Xyl + 537-bGl
Мультиферментный
препарат
Cell + Xyl + bGl
Ферментный комплекс
для осахаривания
определенных видов
лигноцеллюлозного сырья
(III) Стратегия создания штаммов –
продуцентов
 Создание штаммов – продуцентов
мультиферментного комплекса с
увеличенной активностью
определенного (целевого)
фермента
 Проблема – продуктивность по собственным
ферментам мультиферментного комплекса
может уменьшиться
Создание рекомбинантных штаммов – продуцентов
мультиферментного комплекса с увеличенной
активностью определенного (целевого)
фермента (III)
Экспрессия β-глюкозидазы
в Penicillium 537
(Hist промотор)
Осахаривание МКЦ
Дозировка по белку – 5 мг/г
[МКЦ]- 5%, рН 5.0, 50ºC
8
1 час,
Глюкоза
и ВС
4
β-G
0
P.verr 221-151
pHist1-β-Glu
pHist4-β-Glu
24 часа,
Глюкоза
И ВС
16
12
8
4
0
P.verr 221-151
pHist1-β-Glu
pHist4-β-Glu
(IV) Стратегия создания штаммов продуцентов
 Создание штаммов – продуцентов
смеси заранее выбранных
(целевых) ферментов
 Проблема – необходимость иметь в наличии
широкий круг очищенных ферментов для
предварительных экспериментов по выбору
наиболее активных осахаривающих
ферментов
 Могут возникнуть проблемы при экспрессии
смеси целевых ферментов в нужной
пропорции
Эксперименты по выбору наиболее активных
осахаривающих ферментов (IV)
Предобработанные кукурузные початки, pH5, 50ºС, 72 часа
Дозировка по белку – 0.2 мг/мл, целлобиаза – 0.1 ед/мл
Контроль:
Spezyme CP,
Multifect XL,
CP + XL
12
8
6
4
2
Trichoderma
индивидуальные
ферменты
Pv EG III 25
Pv BGL
116
Pv Xyl 23
Spezyme
0,1 g/l
Multifect 0,1
g/l
S 0,07 g/l +
M 0,025 g/l
Background
substrate
Pv EG II 39
Pv EG I 52
A.j. BGL
Pv CBH I
66 (A280)
Pv CBH I
55
Pv CBH II
60
Pv EG I 70
Tr Xyl II 21
Tr EG II lm
Tr EG II hm
Tr EG I lm
Tr EG I hm
Tr CBH II 50
Tr CBH II 60
Tr CBH I 57
0
Tr CBH I 66
Glucose (g/L)
10
Penicillium
индивидуальные
ферментыe
Создание рекомбинантных штаммов - продуцентов
смеси заранее выбранных (целевых) ферментов (IV)
Экспрессия целлобиогидролазы и
β-глюкозидазы в Penicillium 537
(CBH1 промотор)
β-G
CBH-s
Концепция биофабрики (Корп.Биотехнологии)
The Chemical Journal, Дек.2008, с.39
Авторский коллектив:
Синицына О.А., Рожкова А.М., Зоров И.Н.,
Правильников А.Г., Середа А.С., Волков П.В.,
Бушина Е.В., Кондратьева Е.А., Сатрутдинов А.Д.,
Федорова Е.А., Кошелев А.В., Беккаревич А.О.,
Бубнова Т.В., Окунев О.Н., Чулкин А.М.,
Вавилова Е.А., Винецкий Ю.П.
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
Химический факультет, Москва
Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН, Москва
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН,
Пущино Московской обл.
Спасибо за внимание!
+7 (495) 939-5966
apsinitsyn@gmail.com
www.enzyme.chem.msu.ru/cellulas/